Giáo trình Cơ sở di truyền chọn giống thực vật: Phần 2

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.43 MB, 20 trang )

(1)<div class='page_container' data-page=1>

Chương

5

LAI TỂ BÀO SOMA

5.1. M ỏ ĐẦU

N hư ta đă biết, khác với các tế bào động vật, t ế bào thực vật ctí th àn h tế bào là lớp
bao ngoài cùng. Thành tế bào gồm xenlulo (khoảng 20-30 % ), hemixenluỉo và pectin. Nếu
như th àn h tế bào bị tách bỏ, thì lúc đđ tế bào thực vật sẽ lộ ra lớp m àng sinh chất ngoài
cùng, m à trạ n g thái ta gọi là tế bào tràn hay protoplast. Khi các protoplast tiếp xúc với
nhau thỉ chúng cổ th ể hợp n h ất lại làm một, m à ta gọi là 8ự d u n g hợp protoplast. Nếu
như các protoplast cđ nguòn gốc từ các tế bào som a thuộc các giống, loài hoặc chi khác
nhau được dung hợp lại thi nó cđ th ể dẫn đến hiện tượng lai té bào soma (somatic
hybrydization),

Vi tế bào thực vật cố thành tế bào, nên trước đây trong một thời gian dài người ta
cho ràn g kỷ th u ật dung hợp protoplâst chỉ giới hạn ở các tế bào động vật; m ặc dầu ngay
từ rấ t sớm K uster (1909) đă nêu ra ý tưởng sử dụng phương pháp lai tế bào soma để
vượt qua những khó khản nảy sinh trong quá trìn h lai xa ở thực vật. Mãi cho đến nảm
1960, sau những nghiên cứu thành cổng của Cocking với việc dùng m ột hỗn hợp các

e m y m cellulose, pectinase và maceroz3nne để tách bỏ th àn h tế bào thực vật, thi kỹ th u ậ t
dung hợp protoplast mdi được áp dụng ở thực vật. Tuy nhiên, nổ chi thực sự phát triể n
m ạnh m ế và cố xu hiỉớng được úng dụng tro n g chọn giổng chỉ sau các kết quả n ^ i ê n
cứu về việc tái sinh hoàn chỉnh cây thuổc lá từ protopỉast của Ikkebe (1971) và việc tái
sinh cây thuốc lá lai do dung hợp protoplast giữa hai loài N. tabacum với N. langsdorffi

của Carlson (1972),

Sự r a đời của kỹ th u ậ t protoplast cho phép ngườỉ ta tẹo ra nhữ ng tái tổ hợp di truyền

giữa các đơn vị phân loại xa ( loài hay chi) m à bằng phương pháp ỉai hữu tính khị hoặc
khơng đ ạ t được. Trong quá trỉn h dung hợp, bên cạnh sự kết hợp giữa các genom trong
nhân, còn cố th ể xảy ra sự hợp n h ất tế bào ch ất giữa các protoplast. Nhờ vậy, m ột số
tín h trạ n g do các gen trong tế bào chất kiểm soát, như tính b ất th ụ đực, cố th ể được
chuyển m ột cách khơng khó khăn từ cây này sang cây khác nhờ kỹ th u ậ t này.

Muốn tiến hành lai tế bào soma càn phải tách được các protoplast m ột cách nguyên
vẹn, cho chúng dung hợp với nhau, làm cho các sản phẩm dung hợp phân chia và tái sinh
chúng th àn h cây.

5.2. TÁCH PROTOPLAST

</div>
(2)<div class='page_container' data-page=2>

pháp enzym, vì nđ cd^hiệu su ẩt rấ t cao m à lại không gây thương tổn cho tế bào.

Khi thành tế bào được tách ra, protoplast phải được phóng thích ra mơi trường cd
áp su ất thắm th áu cao để trá n h nước xâm nhập vào không bào, gây vỡ protoplast ( ví
dụ, cd th ể dùng dung dịch manitol 0,5 M). Tuy nhiên, thời gian lưu lại ở đó không nên
quá dài khiến cho trao đổi chất của tế bào và cấu trúc màng lưới sinh chất bị tổn hại.

Dể tách protoplast, ví dụ từ cây thuốc lá được trồng trong nhà kính, được tưới
thường xuyên ở 25"C, thỉ lá thứ ba từ trên xuống là ngiiồn thực liệu thích hợp nhất. Lá
được khử trù n g bằng ethanol 70% trong vài giây, sau đó được nhúng vào dung dịch
hypoclorit canxi 5% rồi rửa bằng nước cất. Lá được thái nhỏ cho vào đỉa P etri chứa hỗn
hợp enzym như sau : 0,1 % cellulase, 0,02% macerozyme và 0,05% driselase, để qua đêm
(khoảng 16 h). Sau đó lọc qua rây cđ lỗ 50 - 80 /ym, rồi rửa 2 làn bàng dung dịch mới
không chứa enzyxn bầng cách ly tâm.

Ngoài lá, người ta cd th ể dùng phần trụ dưới lá mầm hay rễ làm nguyên liệu tách
protoplast. Do không chứa diệp lục nên nguồn protoplast này dễ phân biệt với các
protoplast được tách ra từ mô th ịt lá. Một nguồn nguyên liệu khác cũng được dùng để

tách protoplast là các tế bào nuôi cấy dạng huyền phù. Đơi với các cây hồ thảo, điều cần
biết là, chỉ cd các protoplast được tách ra từ các tế bào phôi được nuôi cấy dạng huyền
phù mới có khả nảng phân chia và tái sinh cao (Fujimura,1985 ).

53. DUNG HỘP PROTOPLAST

Lần đầu tiên Carlson (1972) đã tái sinh ra những cây thuốc lá từ protoplast bàng
cách cho dung hợp protoplast trong môi trường cfịng thẩm tích của dung dịch n itra t
n atri. Còn Melchers (1974 ) thì dung hợp protoplast củng của thuốc lá ở môi trường 50
mM Ca + 0,4 M m anitol với pH = 10,5. Môi trường của Melchers tỏ ra rá t thích hợp
cho việc dung hợp tế bào chất. Sau này, Kao (1974) đả phát hiện ra chát polyethylen
glycol (PEG) cd tác dụng làm tân g hiệu quà dung hợp của protoplast; vl nd là chất qd ái
lực với nước, làm tăn g tính thẩm thấu và tăng bề m ặt tiếp xúc giữa các protoplast. Chỉ
sau vài phút được ngăĩh vào dung dịch 20 - 40 % (w/v) của PBG (mol. Wt. 1500 - 1600)
hàu như tấ t cà các protoplast đều được kết dính lại. Tuy nhiên, việc dung hợp chỉ thực
sự xảy ra khi pha ỉông PEG trong mơi trường có nồng độ cao và pH cao (pH=«
10,5). T\iy nhiên, do PEG có độc tín h đối với tế bào thực- vật nên người ta thường dùng
ở nồng độ thấp hơn và thêm vào đó m ột ít DMSO (dimethyl sulíoxid).

Sau này, phương pháp dung hợp nhờ xung điện (electrofusion) do Zim m erm an đề
xướng (1982) được nhièu người áp dụng. Nguyên tác của phương pháp là ; môi trường
chứa protoplast được đặt giữa hai điện cực; sự dung hợp xảy ra khi ta tạo ra m ột xung
điện với điện th ế cao ( 500 - 10000 v/cm) trong khoảnh khác 5-6/1000 giây.

Với các cây họ cà, hiệu quả dung hợp của phương pháp này đ ạ t tới > 50%. Càn nhớ
là, hiệu su ất dung hợp phụ thuộc vào nhiều yếu tố: m ật độ protoplast, nhiệt độ khi thí
nghiệm, nồng độ PEG, cường độ điện trường... và nguồn nguyên liệu cho protoplast (tế
bào mơ th ịt lá thường thích hợp hơn là mô sẹo hoặc rễ cây). Sự cd m ặt của m ột lượng
lớn không bào và các h ạ t tinh bột làm giảm khả nảng sống sơt của protoplast trong quá
trin h dung hợp. Dưối đâv (bảng 5.1) là môi trường Bourgin (1979) dùng cho nuôi cấy

protoplast được tách ra từ th ịt lá cây thuốc lá.

</div>
(3)<div class='page_container' data-page=3>

100 LAI TẾ BÀO SOMA

Bàng 5.1. MƠI trurịrng nuối cấy protoplast thuốc lá (Bourgỉn, 1979 )

Hoá chất Nồng độ (mg /ỉ) Hoá chất Nồng độ (mg/l)

NH4NOj 825 Inositon KK)

KNOj 950 Calciuiii pantothenat 1

Ca0 2 2 H2 0 2 2 0 BẾtXin 0 , 0 1

MgSố4-7H20 185 Axit nicoUi^ 1

KH2PO4 85 PyrỉdcKin 1

FeSQ,.7H20 27^5 Thiamin 1

Na2m yrA 37^5 Axit naphthalen acetỉc 3

Tsắo^ 1 6-Ben2ylamlnopui1n 1

H2B Ặ 1 Sucrose 2 0 0 0 0

MnS04.4H2Ơ 0 , 1 Mannitol 80000

CuS0 4^ H2 0 0,03 p H 5 ^

AIOị 0,03

NICI2.6H2O 0,03

KI 0 , 0 1

5.4. NUÔI CẤY PROTOPLAST VÀ TÁI SINH CÂY

Môi trường nuôi cấy protoplast khác xa so với các môi trường nuôi cấy mô đ ể cho tế
báo cổ th ể phfln chia và hinh th ành md sẹo. Điều khác trư ãc tiên là, mổi trư dng này cần
phảỉ cd áp suăt thẩm thâu cao lúc ban đầu bầng cách aử dụng m annitol hoặc sorbitol ;
thứ hai là, mơi trường phẩd ctí nông độ chất sinh trưởng tương đổi cao. Đối với protoplast
thuổc lá nồng độ các chất đổ là : 3 mg/1 NAA (15 Ịiim.) và 1 mg/ỉ benzylam inopurín (5

/im ) - Xem bảng 5.1. M ật độ protoplast / ml phải điều chỉnh sao cho cd th ể đếm được
bầng bu&ng đốm hồng cầu. Vối thuốc lá, nồng độ đó là 60000 protoplast /ml (nốu tế bào
cđ kích thước bé thỉ m ật độ ctí th ể tAng lên). Môi trường dịch th ể của protoplast cần đ ật
trong điều kiộn tổi cho đến khi chứng b&t đ&u phftn chia l&n thú nhát. Sau đổ kho&ng tìỉ
2 -6 ngày thỉ th ành tế bào được tái sinh (tùy theo loài cây). Cấu trú c 2 tế bào cố th ế
quan s á t được dưới kính hiển vi soi ngược, nếu chúng được nuôi cấy trê n môi trường
lỏng. THỉy nhiên, nếu nuôi cấy trôn môi trường đặc thl ta có th ể theo dõi được sự p h át
triể n của từng protoplast và sự hinh th àn h từ n g cụm t ế bào bé cđ nguồn góc từ từ n g
protoplast.

Đ ể chọn lọc các đột biến sinh hoá hoậc các con lai soma ngưdi ta cổ th ể nuỗi cẨy
tách riêng từng protoplast trên từ ng đĩa P e tri nhỏ trong mối trường cổ n&ng độ auxin
th ấp và m ật độ tế bào thấp (1 tế bào / Iml). Với protoplast của cây cải dầu, bàng phương
pháp nuôi cấy liên tục cđ thay môi trường mới 2-3 lần thì có th ể thu được các nhổm tế
bào cổ kỉ}ả n&ng tái sinh, sau khi chuyển chúng san g mối trường đặc tạo ch&ỉ thân.

</div>
(4)<div class='page_container' data-page=4>

tố bào phôi được nuôi cẩy dạng huyền phù ( thưịng đổi với họ hồ thảo ) thi các cụm tố
bào v&n giữ nguyẽn được khả n&ng phát sinh phối để hinh thành nên các phổi. Nếu đảm
bảo được qui trìn h chặt chẽ như trên, thi phồi hoặc mô phân sinh sỗ hỉnh th àn h sau
khoảng 3 -5 tu ầ n lễ. Tuy nhiên, trong những trường hợp khi mà điều kiện th í n i^iộ m
khống tổi ưu và có những biến đối về mặt di truyền thỉ sẽ xuát hiện sự thay đổi VẾ sổ
lượng nhiễm sác th ể. Ví dụ, với các protoplast từ cây khoai tây 2n, tầ n số cây 2n được
tá i sinh chỉ khoảng 10%, còn lại chủ yếu là các cây 4n.

5.5. CHỌN LỌC SẤN PHẨM DUNG Hộp

Giả sử ta cho dung hợp giữa các protoplast từ 2 cây khác nhau và thu được kiểu tế
bào dị nhân (heterokaiyocjrte), trong đó có sự trộ n lẫn cả nhân và tế bào chất (bao gốm
cả ty, lạp th ể trong tế bào chẫt ). Song, sự dung hỢp này cũng có th ể chỉ xảy r a giữa 2
nhãn hoậc giữa các tế bào chất hoặc chi một phần giữa các nhân. Điều này phụ thuộc
vào quan hệ giữa các lồi. Ví dụ, tàn số dung hợp giữa N.tabacum / N.tabacum ỉà 10 ■*,
giữa Brassica campetris / B. oleracea là 0,5. Dể làm tăng khả năng tái sinh các cáy lai,
người ta đã sử dụng một số phương pháp làm tản g tỷ lệ các tế bào dị nh ân hoậc các
phương pháp chọn lọc tế bào lai.

Dưới đây, ta xem xét một sổ kỹ thuật tách các sản phẩm dung hợp.

1) Gleba (1978) đề xuất kỹ thuật tách và ũh&n dòng đổi với các sản phẩm dung hạp
dưới kính hiển vi, dựa vào sự sai khác về m ặt hinh thái; chẳng hạn sự cổ m ặ t của các
chloroplast từ protoplast của mô thịt lá và sự khũng cổ m ặt của chúng tro n g các
protoplast cd nguồn gốc từ mô sẹo hay trụ dưới lá mầm. Việc tách các tố bào dị nh án
được tiến hành bằng micropipet.

2) G albraỉth (1978) và Redenbaugh (1981) đS ra phương pháp nhận diện các sản
phẩm dung hợp bằng cách nhuộm huỳnh quang hoặc với chất rhodam in isothiocyanat đối
với các protoplast trước lúc cho dung hợp.

3) Các sản phẩm dung hợp cũng có thể được tách ra bàng phương pháp kốt hợp tìí
trường với gen chỉ thị kháng ehẵt khấHg ẫÌRh. Nguyên tấc nhu ẫãu; protoplast của dạng
A được gán những phân tử nhỏ cố ái lực tỉí tính mạnh; protoplast của dạng B có gán gen
kháng chất kháng sinh (ví dụ như kanamycin) Sau thí nghiệm dung hợp, protoplast được
cho đi qua cột phàn ly ctí từ tính mạnh; protoplast dạng A và protoplast lai được gỉữ lại
ở cột, cịn proplast dạng B thỉ tách khỏi cột. Hỗn hợp protoplast lai và dạng A được
nuổi căy tro n g mổi trường có kanamycin để tách ra các tế bào lai.

4) Các hiện tượng bổ sung di truyền trong quá trinh dinh dưỡng được dùng r ấ t rộng
rãi và cđ hiệu quả để nhận biết các sản phắm dung hợp, như sử dụng các đột biến bạch
tạn g hay thiếu h ụ t diệp lục, các đột biến sinh hoá do thiếu enzym n itra t reductase - NR
(Melchers, 1974; Glỉmelius, 1978 ) hoặc các gen đánh dấu (ctí được bằng phương pháp
chuyển gen) có liên quan đến tỉnh kháng các chát kháng sinh (Hamil, 1984) hoặc kháng
chất diệt cỏ (Evola, 1983).

- C hẳng hạn, cđ những trưòng hợp, khi được nuôi cấy tro n g môi trư ờ n g thiếu
hoocmon ngoại sinh thi các tế bào lai có khả nãng cho mỏ sẹo và tái sinh cây, còn các tế
bào của từ n g dạng bó mẹ lại khơng có khả năng ấy (Power (1977) và Shenck (1982)) .

- Trong nghiên cứu của Cocking (1977), khi dung hợp protoplast giữa các dạn g đột

</div>
(5)<div class='page_container' data-page=5>

biến thuộc hai ioài Petunia hybrida và p. parodii, tro n g đổ protoplast từ dạng đột biến
albỉno của p. hybrida cho md sẹo m àu trá n g trê n mối trư òng m à d đd protopỉast của p.
parodii khống cho mữ sẹo, còn tế bào lai thì cho mỗ sẹo m àu xanh.

• Masson (1989) và Thomas (1990) đ a sử dụng phương pháp biến nạp cho cả hai dạng
bố m ẹ : m ột dạng được g&Đ gen kháng k an am y d n còn dạng kia được gán gen kháng
hygrom ydn; việc chọn lọc các tế bào lai được tifo hàn h trong mữi trường chứa cả hai loại
kháng sinh đđ.

N ếu m ột trong hai dạng bổ mẹ là kiểu đột biến sinh dưỡng, ví dụ, kiốu thiếu enz}an
N R nén khống th ể sổng được tr6n mỗi trư ờ ng N O ^d o khống có khả năng khử N O ^ -*■
N 0J" -* NH3, còn dạng kia được chuyển gen kiểm soát m ột tính trạ n g trội - như kiểu
kháng chất diệt cỏ hoặc kháng sinh - th i ta cổ th ế chọn lọc trực tiếp các tế bào lai trê n
mỗi trường tổi thiểu và cổ bổ sung chãt kháng sinh hoặc chất diệt cỏ (các tế bào bổ hoặc
mẹ khổng thổ sỔBg binh thườhg được). D ạng con lai đ a năng như vậy đa được sử dụng
d cây thuổc ỉá hoặc cải d&u.

5.6. CON LAI DO sự DUNG Hộp NHẢN

Nhiều dạng con lai soma do kết quả của sự hợp nhấib nhân (nuclear hybrid) đa được
tạo ra thành cống giữa các ỉoài cây trồng vỗi loài hoang dại d chi cải dầu; ví dụ, giữa loài

B. nigra chứa 1 bộ gen (B) vói ỉoài B. napua chúa 2 bộ gen (ÁC). Bàng phương pháp dung
hợp protoplast giữa hai loỉd ây, người ta đã tạo ra được dạng con lai chứa 3 bộ gen (ABC).
H oặc khi dung hợp protoplast giữa E n ica sativa vói B. napus người ta đã chuyển được
gen kháng cỏn trù n g và chịu khô <x5 d Eruca vào con lai.

ỏ khoai t&y (S. tuberosum), khả nàn g sử dụng kỹ thuẠt dung hợp protoplast là rđt
lớn. Khi dung hợp protoplast giữa s . tuberosum (4n) với ỉoàỉ s. brevidena (2n) khống cho
củ, người ta đa th u nhẠn được m ột dạng OOIÍ lai khác lồi (6n) cho củ, hữu th ụ và lại cd
khả n&ng lai được với 5. tuberosum. M ặt khác, dạng con lai này lại nhận được các gen
q từ lồi hoang dại là gen kháng v irut thường gây bệnh xoăn lá d khoai tAy trồng và
gen kháng bệnh vi khuẩn ở củ.

c&n lưu ý'ỉà, mặc dàu sự dung hợp protoplast giữa các cáy thuộc các ỉoàỉ, thậm chí
các chỉ khác nhau có thế xảy ra binh thường, nhưng vỉộc tái sinh cáy có thể khống xảy
ra, hoặc con lai cd sức sổng thãp hoậc b át thụ. 'Trong nhỉdu trưdng hợp, g&n như toàn bộ
hoặc m ột phần nhiễm sấc th ể của m ột tro n g hai dạng bổ mẹ bị m ất đi. .T\iy nhiên, diồu

này lại dán đến m ột hiộu ứng lý thú khác-, con lai chỉ n h ận được m ột số nhiễm 8ấc th ế
hay m ột đoạn nhiễm sác th ể của m ột tro n g hai dạng bố mẹ, nhưng chứng lại chứa những
gen cd ích cliị mục đích chọn giổng. Bàng phương pháp xử lý phdng zạ, người ta làm đ ú t
các nhiễm sác th ế th ành các đoạn nhô và chúng được chuyển vào genom của th ế nhận
sau quá trìn h dung hợp protoplast. Ch&ng hạn, hoạt tín h của gen N R d c&y thuốc lá đột
biến N R ~ được khdi phục sau khi protoplast của nđ được dung hợp với protoplast của
lúa mỉ đã được chiếu xộ. Theo cách nhu vậy, người ta- đă chuyển được nhiều gen kháng
bệnh từ loài này sang loẳứ khác thuộc chi cải dầu.

5.7. CON LAI DO DUNG Hộp TẾ BÀO CHẤT

l y lạp th ể chứa những bộ gen tương đối bé nhỏ 80 vâi hệ gen trong nh&n. Chúng
chứa lượng ADN m ã hoá cho khoảng 10% poỈ3rpeptit đảm bảo cho chức n an g của các cơ

</div>
(6)<div class='page_container' data-page=6>

quan tử, phàn 90% còn lại là do các gen n h ãn m ã hoá và được chuyển qua m àng của các

cơ q u an tử . Các cơ quan tử được phân bố m ột cách n g ỉu nhiỗn vào các tế bào con qua
các th ế hệ tế bào. Trong sinh sản hữu tính, các cơ quan tử nổi chung chỉ được chuyển
qua giao tử cái. Trong khi đổ, nhờ sự dung hợp protoplast mà ta cđ được hiện tượng đổng
góp như nhau của các cơ quan tử có tro n g tế bào chất từ hai dạng bố mẹ. Sản phẩm của
dung hựp có th ể chứa các nh&n, ty th ể và lạp th ể tù cả hai dạng bố mẹ. Nhưng, nó cũng
có th ể chi chúa nhân của một dạng bố mẹ còn tế bào chát thi lại của cả hai. D ạng con
lai như vậy ctí tên gọi là con lai tế bào chất hay cybrid.

ỗ.7.1. Dung hợp protoplast và trao dổi tế bào chát

Trong trường hợp mục đích thí nghiệm là phối hợp nhân của một dạng bố mẹ này
với to àn bộ tế bào chất của dạng bố mẹ kia và nếu như, khả năng kết hợp nhân của hai
d ạn g ấy là cao, thì người ta có th ể chiếu xạ dạng bđ mẹ cho tế bào chát (cytoplasmic
donor) bằng tia X hay tia gamma. Bằng cách xử lý như vậy, tia phổng xạ sẽ khồng g&y

ra hiệu quả đột biến đến các hệ gen ở cơ quan tử, vỉ nđ cổ nhiều bản sao trong tế bào.
Còn đổi với dạng bố mẹ nhận nh&n (nuclear recipient) thỉ ngưòi ta loại bỏ cơ quan tử
tro n g t ế bào ch ất bằng cách sử dụng các chất ức chế trao đổi chât, như iodoacetat hay
iodoacetamid.

5.7.2. Dung hợp protoplast và tạo các tái tổ hệ gen lạp thể

Trong các sản phẩm dung hợp, lạp th ể được phân ly ngẫu nhiẻn vào các th ế hệ tế
bào k ế tiếp. Cũng cd hiện tượng, tro n g m ột cụm tế bào chi tồn tại các lạp th ể của m ột
trong hai dạng bổ mẹ cả trong các con iai nhân hay con lai tế bào chất.

Các nghiên cứu ở con lai som a giữa hai ioài thuổc lá và giữa thuốc lá với cây họ cà
cho th ấy cd hiện tượng tái tổ hợp giữa các genom của ỉạp th ể (Thanh & Medgyesy,19ỗ9).
Thí nghiệm nối trê n đã sử dụng các c&y đột biến về lạp th ể kháng chăt kháng sinh và
bạch tạng. Theo phân tích của Fẹjes (1990) trẻ n cây thuốc iá thỉ, tái tổ hợp này xuát hiện
là do sự trao đổi chéo.

Lạp th ể của Lạp thổ của

N. tabacum N. plum onoinitoba

ch' str'' (+ ) ch'*' stĩ*

ị

Cụm tế bào p h át triể n
trong môi trường cđ
streptom ycin.

Chọn lọc các cụm xanh.
ị

l ầ i sinh các cây m ang
lạp th ể tái tổ hợp.

</div>
(7)<div class='page_container' data-page=7>

5.7.3. Dung hợp protoplast và các tái tổ hợp hộ gen ty thể

T ính b ấ t thụ đực tế bào chất cổ ở nhiều loài thực vật là một tỉn h trạ n g di truyền do
sự kiểm soát của hệ gen ty th ể (Lonsdale, 1987). N hững phân tích v6 tính đa hinh chiều
dài các phân đoạn cát giới hạn (RFLP) đổi vối ty th ể của các con lai soma hay các cybrid

ở Petunia hay Brassica (Rothenberg, 1985; Vedel, 1986) đều cho thấy có hiện tượng tái

tổ hợp giữa các genom trong ty thể.

ỏ cfly thuốc lá, khi đem dung hợp protoplast giữa m ột ỉoài hữu thụ với m ột loài băt
th ụ đực thì sự tái tổ hợp xảy ra giữa các ty th ể đâ dẫn đến chỗ làm cho hỉnh thái hoa
của cAy ỉai khác so với cả hai dạng bổ mẹ ban đầu (Kofer, 1990). Hiện tương tái tổ hỢp
xảy ra ở hệ gen ty th ể đâ được tìm thấy ở nhiều loài thực vật. Diều đó mở ra khả năng
cố th ể tạo ra sự trao đổi gen ty th ể giữa các ỉồi.

5.7.4. ÍÁp dụng sự dung hợp tế bào soma dể cải tiến các giống cây trồng qua
hệ thống các cơ quan tử

Từ sơ đ& trê n hinh ỗ .l ta thấy, về m ặt lý thuyết cố th ể cố 9 sản phẩm sau quá trin h
dung hợp protoplast giữa hai dạng bổ mẹ khác nhau vS hộ gen lạp th ể (dạng trõ n )v à ty
th ể (dạng sao), khi ta xem xét đến các khả năng: việc loại trừ đi hệ gen ty lạp th ể của
m ột trong hai dạng bố mẹ hoặc các kiểu tái tổ hợp khác nhau xảy ra giữa hai dạng bố.

N hìn chung, tái tổ hợp xảy ra ở các trường hợp 7 và 8 là phổ biến hơn cả.

Các hệ gen lạp th ể khác nhau khi tbn tại chung trong m ột tế bào thường ít xảy ra
tá i tổ hợp, nhđt ỉà trong các trường hạp ít hoặc khổng có sự cạnh tra n h giữa chúng.
Ngược iạỉ, giữa các hệ gen ty th ể thường hay xảy ra tái tổ hợp. Hệ gen tái tổ hỢp này
được duy trl trong cây cybrid được tá i sinh hoặc ở hậu thế. Vi thế, cấu trú c hay gập ở
các cybrid là sự cố m ặt trong tế b&o của các tái tổ hợp ty th ể và genom lạp th ể của một
tro n g hai dạng bố mẹ ( trường hợp số 7 và 8 của sơ d& trẽn).

Chuyển tẽ bào chất bất thụ đực vào căy trầng

B àng phương pháp dung hợp protoplast ta cđ th ể chuyển ngay được tế bào chăt bất
thụ đực vào các giống cáy trSng hữu thụ Uiảc nhau, điều mầ bàng phương phặp lai trở
lại thống thường ta phải tiến hành qua 5 - 6 lần la i.ỏ cfly lúa, ngưòi ta đã tá i sinh được
các cây cybrid chúa nhân của giổng hữu th ụ và các ty th ể tái tổ hợp từ hai dạng bố mẹ
nhứng vẫn cổ tính băt thụ đực tế bào chất của dạng bất thụ đực (Kyozuka, 1989). Cũng
như thố, G upta (1996) đã chuyển được tố bào ch ất b ấ t thụ từ dòng CMS m ang ký hiệu
V20A sang các dòng duy trì và phục hồi hữu th ụ RCPL1-2C, V20B và IR36, đều thuộc
nhdm ỉúa Indica. Bằng phương pháp tương tự r.hư vậy, người ta cũng đã th àn h cổng
tro n g việc chuyển tế bào chất b át th ụ đực vào các giổng cây hữu thụ ở báp CÂÌ, cà rốt và
củ cải đường (Prim ard, 1988; 'Iknno- Suenaga, 1988; Krens, 1990). ở thuổc lá,
K um ashiro (1988) đã tạo ra được m ột kiểu b á t th ụ đực tế bào chất mới nhờ việc dung
hợp giữa protoplast của loài N . tabacum với protoplast đă được chiếu xạ của loài N.
africana. Đối với các c&y cam quít, tính bất th ụ đực d những giống có quả khỗng h ạt có
ý ng^ĩa kinh tế lón. Vardi (1989) đã tạo r a được các cybrid bất thụ đực cho quả khống
h ạ t ở nhdm cây này.

Cái tiên hệ thống bđt thụ đực tế bào chất ờ Brassica

Các cây trống thuộc chi Braasica có nhiều lồi là cây rau hoặc cây cho dầu, như báp

cải hoặc cải dầu. Cải dầu ỉà loại cây cho dầu quan trọ n g thứ ba, sau đậu tương và cọ

</div>
(8)<div class='page_container' data-page=8>

co sỏ

DI TRUYỀN CHỌN GlốNG THựC VẬT 105
dàu. Đế sản x u í t cây ỉai Fj thường ngưòi ta sử dụng tính khổng hợp của chúng. N hưng
đidu này khòng cho phép áp dụng ở qui mô lớn. Vỉ thế, c&n cổ m ột hộ thống kiểm soát
cổ hiệu quả hơn sự th ụ phân thống qua tín h b á t thụ. Tính bất thụ đực tế bào chất của
cây củ cải cd th ể được chuyển qua c&y báp cải nhờ phương pháp lai hữu tính khác loài;
con lai th u được m ặc dầu cố tín h bất th ụ đực nhưng cỡ quan sinh sản cái lại cố tín h hữu
thụ kém. Bằng phương pháp dung hợp protoplast ngưòỉ ta đa tạo ra sự tta o đổi lục lạp
và sự tái tổ hợp ở ty th ể giữa củ cải và báp cải. TVong quá trin h chọn lọc các cybrid,
người ta đă tách được các cây b ấ t th ụ h ạ t phấn nhưng cơ quan sinh sản cái p h á t triể n
binh thường và cổ khả n in g k í t hợp cao.

( + )

ị

6

</div>
(9)<div class='page_container' data-page=9>

N hững kết quả nghiên cứu trên báp cải và củ cải cho thấy, chl cđ một phàn nhỏ của
genom ỉạ càn được đưa vào cây trồng, khi phàn đtí kiểm sốt tính trạng kiểu như bất
th ụ đực t ế bào chát. Điều này cũng chứng tỏ rằng, hiện tượng tái tổ hợp ty th ể cho phép
loại bỏ đi nhữ ng tính trạn g khững tốt về m ặt chọn giống.

5.8. MỘT s ó THÀNH T ự u CỦA KÝ THUẬT LAI TẾ BÀO SOMA

Trong hơn hai thập kỷ qua người ta đă đạt được nhiều tiến bộ trong kỹ th u ật dung
hợp pĩX)toplast, từ việc tách, dung hợp protoplast đến tái sinh cây ở nhiều loài cây trùng.
D ung hợp protoplast là con đường có hiệu quả để khác phục được nhiều khó khăn gặp
phỉd trong quá trìn h lai hữu tính khác loài hoặc khác chi. Kỹ thuật này cũng cho phép

tạo ra được những cơ th ể có tái tổ hợp gen ở những loài cây đa bội hoậc có cơ quan sinh
sản hữu tín h p h át triể n kém.

Sau đây là m ột số thành tựu của việc ứng dụng kỹ thuật dung hợp protoplast đối với
việc cải tiến giống cày trồng.

ở

chi cải Brassica, nhờ dung họp protopỉast mà người ta đã tái tổng hợp được loài

Brassica napus từ hai loài B. oleracea và B. campestris.

-ở thuốc lá, loài N.tabacum dễ nhiễm vi khuấn gây bệnh đốm lửa và nấm đen; trong
khi đó, ỉồi N . rustica chống được các bệith trên. Con lai hữu tính giữa hai lồi này bát
thụ. N hưng con lai soma giữa chúng lại hữu thụ và cổ khả nâng kháng các bệnh kể trôn.

- ỏ các c&y họ cà, nhờ kỹ thuật dung hợp protoplast mà người ta đã tạo ra được con
lai som a giữa khoai t&y với các loài khác của chi Solanum, vốn khổng lai được với nhau
bằng phương pháp hữu tính, mà lại cố tính kháng bệnh cao.

- ỏ cây họ đậu, bằng kỹ thuật dung hợp protopỉast người ta đã tạo ra được con lai
soma giữa cỏ ba lá {Trifolium repens) với cây Međi (Medicago sativa) và được sử dụng
trong việc sản xuất chđt tanin tit lá. Tương tự như vậy, con lai soma giữa đậu tuang
trồng với các lồi hoang dại - ví như giữa Glycine max với G. tom m tella • cũng đã được
tạo ra.

ở cây lOa, tròng một

chựợRg

trinh hợp

tốG

nghiên eđy giSa IIQII với TVưbng

DH
Tổng hợp N o ttỉn ỉ^ a m (Anh), nhờ sử dụng kỹ th u ật dung hợp protopỉast Dgười ta đã tạo
được m ột sđ giống lúa cổ tính bát thụ đực tế bào chất nhưng lại cđ khả năng chổng chịu
s&u bệnh và nhiệt độ thấp.

- Riêng đối với cây lúa mi, mậc dầu người ta đâ bỏ ra rấ t nhiều công sức để nghiên

cúu nổ, như ng cho đến nay những kết quả thu được trong lỉnh vực này còn rấ t hạn chế.

</div>
(10)<div class='page_container' data-page=10>

107

Chương

6

KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ ÚNG DỤNG CỦA NÓ TRONG

CHỌN GIỐNG THựC VẬT

6.1. Mỏ ĐẦU

6.1.1. Khái niệm chung

Xét cà ở góc độ kỹ th u ật di truyền thực vật và sinh học thực vật ndi chung, kỹ th u ậ t
chuyển gen là m ột công cụ có tiềm năng trong viêc giải quyết m ột số vấn đề hiện đại
của sinh lý học, sinh hoá học, sinh học phát triển và di truyền học. Rố ràn g kỹ th u ậ t
chuyển gen thực vật sỗ tác động mạnh đến sự phát triển của kỹ th u ậ t tách dòng gen,
giúp cho việc làm sáng tỏ hơn mối liên hệ giữa kiểu gen với kỉểũ hinb; và do vậy sẽ tạo
ra những thành tựu to lớn mới trong việc xác định các gen có lợi trong các nghiên cứu
lý thuyết và ứng dụng.

N hững bước phát triể n của kỹ thuật chuyển gen thực vật đả bát nguồn từ những
th àn h công của các hệ thổng chuyển gen ở động vật cđ vú và nấm men. 'I\iy nhiên, khác
với ở động vật, kỹ thuẠt chuyển gen thực vật trở nên rất phức tạp do sổ lượng lớn của
các lồi và tính đa dạng của chúng. Mặt khác, bản thân qúa trỉnh này gập nhiều trở ngại
lớn, như thành tế bào thực vật là một hàng rào ngàn chặn rá t hiệu quả đối với sự xâm
nhập của các phân từ ADN. Cịn đối vói các tế bào sinh dục hay hợp tử th ỉ ADN khổng
cổ khả năng lọt vào được. Phữi non thi rấ t bé và được bao bọc bởi các lớp m àng cứng.
Các t ế bào của mữ ph&n sinh cũng không cho phép các gen hoạt động cổ th ể đi tới được.
Hơn nữa, kỷ th u ậ t thụ tinh in vitro được sử dụng cho các thao tác đổi với noãn, hợp tử

và tiền phôi ỏ thực vật vẫn chưa phải là dễ dàng như ỏ động vật.

</div>
(11)<div class='page_container' data-page=11>

108 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ ỦNG DỤNG CỦA NÓ..

t ế bào som a nào cũng cđ được khả n&ng đđ.

Kế từ 1984, là lức người ta b á t đầu gẫy tạo được cAy chuyển gen, đến nay kỹ th u ật
này đa có những bước tiến rẩ t lớn. Những th àn h cống của nổ khững chi giới hạn ở những
cây m ang tính chất mỗ hình như thuổc lá và các cây họ cà, m à còn đ ạ t được những kết
quả ÚDg dụng d một số c&y trống quan trọng (xem bảng 6.1).

vì

thế, chúng ta có cơ sở
để hy vọng rầng, trong tương ỉai kỹ th u ậ t gen sẽ trd thành một cống cụ hỗ trợ khỏng
th ể thiếu được của chọn giổng thực vật.

6.1.2. Các c&y được chuyển gen

N hững cáy được chuyển gen, m à trong đổ các gen được di truyền theo kiểu Mendel,
khống chỉ giới hạn d những c&y ” mố hình * như thuổc lá, Petunia, Arabidopsia m à còn
bao gồm r ấ t nhiều loỀũ c&y khác, như danh sách ở bảng 6.1. dưới đ&y.

Bảng 6.1. Các loài cây trỒDg đă đirọx chuytn gen

Cây trồng Tãt Uệu tham kbảo

Lúa (Oryza sattva ) Shimamoto et aL(ỉ989X Datta et ai. (1990 )

Ngô (Zea mạys) Donn et al<1990), F t a ^ et ai. (19^>

Lùa mì Ợriticum aestivum) VasO and Vasll (»92).

Đậu tucmg (Glycừư mac ) Htachee ct al. (1988), Chístou (1992>

Bâng (Goísyplum hừsutum) Flroazabada et aL (1987),Periak et al. (1990> *

Khoai tây (Solamm tuberoam) DeGrecí et aL (1989), Lavraon et al. (1990>
Cà chua (LyccỊỉersiccn esculerưum) Timier et aL (1987), Smlth ct aL (»88, 19W>
Cải d&i (Brassica napus) Gucrchc ct al. (1987), Radke ct àl (1988>

Đậu Hà Lan {Pừum ỉotịvum) Puonti-Kaerias èt aL ((1990>

Bắp cảl (Broĩstca oleraexđ) Toríyama et aL (1991>

Đu đủ (Carlca papi^a) F its^ et aL (19%>

Tão tỉy {Aíabir panulà) Jatncs et íà. (]989> Lambert (1991>

Cỏ đufll bâu Ợestuca anmdinacea) >Afang et aL (Ỉ992)

Cỏ nốn ựìactylừ glomerata) Horn et aL (1988>

Linh Bng {Medicago sattva) Shahin et aL (B86XH10 et al. (1991>

Rau d íp {Lactuca sattva) Chupcau et aL (1989)

Nho

{ỵuis

rupestrừ : V. vừiựera) Mullins et aL(1990>

Mận (Prumis domatica) Maite et

aL

(&91>

Dương (Pepulus dba X grandidenma) I^tỉxxid et aL (1987>

Óc chố ựugìans regia) McGranahan et al. (1988).

câm ciiuớng (Dianlhuỉ cayophyưus) Lu ct aL(1991>

Dă yên (Peĩunia hybrtda) Van dcr Ktoí et aL (1988>

</div>
(12)<div class='page_container' data-page=12>

6.2. MỘT SÓ NGUYÊN TẤC SINH HỌC CỦA VIÊC CHUYỂN GEN

c<5 m ột số yếu tố sinh học ảnh hưởng đến quá trỉnh chuyển gen. Biết được điều này
ta sẽ th iết kế các thí n ^ iệ m sao cho thích hợp hơn. Khống phải tấ t cả các tế bào trong

cơ th ể đều cd tính tồn thế; các cây khác nhau cổ phản ứng khổng giống nhau với sự
xâm nhập của m ột gen lạ. Một loại cây nâo đđ cđ th ể được biến nạp khi nó cđ khả nâng
tái sinh và chấp nhận sự biến nạp. Mữ t ế bào là một tập hạp của nhiều tế bào cổ phản
ứng khác nhau khi gặp m ột yếu tổ tá c động tới. Một sổ ít tế bào trong cây có khả năng
tái sinh và tiếp nhận sự biến nạp. N hững tế bào khác sẽ chi có một trong hai khả năng
ấy. Một số lượng lớn tế bào tro n g cơ th ể có th ể điều chỉnh được khả nảng đtí, m ột số
khác, ngược lại khơng làm được điều đó. Tương quan giữa các quằn th ể tế bào kiểu như
vậy tuỳ thuộc vào loài, kiểu gen, cớ quan, thậm chí tùy từng vùng trong một cơ quan.
Một trong các cơ chế có th ể chuyển các tế bào từ trạ n g thái tiềm ẩn sang trạ n g thái thực
sự cđ khả n àn g tái sinh là sự xuất hiện thương tổn trên cơ thể. Phản ứng với sự thương
tổn có lẽ là cơ sở sinh học cho sự tăn g sinh và tái sinh của các tế bào soma. Tuy nhiên,
phản ứng này khác nhau giữa các loài cây, cũng như giữa các nhóm tế bào trong cùng
m ột cây. Ntíi chung, các cây hồ thảo và ctí th ể là các cây họ đậu nữa, phản ứng này là
rấ t yếu. Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của ADN. thế, gen chỉ có th ể được đưa
vào trong tế bào thông qua Agrobacterium, virut, bằng phương pháp vi tiêm hay súng
bán gen. Và, việc chuyển gen chỉ th àn h công khi đưa được gen vào nhdm tế bào có khả
n ăn g tái sinh và tiếp nhận gen lạ. TViy nhiên, khả năng biến nạp khống cổ liỗn quan chặt
chẽ đốn khả n ă n g biểu hiện của gen được biến nạp. ADN không phải của v in it cđ th ể
liên kết với hệ gen của vật chủ và khững di chuyển từ tế bào này qua tế bào khác. TVong
khi đó thỉ, các ADN của virut lại khống liên kết với hệ gen của vật chủ, thậm chí cả khi

nổ có rấ t nhiều bản sao trong tế bào vật chủ. ADN, ARN kiểu virut di chuyển từ tế bào
này qua tế bào khác và cd th ể lan truyền kháp trong cây, trừ vùng mỡ ph&n sinh.

Phản ứng cùa các loại tẽ bào thực vật với quá trình chuyển gen

Mục đích chính của một qui trìn h chuyển gen là đưa một cách ổn định một đoạn
ADN vào hệ gen nhân của các tế bào có khả năng phát triể n thành m ột cây biến nạp.
Nếu sự biến nạp xảy ra mà khỏnịg có sự tái sinh kèm theo, hoặc sự tái sinh diễn ra mà
không kèm theo sự biến nạp thì thí nghiệm biến nạp chưa thành công, ở rấ t nhiều loài
thục vật điều khd khăn ỉà phải xác định cho được kiểu tế bào nào trong c&y có khả năng
tiếp nhận sự biến nạp. H ạ t phấn hay t ế bào trú n g sau khi được biến nạp cd th ể được
dùng để tạo ra cây biến nạp hoàn toàn, thơng qua q trìn h thụ tin h bình thường. H ạt
phán thường được coi là đối tượng lý tưởng để gây biến nạp. Trong khi đd, việc biến nạp
gen vào hỢp tử in vivo hay in vitro lại gập nhiều khó khăn. TVong trường hợp này, người
ta thường phải kết hợp với kỹ th u ậ t cứu phôi. Việc biến nạp gen đổi với các tế bào đơn
của các mô phức tạp như phôi hay mỗ phân sinh thường cho ra những cây khảm.

Từ nhiều th ập kỷ qua người ta đã biết rằng, tính tồn th ế của tế bào thực vật đă tạo
điêu kiện cho sự tái sinh cây hoàn chinh in vitro qua quá trin h phát sinh cơ quan (hỉnh
thành chồi) hay phát sinh phôi. Các chồi b ất định hay phơi được hình thành từ các tế bào
đơn được hoạt hoá là những bộ phận dễ dàng tiếp nhận sự biến nạp và có khả năng cho
những cây biến nạp hoàn chỉnh (khỏng có tính khảm). Bảng 6.2 nêu lên khả năng sử

</div>
(13)<div class='page_container' data-page=13>

110 KỸ THUẬT CHUYỂN QEN VÀ ÚNG DỤNG CỦA NÓ
d ụ n g c á c l o ạ i t ế b à o . k h á c n h a u v à c á c h p h á t h iỘ D c á c cAy b i ế n n ạ p .

Bàng 6.2. Phưvng pháp thu nhận cây biến nạp từ các kỉều tế bào khác nhau

Kiều tế bào Phiibng {diáp thu nhận cãỵ uến liạp

1/ T í bào nuồi cấy

2/ Pbũt chưa chín hỉ^ các tế bào
phân sinh cơ quan.

3/ Các tế bào ở pbũi chưa chín và
mơ phân sinh hoa.

4/ Hạt phấn.

5/ Hợp tử.

Sự phát sinh cơ quan hay phát sinh phối qua pha cailus.
Tái sinh cậy in vitro từ các dòng tế bào biĩn nạp.

Sự phát triền tỉếp tục của pbâl, chãi hay hca sẽ cho ra niột cây ktaảm.
Hạt pìứia cố ngn gốc từ các dịng t£ bào biến nạp được sử dụng chũ
việc tạo ra các hạt cây đuợc biến nạp nhờ quá uình ưiụ tinh bình
thường.

Tạo các cây biến nạp trực uếp qua con đường thụ tinh V Ớ I hạt phấn

nảy mầm hạy hạt phấn chín đang phát tilèn mà ADN của nố đầ b| xử
lý bềến Ịiíp.

Phát triền trực tlỉp cây được biến nạp.

6 3 . KHÁI NIỆM CHUNG VỀ CÁC VECTỮ s ử DỤNG TRONG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN

Cáp vectơ được sử dụng trong biến lịạp di truyỄn của các t ế bào Eukaryote nổi chung

hay của t ế bào thực vật nổi riông đều cổ một sổ dặc điếm chung (hinh 6.1.A). P h ần ỉớn
các vectơ đdu cố chứa các thành phán sau; l)_gữn khdỉ động (promotor) thường có nguốn
gổc hoặc liốn quan trực tiếp với thực vật, như CaMV-SSS-promotor, 2) m ột đồạn kết thúc
(term in ato r), thưỜDg đang được dùng phổ biến 1& noa-terminator hay 
CaMV-35S-term inator, các đoạn kết này phải cd một trậ t tự tín hiộu polyadenin hố như là AATTÂÂ
hoặc ÂÂCCAÂ, giúp cho mARN được bền vững hơn; 3) một đoạn chịu trách nhiệm cho

B

GcnkhánB
kháng sinh VK

Promotor
oA aryote ^

V ù n » 3 'c h ử a
tín hiệu
poầyademnhố

Gcn
cUtlii
chọn lọc

r

ĐoạnmAhoAgen
kháng kháng slidi

vi khuẩn

</div>
(14)<div class='page_container' data-page=14>

quá trỉn h tái bàn, có nguồn gốc từ vi khuẩn, như CoỉEl; 4) một đoạn chứa m ột số tr ậ t
tự nucleotit đặc trư ng cho sự nhận biết của enzỵm giới hạn MCS (muỉticloning sites); và
5) các gen chỉ thị, cho phép nhận biết các tố bào được biốn nạp nhờ các quá trìn h chọn
lọc ở t ế bào vi khuắn hoặc sàng lọc d các mô tái sinh. Các gen này cổ tính trội và cổ
nguốn gốc từ vi khuẩn, m à hoạt động của chúng chịu sự kiểm soát của các prom otor kiểu

Eukaryote, thường là từ v init khảm thực vật (hỉnh 6.1.B). Người ta thường dùng các gen
chỉ thị kiểm sốt tính kháng chất kháng sinh như kanamycin, m ethotrexat hay các ch ất
diệt cỏ, như glyphosat hoặc bialaphos. Để cho việc chọn iọc cổ kết quả thi các t ế bào được
xử lý biến nạp phảỉ m ẫn cảm với các chất nổi trê n ở nòng độ tương đối thấp. Còn các
gen chỉ thị dùng để sàng lọc thường là những gen của vi khuẩn m ã hoá cho các enzỵm
dễ p h át hiện như chloramphenicol acetyl transferase, ^-glucuronidase, luciĩerase, nospalỉn
sy n th ase và octopine sy n th ase.' Thông thường, người ta hay sử dụng tín h kháng
kanam ycin để làm kiểu hình chỉ thị cho việc chọn lọc và sự ctí m ặt của ^-glucuronidase
để làm chỉ thị cho sự sàng lọc các tế bào thực vật được biến nạp.

Các plasm id đã m ang những yếu tố chung như vậy lại có thêm những gen chỉ thị đặc
biệt cho phép xác định sự biểu hiện của gen cần đựơc chuyển ỏ tế bào thực vật cổ th ế
được dùng để chuyển gen trực tiếp vào hệ gen nhân của thực vật.

Một m ặt khác, người ta lại thiết kế những kiểu vectơ đặc biệt, trong đó có sử dụng
thêm m ột ph&n plasm id của vi ỵhnẳn AgrobacỀerium y k thực hiộn quá trỉnb biến nạp tự
nhiôn thống qua hoạt động của loại vi khuẩn này. Loại vectơ này cổ chúc năng chuyển
gen và phổ tá i bản rộng, cho phép tiếp hợp giữa E x o li với Agrobacterium và duy trỉ được
plasm id ở cả hai loại vật chủ đổ.

K.4. CÁC PHUữNG PHÁP CHUYỂN GEN

Hiện nay, cổ n h iỉu tài liệu đs cập tdi các phương pháp chuyển gen khác nhau ở thực
vật. Tuy nhiên, ctí thể nẽu ra dưới đây M n phương pháp chính đa đựơc áp dụng th àn h
công ở m ực vật :

1- Biến nạp gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium (Binns, 1990).
2- Biến nạp trực tiếp qua protoplast (Paszkowski, 1989).

3- Biến nạp bàng súng bắn gen - gene gun hay biolỉqtics (Sanford,1988).
4- Biến nạp bàng vi tiêm - microinjection ( Schnorí e t al.,ỉ991 ).

6 .4 .ỉ . C h u y é n g e n n h ờ iAgmbacterium

Vào đầu thố kỷ XX ngưòi ta đã biết đỂa hai loài vi khuẩn sống trong đSt là Agrobacterium
tumefaciens và A rhừogenea gây ra các bộith kh(fi u hỉnh chđp và lổng td d phần cổ rS của
nhiều cây hai lá m&m. v s sau, người ta đ& xác định được ràng, hai ỉoại vi khtiẩn này chứa hai
loại plastnid cổ kích thước Idn là Tí-plasmỉd , gây ra kh<fi u (tumour indudng = Tỉ ) và
Ri-plasmid, gây ra lông tơ (root indudng = R i ). Dđ là những vectơ od khả năng chuyển một
sổ gen của chúng sang tế bỄUỉ thực vật. Quá trình này cổ sự tương tác giữa vi khuẩn và cây
chủ. TVong nhiều thập ^ qua, những khía cạnh sinh học của hiện tượng này đa được ns^iên
cứu khá kỹ. I k sẽ đề cập tới nổ ở những phần sau.

• 'Ti-plasmid là nhân tế gây biẽn nạp tự nhiên ở thực vậí

P h àn lớn các loại Ti-plasmid cđ kích thước khoảng 200kb và gòm bốn vùng A, B, c

</div>
(15)<div class='page_container' data-page=15>

112 KỸ THỤẬT CHUYỂN GEN VÀ ÚNG DỤNG CỦA NÓ. . .
và D.

Vùng B cổ liỆn quan đến sự tái sinh.
Vùng c cd liéa quan đến sự tiếp hợp.

Vùng A luốn iudn được truyền sang tẽ bào thực vật nên cd tên là T-ADN (transĩerred
ADN) - hlnh 6.2.1 l ỵ đây ctí hai hộ gen : 1) hệ gen gây khối u onc (oncogenic), ntí chứa
ít n h ất 3 gen chịu-^ách nhiệm tổng hợp các phytohormon auxin và cytokỉnin (hỉnh 6.2C)
và do đổ cd liốn qnan đến việc sản sinh ra và duy trỉ sự phân chia tế bào liên tục; 2) hệ

A

■ ■ M T - A P N :

V t e « d Ị Ị « c c h u ] r 6 i
v à o d k ỹ đ ỉs« y k M lo

VàngtwmgdAiitctai«
chomviTI-planM

VừDgslV<4c
(Ỹlr)

vàosaAỵ
kbỐlD(Oiic)

Phtagiii

TKphop
plasnM

yừttgOnc

I I

"shooty" "rooly"
locus locus
í— ^--- M---1

tnu 2 ỉms I tmr

TOOCCCATATATATCTGCTCTAAÀC TCACAGCATATATTGCCCCGTAAAC

tryptopluB ị ^ ị ladoi-3acctamkl

Ii^nt

amteohydrolase

tms 2
Ị
ị

ị

lAA (AUHN)

dlMthylallyipyroplHMplul

(DMA)^AMP

tnir

mmiMmt

DMA*tnMfcr»M 5* moDOphosphat

noors

ị

bopenienyladeoasln (CYTOKIHIM)-^SHỎOTS

</div>
(16)<div class='page_container' data-page=16>

co sỏ

DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THựC VẬT 113
gen m ã hoá cho một số enzym điều khiển quá trình tổng hợp các dẫn xuất của các axit
am in hay đưòng, gọi là opine. Hai loại enzym đã được nghiỗn cứu kỹ n h ấ t là octopine
synthase và nopaline synthase.

Vùng D ctí tên gọi là vùng độc (virulence region), chứa các gen vir, giữ vai trò quan
trọng tro n g việc chuyển T-ÂDN vào hộ gen nhAn của tế bào thực vật.

Ngoài ra, mỗi Ti- plasmid còn chứa các gen'nầm ngoài vùng T-ADN m ã hoá cho các
enzym phân giải opine dế làm nguốn dinh dưỡng cacbon và nitơ cho vi khuấn. Dưới đfty
ta sẽ xem xét chỉ tiết hơn về cáu tạo và chức năng của vùng T-ÁDN và vùng vir.

• T-ADN và các trật tự biên 25bp

Vùng T-ÁDN cố kỉch thưỏc từ lOkb đến 20kb, Đ ằ m kẹp giữa hai trẠt tự 25bp lặp iại
khỗng hoàn chỉnh gọi là biên trái ( Ieft border ==LB) và biên phải (right border sR B ).
'Ibàn bộ phần giới hạn giữa hai đoạn biên này đều được chuyển sang t ế bào thực vật. LB
và RB là những yếu tổ c&n thiết để định hướng cho sự chuyển ÂDN. Viộc m ất đi 6bp đàu
tiên hoặc lObp cuổi cùng trong sổ 25 bp đều ngăn cản sự chuyến của T-ÂDN. Quá trìn h

chuyển T-ADN được b át đầu từ vị trí RB và kết thúc ở vị trí LB. Sự định hướng này là
r ấ t quan trộng, nếu khổng việc chuyển sỗ kém hiệu quả. IVong các gen được m ã hoá ở

vùng T-ÂDN cố 3 gen rấ t quan trọng trong việc phát triển khổi u : một gen m ã hoá cho
enzym AMP- isopentenyl trạnsferase và 2 gen m ã hoá cho enzjrm tham gia vào sinh tổng
hợp auxin (tryptophane-2mono oxygenase và acetam ỉd hydrolase ). Sự hoạt động của các
gen này tạo điều kiện cho sự phát triể n củĩi t ế bào thực vật cổ sự phụ thuộc vào auxin
và cytokinin. Dặc điểm này đựợc sử dụng để chọn lọc các tế bào được biến nạp từ trong
phần lớn các tế bào khống được biến nạp. Cần lưu ý là, khống cổ một gen nào tro n g vùng
là cần th iết cho việc chuyển của T-ADN. Việc chuyển đi của vùng này m aog tính th ụ
động. IXiy nhiẽn, T-ADN trong các khổi u thực vật thưịng có kích thưóc ổn định như
trong Ti- plaamid. Vì th ế cd thể coi mỗi T-ADN là 1 đơn vị được gấn vào hệ gen thực vật

</div>
(17)<div class='page_container' data-page=17>

114 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ ÚNG DỤNG CỦA NÓ.
m à khống c&n cổ sự biến đổi nào.

• Vùng vir

Chính hoạt động của vùng vir đđng vai trò quan trọng cho việc chuyển T-ADN sang
tố bào thực vật. Nó lớn khoảng 40kb và bao gồm 6 operon (hinh 6.3): virA, B, D và G là
hoàn to àn cần thiết cho việc tạo ra độc tính; cịn virC và £ thi liên quan đến việc hỉnh
th ành khối u. Trừ virG và Â còn các operon khác đều là đa cistron. Nói chung, gen virÁ
biểu hiện ở mọi điều kiện; gen virC biểu hiện thấp ở các tế bào sinh dưỡng nhưng th ể
hiộn r á t m ạnh ở các dịch chiết từ các mô bị thương ưỉn. H oạt động của các operon này
cổ li6n quan ch ặt chẽ đến sự có m ặt của các hợp ch ất phenol được tiết r a từ vết thương
của cây. Từ vốt thương cây thuốc iá người ta đă tinh chế và xác định được các hợp chất
này là acetosyringon và aỉpha hydroxyacetosyringon.

• Q trình chuyển T-AĐN

Doạn T-ADN muốn được chuyển, trưốc tiên nd cần phải được hoạt hố. Chính hoạt
động của các gen vir đdng vai trò này. Hiện tượng này xảy ra khi Agrobacterium bát dầu
tiếp xúc với hạp chát chứa phenol được tiết ra tỉí vết thương của cây họăc từ các tế bào
nuôi cấy hay protoplast. Đàu tiẽn là sự hoạt động của các sản phẩm được tạo ra từ gen

Tế bào ở vùng
b| thuơi^ tổn

0 o

acetoseríngon

chemotaxis

Hình 6.4. Những sự kiện chính xảy ra khi các gen vir cùa Ti-plasmừi được cảm ứng bởi hạp chất chứa
phenoỉ -aceiosyringon dược tiết ra từ vếi íhương cảa cây.

</div>
(18)<div class='page_container' data-page=18>

G õ Sỏ DI TRUYEN CHỌN GIỐNG THựC VẬT 115
virÂ (protein virÂ). Protein này nằm ở m àng trong của tế bào Agrobacteriurh, đdng vai
trò như là m ột chát thụ cảm đối với acetosyringon cd trong mữi trường. Tín hiộu này sỗ
được truyền dẫn qua sự hoạt hoá (cđ lẽ bằng việc phosphoryl hoá) gen virG. P rotein virG
sau đố lại gán vào gen chỉ huy nằm sá t gen khởi động thuộc các gen vir khác. Bầng cách
như vậy, protein của gen virG đã được hoạt hoá ỉàm tãn g quá trinh phỉèn m& của chinh
nó, đồng thời làm giảm quá trỉn h này của các operon B, c, D và E (Zambryski, 1988) -
hinh 6.4.

Trong tiến trin h chuyển T-ADN, d giai đoạn đầu xuát hiện các vết cát Ti-plasmid tại
2 trậ t tự biên 25bp, ở vị trí giữa bazơ nitơ thứ ba và thứ tư của mạch đơn nằm phía dưói
(hỉnh 6.5). Từ đố 1 mạch đơn T-ADN được giải phổng ra khỏi Ti-plasmid và thay th ế vào
đó là 1 mạch đơn mới được tổng hợp theo hướng 5’- 3’, bất đầu tií chỗ đứt của tr ậ t tự

biên phải (RB). Diều này giải thích tạ i sao trậ t tự biên phải lại cần thiết cho sự chuyến
T-ADN. Operon D chủ yếu m â hoá m ột loại endonuclease tạo ra các vết cát nổi trôn tại
hai trậ t tự biên. Sự hỉnh th ành m ạch đơn T-ADN được tă n g cường nhờ sự tương tác giữa
protein virD2 với 1 hoặc 2 protein do gen virC mâ hố. Cịn protein gen virE2 thl gấn
vào mạch đơn T-ADN sau khi được cắt ra, để làm cho nd ổn định trong quá trìn h chuyến
vào nhân tế bào thực vật. Phức hỢp protein- mạch đơn T-ADN là cấu trúc cần th iết cho
việc chuyển T-ADN sang tế bào thực v ật và nó phải được sản sinh ra từ Agrobacterium.

Còn gen virB m ã hố cho ít n h ấ t 11 protein để hỉnh thành nên một cầu nối, cho phức
hợp trên được chuyểri từ Agrịbactèrìum sahg tế bàố thực vật.

</div>
(19)<div class='page_container' data-page=19>

116

KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ ÚNG DỤNG CỦA NĨ. .
• Các h ạ i vectơ đựa trẽn Tĩ-pìasmid

Ti-plasmid khổ được dùng trự c tiếp trong các th í n ^ i ộ m chuyến gen, vỉ nd cổ kích
thưốc lớn và m a ĩ^ các gen gây khối u; hơn nữa ADN của Ti-plasmid cố quá nhiều chỗ
đ ế các enzym giới hạn cổ th ế cát, trong khi đđ người ta chỉ cần m ột số ít vị trí như vậy
m à thdỉ.

l\iy nhiên, Ti-plasmid cổ th ể cung cáp cho ta nhữ ng y íu tổ cán th iết để th iết kế
những vectơ hữu ích cho kỹ th u ậ t chuyển gen. Thường người ta hay sử dụng các

Ti-VIR

RES

C o l EI

B

MSC

RK2

VIR

o riT

Hình 6.6. Sơ đ ĩ các kệ lầổi^ vecta tiÌH hợp (A) và nhị thê (B):

Vlr vùng gậy độc; HCM : các vùng tuxmg đ&ng, mà trong phạm vi đó sự tái t& hợp (trao đối chéo) cố tbề xảy
ra d&i (fên S»Ị hợp nhất giữa lãi piasmid; RB và L& các đoạn trật tự bi£n pbải và u â 2Sbp d á T-AE^ (

LB boặc RB hoặc cả hai có thề cố ở vectơ tnng glan^ MCS: đoạn mang các tr^ tự nudeodt đề enzym giối
hạn nhận béỄt; PTM: gcn chi th| sàng lọc biến ở t í bào Uiực vật; RES: gen chi thi Mỉ^g chất kháng sinh đề

</div>
(20)<div class='page_container' data-page=20>

co sỏ

DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THựC VẬT 117
plasmid, mà trong đó vùng T-ADN gây khối u đã bị tách bỏ và thay th ế vào đđ là các
gen trội chỉ thị cho chọn lọc - thường là các gen vi khuẩn kháng chất kháng sinh, như
kanamycin. Trước đây, người ta hay dùng các gen chỉ thị được kiểm soát bởi prom otor
và các tín hiệu polyadenin hoá được tách ra từ các gen vùng T-ADN như octopine
synthase hay nopaline synthase. Gàn đây, người ta hay sừ dụng các prom otor m ạnh hơn
được tách ra từ virut khảm báp cải, như CaMV35S và CaMV19S. Tuy nhiên, kích thước
lớn của Ti- plasmid rấ t khó khăn cho việc gán trực tiếp m ột phân đoạn ADN vào vùng

Vectơ liên hợp

A

pGV3850

Vectơ trung gian

P G V 1 1 0 3

Vỉr region

pBR322
BOB-ODCOgemic

GenctóthỊ
chọntọcỗ
TB thục vật

nos

iCm'

^ịịBSSSBĩP ^

Genchỉ thi
chọn lọc ôvk

A p '

B

Ã

'

____

Tái tổ hợp các

d o ạ n tư ơ n g đồng

Vectơ liên hợp kấơng gây khối u

Tí p lasm ld pGV3850::1103

D—tSBSỀ— fc - ' » '

nos-npl II
gcn

Btếnnạp

pGVlỉ03

I

__Tiếp hợp

^ ^ L Tiếp hợp

Tái l ổ hợp c á c đ o ạ n tương đỏng

'N.

I

r bO " "■

POV1103

pCVSáso

>

Agrobacterỉum

</div>

Giáo trình Cơ sở di truyền chọn giống thực vật: Phần 2

<i><b>Chương </b></i>

<i><b>5</b></i>

<b>LAI TỂ BÀO SOMA</b>

co sỏ

<b>( + )</b>

<i><b>ị</b></i>

6

ở

ở cây lOa, tròng một

trinh hợp

nghiên eđy giSa IIQII với TVưbng

<i><b>Chương</b></i>

<b>6</b>

<b>KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ ÚNG DỤNG CỦA NÓ TRONG</b>

<b>CHỌN GIỐNG THựC VẬT</b>

<b>vì </b>

<i>{ỵuis </i>

<i>aL</i>

r

<b>A</b>

<b>yừttgOnc</b>

co sỏ

116

Ti-VIR

RES

B

MSC

RK2

VIR

co sỏ

<b>Vectơ liên hợp</b>

<b>A </b>

<b>Vectơ trung gian</b>

<b>B</b>

<b>Ã</b>

<b>'</b>

____

Tái tổ hợp các

Vectơ liên hợp kấơng gây khối u

<b>I </b>

<b>____Tiếp hợp__</b>

<b>'N. </b>

<b>I</b>

<b>pCVSáso </b>

<b>></b>

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

<b>__Tiếp hợp</b>