Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh diệt vi khuẩn xanthomanas oryzae gây bệnh bạc lá lúa

/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
..

VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
-----------***-----------

LUẬN VĂN CAO HỌC
Mã số: 60420114

Đề tài:
Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh diệt vi khuẩn Xanthomonas oryzae
gây bệnh bạc lá lúa

Học viên: Từ Thị Bẩy
Lớp: CHST _ K15
Hƣớng dẫn: TS Đào Thị Hồng Vân

Hà Nội, 2013

i


/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Lời cảm ơn

Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đào Thị Hồng Vân - Khoa Công
nghệ Sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội là người thầy đã hướng cho tơi những ý

tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho tơi hồn thành bản luận án này.
Tơi xin trân trọng cảm ơn Kỹ sư Đặng Văn Tiến, Viện Công nghệ sinh học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho tơi hồn
thành khóa học và bản luận án này.
Tơi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật,
Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi
vượt qua mọi khó khăn để hồn thành tốt cơng việc nghiên cứu của mình.
Cuối cùng, tơi xin tỏ lịng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người ln
bên tơi, động viên,góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học
tập và nghiên cứu.
Tác giả

ii


/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Lời cam đoan

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi và một số kết quả
cùng cộng tác với các đồng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn
là trung thực.
Hà Nội, ngày tháng
Tác giả

iii

năm 2013

/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

MỤC LỤC
MỤC LỤC .................................................................................................................iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. viii
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................ix
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. x
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
PHẦN I. TỔNG QUAN ............................................................................................. 3
1.1. XẠ KHUẨN ........................................................................................................ 3
1.1.1. Sự phân bố và ý nghĩa của xạ khuẩn trong tự nhiên ........................................ 3
1.1.2. Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới ................................................................... 4
1.2. ĐẶC ĐIỂM VÀ CẤU TẠO CỦA XẠ KHUẨN ................................................ 5
1.2.1. Đặc điểm hình thái ........................................................................................... 5
1.2.2. Cấu tạo của xạ khuẩn........................................................................................ 6
1.2.3. Sự sinh trƣởng và phát triển ............................................................................. 8
1.2.4. Sự hình thành bào tử......................................................................................... 9
1.2.5. Sinh tổng hợp chất kháng sinh ....................................................................... 11
1.3. PHÂN LẬP CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG
SINH ỨNG DỤNG TRONG NÔNG NGHIỆP ....................................................... 13
1.3.1. Phân lập các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh ....................................... 13
1.3.2. Phân loại và định tên xạ khuẩn....................................................................... 13
1.3.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn . 16
1.4. TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG SINH.............................................................. 18
1.4.1. Phƣơng pháp hấp phụ ..................................................................................... 18
1.4.2. Một số chất hấp phụ ....................................................................................... 19
1.4.3. Một số chất nhả hấp phụ................................................................................. 21

1.5. BỆNH BẠC LÁ TRÊN LÚA ............................................................................ 22
1.5.1. Thiệt hại do bệnh bạc lá gây ra đối với cây lúa.............................................. 22
1.5.2. Biểu hiện của bệnh bạc lá trên lúa.................................................................. 23
1.5.3. Vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá ở lúa ................................... 24

iv


/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

1.5.4. Cơ chế gây bệnh ............................................................................................. 24
1.5.5. Sử dụng xạ khuẩn trong phòng trừ bệnh bạc lá trên lúa ................................ 25
PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 26
2.1. VẬT LIỆU ......................................................................................................... 26
2.1.1. Chủng giống vi sinh vật.................................................................................. 26
2.1.2. Hóa chất .......................................................................................................... 26
2.1.3. Thiết bị............................................................................................................ 26
2.1.4. Môi trƣờng ...................................................................................................... 27
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................... 27
2.2.1. Bảo quản giống ............................................................................................... 27
2.2.2. Xác định đặc điểm sinh học ........................................................................... 28
2.2.3. Xác định sinh khối .......................................................................................... 29
2.2.4. Xác định hoạt tính kháng sinh ........................................................................ 29
2.2.5. Nghiên cứu điều kiện lên men ........................................................................ 30
2.3. NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG SINH CÓ TRONG DỊCH
LÊN MEN ................................................................................................................ 31
2.3.1. Đánh giá khả năng hấp phụ chất kháng sinh trên các chất hấp phụ ............... 31
2.3.2. Xác định nồng độ chất hấp phụ ...................................................................... 31
2.3.3. Thử các dung môi nhả hấp phụ chất kháng sinh ............................................ 31

2.3.4. Xác định pH và thời gian nhả hấp phụ ........................................................... 31
2.3.5. Xác định tỷ lệ các thành phần của hỗn hợp dung môi ................................... 32
2.3.6. Chạy sắc ký giấy chất kháng sinh .................................................................. 32
2.4. ẢNH HƢỞNG CỦA DỊCH LÊN MEN ĐẾN KHẢ NĂNG NẢY MẦM CỦA
HẠT .......................................................................................................................... 32
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................ 33
3.1. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH .............. 33
3.1.1 Phân lập các chủng xạ khuẩn .......................................................................... 33
3.1.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh .......................................... 34
3.1.3. Khả năng đối kháng trong môi trƣờng dịch thể ............................................. 37

v


/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

3.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN TB 5.4
.................................................................................................................................. 38
3.2.1. Đặc điểm ni cấy .......................................................................................... 38
3.2.2. Đặc điểm hình thái bào tử .............................................................................. 41
3.2.3. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa.......................................................................... 42
3.3.NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH
TỔNG HỢP KHÁNG SINH CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces
oligocarbophilus TB5.4............................................................................................ 47
3.3.1. Lựa chọn môi trƣờng nhân giống và môi trƣờng lên men ............................. 47
3.3.2.Ảnh hƣởng của nguồn cacbon thay thế ........................................................... 48
3.3.3. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ ............................................................................. 49
3.3.4. Ảnh hƣởng của thời gian nhân giống đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng
sinh của chủng S. oligocarbophilus TB5.4 .............................................................. 50

3.3.5. Ảnh hƣởng của tỷ lệ tiếp giống đến sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng
S. oligocarbophilus TB5.4........................................................................................ 50
3.3.6. Ảnh hƣởng của độ thơng khí đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh ở chủng
S. oligocarbophilus TB5.4 ........................................................................................ 51
3.3.7.Ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S.
oligocarbophilus TB5.4............................................................................................ 52
3.4. TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG SINH TỪ DỊCH LÊN MEN CỦA CHỦNG S.
oligocarbophilus TB5.4............................................................................................ 53
3.4.1. Đánh giá khả năng của kháng sinh trên các chất hấp phụ .............................. 53
3.4.2. Xác định nồng độ than hoạt tính .................................................................... 54
3.4.3. Nghiên cứu nhả hấp phụ chất kháng sinh từ than hoạt tính ........................... 55
3.4.4. Xác định pH và thời gian nhả hấp phụ tốt nhất .............................................. 56
3.4.5. Xác định tỷ lệ thành phần hỗn hợp dung mơi sử dụng cho q trình nhả hấp
phụ chất kháng sinh .................................................................................................. 57
3.4.6. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố đến tính chất hố lý của chất kháng
sinh từ chủng S. oligocarbophilus TB5.4 ................................................................. 58

vi


/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

3.5. ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA DỊCH SAU LÊN MEN CỦA CHỦNG XẠ
KHUẨN S. oligocarbophilus TB5.4 ĐẾN KHẢ NĂNG NẢY MẦM CỦA THÓC
.................................................................................................................................. 60
3.5.1.Ảnh hƣởng của dịch kháng sinh thô đến khả năng nầy mầm của hạt ............. 60
3.5.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ dịch sau lên men đến quá trình nảy mầm của hạt ......... 61
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................. 64
KẾT LUẬN .............................................................. Error! Bookmark not defined.

KIẾN NGHỊ.............................................................................................................. 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 65
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT .......................................................................................... 65
TÀI LIỆU TIẾNG ANH........................................................................................... 65

vii


/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

KTKS

Khuẩn ty khí sinh

KTCC

Khuẩn ty cơ chất

RF

Cuống bào tử thẳng hay lƣợn sóng

(Rectus-Flexibilis)
RA

Cuống bào tử xoắn đơn hình móc câu

(Retinaculum aperturm)
DNA

Deoxyribonucleic acide

RNA

Ribonucleic acide

CSBT

Cuống sinh bào tử

BMBT

Bề mặt bào tử

MT

Môi trƣờng

viii


/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Biểu hiện của lá lúa bị khi bị nhiễm bệnh bạc lá
Hình 1.2. Hình thái tế bào vi khuẩn Xanthomonas oryzae

Hình 3.1..Vịng đối kháng chủng vi khuẩn X. oryzae 020 đƣợc tạo ra bởi các chủng
xạ khuẩn bằng phƣơng pháp cục thạch
Hình 3.2. Hoạt tính kháng chủng lại chủng vi khuẩn X. oryzae 020 từ dịch sau lên
men của các chủng xạ khuẩn bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch
Hình 3.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng TB5.4 trên mơi trƣờng ISP4 sau 7
ngày ni ở nhiệt độ 28 C
Hình 3.4. Hình dạng chuỗi và bề mặt bào tử chủng TB5.4 (x 15.000)
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng
sinh của chủng xạ khuẩn S. oligocarbophilus TB5.4
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng
sinh của chủng xạ khuẩn S. oligocarbophilus TB5.4
Hình 3.7. Nhả hấp phụ chất kháng sinh từ than hoạt tính với các dung mơi
Hình 3.8. Định tính chất kháng sinh tách chiết và hệ số Rf có trong dịch sau lên
men của chủng S.oligocarbophilus TB5.4 bằng sắc ký giấy
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của tỷ lệ dịch ngâm ủ đến khả năng nảy mầm của hạt.

ix


/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Sự phân bố theo nhóm màu của xạ khuẩn
Bảng 3.2. Hoạt tính đối kháng với vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn
Bảng 3.3. Khả năng đối kháng của dịch sau lên men của các chủng xạ khuẩn với
các chủng vi sinh vật kiểm định đối.
Bảng 3.4. Đặc điểm nuôi cấy của chủng TB5.4 sau 14 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ
28 C
Bảng 3.5. Đặc điểm khuẩn lạc của chủng TB5.4 trên một số môi trƣờng

Bảng 3.6. Khả năng sinh enzym ngoại bào của chủng TB5.4
Bảng 3.7. Khả năng đồng hoá đƣờng của chủng TB5.4
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl đến sinh trƣởng của chủng TB5.4
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự sinh trƣởng của chủng TB5.4
Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng của chủng TB5.4
Bảng 3.11. So sánh đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn TB5.4 với chủng chuẩn
Streptomyces oligocarbophilus
Bảng 3.12. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. oligocarbophilus
TB5.4 trên một số MT lên men
Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới hoạt tính kháng sinh của chủng
S.oligocarbophilus TB5.4
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ tới hoạt tính kháng sinh của chủng S.
oligocarbophilus TB5.4
Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của thời gian nhân giống đến khả năng sinh tổng hợp chất
kháng sinh của chủng S. oligocarbophilus TB5.4
Bảng 3.16. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh
của chủng S. oligocarbophilus TB5.4
Bảng 3.17. Ảnh hƣởng của độ thơng khí đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh
của chủng S. oligocarbophilus TB5.4

x


/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Bảng 3.18. Khả năng hấp phụ của chất kháng sinh có trong dịch sau lên men của
chủng S. oligocarbophilus TB5.4 trên một số chất hấp phụ ở các pH
khác nhau
Bảng 3.19. Ảnh hƣởng của nồng độ than tới khả năng hấp phụ kháng sinh trong

dịch sau lên men chủng S. oligocarbophilus TB5.4
Bảng 3.20. Khả năng nhả hấp phụ chất kháng sinh từ than hoạt tính bằng các dung
mơi khác nhau
Bảng 3.21. Ảnh hƣởng của pH và thời gian đến quá trình nhả hấp phụ chất kháng
sinh có trong than hoạt tính
Bảng 3.22. Ảnh hƣởng của tỷ lệ dung mơi:nƣớc lên q trình nhả hấp phụ chất
kháng sinh từ than hoạt tính
Bảng 3.23. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính kháng sinh
Bảng 3.24. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính kháng sinh
Bảng 3.25. Hệ số Rf của chất kháng sinh có trong dịch sau lên men của chủng
S.oligocarbophilus TB5.4
Bảng 3.26. Ảnh hƣởng của dịch ni cấy đến khả năng nảy mầm của hạt thóc
Bảng 3.27. Ảnh hƣởng của tỷ lệ dịch nuôi cấy S. oligocarbophilus TB5.4: X.
oryzae

020

(v/v)

đến

khả

xi

năng

nảy

mầm

của

hạt

thóc


/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

MỞ ĐẦU
Chất kháng sinh là những hợp chất hữu cơ có nguồn gốc từ các hoạt động
sống của các sinh vật, có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc đối với
vi sinh vật, ngay cả ở nồng độ thấp. Việc nghiên cứu sản xuất và sử dụng có hiệu
quả nhiều loại kháng sinh có ý nghĩa rất lớn đối với y học nói riêng và trong rất
nhiều ngành cơng nghiệp sản xuất khác nói chung. Trong y học, chất kháng sinh đã
đƣợc sử dụng để cứu hàng triệu ngƣời khỏi các bệnh nhiễm trùng. Trong nông
nghiệp, chất kháng sinh đƣợc sử dụng để chữa bệnh và làm tăng trọng cho vật ni
và phịng trừ dịch bệnh, bảo vệ thực vật nhờ khả năng ức chế các vi sinh vật gây hại
một cách chọn lọc. Chất kháng sinh thu nhận từ vi sinh vật dễ phân giải trong điều
kiện tự nhiên, không gây ô nhiễm môi trƣờng.
Trong số các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh thì xạ
khuẩn là nhóm sinh vật có tiềm năng lớn. Trong số, khoảng 9000 chất kháng sinh
hiện đƣợc biết trên thế giới thì có khoảng 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn. Hầu
hết các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn đều có phổ tác động rộng, có khả
năng ức chế hoặc tiêu diệt nhiều lồi vi sinh vật khác nhau. Xạ khuẩn có nhiều
trong đất, sử dụng các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp các chất kháng
sinh tạo chế phẩm sinh học nhằm ức chế các nhóm vi sinh vật gây bệnh có trong đất
góp phần hạn chế các bệnh có thể gây ra đối với cây trồng.

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây ra đƣợc phát hiện đầu
tiên ở Nhật Bản vào khoảng năm 1884-1885. Bệnh phổ biến ở hầu hết các nƣớc
trồng lúa trên thế giới, đặc biệt là châu Á (Nhật Bản, Trung quốc, philippin, Ấn
Độ,...). Ở nƣớc ta, bệnh này đã gây hại từ lâu trên các giống lúa cũ nhƣng đặc biệt
từ năm 1965-1966 tới nay có năm bệnh phá hại một cách nghiêm trọng ở các vùng
đồng bằng trên các giống lúa mới nhập nội có năng suất cao ở vụ xuân và nhất là
trong vụ mùa. Nƣớc ta là một nƣớc nhiệt đới nóng ẩm thuận lợi cho vi sinh vật nói
chung và xạ khuẩn nói riêng phát triển. Do đó, có thể tìm thấy nhiều chủng xạ
khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh quý, trong đó có kháng sinh chống lại vi
khuẩn Xanthomonas oryzae đây là tác nhân gây bệnh bạc lá. Vấn đề đặt ra là làm

1


/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

sao để sản xuất ra những chế phẩm sinh học có khả năng diệt vi khuẩn
Xanthomonas oryzae trong phòng trừ bệnh bạc lá lúa phục vụ sản xuất nơng nghiệp.
Với mục đích đó, tơi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng
sinh diệt vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá lúa”, bao gồm các nội
dung chính sau:
1. Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng chủng
vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá ở lúa từ các mẫu đất thu thập tại
Nam Định và Thái Bình .
2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, phân loại đến loài chủng xạ khuẩn.
3. Nghiên cứu một số điều kiện lên men, tách chiết và một số tính chất hố lý
của chất kháng sinh do chủng xạ khuẩn tuyển chọn sinh ra.
4. Bƣớc đầu đánh giá ảnh hƣởng của dịch kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn
tuyển chọn đối với sự nảy mầm của lúa.

2


/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

PHẦN I. TỔNG QUAN
1.1. XẠ KHUẨN
1.1.1. Sự phân bố và ý nghĩa của xạ khuẩn trong tự nhiên
Xạ khuẩn (Actinomycetales) là một nhóm vi khuẩn thật (Bacteria) phân bố
rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, trong nƣớc ao hồ, một phần trong bùn và trong
các cơ chất hữu cơ khác, thậm chí trong cả cơ chất mà các vi khuẩn khác và nấm
mốc không phát triển đƣợc [3]. Xạ khuẩn có nhiều nhất trong lớp đất bề mặt, số
lƣợng không chỉ phụ thuộc vào loại đất mà còn phụ thuộc vào mức độ canh tác của
đất và khả năng bao phủ của thực vật. Đất giầu dinh dƣỡng và lớp đất trên bề mặt
(đến 40cm) thƣờng có số lƣợng xạ khuẩn lớn. Số đơn vị sinh khuẩn lạc (CFUcolony forming unit) xạ khuẩn trong 1g đất canh tác thƣờng đạt tới hàng triệu mầm
xạ khuẩn, đất hoang hố chỉ có 10-100 nghìn mầm. Số lƣợng xạ khuẩn trong đất
cũng thay đổi theo thời gian trong năm [6, 28].
Xạ khuẩn cũng thƣờng sống trên các cây chết, rơm rạ, thƣờng hoại sinh
nhƣng có thể kí sinh trên thân cây, ở củ và rễ cây. Một số nghiên cứu cũng cho thấy
sự có mặt của xạ khuẩn trong trầm tích biển nhƣ các lồi Actinomyces halophila, A.
mortivalis và A. iraquensis, Streptomyces nhƣ S. antibioticus (MU106, MU107) và
S. rimosus (MU114) [15,16, 33] hoặc trong các mẫu nƣớc và bùn ao nuôi trồng
thủy sản đặc biệt là ở lớp bùn, xác các hợp chất hữu cơ lắng đọng nhiều.
Ngồi ra, pH của mơi trƣờng cũng ảnh hƣởng đáng kể đến sự phân bố của xạ
khuẩn, thƣờng thì trong mơi trƣờng trung tính hoặc hơi kiềm, mật độ xạ khuẩn cao
hơn so với các mơi trƣờng có độ pH quá cao hoặc quá thấp. Xạ khuẩn thƣờng hoạt
động ở pH cao hơn so với nấm [6].
Xạ khuẩn đƣợc nghiên cứu một cách sâu sắc vì chúng có ý nghĩa quan trọng

trong tự nhiên: tích cực tham gia vào các q trình chuyển hố nhiều hợp chất trong
đất, trong nƣớc, chúng có vai trị rất quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất
trong tự nhiên. Chúng sử dụng axit humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác
trong đất. Bên cạnh đó chúng cịn sản sinh nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng

3


/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

nên đã đƣợc dùng để sản xuất nhiều loại enzim nhƣ proteaza, amilaza, xenlulaza,
glucoizomeraza, vitamin và các axít hữu cơ [3]. Do có các loại enzim này nên
chúng cũng có khả năng phân giải các hợp chất bền vững nhƣ kitin, xenluloza,
lignin…. Một đặc điểm quan trọng của xạ khuẩn là khả năng sinh chất kháng sinh.
60-70% xạ khuẩn phân lập đƣợc từ đất có khả năng này. Trong số khoảng 8000
chất kháng sinh hiện đã đƣợc biết đến trên thế giới thì trên 80% là do xạ khuẩn
[17]. Chúng sống trên rễ cây hoặc củ và gây bệnh, nhất là ở vùng đất kiềm, đất cát
khi thời tiết khô hạn, làm cho củ lở loét, sần sùi ngay từ ngoài đồng ruộng. Một số
xạ khuẩn (thuộc chi Frankia) có thể tạo nốt sần trên rễ một số cây khơng thuộc bộ
đậu và có khả năng cố định Nitơ khơng khí thành dạng dễ sử dụng cho cây. Các
chủng Streptomyces spp. sinh độc tố phytotoxin ảnh hƣởng lớn tới mùa vụ, do
chúng có thể tồn tại trong đất trên 10 năm [3, 6].
1.1.2. Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới
Trƣớc đây, vị trí phân loại của xạ khuẩn luôn là câu hỏi gây nhiều tranh luận
giữa các nhà vi sinh học do nó có những đặc điểm vừa giống vi khuẩn, vừa giống
nấm. Trƣớc thế kỉ 19, xạ khuẩn đƣợc xếp vào nhóm nấm. Về sau, khi đã nghiên cứu
sâu hơn ngƣời ta đã tìm ra các bằng chứng về mối liên hệ giữa xạ khuẩn và vi
khuẩn nhƣ:
- Một số xạ khuẩn nhƣ các loài thuộc chi Actinomyces và Nocardia rất giống

với các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Corynebacterium.
- Xạ khuẩn giống vi khuẩn ở chỗ khơng có nhân thật, chúng chỉ chứa nhiễm
sắc chất phân bố dọc theo các sợi hoặc các tế bào.
- Đƣờng kính của sợi xạ khuẩn và bào tử giống với vi khuẩn. Đồng thời xạ
khuẩn thƣờng khơng chứa vách ngăn.
- Xạ khuẩn là đích tấn công của các thực khuẩn thể giống nhƣ vi khuẩn,
trong khi đó, nấm khơng bị tấn cơng bởi thực khuẩn thể.
- Xạ khuẩn thƣờng nhạy cảm với các kháng sinh có tác dụng lên vi khuẩn
nhƣng lại thƣờng kháng với những kháng sinh tác dụng lên nấm nhƣ các polyen.

4


/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

- Xạ khuẩn chứa chitin, chất có mặt trong sợi và bào tử của nhiều nấm, mà
khơng có ở vi khuẩn. Đồng thời giống nhƣ phần lớn vi khuẩn, xạ khuẩn không
chứa xenluloza.
- Tƣơng tự với vi khuẩn, xạ khuẩn nhạy cảm với phản ứng axít của mơi
trƣờng, đặc điểm này khơng có ở nấm.
- Các đặc điểm về sợi và nang bào tử lớn (sporangium) của chi Actinoplanes
cho thấy có thể chi này là cầu nối giữa vi khuẩn và các nấm bậc thấp.
Từ những đặc điểm trên (về nhân nguyên thuỷ, kích thƣớc nhỏ bé...) nên
ngƣời ta đã xếp xạ khuẩn vào nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria).
Vị trí của nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) đƣợc xác định nhƣ sau: Năm
1978, Gibbbens và Murray chia các vi khuẩn nhân nguyên thuỷ thành 4 ngành là
ngành Gracilicutes (gồm các vi khuẩn Gram âm), ngành Tenericute (gồm xạ khuẩn
và các vi khuẩn Gram dƣơng), ngành Mendosicutes gồm các vi khuẩn không chứa
Peptidoglican trong thành tế bào, và ngành Mollicutes gồm các vi khuẩn chƣa có

thành tế bào.
Năm 1977 và 1980, Woese và cộng sự chia vi khuẩn nhân nguyên thuỷ thành
2 giới là giới vi khuẩn thật (Eubacteria) (tƣơng đƣơng với 3 ngành Gracilicutes,
Tenericute, Mollicutes theo Gibbbens và Murray) và giới vi khuẩn cổ
(Archaebacteria) (tƣơng đƣơng với ngành Mendosicutes)[3].
Xạ khuẩn thuộc về nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), lớp Actinobacteria, bộ
Actinomycetales, bao gồm 10 dƣới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài. Hiện nay, 478
loài đã đƣợc công bố thuộc chi Streptomyces và hơn 500 lồi thuộc tất cả các chi
cịn lại đƣợc xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm.
1.2. ĐẶC ĐIỂM VÀ CẤU TẠO CỦA XẠ KHUẨN
1.2.1. Đặc điểm hình thái
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn đặc biệt. Trên môi trƣờng đặc xạ khuẩn phát
triển thành những khuẩn lạc khơ, kích thƣớc khuẩn lạc thay đổi tùy từng loại và
điều kiện hoàn cảnh. Khuẩn lạc xạ khuẩn không trơn ƣớt nhƣ ở vi khuẩn, nấm men
mà thƣờng có dạng thơ ráp, có các nếp toả ra theo hình phóng xạ vì vậy mới có tên
gọi là xạ khuẩn (actinomycetes, tiếng Hi Lạp: Aktis là “tia”, mykes là “nấm”).

5


/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Khuẩn lạc xạ khuẩn thƣờng chắc (dùng que cấy không di đƣợc khuẩn lạc của xạ
khuẩn vì khuẩn ty cơ chất bám sâu trong thạch). Mặt khuẩn lạc xù xì, có dạng da,
dạng vơi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc của xạ khuẩn khơng thể lẫn
với khuẩn lạc của nấm vì khuẩn ty của xạ khuẩn thƣờng mảnh hơn của nấm mốc
(khuẩn ty cơ chất 0,8µm; khuẩn ty khí sinh 1,14µm), đƣờng kính khuẩn ty nấm có
thể lớn hơn 10 lần đƣờng kính khuẩn ty của xạ khuẩn [3].
Khuẩn lạc xạ khuẩn thƣờng có 3 lớp: lớp vỏ ngồi là các sợi bện chặt, lớp

trong tƣơng đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn ty trong mỗi lớp có hoạt
tính sinh học khác nhau. Các sản phẩm trong qúa trình trao đổi chất nhƣ: chất
kháng sinh, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ… đƣợc tích lũy trong mỗi lớp khác
nhau. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, lam, tím tùy
thuộc vào loại và điều kiện ngoại cảnh. Có loại xạ khuẩn có thể tạo sắc tố tan trong
môi trƣờng nuôi cấy, thƣờng gặp các loại mang màu: xanh, tím, đỏ, da cam, vàng,
lục, nâu và đơi khi màu đen. Có sắc tố tan trong nƣớc, có sắc tố chỉ tan trong dung
mơi hữu cơ [3, 6, 34].
1.2.2. Cấu tạo của xạ khuẩn
Xạ khuẩn giống nấm mốc ở chỗ có thể tạo thành hệ sợi, nhƣng lại là cơ thể
đơn bào, khơng có nhân thực (procariotic) và có kích thƣớc giống vi khuẩn. Cấu
trúc khuẩn lạc xạ khuẩn đƣợc phân biệt ở hƣớng sinh trƣởng trong và ngồi mặt
mơi trƣờng thạch tạo thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn ty cơ chất
(substrate mycelium) cắm sâu vào môi trƣờng để lấy nƣớc và thức ăn. Khuẩn ty cơ
chất phát triển một thời gian thì dài ra trong khơng khí thành khuẩn ty khí sinh
(aerial mycelium). Ngƣời ta gọi khuẩn ty khí sinh là khuẩn ty thứ cấp để phân biệt
với khuẩn ty sơ cấp phát triển từ các bào tử nảy mầm. Nhiều loại chỉ có khuẩn ty cơ
chất nhƣng cũng có loại (nhƣ chi Sporichthya) lại chỉ có khuẩn ty khí sinh. Khuẩn
ty khí sinh phát triển ra ngồi khơng khí và thƣờng phần cuối các khuẩn ty này biến
thành cuống sinh bào tử. Loại khuẩn ty không mang bào tử gọi chung là khuẩn ty
dinh dƣỡng. Khuẩn ty xạ khuẩn mảnh hơn khuẩn ty nấm mốc, và có đƣờng kính
thay đổi trong khoảng từ 0,2-1,0µm đến 2-3µm. Đa số xạ khuẩn có khuẩn ty khơng

6


/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

có vách ngăn và khơng tự đứt đoạn. Một số xạ khuẩn có bao sợi là một bao mỏng

bọc bên ngồi khuẩn ty khí sinh, có thể thấy rất rõ khi phân hố thành bào tử [3].
* Màng tế bào xạ khuẩn khá phức tạp: gồm có thành tế bào và màng tế bào:
- Thành tế bào xạ khuẩn (CW) có dạng kết cấu lƣới, dày khoảng 10-20nm,
có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty và bảo vệ tế bào. Căn cứ vào kết cấu
hoá học ngƣời ta chia thành tế bào xạ khuẩn thành 4 nhóm:
Nhóm

CW

I:

Có

chứa

L,

L-DAP

và

Glixin

(Streptomyces,

Streptoverticillium, Sporichthya, Nocardioides)
Nhóm CW II: Có chứa mezo-DAP và Glixin.
Nhóm CW III: Có chứa mezo-DAP.
Nhóm CW IV: Có chứa mezo- DAP, arbinoza và galactoza [3, 29].
Thành tế bào xạ khuẩn chủ yếu chia thành 3 lớp: lớp ngồi dày 60-120Å, khi

già có thể dày tới 150Å; lớp giữa rắn chắc dầy 50Å và lớp trong dày 50Å. Thành tế
bào cấu tạo chủ yếu từ các lớp glucopeptit gồm các gốc N-axetylglucozamin liên
kết với N-axetylmuzamic bởi liên kết 1,4-glucozit. Khi xử lý bằng lizozim các liên
kết này bị phá vỡ, thành tế bào bị phá huỷ và màng nguyên sinh chất bao bọc phần
còn lại của tế bào tạo thành tế bào trần (protoplast). Cấu trúc sợi cũng mất đi khi xử
lý bằng hỗn hợp eter, clorofoc và các dung mơi hồ tan lipit. Điều đó chứng tỏ lớp
ngồi thành tế bào xạ khuẩn có cấu tạo bằng lipit. Thành tế bào xạ khuẩn không
chứa xenluloza hay kitin [3, 6, 13].
Đối với xạ khuẩn phân lập từ vùng ngập mặn, chúng có thành tế bào dày và
độ bền cơ học cao để có thể chống chịu với mơi trƣờng khắc nghiệt bên ngồi
(nồng độ muối trung bình 3-4%, pH 6,8 - 8,5 và nhiệt độ dao động từ 20-35 C). Ở
pH trung tính và kiềm nhƣ ở biển, so với xạ khuẩn trung tính, thành tế bào của xạ
khuẩn chịu kiềm ngồi peptitdoglycan cịn chứa nhiều polyme axit nhƣ là axit
galacturonic, axit gluconic, axit glutamic, axit asparic và axit photphoric. Với điện
tích âm tạo bởi thành phần axit khơng thuộc peptidoglican, bề mặt tế bào có thể hấp
thụ đƣợc ion Na+ và H+ trong khi đẩy ion OH-. Bên cạnh đó, tuy cấu trúc lớp
peptitdoglycan là giống nhau ở xạ khuẩn trung tính và chịu kiềm nhƣng lại khác

7


/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

nhau về thành phần các hợp chất cấu thành, xạ khuẩn ƣa kiềm chứa nhiều
hesosamin và axit amin [25].
- Màng tế bào chất nằm dƣới lớp thành tế bào, dày 7,5-10,0 nm. Chúng có
cấu trúc và chức năng tƣơng tự nhƣ màng tế bào chất của vi khuẩn: chủ yếu gồm 2
thành phần là photpholipit và protein; màng chứa nhiều enzym có vai trị đặc biệt
quan trọng trong quá trình vận chuyển và trao đổi chất qua màng [6].

* Thể trung gian (mezoxom) nằm ở phía trong màng tế bào chất, có hình
phiến, hình bọng hay hình ống. Cơng dụng của thể trung gian là làm tăng diện tích
tiếp xúc của màng tế bào chất và do đó tăng cƣờng hoạt tính enzim, tăng chuyển
điện tử...[3].
* Các vật thể ẩn nhập nằm trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm có các hạt
poliphotphat (hình cầu, bắt mầu với thuốc nhuộm Soudan III), các hạt polisaccarit
(bắt màu với dung dịch Lugol) [3].
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram (+), “nhân” của xạ khuẩn cùng loại với
nhân của “vi khuẩn”, nhƣng khác với nhóm vi sinh vật khơng có nhân thực khác là
tỉ lệ G+C cao (>70%) trong khi đó ở vi khuẩn là 25 - 40%.
Một trong những đặc điểm đáng lƣu tâm của xạ khuẩn là chúng không bền
vững về di truyền và thƣờng xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử ADN. Điều này
gây ra một số hiện tƣợng kì lạ khác: tạo ra tính đa dạng của hình thái, tính kháng
thuốc do sự xuất hiện các dị vòng [3, 6, 23].
1.2.3. Sự sinh trƣởng và phát triển
Mặc dù xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ nhƣng chúng thƣờng sinh
trƣởng dƣới dạng sợi và thƣờng tạo nhiều bào tử. Một đoạn khuẩn ty (mầm xạ
khuẩn) hoặc 1 bào tử xạ khuẩn khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ trƣơng lên, sau 1-2
giờ xuất hiện quá trình tổng hợp ARN, nhân các gen cần thiết từ genome và tiến
hành tổng hợp protein và nhƣ vậy hình thành khuẩn ty sơ cấp. Đầu khuẩn ty sơ cấp
kéo dài và phát triển theo phƣơng pháp mọc chồi phân nhánh. Độ dài khuẩn ty xạ
khuẩn trong giai đoạn phát triển khoảng 11µm/1giờ và “nhân” của tế bào xạ khuẩn
sắp xếp đều đặn theo chiều dài của khuẩn ty [6].

8


/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dƣỡng. Chúng sử dụng nguồn cacbon là tinh
bột, rƣợu, axit hữu cơ, polysacarit, lipit, axit amin, protein và nhiều hợp chất hữu cơ
khác. Nguồn nitơ vô cơ thƣờng là: nitrat, muối amon…, nitơ hữu cơ: pepton,
protein, cao ngơ, cao nấm men… Khả năng đồng hố các chất ở các loài hay chủng
xạ khuẩn khác nhau là khác nhau. Phần lớn chúng là các vi sinh vật ƣa khí và ƣa
ẩm. Xạ khuẩn ƣa nhiệt thƣờng ít gặp, phần lớn xạ khuẩn phát triển tốt ở môi trƣờng
trung tính và hơi kiềm [6].
Trong mơi trƣờng dịch thể, q trình sinh trƣởng, phát triển của xạ khuẩn
chia làm 4 pha:
- Pha lag: sinh khối tăng không đáng kể.
- Pha log: lƣợng sinh khối tăng theo hàm log, ở cuối pha này có sự tổng hợp
các sản phẩm bậc hai nhƣ chất kháng sinh.
- Pha cân bằng: ở pha này sinh khối khơng tăng, hầu hết lƣợng dinh dƣỡng
cịn lại trong môi trƣờng đều đƣợc sử dụng cho việc tổng hợp chất kháng sinh.
- Pha suy tàn: sinh khối giảm nhanh, lƣợng chất kháng sinh cũng giảm.
Tế bào xạ khuẩn phân chia theo kiểu amitoz (phân bào vô sắc) - đó cũng là
tính chất đặc trƣng của vi khuẩn. Thời gian phân đôi tế bào ở xạ khuẩn nuôi cấy
trong mơi trƣờng lỏng khoảng 90 phút (trong khi đó ở vi khuẩn là 20-40 phút) [6].
1.2.4. Sự hình thành bào tử
Xạ khuẩn sinh sản bằng cách tạo bào tử. Khuẩn ty khí sinh phát triển ra
ngồi khơng khí và thƣờng phần cuối các khuẩn ty này biến thành cuống sinh bào
tử. Hai dạng cuống sinh bào tử (sporophore) và cuống sinh nang bào tử
(sporangiophorres) có thể riêng rẽ, có thể phân nhánh.
Cuống sinh bào tử (sporophore) hình thành bào tử trần (conidia hay
conidiospores). Các chuỗi bào tử trần có thể chỉ là 1 bào tử, có thể có 2 bào tử, có
thể là chuỗi ngắn hoặc dài, có thể các bào tử trần nằm trên bó sợi (synnema), tƣơng
tự bó sợi của nấm.
Cuống sinh nang bào tử (sporangiophorres) mang bào tử kín (sporangiospores) nằm trong túi (nang) bào và bào tử di động [3].

9

/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Hình thái, kích thƣớc của cuống sinh bào tử và bào tử là một đặc điểm quan
trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn.
Cuống sinh bào tử thƣờng có dạng thẳng (R) hay hơi cong (F), dạng xoắn lị
so (kí hiệu S) xoắn đơn giản hình móc câu (RA). Cuống sinh bào tử dạng xoắn có
chiều dài và số vịng khác nhau. Cuống sinh bào tử dạng thẳng có thể là dài hoặc
ngắn với các dạng lơng cứng hoặc có thể thon lại, uốn cong hay kéo dài. Những đặc
điểm này rất quan trọng khi định tên xạ khuẩn. Cuống sinh bào tử xạ khuẩn hình
thành bào tử theo 3 phƣơng thức sau:
- Phƣơng thức phát triển toàn bộ: toàn bộ hay một bộ phận của khuẩn ty hình
thành ra các thành của bào tử.
- Phƣơng thức phát triển trong thành: thành bào tử sinh ra từ tầng nằm giữa
màng nguyên sinh chất và thành khuẩn ty. Trƣờng hợp này gặp ở Planomonospora.
- Phƣơng thức phát triển bào tử nội sinh thật: thành khuẩn ty khơng tham gia
vào q trình hình thành bào tử. Trƣờng hợp này gặp ở Thermoactinomycetes [3].
- Hình thái bảo tử cũng là một đặc điểm quan trọng trong định tên xạ khuẩn.
Bào tử trần (conodiospore) của xạ khuẩn có thể có hình trịn, hình bầu dục, hình
que, hình trụ. Bề mặt bào tử xạ khuẩn có dạng trơn nhẵn, xù xì, có vẩy, có gai, có
lơng. Bào tử trần là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bào tử trần đƣợc hình
thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo hai phƣơng thức
khác nhau:
- Vách ngăn hình thành dần từ phía trong của màng tế bào và tiến dần vào
trong tạo ra những vách ngăn khơng hồn chỉnh, sau đó sợi bào tử mới phân cắt
thành các bào tử trần.
- Thành tế bào và màng tế bào đồng thời xuất hiện vách ngăn tiến dần vào
phía trong làm cho sợi bào tử phân cắt, đồng thời tạo thành chuỗi bào tử trần [3].

Muốn kích thích hình thành bào tử, trƣớc hết phải kích thích sự sinh trƣởng
của khuẩn ty khí sinh. Ví dụ khi nghiên cứu 6 chủng S. griseus, Kalakoutski và
Agre (1973) nhận thấy muốn kích thích khuẩn ty khí sinh nên sử dụng các mơi
trƣờng có bổ sung pepton, NaCl và glixerin. Một số tác giả khác cho rằng việc bổ
sung CaCO3 và CaCl2 vào mơi trƣờng cũng kích thích q trình hình thành bào tử ở

10


/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

xạ khuẩn. Tuy nhiên việc bổ sung các nguyên tố vào môi trƣờng phải đƣợc nghiên
cứu kỹ và chỉ sử dụng ở nồng độ nhất định. Mơi trƣờng ni cấy nghèo dinh dƣỡng
sẽ kích thích hình thành bào tử ở xạ khuẩn cịn mơi trƣờng ni cấy giàu dinh
dƣỡng thì q trình sinh bào tử thƣờng bị kìm hãm. Độ ẩm và nhiệt độ cũng có ảnh
hƣởng đến sự hình thành bào tử [6].
Ở các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh thuộc chi Streptomyces, khả
năng sinh kháng sinh liên quan đến sự hình thành bào tử đƣợc thể hiện rất rõ. Trong
nhiều trƣờng hợp khi kích thích hình thành bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp chất
kháng sinh giảm đi. Khi nghiên cứu đột biến và chọn lọc chủng xạ khuẩn sản xuất
oxytetraxylin và streptomyxin ngƣời ta nhận thấy nếu sự hình thành bào tử kém thì
khă năng sinh tổng hợp kháng sinh lại tăng. Đây cũng là đặc điểm cần lƣu ý khi
nghiên cứu chọn lọc các chủng có hoạt tính cao. Nhƣ vậy, sự hình thành bào tử và
khả năng sinh kháng sinh ở xạ khuẩn có mối quan hệ nghịch [16, 24].
1.2.5. Sinh tổng hợp chất kháng sinh
Xạ khuẩn là nhóm sinh vật có khả năng sinh kháng sinh cao, 60 - 70% xạ
khuẩn phân lập đƣợc từ đất có khả năng này. Trong số 9000 chất kháng sinh đã
đƣợc biết đến trên thế giới thì trên 80% là do xạ khuẩn sinh ra. Chi Streptomyces là
chi quan trọng nhất trong nhóm xạ khuẩn, với trên 500 lồi đã đƣợc miêu tả. Chi

này có nhiều lồi có khả năng sinh kháng sinh, một trong số các kháng sinh rất
quan trọng là Streptomycin do S. griseus sinh ra. Khả năng sinh chất kháng sinh là
kết quả của quá trình đối kháng giữa các vi sinh vật và thúc đẩy quá trình tiến hoá
của xạ khuẩn [17].
Chất kháng sinh là chất trao đổi bậc 2, thơng thƣờng đƣợc hình thành ở cuối
pha sinh trƣởng, trong pha cân bằng. Ở xạ khuẩn, sinh tổng hợp chất kháng sinh có
quan hệ nghịch với sự hình thành bào tử. Đó là điểm cần lƣu ý trong khi nghiên
cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn [12].
Đối với sinh tổng hợp chất kháng sinh ở xạ khuẩn, ngƣời ta thƣờng mô tả hai
pha: pha sinh trƣởng (trophophase): khuẩn ty sơ cấp phát triển nhanh với nguyên
sinh chất đồng nhất làm giảm nguồn cacbon, nitơ và pH; pha sinh tổng hợp
(idiophase): sinh trƣởng chậm lại đôi khi xuất hiện quá trình tự tan của khuẩn ty và

11


/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

sinh tổng hợp chất kháng sinh mạnh [6, 16]. Cũng có tác giả chia sự phát triển của
giống thành 4 hoặc 6 pha theo các đặc điểm sinh hoá tế bào. Trong một số trƣờng
hợp quá trình sinh học này lại diễn ra mạnh mẽ trong pha sinh trƣởng nhƣ trƣờng
hợp của chủng xạ khuẩn Saccharothrix sp. SA 103 phân lập từ Sahara của Algeria,
sinh kháng sinh mutactimycin PR (Anthracycline mới). Quá trình tƣơng tự cũng đã
thấy ở chủng Saccharothrix sp. SA 233 sinh dithiolopyrrolone và chủng S.
clavuligerus sinh axit clavulanic [12,30].
Mặc dù chất kháng sinh có cấu trúc khác nhau và vi sinh vật sinh ra nó cũng
đa dạng nhƣng q trình sinh tổng hợp chúng dƣờng nhƣ theo một số con đƣờng
nhất định. Các con đƣờng này chỉ là sự cải biên các con đƣờng sinh tổng hợp của tế
bào. Các vật liệu ban đầu của của qúa trình chuyển hố chất trao đổi bậc hai (chất

kháng sinh) là những chất trao đổi sơ cấp. Chất kháng sinh đƣợc tổng hợp từ 1, 2
hoặc 3 chất trao đổi bậc nhất, hoặc có thể là trùng hợp các hợp chất bậc nhất rồi
biến đổi chúng bằng các enzim. Mọi con đƣờng sinh tổng hợp chất kháng sinh đều
có sự tham gia của các enzim hoặc hệ thống enzim đặc biệt. Các enzim này đƣợc
mã hoá bởi các gen nằm trong những cụm (cluster) trên nhiễm sắc thể hoặc trên
plasmit. Ví dụ tổng hợp chlotetraxyclin ở S. aureofaciens có 3 hệ thống enzim (hay
hệ thống gen) tham gia: hệ thống 1 với hơn 200 gen mã cho các enzim chuyển
glucoza thành axetyl-CoA; hệ thống 2 chuyển axetyl-CoA thành malonyl-CoA; hệ
thống 3 chuyển malonyl CoA thành chlotetracyclin. Tổng số gen ở 3 hệ thống liên
quan tới tổng hợp chlotetracyclin lên tới 2000 gen [16,31,32,35].
Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn rất phong phú và đa dạng, nguyên nhân là 1
loại kháng sinh có thể do nhiều loài vi sinh vật khác nhau tổng hợp ra, cũng có khi
1 loại vi sinh vật tạo ra nhiều loại kháng sinh khác nhau [31, 32]. Ví dụ, có tới 27
chủng xạ khuẩn khác nhau có thể tổng hợp đƣợc kháng sinh oxytetraxyclin, hay
Streptomyces rimosus cùng lúc có thể tổng hợp đƣợc oxytetracylin và rimicidin.
Ngày nay số lƣợng chất kháng sinh đƣợc sản xuất từ xạ khuẩn tăng lên đáng kể, rất
nhiều trong số đó đã đƣợc sản xuất ở quy mơ thƣơng mại, có ý nghĩa lớn trong y
học và mang lại nhiều lợi nhuận.

12


/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

1.3. PHÂN LẬP CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH TỔNG HỢP CHẤT
KHÁNG SINH ỨNG DỤNG TRONG NÔNG NGHIỆP
1.3.1. Phân lập các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh
Nhu cầu về các chất kháng sinh sử dụng trong nông nghiệp hiện nay rất lớn
do sự xuất hiện của nhiều tác nhân gây bệnh mới, cùng với hiện tƣợng kháng thuốc

kháng sinh ngày càng phổ biến. Việc tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng
đối kháng các chủng vi sinh vật gây bệnh trên cây trồng sẽ giúp hạn chế thuốc hóa
học mà vẫn có tính an tồn cao [31,32,33].
Một trong những chính sách nhằm tách và tinh sạch các chất kháng sinh mới
với mong muốn là khám phá các hệ sinh thái đặc biệt, nhƣ ở tầng nƣớc sâu, vùng
biển có nồng độ muối cao hay vùng khí hậu khơ cằn. Từ năm 1975 đến 1994, một
số loài xạ khuẩn mới đã đƣợc phân lập và mô tả nhƣ Actinopolyspora halophila,
Actinopolyspora mortivalis và Actinopolyspora. Trong nỗ lực tìm kiếm những chất
kháng sinh mới, gần đây các nhà khoa học đã phân lập đƣợc một chủng xạ khuẩn kí
hiệu Actinopolyspora AH1 ở Alibag, một vùng biển ở phía tây Ấn Độ. Chủng này
thuộc chi Actinopolyspora, có đặc điểm ƣa mặn (sinh trƣởng ở nồng độ muối 815%w/v) và sinh trƣởng tối ƣu ở pH 7,6. Chủng này khác với tất cả các chủng
trong chi Actinopolyspore đã đƣợc mô tả trƣớc đây nên đƣợc coi là một chủng mới
[15, 20]. Năm 1928, Fleming tình cờ phát hiện ra nấm Penicilium sinh kháng sinh
penicilin. Nhƣng ngày nay, cũng nhƣ các loại vi sinh vật sinh chất kháng sinh khác,
xạ khuẩn đƣợc tìm ra theo quy trình tuyển chọn có hệ thống và cân nhắc kỹ lƣỡng,
thƣờng tuân theo sơ đồ nhất định.
Tuy nhiên, hiếm khi phân loại đƣợc một chủng từ tự nhiên có khả năng sinh
kháng sinh cao đạt yêu cầu cho sản xuất thƣơng mại, do đó cơng việc tuyển chọn
giống ln gắn liền với những thành tựu của di truyền học và đặc biệt là các
phƣơng pháp làm đột biến lí hố, kỹ thuật khuếch đại gen nhờ plasmit. Kết quả của
những nghiên cứu cơ bản này đã giúp cho việc lựa chọn những giống có hoạt lực
cao trong các điều kiện ni cấy ổn định và hình thành quy trình cơng nghệ áp
dụng trong sản xuất có quy mơ rộng lớn [1, 9].
1.3.2. Phân loại và định tên xạ khuẩn

13


/>
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Trong số xạ khuẩn đã đƣợc đặt tên thì Actinomyces Hart là lồi lâu đời nhất.
Actinomyces israeli đƣợc coi là chủng xạ khuẩn kị khí thuần chủng đầu tiên (1889),
vì trƣớc khi phát triển phƣơng thức giữ giống đơng khơ thì khó có thể bảo quản vi
sinh vật lâu dài và nhiều chủng giống đã bị thất lạc. Do vậy khơng có chủng xạ
khuẩn nào đƣợc tìm ra sớm hơn các chủng mà Waksman phát hiện và lƣu trong
danh mục Bộ sƣu tập giống của ơng (1916-1919). Cho đến nay, có thêm rất nhiều
chủng xạ khuẩn đƣợc lƣu trong danh mục giống xạ khuẩn [6, 14].
Ba phƣơng pháp phân loại xạ khuẩn là phƣơng pháp phân loại truyền thống,
phƣơng pháp phân loại bằng kỹ thuật phân tử và phân loại số.
a)

Phương pháp phân loại truyền thống

Krainski (1914) lần đầu tiên đề ra các chỉ tiêu về đặc điểm sinh lí và coi đó
là mấu chốt trong nguyên tắc phân loại để sơ bộ phân loại 17 chủng thuộc chi
Actinomyces. Waksman và Curtis (1916), Waksman (1919) đã đề cập đến những
dạng trung gian trong mô tả phân loại của mình và coi đặc điểm hình thái của bào
tử là đặc tính quan trọng của các cá thể. Do vậy họ đã đƣa ra một số lồi mới có ý
nghĩa. Tiếp đó Millard và Burr (1926) tìm ra 17 lồi, Jensen (1930-1931) – 2 lồi,
Dunche (1934) – 13 loài. Baldacci và cộng sự đã bắt đầu nghiên cứu xạ khuẩn từ
năm 1936 và đến năm 1953 cơng bố một khố phân loại chi Streptomyces dựa trên
cơ sở màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và một số đặc điểm trung gian
khác nhau [11]. Năm 1943, Waksman và Henrici đã đƣa ra một số hệ thống phân
loại và đến năm 1961 có sửa đổi [36]. Trong hệ thống này, xạ khuẩn đƣợc xếp
thành nhóm gồm 3 họ, chia nhỏ thành 10 chi và mô tả chi tiết hơn 250 loài thuộc
chi Streptomyces. Krassilnikov là một trong những chuyên gia nổi tiếng về nghiên
cứu và phát triển khoá phân loại xạ khuẩn. Từ năm 1941 đến năm 1949 ơng đã phát
triển 38 lồi mới. Năm 1970, ông lại công bố hệ thống phân loại mới dựa trên hệ
thống đã cơng bố năm 1949. Trong đó xạ khuẩn đƣợc phân chia thành 6 họ, gồm 26

chi. Theo ông Actinomyces đƣợc dùng nhƣ một tên gọi chung cho những loài thuộc
chi Streptomyces mà Waksman và Henrici đã phác hoạ năm 1943 [14].
Một số nhà nghiên cứu ngƣời Đức (Flaig và cộng sự, 1952; Flaig và
Kutzner, 1954; Kuster và Geiuz, 1955) cho rằng chi Streptomyces là một nhóm lớn.

14