Ứng dụng công nghệ sinh học trong xác định tính đồng nhất, tính khác biệt và tính ổn định của lúa phục vụ cho khảo nghiệm DUS

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (663.47 KB, 7 trang )

(1)<div class='page_container' data-page=1>

Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất

Ứ

NG D

Ụ

NG CÔNG NGH

Ệ

SINH H

Ọ

C TRONG XÁC

ĐỊ

NH

TÍNH

ĐỒ

NG NH

Ấ

T, TÍNH KHÁC BI

Ệ

T VÀ TÍNH

Ổ

N

ĐỊ

NH

C

Ủ

A LÚA PH

Ụ

C V

Ụ

CHO KH

Ả

O NGHI

Ệ

M DUS

Lưu Minh Cúc, Lưu Thị Ngọc Huyền, 
Lê Huy Hàm

Viện Di truyền Nông nghiệp

SUMMARY

(Application of biotechnology in identifying the distinctness, uniformity, 
stability of rice varieties to aid for DUS testing)

This study aimed at developing procedures for identifying the distinctness, uniformity, stability of
rice varieties to aid for DUS testing. The collection of 261 lines/varieties, which are abundant about
sources, desease resistance, tolerance to biotic and abiotic stresses, were used in screening. Using the
information from published data about DUS testing on rice in country around the world like China, Brazil,
India..., walk along 12 rice chromosomes, 557 markers were selected. The use of those markers to
screen with the large numbers of rice varieties were carried out. A strategy of upside down conical in
many steps of screening was applied. At last, a reference set of DNA markers were selected. This set was
including 30 markers. Procedures for identifying the distinctness, uniformity, stability of rice varieties to
aid for DUS testing were developed. These procedures are tightly suitable to current DUS testing
regulations. In addtion, a software namely DUS-DFP, with the DNA fingerprint data of 180 rice varieties
base on 30 reference markers, was developed for applying all the results of this study in DUS testing
purpose.

Keywords: biotechnology, distinctness, uniformity, stability, DUS testing, rice.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ*

Theo tiêu chuẩn của Hiệp hội Quốc tế về

Bảo vệ Giống cây trồng mới (International
Union for the Protection of New Varieties of
Plants), các cây trồng mới được chọn tạo phải
trải qua khâu kiểm nghiệm theo tiêu chí DUS
(bao gồm khảo nghiệm tính khác biệt -
distinctness, tính đồng nhất - uniformity và tính

ổn định - stability). Trong 10 năm gần đây, mỗi
năm Trung tâm Khảo Kiểm nghiệm giống, sản
phẩm cây trồng Quốc gia thường gặp phải tình
trạng (5 - 10 trường hợp mỗi năm) các giống

đưa ra khảo nghiệm có các đặc điểm hình thái
(thỉnh thoảng cả đặc điểm hóa sinh) khó phân
biệt. Trong một số trường hợp, giống cây trồng
của các tác giả khác nhau hoặc được nhập nội có
tên gọi khác nhau, nhưng về mặt hình thái lại rất
giống nhau, gây ra những tranh cãi khó giải
quyết. Câu hỏi đặt ra là thực chất chúng thuộc
một giống hay các giống khác nhau? Các tiêu
chí khảo nghiệm DUS truyền thống dựa trên 62

đặc điểm hình thái và hóa sinh cho thấy chưa đủ

Người phản biện: TS. Lã Tuấn Nghĩa

cơ sởđể phân biệt các giống với nhau. Điều này
gây nhiều khó khăn và cản trở trong việc xác
minh bản quyền về giống cây trồng. Những tiến
bộ gầy đây trong công nghệ sinh học nói chung
và sinh học phân tử thực vật nói riêng đã có
nhiều đóng góp tích cực khơng chỉ trong việc
chọn tạo ra những giống cây trồng mới mà còn
giúp phân biệt các đặc điểm di truyền của các bộ

giống mới được chọn tạo hoặc giống nhập nội.
Cho đến nay, nhiều nước trên thế giới sử dụng
hệ thống khảo nghiệm DUS dựa trên cơ sở các

đặc điểm hình thái và hóa sinh. Tuy nhiên, một
số quốc gia đã bắt đầu áp dụng phương pháp
ADN dùng cho khảo nghiệm DUS (Navraj và 
cs., 2009). Đối với công tác khảo nghiệm DUS

ở nước ta, việc xây dựng một qui trình giám

</div>
(2)<div class='page_container' data-page=2>

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
2.1. Vật liệu

- Tập đoàn 261 giống lúa thu thập
- 40 giống lúa đểđánh giá DUS
- 180 giống lúa để lập cơ sở dữ liệu

- 19 giống lúa điển hình của Trung tâm Khảo
nghiệm.

- 19 giống lúa giống nhau theo cặp trong
khảo nghiệm DUS năm 2010- 2012

- Tổng số 557 chỉ thị phân tử đã dùng để

khảo sát lập bộ chỉ thị tham chiếu

- Các vật tư hoá chất sinh học phân tử

chuyên dụng.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

- Tách chiết ADN tổng số theo phương pháp
CTAB cải tiến (của Phịng thí nghiệm Di truyền
học, Trường Đại học Gent, Bỉ).

- Phương pháp PCR (Michael and Simon
2006).

- Điện di gel polyacrylamide biến tính và
khơng biến tính (PTN IRRI-Phillipine).

- Thí nghiệm đồng ruộng được tiến hành
theo Quy phạm khảo nghiệm tính khác biệt, tính

đồng nhất và tính ổn định của giống lúa 10TCN

554-2002.

- Các biện pháp kỹ thuật khác được tiến hành
theo Quy phạm khảo nghiệm giá trị canh tác và
giá trị sử dụng giống lúa 10TCN 558-2002.

- Xử lý số liệu thu được bằng phân tích trên
phần mềm POPGEN 1.31 và NTSYS 2.1, Power
Marker 3.0.

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu xác định nguồn vật liệu và 
thiết lập bộ chỉ thị tham chiếu

Đề tài đã thu thập được tập đồn 261
dịng/giống lúa để sử dụng trong đề tài nhằm
sàng lọc tìm kiếm các alen có thể có trên các
giống lúa đối với các chỉ thịđược sử dụng trong
nghiên cứu.

Bước đầu tiên, nghiên cứu tiến hành khảo sát
261 giống lúa thu thập từ nhiều nguồn khác nhau

đối với 100 chỉ thị gồm 81 chỉ thị SSR rải rác
trên 12 NST có số lượng từ 3-8 alen và 19 chỉ thị

thiết kế khi nghiên cứu vùng bảo thủ của các

promoter tập trung vào các cis-element hay chính

là trình tự điều khiển để nhân tố phiên mã bám
vào và điều hòa biểu hiện gene và các EST ở lúa.
Mở rộng phạm vi tìm kiếm, bước tiếp theo

được tiến hành với 152 chỉ thị InDel marker
được thiết kế dựa trên sự so sánh trình tự hệ gen
của giống lúa Indica 93-11và giống lúa Japonica

Nipponbare, có thể xác định được sựđa hình từ

các đột biến thêm/bớt (insertion/delection) trong
hệ gen lúa. Đây chính là những chỉ thị đa hình
cao và hoạt động tốt được sàng lọc từ 756 chỉ thị

STS nằm trên toàn bộ hệ gen lúa với khoảng cách
2-3 cM/chỉ thị phân bố tương đối đều trên 12
NST của lúa. Sản phẩm nhân bản của đoạn ADN
từ các chỉ thị này có thể chứa ít nhất 5% đoạn
chèn-xóa khác nhau của kích thước các băng
nhận được (trong khoảng từ 100-400bp). Những
chỉ thị này có thể phân biệt rất tốt những sự khác
biệt giữa các giống lúa mới được tạo ra bằng lai
tạo, đột biến, phân biệt giữa các giống lúa thuộc
loài phụ Indica và Japonica... Để thực hiện tốt
hơn cơng việc sàng lọc tìm kiếm chỉ thị của đề

tài, chúng tơi đã tìm kiếm, tiếp cận thêm các
thông tin về chỉ thị phân tử, chọn lọc thông tin,
tiến hành thu thập và lọc cơ sở dữ liệu, từđó đề

tài đã sử dụng thêm các chỉ thị trên 12 NST, dọc
theo bản đồ genome của lúa, đã chọn được thêm
hơn 300 chỉ thị SSR đã cho kết quả hoạt động tốt
từ các nghiên cứu được tham khảo, đã được sử

dụng đểđánh giá đa dạng di truyền, nghiên cứu
sự khác biệt, lập bản đồ, đánh giá DUS... trên các
nghiên cứu trong và ngoài nước, cho băng ADN
rõ ràng để sàng lọc chỉ thịđa hình cao cho bộ chỉ

thị tham chiếu.

Nghiên cứu được tiến hành trên tổng số 557
chỉ thị SSR với 261giống để sàng lọc tìm chỉ thị

cho đa hình cao trên tập đồn giống lúa phong
phú. Chỉ những chỉ thị cho băng vạch rõ ràng và
có dấu hiệu cho đa hình sẽ được chọn cho bước
sàng lọc tiếp theo. Kích thước của các alen đối
với những chỉ thị cho băng vạch ADN rõ nét và
kích thước băng phù hợp được ghi nhận lại để

</div>
(3)<div class='page_container' data-page=3>

Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất

polyacrylamide. Thứ ba, các locus SSR được sử

dụng để phân tích phải nằm trên các NST khác
nhau đểđảm bảo cho tính độc lập của từng locus.
Thứ tư, các locus SSR nằm trên những vùng liên
quan đến hoạt động sống của cơ thể. Thứ năm,

các chỉ thị cho kết quả tốt, rõ nét, thuận lợi cho
sử dụng, dễ phân biệt trên gel polyacrylamide.
Bộ chỉ thị tham chiếu được chọn lựa khi hội tụ
đầy đủ các đặc điểm như yêu cầu ở trên.

Cơ sở khoa học để tính tốn sự khác biệt
trong việc xác định số lượng và chỉ thị cho bộ chỉ

thị tham chiếu: Mỗi kiểu gen (genotype) cây nhị

bội mang 2 alen đối với từng locus. Giả sử tần
suất xuất hiện tất cả các alen trong 1 quần thể

ngẫu nhiên là bằng nhau, đối với cây lúa là cây tự

thụ phấn (mỗi cặp alen là đồng hợp tử), số tổ hợp
các cặp alen sẽ bằng tích của số alen của từng
locut khảo sát (Riêng đối với cây thụ phấn chéo
là cây dị hợp tử, số tổ hợp các cặp alen sẽ lớn
hơn gấp nhiều lần so với cây tự thụ phấn).

Bộ chỉ thị sơ bộ gồm 5 locus: RM11: 5
alen; RM21: 6 alen; RM163: 6alen; RM 481:
12 alen; RM3412:11 alen. Nếu sử dụng cả 5
locus trên thì số tổ hợp cặp alen sẽ bằng 5  6 
6  12  11 = 23.760 tổ hợp. Hay nói một cách
khác, nếu sử dụng bộ chỉ thị bao gồm 5 locus
trên, ta có thể phân biệt được 23.760 mẫu lúa,
khác nhau ít nhất bởi 1 cặp alen.

Bảng 1. Danh sách các chỉ thị trong bộ chỉ thị tham chiếu 
TT Chỉ thị NST Số alen Kích thước alen (số bp)

A Bộ chỉ thị sơ bộ

1 RM11 7 5 120-125-132-136-140

2 RM21 11 6 125-128-132-137-150-156

3 RM163 5 6 130-135-140-153-160-170

4 RM481 7 12 124-132-139-149-154-158-172-177-182-192-210-224
5 RM3412 1 11 148-150-154-155-160-163-165-167-168-182-190
B Bộ chỉ thị tham chiếu chính thức: bao gồm 5 chỉ thị của bộ chỉ thị sơ bộ và 15 chỉ thị khác (từ 6-20)

6 RM1 1 6 80-89-92-105-122-125

7 RM5 1 5 105-110-115-118-122

8 RM6 2 4 142-150-156-165

9 RM17 12 6 150-154-160-175-180-185

10 RM25 8 6 128-132-134-140-142-145

11 RM206 5 8 125-127-130-135-145-152-160-178

12 RM215 9 5 96-100-103-106-109

13 RM333 10 6 170-175-178-180-189-200

14 RM3252 1 7 162-165-167-170-174-200-205

15 RM3843 4 4 165-170-175-182

16 RM7097 3 5 165-167-172-176-179

17 R4M13 4 4 172-188-200-218

18 MADS3 6 4 192-222-238-246

19 SO1160 1 4 170-175-187-210

20 S11033 11 6 162-165-170-175-178-180
C Bộ chỉ thị mở rộng: 10 chỉ thị

21 RM19 12 5 190-202-210-225-227

22 RM223 8 5 152-154-160-165-172

23 RM341 2 7 156-160-166-166-175-192-206
24 RM3486 5 6 215-221-225-230-250-253

25 RM5758 10 5 96-100-103-106-109

26 RM10825 1 4 82-87-92-100

27 RM17954 5 7 150-162-167-170-175-180-184-195-200
28 RM26063 11 6 112-122-130-134-138-143

29 MADS8 1 3 150-175-200

</div>
(4)<div class='page_container' data-page=4>

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Tổng số các alen của chỉ thị tham chiếu
chính thức là 120 alen. Nếu sử dụng 20 chỉ thị

của bộ chỉ thị tham chiếu chính thức, ta sẽ phân
biệt được 1,32434  1015 mẫu giống khác nhau

bởi ít nhất 1 cặp alen. Nếu tính thêm cả bộ chỉ thị

mở rộng ta sẽ có 172 alen, kích thước từ 80-253 bp.
Khi đó nếu sử dụng cả 30 chỉ thị trên thì sẽ phân
biệt được 1,40169  1022 mẫu giống khác nhau

bởi ít nhất 1 cặp alen.

Số lượng các alen đối với từng locut sẽ thay

đổi tùy thuộc vào tập đoàn giống nghiên cứu.
Trong phạm vi của đề tài, chúng tôi đã tìm và xác

định được các alen như bảng 1. Các đồng nghiệp,
tác giả khác khi sử dụng bộ chỉ thị này có thể tự

cập nhật thêm số liệu.

3.2. Thiết lập và thử nghiệm qui trình

Quy trình được nghiên cứu xây dựng dựa

trên nguyên tắc về sự phù hợp giữa chỉ tiêu DUS
với sự kiểm tra chỉ thị ADN như sau:

- Chỉ tiêu khác biệt: Phân tích một số lượng
nhất định các locus chỉ thị ADN cho phép thử

nghiệm kiểu gen quan tâm có khác với các kiểu
gen đã biết trước hay không và đồng thời xác

định khoảng cách di truyền giữa chúng.

- Chỉ tiêu đồng nhất: Kiểu gen đồng nhất di
truyền cần phải có phổ ADN giống nhau đối với
từng locus chỉ thị ADN.

- Chỉ tiêu ổn định: Hạt giống của một kiểu
gen cụ thể thu được ở các năm khác nhau thì phải
có phổ ADN của các locus chỉ thị ADN giống hệt
nhau và ổn định.

Việc thử nghiệm, xây dựng quy trình khảo
nghiệm DUS bằng chỉ thị phân tử cũng phải phù
hợp với các tiêu chí của khảo nghiệm DUS bằng
hình thái và hóa sinh hiện hành, bao gồm đánh
giá tính đồng nhất, tính khác biệt và tính ổn định.

Đối với quy phạm khảo nghiệm DUS hiện hành,
phương pháp chủ yếu đánh giá tính đồng nhất

căn cứ vào tỷ lệ cây khác dạng của tất cả cây trên

ơ thí nghiệm.

Căn cứ vào báo cáo kết quả khảo nghiệm
DUS tại Trung tâm Khảo Kiểm nghiệm, giống
khảo nghiệm được xem là đồng nhất nếu có từ
1-3 cây khác dạng trong số 1000 cây thí nghiệm.
Như vậy khi phân tích 300-500 cây của một
giống đối với bộ chỉ thị tham chiếu, nếu chỉ phát
hiện thấy từ 1-2 sự khác biệt về alen thì có nghĩa
là biến động về alen trong cùng một giống tương

đương với biến động kiểu hình.

Để kiểm chứng và hài hịa giữa phân tích
ADN và phân tích các tính trạng hình thái, chỉ

tiêu sinh hóa, trong quá trình lập quy trình, đề tài

đã tiến hành khảo sát các nhóm giống bao gồm:
nhóm giống có trên 3 cây khác dạng/1000 cây,
nhóm giống có từ 2-3 cây khác dạng/1000 cây;
nhóm giống khơng có cây khác dạng nào.

Mỗi nhóm giống tiến hành phân tích sự khác
biệt về alen đối với các chỉ thị của bộ chỉ thị tham
chiếu. Khảo sát từ 2-5 giống trong mỗi nhóm,
mỗi giống phân tích 480 cây khác nhau để kiểm
chứng cơ sở khoa học và phân tích bằng xác suất
thống kê, tìm sự phù hợp giữa kiểm tra bằng kiểu
hình và đánh giá bằng kiểu gen. Các giống lúa

được gieo trồng theo đúng kỹ thuật đánh giá
DUS theo thí nghiệm hàng-bơng tại Trung tâm
Khảo nghiệm: Chọn ngẫu nhiên 50 bông trong số

100 bông tác giả gửi đến. Mỗi bông cấy 2 hàng
(2 lần nhắc lại), hàng cách hàng 20cm, cây cách
cây 15cm, mỗi hàng 25 cây.

Kết quả khảo sát 480 cây của mỗi giống cho
thấy, nhóm giống có trên 3 cây khác dạng/1000
cây có sự sai khác về alen rất lớn khi khảo sát với
các chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu (từ 30-60
cây đối với 5-10 chỉ thị). Điều này được ghi nhận
trên 480 cây của giống Nếp Nhiệt đới và giống

Hương thơm số 1. Phân tích các chỉ tiêu DUS
năm 2012 cũng cho thấy hai giống này có trên 3
cây khác dạng/1000 cây quan sát.

Bảng 2. Danh sách các giống dùng trong thử nghiệm ADN để lập quy trình

Nhóm Tên giống Số cây có sai khác về alen

Basmati 370 60

HT8 10
Nhóm 1: Giống có nhiều hơn 3 cây khác

dạng/1000 cây trong đánh giá các tính trạng

hình thái Hương thơm số 1 40

Việt thơm 8 10

Nhóm 2: Giống có ít hơn 3 cây khác dạng/1000

cây trong đánh giá các tính trạng hình thái Nếp Nhiệt đới 15

Nếp Lang Liêu 3

NH92 5
TB2 3
Thảo dược Vĩnh Hòa 2

Nhóm 3: Giống khơng có cây khác dạng/1000
cây trong đánh giá các tính trạng hình thái

</div>
(5)<div class='page_container' data-page=5>

Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất

Hình 1. Đánh giá các cây lúa của giống Nếp Nhiệt đớiđối với chỉ thị RM3412, có 10 cây cho alen 
khác biệt với những cây khác

A. Cây số 1-96; B. Cây số 97-192; C. Cây số 193-288; D. Cây số 289-384. E. Cây số 385-480.

Kết quả phân tích 480 cây của từng giống
trong nhóm giống có từ 2-3 cây khác dạng/1000
cây cho thấy có sự sai khác về alen của 10-15 cây

đối với 3-7 chỉ thị. Nhóm giống khơng có cây

khác dạng nào cũng vẫn có từ 1-5 cây có sự sai
khác về alen đối với 1-3 chỉ thị trong bộ chỉ thị
đem phân tích. Như vậy là biến động về alen chỉ

thị phân tử lớn hơn biến động kiểu hình của
giống. Điều này có thể được giải thích như sau:
Các chỉ thị ADN là trung tính, khơng nhất thiết
liên quan đến biểu hiện kiểu hình, vì thế biến

động alen trong cùng 1 giống lớn hơn biến động
kiểu hình.

Từ những kết quả trên, để phù hợp với tiêu
chuẩn khảo nghiệm tính đồng nhất trong khảo
nghiệm DUS, với độ nhậy = 0,80 đến 0,90 và α =
0,05; nghiên cứu cần tối thiểu 50 đối tượng để
ước tính R2 ≥ 0,23; hay tối thiểu 100 đểước tính
R2 ≥ 0,12.

Khi khảo sát các giống trong quá trình thử

nghiệm phương pháp, từ kết quả 261 giống thử

nghiệm ban đầu, đến những giống có từ nhiều

đến khơng có cây khác dạng trong phân tích
ADN đối với các chỉ thị của bộ chỉ thị tham
chiếu, kết quả thực nghiệm đã chứng tỏ mức độ

khác biệt bên trong của cùng một giống tối đa là

5 nhóm. Đối với 5 chỉ thị chọn ra dùng cho bộ

chỉ thị sơ bộ, kết luận này đạt độ tin cậy ở mức α

= 0,05 tương ứng với quy định trong quy phạm
khảo nghiệm.

Kết luận này cũng tương tự như kết luận của
các nhà khoa học Ucraina khi đưa ra các nguyên
tắc để xác định tính đồng nhất và độ khác biệt
bên trong của một giống đối với cây lúa mì.

3.3. Quy trình xác định giống lúa thuần bằng 
sinh học phân tử hỗ trợ cho khảo nghiệm DUS

* Phạm vi áp dụng

Áp dụng tại các cơ sở có điều kiện về cơ sở

vật chất, nguồn nhân lực và được sự cho phép
của Nhà nước.

* Đối tượng áp dụng

Quy trình này áp dụng cho các giống lúa
thuần nhằm hỗ trợ cho công tác khảo nghiệm
DUS một cách chính xác và hiệu quả hơn.

* Các bước của quy trình

Bước 1: Xác định độđồng nhất của giống

1. Tách chiết ADN tổng số của 50 cây/giống
2. Làm phản ứng PCR với 5 chỉ thị của bộ

chỉ thị đánh giá sơ bộ RM11, RM21, RM163,
RM481, RM3412.

3. Điện di sản phẩm của phản ứng PCR trên
gel polyacrylamide 4,5% hoặc 6% - 10% với
ladder 25bp hoặc 50bp kèm theo

4. Ghi nhận kết quả.

5. Phân tích kết quả: Giống đồng nhất khi
các cá thể có sự đồng nhất về alen đối với cả 5
chỉ thị nghiên cứu.

Bước 2. Kiểm tra độ khác biệt bên trong của
giống

</div>
(6)<div class='page_container' data-page=6>

VIỆN KHOA HỌC NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

2. Phân tích ADN của một mẫu đối với từng
nhóm, sử dụng 15 chỉ thị còn lại của bộ chỉ thị

tham chiếu (RM1, RM5, RM6, RM17, RM25,
RM206, RM215, RM333, RM3252, RM3843,
RM7097, R4M13, MADS3, SO1160, S11033).

3. Phân tích kết quả: Tổng hợp kết quả khảo
sát đối với cả 20 chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu,
số nhóm tối đa chỉ có thể là 5. Nếu nhiều hơn 5
nhóm thì được xem là khơng đồng nhất.

Bước 3. Kiểm tra độổn định của giống

1. Tách chiết ADN tổng số của 30 cây đối
với cây lúa gieo từ hạt giống của ba vụ liên tiếp

2. Làm phản ứng PCR với ADN của 30 cây
trên đối với 5 chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu.

3. Điện di sản phẩm của phản ứng PCR trên
gel polyacrylamide 4,5% hoặc 6% - 10% với
ladder 25bp hoặc 50bp kèm theo

4. Ghi nhận kết quả.

5. Phân tích kết quả: Giống ổn định: các cá
thể có sự đồng nhất về alen đối với cả 5 chỉ thị

của bộ chỉ thị tham chiếu.

Bước 4. Kiểm tra sự khác biệt của giống

1. Phân tích thành phần alen của giống mới

được tiến hành với 1 trong số 50 cây đã kiểm tra

ở bước 1, chọn ngẫu nhiên 1 cây.

2. Làm phản ứng PCR với ADN của 1
cây/giống trên đối với toàn bộ các chỉ thị của bộ

chỉ thị tham chiếu chính thức (20 chỉ thị).

3. Điện di sản phẩm của phản ứng PCR trên
gel polyacrylamide 4,5% hoặc 6% - 10% với
ladder 25bp hoặc 50bp kèm theo.

4. Ghi nhận kết quả.
5. Phân tích kết quả:

- So sánh thành phần alen của giống mới với
các giống đã có trong phần mềm DUS-DFP. Nếu
giống mới có nhận dạng ADN (DNA fingerprint)
không tương đồng với bất kỳ một giống nào đã
có trong thư viện quá 95% có thể xem đó là
giống mới.

- Nếu giống có nhận dạng ADN tương đồng
với bất kỳ một giống nào đã có trong thư viện
quá 95% cần phải so sánh hai giống đó với nhau
sử dụng cả 30 chỉ thị của bộ chỉ thị chính thức và
mở rộng (RM19, RM223, RM341, RM3486,
RM5758, RM10825, RM17954, RM26063,
MADS8, EST20). Giống mới là giống có phổ

ADN khác hoàn toàn với các giống đã được lưu

giữ trong thư viện bởi ít nhất một trong số các chỉ

thị của bộ chỉ thị tham chiếu chính thức và một
trong số các chỉ thị của bộ chỉ thị mở rộng.

Bước 5. Kết luận chung

Giống mới được công nhận khi đạt tất cả các
yêu cầu trong các bước kiểm tra nêu ở trên. Kết
luận cuối cùng phải đi kèm với kết quảđánh giá
so sánh về mặt hình thái (65 tính trạng) theo quy

định của Nhà nước.

* Trường hợp đặc biệt:

A - Đánh giá từ 2 giống giống nhau về các
chỉ tiêu DUS hình thái

1. Lấy mẫu lá 5 cây của giống cần kiểm tra
theo phương pháp đánh dấu đường chéo 5 điểm
trên ruộng, mỗi cây lấy 1 lá.

2. Tách chiết ADN tổng số của 5 cây/mẫu
giống. Trộn mẫu lá của 5 cây theo tỉ lệ cân bằng
về nồng độđểđược một mẫu ADN.

3. Làm phản ứng PCR của ADN các mẫu
giống trên đối với tất cả các chỉ thị của bộ chỉ thị

tham chiếu chính thức (20 chỉ thị) và mở rộng
(10 chỉ thị).

4. Điện di sản phẩm của phản ứng PCR trên
gel polyacrylamide 4,5% hoặc 6% - 10% với
ladder 25bp hoặc 50bp kèm theo.

5. Ghi nhận kết quả.

6. Phân tích kết quả: Nếu nhận dạng ADN
của các giống được kiểm tra khác biệt hoàn toàn

đối với 3/30 chỉ thịđã sử dụng (khác biệt về alen
và nhiễm sắc thể). Có thể xem các giống đó có sự

khác biệt hoàn toàn.

B - Một giống khác biệt với giống gốc bởi
1-2 tính trạng đặc biệt

1. Đánh giá DUS giống gốc và giống mới
2. Phân tích hai giống bằng 30 chỉ thị của bộ

chỉ thị chính thức và mở rộng.

3. Xác định tính trạng mới bằng phân tích
kiểu hình.

4. Xác định tính trạng mới bằng phân tích
kiểu gen thơng qua chỉ thị phân tử đặc thù cho

tính trạng mới.

5. Phân tích kết quả: Giống mới được cơng
nhận khi có sự khác biệt cả về kiểu gen lẫn kiểu
hình đối với tính trạng mới.

3.4. Lập ngân hàng dữ liệu cho các giống lúa 
trồng phổ biến và giống địa phương

</div>
(7)<div class='page_container' data-page=7>

Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 
được xây dựng. Khi phân tích ADN của một

giống mới, dữ liệu về ADN truy vấn sẽ được
nhập vào thư viện cơ sở dữ liệu ADN đã lập sẵn
của 180 giống lúa với tất cả các chỉ thị trong bộ

chỉ thị tham chiếu có sẵn trong phần mềm
DUS-DFP. Phương pháp thống kê đa chiều sẽđược sử

dụng trong phần mềm để phân tích cho ra ma trận

khoảng cách di truyền hoặc độ tương đồng giữa
các giống.

Đề tài đã sử dụng bộ chỉ thị tham chiếu để

lập cơ sở dữ liệu của 180 giống lúa. Cơ sở dữ liệu

đã được ký hiệu hóa và nhập vào phần mềm
DUS-DFP để sử dụng.

Hình 2. Ảnh điện di trên gel polyacrylamide 8% của 48 giống lúa với locus RM6 
(L): ladder chuẩn 25bp; trên ảnh là các băng tương ứng kích thước 150bp, 175bp và 200bp

Dòng cuối ký hiệu alen 1: 142bp; alen 2: 150bp; alen 3: 156p; alen 4: 160bp.

Tất cả kết quả điện di của 180 giống với
từng chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu chính thức
và mở rộng đã được nhập vào phần mềm
DUS-DFP 4.1.

IV. KẾT LUẬN 
4.1. Kết luận

- Đã thu thập được 261 dòng/giống lúa.
- Đã sử dụng 557 chỉ thị ADN để khảo sát
lựa chọn ra bộ chỉ thị tham chiếu bao gồm các chỉ

thị sau:

1). Bộ chỉ thị đánh giá sơ bộ (5 chỉ thị):
RM11, RM21, RM163, RM481, RM3412

2). Bộ chỉ thị chuẩn (20 chỉ thị): Gồm 5 chỉ

thị trên: RM11, RM21, RM163, RM481,
RM3412 và 15 chỉ thị khác: RM1, RM5, RM6,
RM17, RM25, RM206, RM215, RM333,
RM3252, RM3843, RM7097, R4M13, MADS3,
SO1160, S11033.

3). Bộ chỉ thị mở rộng (10 chỉ thị): RM19,
RM223, RM341, RM3486, RM5758, RM10825,
RM17954, RM26063, MADS8, EST20.

- Đã nghiên cứu, xây dựng quy trình “Xác

định giống lúa thuần bằng sinh học phân tử hỗ trợ

cho khảo nghiệm DUS” phù hợp với các tiêu chí
và tiêu chuẩn đánh giá trong công tác khảo
nghiệm DUS hiện hành.

- Đã nghiên cứu xây dựng phần mềm
DUS-DFP để lưu trữ thư viện nhận dạng ADN
(DNA fingerprinting), phân tích và hỗ trợ trong
khảo nghiệm DUS.

- Đã lập cơ sở dữ liệu của 180 giống lúa đối
với các chỉ thị của bộ chỉ thị tham chiếu.

4.2. Đề nghị

“Quy trình xác định giống lúa thuần bằng
sinh học phân tử hỗ trợ cho khảo nghiệm DUS”
với mục đích cung cấp phương tiện để phục vụ

cho công tác quản lý giống trong thực tại hiện
nay. Đề nghịđưa quy trình vào áp dụng như một
bước trong cho công tác khảo nghiệm giống lúa ở

Việt Nam.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bonow S., Von Pinho E.V.R., Vieira M.G.C.,
Vosman B. (2009). Microsatellite markers in and
around rice genes: applications in variety
identification and DUS testing. Crop Sci., vol. 49,
pp.880-886.

2. Сиволап Ю.М., Волкодав В.В., Бальвинская

М.С., Кожухова Н.Е., Солоденко А.С. (2004).

Идентификацияирегистрациягенотиповмягкой

пшеницы (Triticum aestivum L.), ячменя (Ноrdеum

vulgаrе L.), кукурузы (Zеа mауs L.),

подсолнечника (Неlіапthus аnnuus L.) спомощью

анализа микросателитных маркepов.

Методические рекомендации - Pешения Ученых

СоветовЮжного биотехнологическогоцентра в

растениеводствеУААНиМОНУ; Селекционно

-генетического института Национального центра

семеноводчества и сортоизучения УААН;

Института экспертизы сортов растений

Госслужбы по охране прав на сорта растений

МинагрополитикиУкраины. 17 trang.

3. Deniken (2005). Molecular markers and DUS
testing, UPOV current situation. Report of Proc. of 
Seminar on the Use of Molecular Techniques for 
Plant Variety Protection, Ottawa, ON, Canada,
16-17 June 2005. Canadian Food Inspection Agency,
Ottawa, ON, Canada.

</div>