Xây dựng quy trình phân tích đồng thời sáu hợp chất giảm glucose huyết ngụy tạo trong thuốc dược liệu và thực phẩm chức năng bằng phương pháp hplc pda

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
-----------------

BỘ Y TẾ

PHAN TRẦN NHƯ NGUYỆT

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI
SÁU HỢP CHẤT GIẢM GLUCOSE HUYẾT NGỤY TẠO TRONG
THUỐC DƢỢC LIỆU VÀ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC-PDA

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
-----------------

BỘ Y TẾ

PHAN TRẦN NHƯ NGUYỆT

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI
SÁU HỢP CHẤT GIẢM GLUCOSE HUYẾT NGỤY TẠO
TRONG THUỐC DƢỢC LIỆU VÀ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG
PHƢƠNG PHÁP HPLC-PDA

Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất
Mã số: 8720210

Luận văn Thạc sĩ Dược học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC TUẤN

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2020


LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả được
trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng
trình nào khác.

Người cam đoan

Phan Trần Như Nguyệt


Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dƣợc học – Năm học: 2018 – 2020
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI SÁU HỢP CHẤT GIẢM
GLUCOSE HUYẾT NGỤY TẠO TRONG THUỐC DƢỢC LIỆU VÀ THỰC PHẨM
CHỨC NĂNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC-PDA
Phan Trần Nhƣ Nguyệt
Thầy hƣớng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn
Từ khóa: metformin, phenformin, glibenclamid, gliclazid, glimepirid, glipizid, chất ngụy
tạo, thuốc dược liệu, thực phẩm chức năng, HPLC-PDA.
Mở đầu: Hiện nay, việc kiểm tra sự pha trộn các hợp chất giảm glucose huyết trong thực

phẩm chức năng (TPCN) và thuốc dược liệu điều trị đái tháo đường vẫn chưa được kiểm soát
chặt chẽ. Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào trong nước cơng bố quy trình phân tích đồng
thời một số hợp chất giảm glucose huyết như metformin, glibenclamid, gliclazid, glimepirid,
glipizid,… ngụy tạo trong thuốc dược liệu và TPCN bằng phương pháp HPLC-PDA. Với
những lý do trên, đề tài này được thực hiện nhằm làm cơ sở để các Trung tâm Kiểm nghiệm
Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm thành phố/ tỉnh kiểm tra sự pha trộn trái phép các hợp chất này,
đảm bảo người bệnh được sử dụng thuốc và TPCN có chất lượng, an toàn và hiệu quả.
Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Metformin, phenformin, glibenclamid, gliclazid, glimepirid và
glipizid ngụy tạo trong thuốc dược liệu và TPCN sử dụng cho bệnh nhân đái tháo đường.
Phương pháp nghiên cứu: Tiến hành thống kê các thành phần dược liệu và tần suất xuất hiện
trong thuốc dược liệu và TPCN, từ đó tạo mẫu giả lập trong phịng thí nghiệm. Tiến hành
khảo sát các điều kiện sắc ký ảnh hưởng đến hiệu quả tách của phương pháp như: pha động
và nồng độ acid phosphoric, chương trình rửa giải gradient, nhiệt độ cột; các điều kiện ảnh
hưởng đến hiệu suất chiết như: dung môi chiết, phương pháp chiết, số lần chiết và thời gian
chiết. Sau đó, tiến hành thẩm định quy trình phân tích theo hướng dẫn của ICH và AOAC.
Quy trình sau khi được thẩm định sẽ được ứng dụng để kiểm tra các hợp chất giảm glucose
huyết ngụy tạo trong thuốc dược liệu và thực phẩm chức năng sử dụng cho bệnh nhân đái
tháo đường trên địa bàn tỉnh Tây Ninh.
Kết quả và bàn luận
Đã xác định được thành phần dược liệu có trong thuốc dược liệu và thực phẩm chức năng sử
dụng cho bệnh nhân đái tháo đường trên địa bàn tỉnh Tây Ninh để tạo mẫu giả lập. Đã xây
dựng được quy trình chiết các chất phân tích từ mẫu giả lập và điều kiện sắc ký phân tích
đồng thời metformin, phenformin, glibenclamid, gliclazid, glimepirid và glipizid như sau: cột
sắc ký InertSustain C18 (250 x 4,6 mm; 5,0 µm), đầu dị PDA, bước sóng phát hiện 230 nm,
pha động AcN – acid phosphoric 0,03% với chương trình rửa giải gradient, thể tích tiêm mẫu
10 µl, tốc độ dịng 1 ml/phút. Quy trình đã được thẩm định đạt tính phù hợp hệ thống, có tính
đặc hiệu, khoảng tuyến tính rộng, đạt yêu cầu về độ đúng và độ chính xác từ mức nồng độ
LOQ đến mức nồng độ 80 µg/ml, hiệu suất chiết cao (> 80%) và ổn định, giới hạn phát hiện
và giới hạn định lượng thấp (0,4 – 1,2 µg/ml). Kết quả kiểm tra 10 mẫu TPCN trên địa bàn

tỉnh Tây Ninh cho thấy có 1 mẫu chứa phenformin.
Kết luận: Quy trình phân tích đồng thời metformin, phenformin, glipizid, gliclazid,
glibenclamid và glimepirid bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA đã được xây dựng và
thẩm định, sử dụng chương trình rửa giải gradient và pha động khơng có dung dịch đệm. Quy
trình đã được ứng dụng để kiểm tra các hợp chất giảm glucose huyết trong một số thuốc dược
liệu và thực phẩm chức năng đang lưu hành trên địa bàn tỉnh Tây Ninh.


Master’s Thesis – Academic course: 2018 - 2020
Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210
SIMULTANEOUS DETERMINATION OF SIX CHEMICAL HYPOGLYCEMIC
AGENTS AS ILLEGAL ADULTERANTS TO TRADITIONAL HERBAL
MEDICINES AND FOOD SUPPLEMENTS BY HPLC-PDA
Phan Tran Nhu Nguyet
Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Nguyen Duc Tuan
Keywords: Metformin, phenformin, glibenclamide, gliclazide, glimepiride, glipizide, illegal
adulterants, herbal medicines, food supplements, HPLC-PDA.
Introduction: Nowadays, determination of chemical hypoglycemic agents illegally added to
traditional herbal medicines and food supplements has not been strictly controlled. Until now,
there have been no published local studies on simultaneous determination of some chemical
hypoglycemic agents such as metformin, glibenclamide, gliclazide, glimepiride, glipizide,…
illegally added to traditional herbal medicines and food supplements by HPLC-PDA.
Therefore, this study was carried out with the aim of supporting the Food, Cosmetic, and
Drug Quality Control Centers for quality control that contribute to ensure patients being used
efficacy, safety, and quality medicines and food supplements.
Materials and methods: Object of study: Metformin, phenformin, glibenclamide, gliclazide,
glimepiride and glipizide illegally added to traditional herbal medicines and food
supplements. Methods of study: The standardized samples were prepared basing on statistical
results of frequency of used herbs in formulation of traditional herbal medicines and food
supplements. The chromatographic conditions that impacts separation efficiency such as

mobile phase in gradient mode, column temperature, were investigated. Samples treatment
was investigated by changing method, solvent, duration, and frequency for extraction. Then,
the assay was validated basing on the guidelines of ICH and AOAC. Finally, the validated
method was applied to control chemical hypoglycemic agents illegally added to traditional
herbal medicines and food supplements as supported regime for diabetes mellitus in Tay
Ninh province.
Results: The standardized samples were formulated and the chemical hypoglycemic agents
added to the samples were extracted by methanol, and quantitatively determined by HPLCPDA. The chromatographic conditions are as follows: InertSustain C18 column (250 x 4.6
mm; 5.0 µm), mixture of acetonitrile and 0.03% phosphoric acid as mobile phase in gradient
mode, detection wavelength at 230 nm, column temperature at 30oC, flow rate of 1.0
ml/minute, and injection volume of 10 µl. Validation results showed that the method was
suitable for the HPLC system, selective, linear, accurate and precise from LOQ to high
concentration levels (80 µg/ml), high extraction recovery (> 80%), robust, and low LOD and
LOQ (0.4 – 1.2 µg/ml). The method was applied to control 10 available traditional herbal
medicines and food supplements in Tay Ninh province. As the results, nine registered
samples do not contain the above-mentioned chemical hypoglycemic agents, and one sample
without registration is detected phenformin as an illegal adulterant.
Conclusion: The HPLC-PDA method for simultaneous determination of metformin,
phenformin, glipizide, gliclazide, glibenclamide and glimepiride was successfully developed
and validated, using gradient mode and mobile phase without buffer. The proposed method
can be applied for quality control of chemical hypoglycemic agents illegally added to
traditional herbal medicines and food supplements in Tay Ninh province.


i

MỤC LỤC
Trang
TRANG PHỤ BÌA
LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC .................................................................................................................. i
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................... iii
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................v
DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................... vii
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................3
1.1. Tổng quan về thuốc dược liệu và thực phẩm chức năng .....................................3
1.2. Tổng quan sáu hợp chất giảm glucose huyết .......................................................5
1.3. Phương pháp xử lý mẫu các thuốc dược liệu và thực phẩm chức năng có ngụy
tạo ............................................................................................................................10
1.5. Một số quy trình định lượng hợp chất giảm glucose huyết ngụy tạo trong thuốc
dược liệu và thực phẩm chức năng ...........................................................................12
CHƢƠNG 2 – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................20
2.1. Đối tượng nghiên cứu – Nguyên vật liệu ...........................................................20
2.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................21
CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................30
3.1. Điều tra các thành phần dược liệu có trong thuốc dược liệu và thực phẩm chức
năng sử dụng cho bệnh nhân đái tháo đường trên địa bàn tỉnh Tây Ninh: ...............30
3.2. Tạo mẫu giả lập ..................................................................................................31
3.3. Xây dựng quy trình phân tích đồng thời sáu hợp chất giảm glucose huyết ngụy
tạo trong thuốc dược liệu và thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC ........32
3.4. Thẩm định quy trình ...........................................................................................42
3.5. Dự thảo quy trình định lượng đồng thời MET, PHEN, GLP, GLC, GLB và
GLM ngụy tạo trong thuốc dược liệu và thực phẩm chức năng bằng phương pháp
HPLC với đầu dò PDA..............................................................................................58


ii

3.6. Ứng dụng quy trình kiểm tra MET, PHEN, GLP, GLC, GLB và GLM ngụy tạo

trong một số thuốc dược liệu và thực phẩm chức năng được sử dụng cho bệnh nhân
đái tháo đường lưu hành trên địa bàn tỉnh Tây Ninh ................................................59
CHƢƠNG 4 – BÀN LUẬN .....................................................................................62
4.1. Tạo mẫu giả lập ..................................................................................................62
4.2. Quy trình xử lý mẫu và hiệu suất chiết ..............................................................62
4.3. Kỹ thuật phân tích áp dụng cho quy trình ..........................................................62
4.4. Quy trình phân tích đồng thời sáu hợp chất giảm glucose huyết trong thuốc
dược liệu và thực phẩm chức năng ...........................................................................63
CHƢƠNG 5 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................66
5.1. Kết luận ..............................................................................................................66
5.2. Kiến nghị ............................................................................................................67
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu,

Từ nguyên

Nghĩa tiếng Việt

chữ viết tắt
AcN

Acetonitrile

ADR

Adverse Drug Reaction

Phản ứng phụ của thuốc

AOAC

Association of Official Analytical

Hiệp hội các nhà hóa phân tích

Chemists

chính thống

Drug Information & Adverse

Thông tin thuốc và phản ứng

Drug Reaction

phụ của thuốc

Gas Chromatography

Sắc ký khí

DI&ADR

GC
GLB

Glibenclamid

GLC

Gliclazid

GLM

Glimepirid

GLP

Glipizid

HPLC

High Performance Liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chromatography
HPTLC

High Performance Thin Layer

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

Chromatography
HQC

High quality control

Mẫu kiểm tra nồng độ cao
(nồng độ cao)

ICH

International Conference on

Hội nghị hòa hợp quốc tế

Harmonization
IUPAC

International Union of Pure and

Hiệp hội Quốc tế về Hóa học

Applied Chemistry Nomenclature

thuần túy và ứng dụng

LC

Liquid Chromatography

Sắc ký lỏng

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Quantitation

Giới hạn định lượng


iv

LQC

Low quality control

Mẫu kiểm tra nồng độ thấp
(nồng độ thấp)

MET

Metformin

MQC

Medium quality control

Mẫu kiểm tra nồng độ trung
bình (nồng độ trung bình)

MS

Mass Spectrometry

Khối phổ

PDA

Photodiode Array

Dãy diod quang

PHEN

Phenformin

Ppb

Parts per billion

Phần tỷ

Ppm

Parts per million

Phần triệu

S/N

Signal/ Noise

Tín hiệu/ nhiễu

TB

Trung bình

TFA

Trifluoroacetic acid

TLTK

Tài liệu tham khảo

TPCN

Thực phẩm chức năng

UPLC

Ultra Performance Liquid

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

Chromatography
UV-Vis

Ultraviolet-Visible

Tử ngoại – Khả kiến


v

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Tóm tắt các quy trình định lượng hợp chất giảm glucose huyết ngụy tạo
trong thuốc dược liệu và thực phẩm chức năng ........................................................15
Bảng 2.1. Danh mục chất chuẩn ...............................................................................20
Bảng 2.2. Danh mục dung môi và hóa chất ..............................................................20
Bảng 2.3. Danh mục trang thiết bị ............................................................................21
Bảng 2.4. Giới hạn chấp nhận về độ đúng của phương pháp theo AOAC [13] .......27
Bảng 2.5. Giới hạn chấp nhận về độ chính xác của phương pháp theo AOAC [13]28
Bảng 3.1. Một số dược liệu thường dùng trong thuốc dược liệu và thực phẩm chức
năng được sử dụng cho bệnh nhân đái tháo đường ...................................................30
Bảng 3.2. Các dược liệu được sử dụng để tạo mẫu giả lập ......................................32
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát hệ dung môi pha động và nồng độ acid phosphoric .....33
(n = 2) ........................................................................................................................33
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát chương trình rửa giải gradient (n = 2) ..........................36
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát nhiệt độ cột (n = 3) .......................................................39
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát bước sóng phát hiện (n = 2)..........................................40
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát dung môi chiết (n = 2) ..................................................40
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát phương pháp chiết (n = 2) ............................................41
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát số lần chiết (n = 2) ........................................................41

Bảng 3.10. Kết quả khảo sát thời gian chiết (n = 2) .................................................42
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu chuẩn (n = 6) ...........43
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu thử giả lập (n = 6) ...43
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát LOD và LOQ của MET, PHEN, GLP, GLC, GLB và
GLM trong mẫu thử giả lập ......................................................................................48
Bảng 3.14. Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của MET, PHEN và GLP
(n = 2) ........................................................................................................................51
Bảng 3.15. Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của GLC, GLB và GLM
(n = 2) ........................................................................................................................51


vi

Bảng 3.16. Kết quả xử lý thống kê ...........................................................................52
Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độ đúng và độ chính xác của phương pháp phân tích
MET, PHEN, GLP, GLC, GLB và GLM (n = 6)......................................................54
Bảng 3.18. Hiệu suất chiết các hợp chất (n = 6) .......................................................55
Bảng 3.19. Kết quả khảo sát độ ổn định của các hợp chất trong mẫu chuẩn và mẫu
thử giả lập (n = 3) ......................................................................................................56
Bảng 3.20. Kết quả khảo sát độ thô khi thay đổi nhiệt độ cột sắc ký ± 5oC (n = 3) 57
Bảng 3.21. Kết quả khảo sát độ thơ khi giảm thể tích tiêm mẫu (n = 3) ..................57
Bảng 3.22. Kết quả phân tích sáu hợp chất giảm glucose huyết trong thuốc dược
liệu và thực phẩm chức năng (n = 2).........................................................................60


vii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang

Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của metformin hydroclorid ...........................................5
Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo của phenformin hydroclorid .........................................6
Hình 1.3. Cơng thức cấu tạo của glibenclamid ..........................................................6
Hình 1.4. Cơng thức cấu tạo của gliclazid .................................................................7
Hình 1.5. Cơng thức cấu tạo của glimepirid...............................................................8
Hình 1.6. Cơng thức cấu tạo của glipizid ...................................................................9
Hình 3.1. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 100 ppm với pha động MeOH - H3PO4 0,1%
...................................................................................................................................33
Hình 3.2. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 100 ppm với pha động AcN - H3PO4 0,1%..34
Hình 3.3. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 100 ppm với pha động AcN - H3PO4 0,03% 34
Hình 3.4. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 100 ppm với pha động AcN - H3PO4 0,01% 34
Hình 3.5. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 50 ppm với chương trình gradient 1.............37
Hình 3.6. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 50 ppm với chương trình gradient 2.............37
Hình 3.7. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 50 ppm với chương trình gradient 3.............37
Hình 3.8. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 50 ppm với chương trình gradient 4.............38
Hình 3.9. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 50 ppm với nhiệt độ cột 20 oC .....................39
Hình 3.10. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 50 ppm với nhiệt độ cột 30 oC ...................39
Hình 3.11. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 50 ppm với nhiệt độ cột 40 oC ...................39
Hình 3.12. Sắc ký đồ mẫu trắng ...............................................................................45
Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu giả lập.............................................................................45
Hình 3.14. Sắc ký đồ mẫu thử giả lập ......................................................................45
Hình 3.15. Sắc ký đồ mẫu chuẩn ..............................................................................45
Hình 3.16. Phổ UV của các hợp chất trong mẫu chuẩn và mẫu thử giả lập.............46
Hình 3.17. Biểu đồ minh họa độ tinh khiết của các hợp chất trong mẫu thử giả lập
...................................................................................................................................47
Hình 3.18.a. Sắc ký đồ dung dịch thử giả lập MET tại LOD...................................48


viii

Hình 3.18.b. Sắc ký đồ dung dịch thử giả lập MET tại LOQ ..................................48
Hình 3.19.a. Sắc ký đồ dung dịch thử giả lập PHEN tại LOD.................................48
Hình 3.19.b. Sắc ký đồ dung dịch thử giả lập PHEN tại LOQ ................................48
Hình 3.20.a. Sắc ký đồ dung dịch thử giả lập GLP tại LOD ...................................49
Hình 3.20.b. Sắc ký đồ dung dịch thử giả lập GLP tại LOQ ...................................49
Hình 3.21.a. Sắc ký đồ dung dịch thử giả lập GLC tại LOD ...................................49
Hình 3.21.b. Sắc ký đồ dung dịch thử giả lập GLC tại LOQ ...................................49
Hình 3.22.a. Sắc ký đồ dung dịch thử giả lập GLB tại LOD ...................................50
Hình 3.22.b. Sắc ký đồ dung dịch thử giả lập GLB tại LOQ ...................................50
Hình 3.23.a. Sắc ký đồ dung dịch thử giả lập GLM tại LOD ..................................50
Hình 3.23.b. Sắc ký đồ dung dịch thử giả lập GLM tại LOQ ..................................50
Hình 3.24. Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của các chất phân tích ..53
Hình 3.25. Sắc ký đồ các mẫu thử khảo sát .............................................................61


1

MỞ ĐẦU
Ngày nay xu hướng “Quay về với tự nhiên” - sử dụng sản phẩm có xuất xứ từ thiên
nhiên như thuốc dược liệu và thực phẩm chức năng (TPCN) để tăng cường sức
khỏe, phòng và chữa bệnh đang là xu hướng của thời đại. Phần lớn các chế phẩm
này có nguồn gốc thiên nhiên, được người bệnh tin tưởng về sự an tồn và ít tác
dụng phụ khi sử dụng. Tuy nhiên, để thu hút người dùng và tăng hiệu quả kinh
doanh, một số nhà sản xuất và cơ sở khám chữa bệnh tư nhân đã trộn vào các chế
phẩm một số loại thuốc hóa dược để đẩy nhanh tác dụng và tạo ra hiệu quả điều trị.
Theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới, bệnh đái tháo đường là một bệnh mạn tính
có thể dẫn đến tổn hại nghiêm trọng cho cơ thể; và theo kết quả điều tra tại Việt
Nam, tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường ở người trưởng thành từ 18-69 tuổi là 4,1%,
trong đó chỉ có 28,9% người mắc bệnh đái tháo đường được kiểm sốt và theo dõi
điều trị, có nghĩa là hầu hết người mắc bệnh này (hơn 70%) không được điều trị

[35]. Trong số đó có những bệnh nhân chọn điều trị theo các phương thuốc gia
truyền và có nhiều trường hợp nguy hiểm đến tính mạng, thậm chí gây tử vong đã
xảy ra do các thuốc đó bị pha trộn trái phép các hợp chất giảm glucose huyết. Ví dụ
như năm 2018 một số bệnh viện ở Cần Thơ và thành phố Hồ Chí Minh đã phát hiện
hơn 10 ca nhập viện bị suy thận cấp, suy nội tạng do sử dụng thuốc đông dược gia
truyền để điều trị đái tháo đường có pha trộn phenformin là chất đã bị cấm sản xuất
và lưu hành [9]; hay ngày 20/02/2019, Trung tâm DI&ADR Quốc gia ghi nhận 01
báo cáo ADR về bệnh nhân nhiễm toan lactic, sau đó dẫn đến sốc nhiễm khuẩn, suy
đa tạng và tử vong do đã sử dụng TPCN Tiểu đường hồn có chứa phenformin [32];
và sự việc như thế vẫn cứ tiếp diễn, ở bệnh viện Chợ Rẫy, bệnh nhân thường được
đưa vào bệnh viện khi nồng độ acid lactic trong máu vượt mức bình thường, tổn
thương đa cơ quan, suy thận,… sau một thời gian dài uống thuốc đơng y gia truyền
có ngụy tạo các hợp chất giảm glucose huyết [33].
Hiện nay, việc kiểm tra sự pha trộn các hợp chất giảm glucose huyết trong TPCN và
thuốc dược liệu điều trị đái tháo đường vẫn chưa được kiểm sốt chặt chẽ, quy trình
xác định sự pha trộn các thuốc này chưa có trong dược điển Việt Nam hiện hành và


2

các hướng dẫn của Bộ Y tế. Trên thế giới đã có nhiều cơng trình nghiên cứu quy
trình định lượng đơn lẻ hay phối hợp các hợp chất giảm glucose huyết pha trộn
trong thuốc dược liệu và TPCN [12],[19],[27],[28]… Và cũng có những cơng trình
nghiên cứu định lượng đồng thời cả metformin, phenformin và nhóm sulfonylurea
pha trộn nhưng phần lớn sử dụng các kỹ thuật phân tích hiện đại như GC-MS, LCMS/MS hay UPLC-MS/MS [16],[29],[30], các thiết bị này rất ít được trang bị cho
các Trung tâm Kiểm nghiệm. Tại Việt Nam, gần đây đã có vài cơng trình nghiên
cứu được thực hiện để xác định sự pha trộn của các hợp chất giảm glucose huyết
trong thuốc dược liệu và TPCN [5],[8],[9]. Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào
trong nước cơng bố quy trình phân tích đồng thời một số hợp chất giảm glucose
huyết (metformin, phenformin, glibenclamid, gliclazid, glimepirid, glipizid) ngụy

tạo trong thuốc dược liệu và TPCN bằng phương pháp HPLC-PDA. Vì những lý do
trên, đề tài “Xây dựng quy trình phân tích đồng thời sáu hợp chất giảm glucose
huyết ngụy tạo trong thuốc dược liệu và thực phẩm chức năng bằng phương
pháp HPLC-PDA” được thực hiện với mong muốn làm cơ sở để Trung tâm Kiểm
nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm thành phố/ tỉnh kiểm tra sự pha trộn trái phép
các hợp chất này, đảm bảo người bệnh được sử dụng thuốc dược liệu và TPCN có
chất lượng, an toàn và hiệu quả. Mục tiêu cụ thể của đề tài là:
-

Điều tra các dược liệu thường dùng trong thuốc dược liệu và TPCN được sử
dụng cho bệnh nhân đái tháo đường trên địa bàn tỉnh Tây Ninh

-

Thống kê tần suất xuất hiện của các dược liệu để tạo mẫu giả lập

-

Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích đồng thời sáu hợp chất giảm glucose
huyết: metformin, phenformin, glibenclamid, gliclazid, glimepirid và glipizid
pha trộn trong mẫu giả lập

-

Ứng dụng quy trình kiểm tra hợp chất giảm glucose huyết ngụy tạo trong thuốc
dược liệu và TPCN trên địa bàn tỉnh Tây Ninh.


3

CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về thuốc dƣợc liệu và thực phẩm chức năng
1.1.1. Tổng quan về thuốc dược liệu
Thuốc dược liệu là thuốc có thành phần từ dược liệu và có tác dụng dựa trên bằng
chứng khoa học (trừ thuốc cổ truyền). Thuốc cổ truyền (bao gồm cả vị thuốc cổ
truyền) là thuốc có thành phần dược liệu được chế biến, bào chế hoặc phối ngũ theo
lý luận và phương pháp của y học cổ truyền hoặc theo kinh nghiệm dân gian thành
chế phẩm có dạng bào chế truyền thống hoặc hiện đại [7].
Cơ quan quản lý và kiểm tra chất lượng dược liệu, thuốc dược liệu và thuốc cổ
truyền ở địa phương là Sở Y tế thành phố/ tỉnh và Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc,
Mỹ phẩm, Thực phẩm thành phố/ tỉnh. Nội dung kiểm tra chất lượng thuốc dược
liệu đang lưu hành và sử dụng trên địa bàn tỉnh bao gồm tiến hành lấy mẫu để phân
tích, kiểm nghiệm xác định chất lượng theo tiêu chuẩn chất lượng được phê duyệt
trong hồ sơ đăng ký/ hồ sơ công bố/ hồ sơ nhập khẩu [3].
1.1.2. Tổng quan về thực phẩm chức năng
Thực phẩm chức năng (TPCN) là thực phẩm dùng để hỗ trợ hoạt động của các bộ
phận trong cơ thể có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái và
giảm bớt nguy cơ gây bệnh [10].
Thực phẩm chức năng còn được định nghĩa là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng
của cơ thể con người, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng, giảm
bớt nguy cơ mắc bệnh, bao gồm thực phẩm bổ sung, thực phẩm bảo vệ sức khỏe,
thực phẩm dinh dưỡng y học [6].
Thực phẩm bổ sung là thực phẩm thông thường được bổ sung vi chất và các yếu tố
có lợi cho sức khỏe như vitamin, khoáng chất, acid amin, acid béo, enzym,
probiotic, prebiotic và chất có hoạt tính sinh học khác [4].
Thực phẩm bảo vệ sức khỏe là sản phẩm được chế biến dưới dạng viên nang, viên
hoàn, viên nén, cao, cốm, bột, lỏng và các dạng chế biến khác có chứa một hoặc
hỗn hợp của các chất sau đây [4]:

4

-

Vitamin, khoáng chất, acid amin, acid béo, enzym, probiotic và chất có hoạt
tính sinh học khác;

-

Hoạt chất sinh học có nguồn gốc tự nhiên từ động vật, chất khoáng và nguồn
gốc thực vật ở các dạng như chiết xuất, phân lập, cơ đặc và chuyển hóa.

Thực phẩm dinh dưỡng y học còn gọi là thực phẩm dinh dưỡng dùng cho mục đích
y tế đặc biệt, là loại thực phẩm có thể ăn bằng đường miệng hoặc bằng ống xông,
được chỉ định để điều chỉnh chế độ ăn của người bệnh và chỉ được sử dụng dưới sự
giám sát của nhân viên y tế [4].
Yêu cầu chung đối với TPCN đã có quy chuẩn kỹ thuật là cơng bố hợp quy và đăng
ký bản công bố hợp quy tại Bộ Y tế (Cục An toàn thực phẩm) trước khi đưa ra lưu
thơng trên thị trường. TPCN chưa có quy chuẩn kỹ thuật phải được cơng bố phù
hợp quy định an tồn thực phẩm và đăng ký bản công bố phù hợp quy định an toàn
thực phẩm tại Bộ Y tế (Cục An tồn thực phẩm) trước khi đưa ra lưu thơng trên thị
trường [4].
1.1.3. Phân biệt thực phẩm chức năng với thuốc dược liệu
Thuốc dược liệu khác TPCN ở những điểm sau [10]:
-

Thuốc dược liệu được sản xuất từ các vị thuốc, bài thuốc theo phương pháp
bào chế cổ truyền dựa trên y lý của đông y; TPCN được sản xuất từ một hoặc
nhiều cây thuốc theo phương pháp bào chế hiện đại, khơng phụ thuộc y lý cổ
truyền, có thể làm từ nguyên liệu thô hoặc từ cao chiết hoạt chất tồn phần

hoặc từ cao chiết một nhóm hoạt chất đã định.

-

Thuốc dược liệu phải được bào chế theo những quy trình nghiêm ngặt, có
hàm lượng đủ để có tác dụng điều trị một số chứng bệnh nhất định, có chỉ
định điều trị rõ ràng, có thời gian sử dụng nhất định (điều trị theo liệu trình);
TPCN phải có dịng chữ chú ý: “Sản phẩm này không phải là thuốc và khơng
có tác dụng thay thế thuốc chữa bệnh”, theo đó, TPCN khơng có tác dụng
điều trị bệnh.

-

Về phương diện đăng ký: thuốc dược liệu đăng ký tại Cục Quản lý dược,
TPCN đăng ký tại Cục An toàn vệ sinh thực phẩm.


5

1.2. Tổng quan sáu hợp chất giảm glucose huyết
1.2.1. Metformin hydroclorid
Cơng thức cấu tạo [1]:

Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của metformin hydroclorid
Danh pháp IUPAC: N,N-dimethylimidodicarbonimidic diamid hydroclorid.
Công thức phân tử: C4H11N5.HCl [1].
Phân tử lượng: 165,6 g/mol [1].
Tính chất lý hóa: metformin hydroclorid là chất tinh thể màu trắng, dễ tan trong
nước, khó tan trong ethanol 96%, thực tế khơng tan trong aceton và methylen
clorid, có bước sóng hấp thụ cực đại 232 nm (trong môi trường nước) [1].

Chỉ định: đái tháo đường typ 2 khi khơng kiểm sốt được mức glucose huyết bằng
chế độ ăn đơn thuần [2].
Tác dụng khơng mong muốn: rối loạn tiêu hóa (chán ăn, buồn nôn, nôn, tiêu chảy,
chướng bụng), tăng mẫn cảm với ánh sáng, phản ứng dị ứng, nhiễm acid lactic, rối
loạn huyết học [2].
Liều dùng ở người lớn: bắt đầu uống 500 mg/lần, ngày 2 lần (uống vào các bữa ăn
sáng và tối). Tăng liều thêm một viên mỗi ngày, mỗi tuần tăng 1 lần, tới mức tối đa
là 2.500 mg/ngày. Những liều tới 2.000 mg/ngày có thể uống làm 2 lần trong ngày.
Nếu cần dùng liều 2.500 mg/ngày, chia làm 3 lần trong ngày (uống vào bữa ăn), để
dung nạp thuốc tốt hơn [2].
1.2.2. Phenformin hydroclorid
Công thức cấu tạo [18]:


6

Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo của phenformin hydroclorid
Danh pháp IUPAC: 2-(N-phenylethylcarbamimidoyl)guanidin hydroclorid.
Công thức phân tử: C10H15N5.HCl [18].
Phân tử lượng: 241,72 g/mol [18].
Tính chất lý hóa: phenformin hydroclorid là chất tinh thể màu trắng, không mùi, vị
đắng, tan tự do trong nước, tan trong ethanol, hầu như không tan trong cloroform
hoặc ether, có bước sóng hấp thụ cực đại 234 nm (trong môi trường nước) [18].
Chỉ định: đái tháo đường typ 2 [33].
Tác dụng không mong muốn: chán ăn, buồn nôn, nôn, tiêu chảy, vị giác kim loại,
giảm cân, phản ứng da, viêm tụy cấp; quá liều gây nhiễm toan lactic [34].

1.2.3. Glibenclamid
Cơng thức cấu tạo [1]:

Hình 1.3. Cơng thức cấu tạo của glibenclamid
Danh pháp IUPAC: 5-cloro-N-[2-[4-(cyclohexylcarbamoylsulfamoyl)phenyl]ethyl]2-methoxybenzamid.
Công thức phân tử: C23H28ClN3O5S [1].


7

Phân tử lượng: 494,0 g/mol [1].
Tính chất lý hóa: glibenclamid là chất bột kết tinh trắng hay gần như trắng, thực tế
khơng tan trong nước, ít tan trong methylen clorid, hơi tan trong ethanol 96% và
methanol, có bước sóng hấp thụ cực đại 300 nm và 275 nm (trong môi trường
methanol) [1].
Chỉ định: đái tháo đường typ 2 khi chế độ ăn, giảm trọng lượng và luyện tập khơng
kiểm sốt được đường huyết [2].
Tác dụng không mong muốn: thường nhẹ; buồn nôn, nôn, nhức đầu, phản ứng quá
mẫn ở da (ban, ngứa, mày đay), hạ đường huyết, rối loạn thị giác tạm thời, vàng da.
Nếu quá liều: tụt đường huyết, nhức đầu, kích thích, bồn chồn, vã mồ hơi, mất ngủ,
rối loạn hành vi [2].
Liều dùng: ban đầu 2,5 – 5 mg mỗi ngày, uống vào trước bữa ăn sáng 30 phút. Nếu
cần, phải điều chỉnh liều, cứ 1 – 2 tuần, tăng từng 2,5 mg mỗi lần, cho tới khi đạt
mức yêu cầu về glucose huyết. Liều duy trì thường từ 1,25 – 10 mg/ngày. Liều cao
hơn 10 mg/ngày có thể chia làm 2 lần uống. Liều tối đa là 15 mg/ngày [2].
1.2.4. Gliclazid
Cơng thức cấu tạo [1]:

Hình 1.4. Công thức cấu tạo của gliclazid
Danh

pháp

IUPAC:

N-(hexahydrocyclopental[c]pyrrol-2(1H)-ylcarbamoyl)-4-

methylbenzensulfonamid.
Công thức phân tử: C15H21N3O3S [1].
Phân tử lượng: 323,4 g/mol [1].


8

Tính chất lý hóa: gliclazid là chất bột trắng hoặc gần như trắng, thực tế không tan
trong nước, dễ tan trong methylen clorid, hơi tan trong aceton, khó tan trong ethanol
96%, có bước sóng hấp thụ cực đại 235 nm (trong môi trường acetonitril) [1].
Chỉ định: đái tháo đường typ 2 ở người lớn mà áp dụng chế độ ăn, luyện tập và
giảm cân khơng kiểm sốt được glucose huyết. Gliclazid nên dùng cho người cao
tuổi [2].
Tác dụng không mong muốn: rối loạn tiêu hóa (buồn nơn, nơn), đau đầu, phát ban,
rối loạn máu (thường hồi phục), giảm tiểu cầu, mất bạch cầu hạt, thiếu máu. Các tác
dụng phụ thường nhẹ và ít xảy ra [2].
Liều dùng: 80 mg/ngày và tối đa là 320 mg/ngày; có thể bắt đầu dùng với liều 40 –
80 mg, rồi tăng dần nếu cần; trong đa số trường hợp: uống 160 mg/ngày, uống 1 lần
vào lúc ăn sáng; trường hợp điều trị chưa đạt có thể tăng dần liều lên, tối đa là 320
mg/ngày chia 2 lần, uống trong bữa ăn sáng [2].
1.2.5. Glimepirid
Công thức cấu tạo [1]:

Hình 1.5. Cơng thức cấu tạo của glimepirid
Danh

pháp

IUPAC:

3-ethyl-4-methyl-N-[2-(4-{[trans-4-

methylcyclohexyl)carbamoyl]sulfamoyl}phenyl)ethyl]-2-oxo-2,5-dihydro-1Hpyrrol-1-carboxamid.


9

Công thức phân tử: C24H34N4O5S [1].
Phân tử lượng: 490,6 g/mol [1].
Tính chất lý hóa: glimepirid là chất bột màu trắng hay gần như trắng, đa hình, thực
tế khơng tan trong nước, tan trong dimethyl formamid, khó tan trong methylen
clorid, rất khó tan trong methanol, có bước sóng hấp thụ cực đại 228 nm (trong môi
trường acetonitril) [1].
Chỉ định: đái tháo đường typ 2 ở người lớn khơng kiểm sốt được glucose huyết
bằng chế độ ăn, luyện tập thể lực và giảm cân [2].
Tác dụng không mong muốn: hạ glucose huyết là tác dụng không mong muốn quan
trọng nhất, hoa mắt, chóng mặt, nhức đầu; buồn nơn, nơn, cảm giác đầy tức ở vùng
thượng vị, đau bụng, tiêu chảy; rối loạn thị giác tạm thời khi mới dùng glimepirid,
do sự thay đổi về mức glucose huyết; phản ứng dị ứng hoặc giả dị ứng, mẩn đỏ,
mày đay ngứa, mẫn cảm ánh sáng; tăng enzym gan, vàng da, suy giảm chức năng
gan; giảm tiểu cầu nhẹ hoặc nặng, thiếu máu tan huyết, giảm hồng cầu, giảm bạch
cầu, mất bạch cầu hạt; viêm mạch máu dị ứng [2].
Liều dùng: liều khởi đầu nên là 1 mg/ngày. Sau đó, cứ mỗi 1 – 2 tuần, nếu chưa
kiểm sốt được glucose huyết thì tăng liều thêm 1 mg/ngày, cho đến khi kiểm soát
được glucose huyết. Liều tối đa của glimepirid là 8 mg/ngày [2].
1.2.6. Glipizid

Công thức cấu tạo [1]:

Hình 1.6. Cơng thức cấu tạo của glipizid
Danh

pháp

IUPAC:

N-(4-[N-(cyclohexylcarbamoyl)sulfamoyl]phenethyl)-5-

methylpyrazin-2-carboxamid.


10

Công thức phân tử: C21H27N5O4S [1].
Phân tử lượng: 445,5 g/mol [1].
Tính chất lý hóa: glipizid là chất bột kết tinh màu trắng hay gần như trắng, thực tế
không tan trong nước và ethanol 96%, rất khó tan trong methylen clorid và aceton,
tan trong các dung dịch kiềm lỗng, có bước sóng hấp thụ cực đại 225 nm (mơi
trường methanol) [1].
Chỉ định: đái tháo đường typ 2 khơng kiểm sốt được bằng điều chỉnh chế độ ăn
đơn độc [2].
Tác dụng không mong muốn: đau đầu, hoa mắt, chóng mặt, buồn ngủ, chán ăn,
buồn nôn, nôn, tiêu chảy, cảm giác đầy bụng, táo bón, nóng rát ngực, vàng da, ứ
mật, ban đỏ, mày đay, mẫn cảm ánh sáng, phù, hạ glucose huyết, hạ natri huyết, rối
loạn tạo máu, thiếu máu bất sản, thiếu máu tan máu, suy tủy, giảm tiểu cầu, giảm
bạch cầu hạt [2].
Liều dùng: liều khởi đầu ở người lớn chưa được điều trị là 5 mg mỗi ngày, ở người

cao tuổi hoặc người có bệnh gan là 2,5 mg mỗi ngày. Liều lượng tiếp theo phải
được điều chỉnh theo tính dung nạp thuốc và đáp ứng điều trị của người bệnh; liều
lượng điều chỉnh thường tăng mỗi ngày 2,5 – 5 mg cách từng đợt ít nhất vài ngày
(thường 3 đến 7 ngày).
1.3. Phƣơng pháp xử lý mẫu các thuốc dƣợc liệu và thực phẩm chức năng có
ngụy tạo
Thuốc dược liệu là hỗn hợp các thành phần dược liệu phức tạp. Do đó để chiết xuất
những chất cần quan tâm, một phương pháp hiệu quả nên được áp dụng để sàng lọc
những chất pha trộn. Hầu hết các phương pháp chuẩn bị mẫu thử liên quan đến chiết
xuất đều sử dụng dung môi hữu cơ [22].
Một vài phương pháp xử lý mẫu các thuốc dược liệu và TPCN ngụy tạo dược chất
như sau:
-

Mẫu dạng viên nén, viên nang:
+ Chiết xuất mẫu đã nghiền thành bột với 10 ml methanol trong 30 phút, ly
tâm trong 5 phút, 1 ml phần dịch phía trên được ly tâm một lần nữa trong 3


11

phút và phần dịch phía trên cuối cùng được phân tích sự pha trộn của các
thuốc giảm đau, kháng sinh, trị tiểu đường, chống động kinh, kích thích tình
dục, hormon và các thuốc đồng hóa, thuốc hướng thần và các hợp chất giảm
cân [15];
+ Hoặc chiết xuất mẫu với methanol dưới điều kiện khuấy từ trong 20 phút và
siêu âm trong 20 phút, ly tâm khoảng 10 phút, lấy phần dịch phía trên pha
lỗng với methanol và lọc trước khi đem phân tích sự pha trộn của 10 loại
thuốc điều trị đái tháo đường [29].
-

Mẫu dạng viên nén:
+ Chiết xuất với 100 ml methanol, khuấy từ trong 2 giờ và siêu âm trong 30
phút, pha loãng, lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi đem phân tích sự pha
trộn của 8 loại thuốc cải thiện chức năng sinh dục [14];
+ Hoặc chiết xuất mẫu đã được nghiền bằng 10 ml hỗn hợp methanol – nước
(80:20) (tt/tt), siêu âm 40 phút và lấy phần dịch phía trên đem phân tích sự
pha trộn của các thuốc giảm đau kháng viêm steroid và non-steroid [31];
+ Hoặc chiết xuất mẫu với 3 ml hỗn hợp methanol – nước – TFA (78:22:0,1)
(tt/tt), siêu âm 10 phút, ly tâm 10 phút, phần dịch ở trên được pha lỗng 1000
lần và đem phân tích sự pha trộn 9 loại thuốc phổ biến như sildenafil,
famotidin,

ibuprofen,

promethazin,

diazepam,

nifedipin,

captopril,

amoxicillin, dextromethorphan [26].
-

Mẫu dạng viên nang:
+ Chiết xuất mẫu với 100 ml methanol, siêu âm 10 phút, pha loãng đến 250 ml
với methanol và phân tích sự pha trộn các thuốc giảm cân [24];
+ Hoặc chiết xuất mẫu với hỗn hợp AcN – nước (1:1) (tt/tt), siêu âm 20 phút,

ly tâm và lấy phần dịch ở trên để phân tích sự pha trộn các thuốc sildenafil,
tadalafil và vardenafil [20].

-

Mẫu dạng dung dịch uống: 100 µl dung dịch uống được trộn với 1 ml hỗn hợp
methanol – nước – TFA (78:22:0,1) (tt/tt), siêu âm 10 phút, ly tâm 10 phút, và
lấy phần dịch ở trên pha lỗng 100 lần và đem phân tích sự pha trộn 9 loại thuốc


12

phổ biến như sildenafil, famotidin, ibuprofen, promethazin, diazepam, nifedipin,
captopril, amoxicillin, dextromethorphan [26].
Như vậy, tùy vào tính tan của chất phân tích để lựa chọn dung mơi chiết thích hợp.
Một vài dung môi thường được sử dụng trong chiết xuất dược chất pha trộn trong
thuốc dược liệu: methanol, ethanol, dicloromethan, hỗn hợp methanol – nước, hỗn
hợp acetonitril – nước và hỗn hợp methanol – nước – TFA.
Bên cạnh đó, q trình chiết xuất có thể sử dụng các điều kiện hỗ trợ như lắc, khuấy
từ, siêu âm gia nhiệt, ly tâm.
1.5. Một số quy trình định lƣợng hợp chất giảm glucose huyết ngụy tạo trong
thuốc dƣợc liệu và thực phẩm chức năng
Ngoài nước
Năm 2005, Kenichi Kumasaka và cộng sự đã phân tích sáu hợp chất giảm glucose
huyết thuộc nhóm sulfonylurea như tolbutamid, acetohexamid, chlorpropamid,
gliclazid, glibenclamid và glimepirid trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe. Các hợp
chất này được chiết xuất với aceton và dịch chiết được phân tích bằng phương pháp
sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Với phương pháp
TLC, các chất được tách tốt khi sử dụng pha động bao gồm n-butyl acetat chứa acid
formic 0,4% và phát hiện bằng đèn UV ở bước sóng 254 nm. Tính đặc hiệu được

ghi nhận với thuốc thử Dragendorff, dung dịch methanol có acid phosphomolybdic
10% và dung dịch methanol có acid sulfuric 30%. Với phương pháp HPLC pha đảo
được trang bị với đầu dò PDA, nghiên cứu có thể phát hiện các hợp chất này trong
vịng 15 phút, sử dụng cột ODS và pha động bao gồm acetonitril và dung dịch đệm
amoni acetat. Độ phục hồi của các hợp chất từ 90,7 – 105,2%. Độ chính xác trong
ngày và giữa các ngày thể hiện qua giá trị độ lệch chuẩn tương đối lần lượt là 0,2 –
8,1% và 0,6 – 7,2% [25].
Năm 2009, Wensheng Pang và cộng sự đã phân tích các thuốc như gliquidon,
glipizid, gliclazid, glibenclamid, glimepirid, rosiglitazon, repaglinid, metformin,
phenformin và tolbutamid. Độ chính xác trong ngày và giữa các ngày của phương
pháp lần lượt là 2,13 - 5,55% và 3,78 - 8,14%. Giới hạn định lượng (LOQ) là 1; 1;