Nghiên cứu biểu hiện protein interleukin 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật

..

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN HUY HOÀNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN INTERLEUKIN 7
TÁI TỔ HỢP TRONG HỆ THỐNG NUÔI CẤY THỰC VẬT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN HUY HOÀNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN INTERLEUKIN 7
TÁI TỔ HỢP TRONG HỆ THỐNG NUÔI CẤY THỰC VẬT

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số

: 9 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS. TS. Chu Hoàng Hà
2. PGS. TS. Lê Văn Sơn

THÁI NGUYÊN - 2018


i

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự
hướng dẫn của PGS. TS. Chu Hoàng Hà và PGS. TS. Lê Văn Sơn. Các số liệu,
kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần đã được công bố trong
các Tạp chí Khoa học; phần cịn lại chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ
cơng trình nào khác. Mọi trích dẫn, tham khảo đều ghi rõ nguồn gốc.
Thái Nguyên, ngày 10 tháng 2 năm 2018
TÁC GIẢ
Nguyễn Huy Hoàng


ii

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận án này, lời đầu tiên tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu
sắc tới PGS. TS. Chu Hoàng Hà, PGS. TS. Lê Văn Sơn, là những người thầy
đã tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi trong
suốt thời gian thực hiện và hồn thành luận án này.
Tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới TS. Phạm Bích Ngọc, TS. La
Việt Hồng, ThS. Lê Thu Ngọc, ThS. Nguyễn Thu Giang cùng tồn thể các cơ chú,
anh chị và các bạn Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật và Phịng cơng nghệ ADN
ứng dụng, Viện Cơng nghệ sinh học, là những người đã tận tình truyền đạt nhiều

kinh nghiệm quý báu và giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực nghiệm tại phịng.
Tơi xin chân thành cảm ơn GS. TS. Chu Hoàng Mậu, PGS. TS. Nguyễn
Thị Tâm và các thầy cô giáo khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm - Đại học
Thái Nguyên đã giảng dạy, truyền đạt cho tôi những kiến thức mới và tạo điều
kiện để tơi có thể hồn thành được khóa học này.
Tơi xin cảm ơn phịng Đào tạo, cán bộ Bộ phận đào tạo Sau đại học,
Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi về mặt quản
lý trong suốt q trình tơi học tập tại trường.
Tơi xin cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Y Dược, đồng nghiệp
của tôi tại Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học cơ bản và các phòng chức năng
đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong công tác để tôi yên tâm học tập.
Cuối cùng tôi xin gửi tới gia đình, bạn bè, người thân lịng biết ơn sâu
sắc. Những người luôn luôn ở bên, ủng hộ, động viên, giúp đỡ tơi trong q
trình học tập và nghiên cứu của mình
Thái Nguyên, ngày 10 tháng 2 năm 2018
TÁC GIẢ
Nguyễn Huy Hoàng


iii

MỤC LỤC
Lời cam đoan ...................................................................................................... i
Lời cảm ơn ........................................................................................................ ii
Mục lục ............................................................................................................. iii
Danh mục chữ viết tắt ...................................................................................... iv
Danh mục các bảng ........................................................................................... v
Danh mục các hình ........................................................................................... vi
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của luận án ............................................................................. 1

2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của luận án ....................................................... 3
4.1. Ý nghĩa lý luận ........................................................................................... 3
4.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 3
5. Đóng góp mới của luận án ............................................................................ 3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4
1.1. Vai trò của cytokine và interleukin 7 trong hệ miễn dịch ở người ............ 4
1.1.1. Cytokine .................................................................................................. 4
1.1.2. Interleukin 7 .......................................................................................... 10
1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các loại cytokine tái tổ hợp trong y học16
1.2.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới................................... 16
1.2.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nước..................................... 18
1.3. Một số hệ thống biểu hiện protein người tái tổ hợp................................. 19
1.3.1. Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn ................................. 19
1.3.2. Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2) ........ 20
1.3.3. Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật ........................................................... 22
1.3.4. Cây chuyển gen biểu hiện cytokine tái tổ hợp ...................................... 24


Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 29
2.1. Vật liệu ..................................................................................................... 29
2.1.1. Vật liệu thực vật .................................................................................... 29
2.1.2. Các chủng vi khuẩn, tế bào ................................................................... 29
2.1.3. Các gen và vector .................................................................................. 30
2.1.4. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu................................................. 30
2.1.5. Hóa chất và thiết bị máy móc................................................................31
2.1.6 . Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................ 32
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 32
2.2.1. Phương pháp thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện protein ở

thực vật ............................................................................................................ 34
2.2.2. Thiết kế mồi .......................................................................................... 35
2.2.3. Thiết kế vector chuyển gen mang gen hIL-7 tái tổ hợp ........................ 35
2.2.4. Phương pháp biểu hiện gen ở vi khuẩn, tạo dòng tế bào thuốc lá BY2,
rễ tơ thuốc lá .................................................................................................... 44
2.2.5. Phân tích các chỉ tiêu sinh lý của dịng chuyển gen.............................. 47
2.2.6. Phân tích các dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử .......... 48
2.2.7. Tinh sạch protein hIL-7 tái tổ hợp ........................................................ 50
2.2.8. Đánh giá hoạt tính protein hIL-7 tái tổ hợp .......................................... 50
2.2.9. Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm ............................................... 52
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................ 53
3.1. Thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện ở thực vật .................. 53
3.2. Thiết kế vector chuyển gen hIL-7 tái tổ hợp vào vi khuẩn, dòng tế bào
BY2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá ................................................................. 57
3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen pET32c(+)/IL7.......................................... 57
3.2.2. Thiết kế vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7 ................................... 59
3.2.3. Thiết kế vector chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7 ................................ 61


3.2.4. Thiết kế vector chuyển gen pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP.. 63
3.3. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp............................................................ 68
3.3.1. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong vi khuẩn ................................ 68
3.3.2. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2................... 72
3.3.3. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng rễ tơ chuyển gen .......... 83
3.3.4. Biểu hiện protein hIL-7 trong cây thuốc lá bằng Agro-infiltration ...... 91
3.4. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein hIL-7 tái tổ hợp ........................ 99
Chương 4. BÀN LUẬN ............................................................................... 101
4.1. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong E. coli rosetta-gami B............ 101
4.2. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY-2, rễ tơ ......... 103
4.3. Biểu hiện tạm thời protein hIL-7 tái tổ hợp ở cây thuốc lá.................... 106

4.4. Tăng cường biểu hiện protein ở thực vật với ELP và tinh sạch mITC .. 107
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................109
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 110
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 112
PHỤ LỤC ..................................................................................................... 138


iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Ký tự
AIDS

Tiếng Anh

Tiếng Việt

Acquired immunodeficiency

Hội chứng suy giảm miễn dịch

syndrome

mắc phải ở người

A. tumefaciens

Agrobacteria tumefaciens

A. rhizogenes

Agrobacteria rhizogenes

AS

Acetosyringone

bp

Base pairs

Cặp bazơ

BSA

Bovine serum albumin

Huyết thanh bò

BY2

Bright yellow 2

Cal

Calreticulin

cDNA

Complementary DNA

ADN bổ sung

Cetyl trimethyl

Chất hoạt động bề mặt ammonium

ammonium bromide

bromide

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

dNTP

Deoxyribo nucleotide triphosphate

DTT

Dithiothreitol

E. Coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

Axit ethylenediaminetetraacetic

Enzyme-linked

xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên

immunosorbent assay

kết với enzyme

CTAB

ELISA
ELP

Elastin-like peptide

FDA

Food & drug administration

FGF8b

Cục quản lý thực phẩm và dược
phẩm Hoa Kỳ

Fibroblast growth factor 8

Yếu tố tăng trưởng nguyên bào

isoform b

sợi 8 isoform b


hIL-7

Human interleukin 7

Interleukin 7 của người

HEV

Hepatitis E virus

Virus viêm gan E

HPV

Human papilloma virus

Virus papilloma ở người

HRP

Horseradish peroxidase

IFN

Interferon

IL

Interleukin

IMAC

IPTG

Immobilized metal ion affinity
chromatography
Isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside

kb

Kilo base

kDa

Kilo danton

LB

Luria and Bertani

MHC

Major histocompatibility complex

mITC
mRNA

Sắc kí ion cố định kim loại

Membrane-based inverse transition
cycling
ARN messenger

Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy
vi khuẩn theo Luria và Bertani
Phức hệ phù hợp tổ chức
Đảo ngược theo màng
ARN thông tin
Môi trường dinh dưỡng cơ bản

MS

Murashige and Skoog

nuôi cấy mô thực vật theo
Murashige và Skoog

NK cell

Natural killer cell

tế bào giết tự nhiên

Neomycin phosphotransferase

Gen kháng kháng sinh

II gen

kanamycine

OD

Optical density

Mật độ quang

PBS

Phosphate buffer saline

dung dịch muối đệm phosphate

nptII


PBST

Phosphate buffer saline + tween 20

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi polymerase

PVDF

Polyvinylidene difluoride

Màng sử dụng trong western blot

Ri - plasmid

Hairy root inducing plasmid

Plasmid gây bệnh rễ tơ ở thực vật

RNAi

RNA interference

ARN can thiệp

RNase

Ribonuclease

phân giải ARN

Rpm

Revolutions per minute

Vòng/phút

scFv

Single-chain variable fragment

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis

siRNA

small interfering RNA

TAE

Tris acetate EDTA

TCR

T-cell receptor

Thụ thể kháng nguyên tế bào T

T-DNA

Transfer DNA

Đoạn DNA chuyển

TNF

Tumor necrosis factor

yếu tố hoại tử khối u

TMB

3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine

UV

Ultraviolet

Tia tử ngoại

vir

Virulence region

Vùng gây độc

v/v

Volume/volume

thể tích/thể tích

WPM

Woody plant medium

WT

Wild type

Chủng hoang dại

w/v

weight/volume

khối lượng/thể tích

YEB

Yeast extract broth

YMB

Yeast malnitol broth

Môi trường nuôi cấy theo

Mccown


v

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1

Phân nhóm IL ở người.........................................................

7

Bảng 1.2

Một số cytokine biểu hiện thành công ở tế bào BY2............

21

Bảng 1.3

Một số cytokine tái tổ hợp biểu hiện ở thực vật ...................

25

Bảng 2.1

Thống kê các trình tự mồi sử dụng trong luận án.................

30

Bảng 2.2

Danh sách kháng sinh sử dụng trong luận án.......................

31

Bảng 2.3

Thành phần phản ứng LR....................................................

40

Bảng 2.4

Thành phần gel SDS-PAGE................................................

49

Bảng 3.1

Xử lý mẫu protein với DTT.................................................

71

Bảng 3.2

Kết quả tạo và chọn dòng tế bào BY2 mang gen hIL-7........

74

Bảng 3.3

Nồng độ DNA tổng số của 20 dòng tế bào BY2...................

75

Bảng 3.4

Khối lượng tươi và khối lượng khô của một số dòng tế bào BY2.

78

Bảng 3.5

Kết quả chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7 vào mô lá thuốc
lá trên môi trường chọn lọc..................................................

84

Bảng 3.6

Kết quả tạo dòng rễ tơ chuyển gen hIL-7.............................

84

Bảng 3.7

Đánh giá khối lượng tươi và khối lượng khơ các dịng rễ
tơ chuyển gen hIL-7............................................................

87

Bảng 3.8

Đánh giá chiều dài một số dòng rễ tơ chuyển gen (cm)........

89

Bảng 3.9

Hiệu suất thu hồi protein hIL-7 tái tổ hợp bằng phương
pháp mITC..........................................................................

97

Bảng 3.10 Kết quả hoạt hố dịng tế bào 2E8 bằng protein hIL-7..........

99


vi

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1

Cấu trúc protein hIL-7.......................................................................

11

Hình 1.2

Thụ thể hIL-7....................................................................................

12

Hình 1.3

Vai trị của hIL-7...............................................................................

15

Hình 1.4

Dịng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana Bright Yellow 2).....................

22

Hình 2.1

Sơ đồ nghiên cứu tổng quát...............................................................

33

Hình 2.2

Cấu trúc attL1_cal/SacI và HindIII/attL2 trong vector pENTR/cal...

38

Hình 3.1

Sự phân bố tỷ lệ % phù hợp của các nhóm mã bộ ba gen hIL-7 biểu
hiện trong hệ thống thực vật ..............................................................

Hình 3.2

54

Biểu đồ phân bố tần suất sử dụng codon theo chiều dài gen hIL-7
khi biểu hiện trong hệ thống thực vật.................................................

55

Hình 3.3

Trình tự gen hIL-7 trước và sau tối ưu mã di truyền...........................

56

Hình 3.4

Cấu trúc vector pET32c(+)/IL7.........................................................

57

Hình 3.5

Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen

pET32c(+)/IL7...................................................................................

58

Hình 3.6

Cấu trúc vector pENTR221/cal/IL7...................................................

59

Hình 3.7

Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen
pENTR221/cal/IL7.............................................................................

60

Hình 3.8

Kết quả colony PCR pK7WG2D.1/cal/IL7.........................................

62

Hình 3.9

Kết quả cắt pK7WG2D.1/cal/IL7 bằng enzyme SacI và HindIII........

62

Hình 3.10 Cấu trúc vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP...................

63

Hình 3.11 Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen
pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP............................................

65

Hình 3.12 Kết quả điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen
pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP...........................................

66


Hình 3.13 Kết quả kiểm tra vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP
bằng enzyme NcoI..............................................................................

67

Hình 3.14 Kết quả kiểm tra chủng biểu hiện pET32c(+)/IL7/Rosetta.................

69

Hình 3.15 Kết quả kiểm tra khả năng biểu hiện hIL-7 từ vi khuẩn E.coli Rosetta
gami B nuôi ở 37oC và 28oC................................................................

70

Hình 3.16 Kiểm tra biểu hiện protein hIL-7 pha tan bằng Western blot...............

72

Hình 3.17 Kết quả kiểm tra colony PCR pK7WG2D.1/IL7/Cv58.......................

73

Hình 3.18 Chọn lọc dịng tế bào BY2 sau chuyển gen.........................................

74

Hình 3.19 Kết quả PCR các dịng BY2 chuyển gen bằng IL7_F và IL7_R..........

76

Hình 3.20 Kết quả PCR các dịng BY2 chuyển gen bằng cặp mồi gen virC.........

77

Hình 3.21 Các dịng tế bào huyền phù BY2 sau 21 ngày ni cấy.......................

77

Hình 3.22 Đồ thị sinh trưởng của một số dịng tế bào huyền phù thuốc lá BY2
chuyển gen (theo khối lượng tươi)......................................................

79

Hình 3.23 Đồ thị sinh trưởng của một số dòng tế bào huyền phù thuốc lá BY2
chuyển gen (theo khối lượng khơ)......................................................

80

Hình 3.24 Kiểm tra sự biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong các dòng tế bào
huyền phù BY2 bằng Western blot.....................................................

82

Hình 3.25 Biểu đồ so sánh hàm lượng hIL-7 tái tổ hợp trong các dịng BY2
chuyển gen..........................................................................................

83

Hình 3.26 Kết quả q trình tạo và chọn dịng rễ tơ chuyển gen hIL-7………….

85

Hình 3.27 Kết quả PCR 5 dịng rễ tơ bằng cặp mồi IL7_F và IL7_R...................

85

Hình 3.28 Đồ thị sinh trưởng của các dòng rễ tơ (tính theo khối lượng tươi).......

88

Hình 3.29 Đồ thị sinh trưởng của các dịng rễ tơ (tính theo khối lượng khơ)........

88

Hình 3.30 Kết quả biểu hiện protein hIL-7 ở các dòng rễ tơ bằng Western blot...

90

Hình 3.31 Biểu đồ so sánh hàm lượng protein hIL-7 trong 5 dịng rễ tơ chuyển gen

90

Hình 3.32 Kết quả colony PCR bằng cặp mồi IL7_BamHI_F/IL7_BamHI_R........

91

Hình 3.33 Kết quả cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn NcoI......................................

92


Hình 3.34 Kiểm tra biểu hiện protein hIL-7 trong lá thuốc lá bằng Western blot......

94

Hình 3.35 Kết quả tinh sạch và định lượng protein hIL-7 bằng phương pháp IMAC

95

Hình 3.36 Kết quả tinh sạch protein hIL-7 bằng phương pháp mITC.........................

97

Hình 3.37 Kết quả định lượng protein hIL-7 tái tổ hợp bằng Western blot.................

98

Hình 3.38 Khả năng hoạt hóa dịng tế bào 2E8 của protein hIL-7 tái tổ hợp...............

100


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Interleukin là một nhóm các cytokine tiết và các phân tử tín hiệu được
tìm thấy đầu tiên trong các tế bào bạch cầu, đóng vai trị quan trọng trong hệ
thống miễn dịch. Chức năng của hệ thống miễn dịch ở người phụ thuộc chủ yếu
vào các Interleukin, thiếu hụt interleukin sẽ dẫn đến các bệnh tự miễn và thiếu
hụt miễn dịch.
Interleukin 7 (hIL-7) là một cytokine có vai trị chính trong sự tăng
trưởng của các dòng tế bào B và T [13]. Đây là những dịng tế bào có chức năng
quan trọng trong hệ miễn dịch của con người, cũng là đích tấn công của các
virus, mầm bệnh khi xâm nhập vào cơ thể con người.
Trong y học ngày nay, các protein có hoạt tính sinh học được sử dụng
rộng rãi để làm thuốc điều trị như các loại hormone, enzyme tái tổ hợp... Trước
đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại protein này chủ yếu là tách chiết
từ các bộ phận của động vật. Tuy nhiên, do nhu cầu ngày càng cao trong khi
nguồn cung từ động vật rất hạn chế, giá thành lại đắt và dễ nhiễm các mầm
bệnh nguy hiểm cho con người, nên việc nghiên cứu tổng hợp protein tái tổ hợp
được đặt ra một cách cấp thiết.
Trong những thập niên gần đây, với những bước tiến lớn trong lĩnh vực
công nghệ sinh học phân tử, việc tổng hợp protein khơng cịn khó khăn như
trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học. Thực tế hiện nay phương pháp này
đã được áp dụng rộng rãi không những để tổng hợp một số loại protein làm

thuốc như insulin, hormone tăng trưởng v.v…. mà còn để tổng hợp rất nhiều
hợp chất khác trong khi nguồn nguyên liệu hạn chế hoặc con đường tổng hợp
hố học gặp khó khăn [11].
Hiện nay, biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật đang được quan tâm
nghiên cứu vì những ưu điểm vượt trội so với các hệ thống biểu hiện khác như


2

chúng có thể sinh trưởng trên mơi trường tương đối đơn giản, protein được tiết
ra môi trường nhiều hơn phần tích luỹ trong tế bào nên việc thu hồi và tinh sạch
dễ thực hiện [105], đặc biệt protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật an tồn cho
con người hơn so với các protein có nguồn gốc từ các hệ thống nuôi cấy khác
do các mầm bệnh và virus thực vật không phải là tác nhân gây bệnh ở người.
Nhằm mục đích nâng cao chất lượng điều trị bệnh theo hướng sử dụng
liệu pháp sinh học và góp phần hoàn thiện các phương pháp nghiên cứu sản
xuất các cytokine nói chung và hIL-7 nói riêng một cách tối ưu. Căn cứ vào
điều kiện phịng thí nghiệm cho phép và với phương pháp khả thi, chúng tôi
quyết định lựa chọn thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu biểu hiện protein
interleukin 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được hệ thống nuôi cấy thực vật biểu hiện tối ưu protein hIL-7
tái tổ hợp.
Thu nhận và tinh sạch được protein hIL-7 tái tổ hợp từ hệ thống nuôi cấy
thực vật.
3. Nội dung nghiên cứu
Đổi mã di truyền gen hIL-7 phù hợp biểu hiện ở hệ thống thực vật.
Thiết kế vector chứa cấu trúc gen mã hóa hIL-7 tái tổ hợp phù hợp với
các hệ thống nuôi cấy thực vật.
Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật:

huyền phù, rễ tơ và cây thuốc lá chuyển gen.
Phân tích, kiểm tra và đánh giá chất lượng hIL-7 tái tổ hợp thu được qua
hệ thống nuôi cấy thực vật.


3

4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của luận án
4.1. Ý nghĩa lý luận
Luận án cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu về biểu hiện, sản
xuất protein tái tổ hợp dùng trong y học ở thực vật thông qua biến đổi mã di
truyền và các hệ thống ni cấy thực vật.
Nội dung luận án có thể được sử dụng làm tài liệu giảng dạy, tham khảo
cho giảng viên và sinh viên các trường khối khoa học tự nhiên nói chung và
sinh học nói riêng.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Luận án cung cấp quy trình biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp ở các hệ
thống ni cấy dịng tế bào huyền phù BY2, rễ tơ, cây thuốc lá chuyển gen
trong quy mơ phịng thí nghiệm, phục vụ cho mục đích nuôi cấy thu sinh khối
tế bào.
Bước đầu đánh giá được hoạt tính sinh học của protein hIL-7 tái tổ hợp
thu được sau khi tinh sạch ở các hệ thống nuôi cấy, là tiền đề cho các nghiên
cứu sâu hơn.
5. Đóng góp mới của luận án
Luận án đã thiết kế thành công 3 cấu trúc vector biểu hiện protein hIL-7
ở tế bào thuốc lá BY2, rễ tơ và cây thuốc lá chuyển gen.
Đã biểu hiện thành công protein hIL-7 tái tổ hợp trong: dòng tế bào BY2,
rễ tơ và cây thuốc lá chuyển gen. Trong đó, protein biểu hiện cao nhất ở lá cây
thuốc lá sau 5 ngày xâm nhiễm với vi khuẩn A. tumefaciens với hàm lượng 36,7
ng/µg protein tan tổng số, có hoạt tính sinh học cao.

Đây là cơng trình nghiên cứu mới ở Việt Nam và trên thế giới về biểu
hiện protein hIL-7 trong hệ thống nuôi cấy thực vật.


4

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. VAI TRÒ CỦA CYTOKINE VÀ INTERLEUKIN 7 TRONG HỆ
MIỄN DỊCH Ở NGƯỜI
1.1.1. Cytokine
1.1.1.1. Vai trò trong hệ miễn dịch người
Cytokine là các polypeptide được sản xuất khi có kích thích của vi sinh
vật hay các kháng nguyên khác nhằm điều hòa các phản ứng miễn dịch và viêm
của cơ thể. Những phân tử này điều hòa các hoạt động chức năng của từng tế
bào riêng biệt và của cả tổ chức trong trường hợp sinh lý và bệnh lý. Các protein
này cũng làm trung gian điều hòa trực tiếp sự tương tác giữa các tế bào và kiểm
sốt các q trình xảy ra trong khoang ngoại bào. Cytokine hoạt động như
những yếu tố giúp tế bào sống sót bằng cách ngăn hiện tượng apoptosis xảy ra.
Cytokine gồm một số nhóm có mối liên hệ mật thiết, tác động qua lại với
nhau trong hệ thống miễn dịch của người để thực hiện chức năng của chúng.
Thuộc các cytokine này có chemokine, họ yếu tố hoại tử khối u (TNF), họ các
interferon và họ interleukin. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, cytokine tham gia
vào nhiều quá trình sinh học trong cơ thể như tạo phơi, sinh sản, tạo máu, đáp
ứng miễn dịch, viêm; chúng có vai trò khá quan trọng trong các bệnh lý như:
bệnh tự miễn, nhiễm trùng huyết, ung thư, viêm gan siêu vi, nhiễm HIV v.v…
Ngồi ra, cytokine cịn được dùng làm các tác nhân trị liệu (yếu tố tạo khóm tế
bào hạt sử dụng trong huyết học) hay các đích điều trị (như các loại TNF trong
bệnh Crohn, viêm đa khớp dạng thấp v.v…) [64], [164].
1.1.1.2. Cơ chế hoạt động

a. Chemokine
Chemokine là những cytokine được sản xuất trong giai đoạn sớm nhất
của nhiễm trùng. Chúng phát huy tác dụng hóa ứng động đến các tế bào có khả


5

năng đáp ứng gần đó. Cơ chế hoạt động của chemokine thể hiện ở khả năng
tập trung các loại tế bào bạch cầu của cơ thể chủ đến vị trí nhiễm trùng.
Chemokine hiện diện trên tế bào nội mô tác động lên các bạch cầu đi qua làm
cho các integrin bạch cầu tăng ái lực kết gắn với ligand của chúng. Điều này
rất quan trọng để giữ bạch cầu lại nội mơ của mao mạch vùng tổn thương.
Ngồi ra, chemokin cịn kích thích sự di chuyển của bạch cầu đến nơi có tổn
thương trên cơ sở sự chênh lệch nồng độ của chemokin tại nơi tổn thương và
các nơi khác. Các chemokin khác nhau kích thích các tế bào khác nhau nhờ
thế mà kiểm soát được thành phần của các tế bào tại ổ viêm. Chemokin điều
hịa sự lưu thơng của tế bào lympho và các bạch cầu khác trong các mơ lympho
ngoại biên. Các chemokin có khả năng thúc đẩy các tế bào đã được hoạt hóa
và tế bào T di chuyển đến các mô không phải thuộc hệ lympho bao gồm cả da
và niêm mạc [64], [152].
b. Họ các yếu tố hoại tử khối u (TNF)
TNF có khả năng kích thích tập trung tế bào trung tính và tế bào mono
đến nơi nhiễm trùng và hoạt hoá những tế bào này để tiêu diệt vi khuẩn. Ngoài
ra, TNF cịn có khả năng kích thích tế bào nội mơ và đại thực bào tiết ra
chemokine nhằm tăng cường ái lực của integrin bạch cầu đối với ligand của
chúng, tạo nên sự tập trung bạch cầu; đặc biệt chúng còn kích thích thực bào
đơn nhân tiết interleukin 1 - là chất có tác dụng rất giống với TNF [82].
TNF tác động lên tế bào gan làm tăng tổng hợp protein huyết thanh, dưới
tác động của TNF, interleukin 1 và interleukin 6 tạo nên đáp ứng pha cấp của
phản ứng viêm. Với nồng độ thấp, TNF tác động lên bạch cầu và nội mô để khởi

động phản ứng viêm. Ở nồng độ trung bình, TNF làm trung gian cho các tác
động toàn thân của phản ứng viêm. Đặc biệt, với nồng độ cao TNF có thể gây
ra các bất thường bệnh lý của sốc nhiễm trùng có thể gây tử vong [154], [158].


6

c. Họ interferon (IFN)
IFN là những protein kháng virus được tế bào sản xuất khi bị nhiễm virus
gây bệnh nào đó. Chúng có khả năng bảo vệ cơ thể chống lại nhiễm trùng virus
và thúc đẩy đáp ứng miễn dịch tế bào chống lại các vi sinh vật nội bào. IFN ức
chế sự nhân lên của virus bằng cách kích thích tế bào sản xuất ra nhiều loại
enzyme như 2’,5’- oligoadenylate synthetase ngăn cản sự sao chép của virus
DNA hoặc RNA và sự nhân lên của chúng [106].
IFN có tác dụng làm bộc lộ phân tử MHC lớp I. Tế bào T CD8+ có khả
năng nhận diện kháng nguyên lạ liên kết với MHC lớp I, qua đó tế bào gây độc
nhận ra tế bào chứa virus và tiêu diệt chúng. Ngồi ra, IFN cịn có khả năng
kích thích sự phát triển của tế bào Th1 trong hệ miễn dịch của người, giúp gia
tăng hoạt tính ly giải tế bào của tế bào NK [64], [142].
d. Họ Interleukin
Interleukin (IL) là một trong các nhóm chính của cytokine, đóng vai trị
quan trọng nhất trong hệ miễn dịch của con người. Chúng có chức năng điều
hồ miễn dịch, bao gồm cả phát triển tế bào, sự trưởng thành, di chuyển và bám
dính. Ngồi ra, chúng cịn có khả năng kích hoạt các phản ứng miễn dịch của
cơ thể [25], [82].
Interleukin được chia thành nhiều loại khác nhau từ IL-1 đến IL-36 dựa
vào đặc điểm cấu trúc của chúng. Ví dụ, IL-1 được phân biệt với các IL khác
bởi sự gấp nếp nhiều hơn ở chuỗi  [158]. Ngồi ra, chúng cịn được xếp vào
các nhóm khác nhau gọi là cytokine nhóm I và cytokine nhóm II. IL-10 và IL28 được xếp vào cytokine nhóm II vì có cấu trúc phân tử gần giống nhau, đều
có sáu hoặc bảy xoắn  xếp song song nhau [39], [76], [170]. IL-28 cũng có

cấu trúc intron-exon tương tự IL-10 [135].


7

Bảng 1.1. Phân nhóm IL ở người [9], [19], [26], [34], [60], [63], [83], [84], [156]
IL

IL-1

Nguồn gốc
Tế

bào

Thụ thể

B, CD121a/IL1R1

monocytes

CD121b/IL1R2
CD25/IL2RA,

IL-2

Tế bào Th1

CD122/IL2RB,
CD132/IL2RG

IL-3

IL-4

IL-5

Vai trị
Kích thích tế bào T hỗ trợ; bảo
vệ và kích hoạt tế bào B, tế bào
NK.
Tham gia kích hoạt tế bào B, T
và NK.

Tế bào T hỗ trợ, CD123/IL3RA, Hỗ trợ tế bào mast tổng hợp
tế bào mast, NK CD131/IL3RB

histamin

Tế bào Th2, đại CD124/IL4R,

Tham gia kích hoạt tế bào B,

thực bào

hỗ trợ tăng sinh tế bào T

CD132/IL2RG

Tế bào Th2, tế CD125/IL5RA, Tham gia sản xuất eosinophils

bào mast

CD131/IL3RB

và IgA.

Tế bào Th2, tế
IL-6

bào B, tế bào CD126/IL6RA, Gây phản ứng cấp tính, viêm ở
hình sao, nội CD130/IL6RB

tế bào T

mạc
Các tế bào mô
IL-7

đệm

ở

tuỷ CD127/IL7RA,

xương và tuyến CD132/IL2RG
ức
Tế bào lympho,

IL-8

biểu mô, nội
mô, đại thực
bào

IL-9

Tế bào Th2

CXCR1/IL8R,
CXCR2/IL8RB
/CD128
CD129/IL9R

Hỗ trợ và bảo vệ các tế bào B,
T và NK; cân bằng nội môi,
cytokine tiền viêm.

Tác động hướng hố lên bạch
cầu trung tính, tế bào lympho.

Kích thích tế bào mast.


8

IL-10

IL-11

Tế bào Th2, CD210/IL10R

Kích hoạt tế bào lympho B, ức

monocytes,

A, CDW210B/

chế tế bào Th1 sản xuất các yếu

CD8+ T

IL10RB

tố IFN-γ, TNF-β, IL-2

Tuỷ xương

IL11RA

Tế bào đuôi gai,
IL-12

tế bào lympho CD212/IL12R
B, T, đại thực B1IL12RB2
bào

Sản xuất protein pha cấp, kích
thích tạo máu
Tham gia kích hoạt tế bào T,
kích thích tế bào NK sinh IFNγ, TNF-α

Kích thích sự tăng trưởng và

IL-13

Tế bào NK, tế

biệt hoá của tế bào B (IgE), ức

bào mast, tế bào

chế tế bào Th1 và sản xuất các

Th2 đang hoạt

IL13R

động

cytokine gây viêm đại thực bào
(IL-1, IL-6) và giảm IL-8, IL10, IL-12.

IL-14

Tế bào T và

Kiểm soát sự tăng trưởng và

một số tế bào B -

phát triển của các tế bào B, ức

ác tính

chế tiết Ig

Thực bào đơn

IL-15

nhân, các đại

Kích thích sản xuất các tế bào

thực bào sau IL15RA

miễn dịch tự nhiên (tế bào

nhiễm trùng bởi

NK), tế bào T CD8+.

virus
Tế bào lympho,
IL-16

biểu mô, bạch
cầu ái toan, tế
bào CD8+ T

CD4

Thu hút CD4+


9

IL-17

Tế bào Th17

CDw217/IL7R

Tăng nồng độ các cytokine

AIL7RB

trong phản ứng viêm.
Kích thích sản xuất yếu tố

IL-18

Đại thực bào

CDw218a/IL18
R1

IFN, tăng hoạt động của tế
bào NK.

IL-19

IL-20

Bạch cầu đơn
nhân

IL20R
IL20R

Điều khiển sự tăng sinh và biệt
hoá của tế bào sừng.
Tham gia hoạt hoá CD8+ T,

Tế bào NKT và
IL-21

-

tế bào T hỗ trợ IL21R
đang hoạt động

tăng cường NK độc tế bào, thúc
đẩy sự phân hoá của các tế bào
Th17.
Sản xuất defensins từ các tế
bào biểu mô. Hoạt hoá STAT1

IL-22

Tế bào hỗ trợ
Th17

IL22R

và STAT3, làm tăng protein
pha cấp như amyloid huyết
thanh A và haptoglobin trong
tế bào gan.

IL-23

IL-24

Đại thực bào, tế
bào đuôi gai
Tế bào T, bạch
cầu đơn nhân

IL23R

IL20R

cầu ái toan, đại LY6E
thực bào

17, làm giảm xâm nhập CD8 T.
Tham gia ức chế khối u, làm

Tế bào T, bạch
IL-25

Bảo vệ các tế bào sản xuất IL-

lành vết thương và bệnh vẩy
nến, biểu hiện cytokine viêm.
Kích thích sản xuất IL-4, IL-5,
IL-13.


10

IL-26

IL-27

Tế bào T, tế bào
mono
Đại thực bào, tế
bào đuôi gai

IL20R1

IL27RA

IL-28

-

IL28R

IL-29

-

-

IL-30

-

-

IL-31

Tế bào Th2

IL31RA

Tăng tiết IL-10 và IL-8; biểu
hiện CD54 trên tế bào biểu mơ.
Điều hồ hoạt động của tế bào
lympho B và T.
Có vai trị trong miễn dịch
chống lại virus.
Có vai trò trong miễn dịch
chống lại vi khuẩn.
Là một chuỗi của IL-27
Có thể đóng vai trị trong viêm
da.
Kích thích bạch cầu đơn nhân

IL-32

-

-

và đại thực bào tiết TNF-, IL8 và CXCL2.

IL-33

-

-

IL-35

Tế bào T

-

IL-36

-

-

Hỗ trợ các tế bào lympho T sản
xuất cytokine typ 2.
Ức chế hoạt hoá tế bào T hỗ
trợ.

Điều chỉnh phản ứng tế bào
đuôi gai và tế bào lympho T.

1.1.2. Interleukin 7
1.1.2.1. Cấu trúc gen hIL-7
hIL-7 gồm một chuỗi glycoprotein xoắn 4α, có khối lượng phân tử 17,4
kDa và được ổn định bằng gốc N - glycosyl hóa hoặc O - glycosyl hóa và cầu
nối disulfide nội phân tử [169]. Ở người, gen hIL-7 có kích thước 33Kb, gồm
có 6 exon và 5 intron nằm trên nhiễm sắc thể số 8, ở vị trí 8q21.13. Cấu trúc


11

phân tử của hIL-7 được giữ vững ngay cả khi nồng độ pH có sự biến động mạnh
(2,1 - 8,0) [33]. Tuy nhiên, hIL-7 sẽ mất hoạt tính sinh học khi bổ sung 2mercaptoethanol, điều này cho thấy tầm quan trọng của các liên kết cầu nối
disulfide có trong cấu trúc phân tử hIL-7 [14].

Hình 1.1. Cấu trúc protein hIL-7 [65]
hIL-7 cấu tạo gồm một chuỗi glycoprotein xoắn 4α, liên kết với nhau
bằng gốc N-glycosyl hóa hoặc O-glycosyl hóa và các cầu nối disulfide
hIL-7 lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1988 bởi công ty Immunex
[102] và cDNA được nhân bản đầu tiên vào năm 1989 [103]. hIL-7 có vai trị
quan trọng trong hệ bạch huyết do có khả năng thúc đẩy sản sinh các tế bào
bạch cầu lympho ở chuột bị nhiễm bệnh [97], [98].
hIL-7 chủ yếu được sản xuất bởi tuyến ức [102], [163]. Ngoài ra, các tế
bào khác như các tế bào tủy [47], nội mạc ruột [162] và tế bào sừng trên da [57]
cũng có thể sản xuất hIL-7. Gần đây, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hIL-7 còn
được sản xuất bởi các tế bào nguyên bào sợi lưới (FRC) trong vùng tế bào T
của hạch bạch huyết [84].
1.1.2.2. Thụ thể của hIL-7

hIL-7 có hai thụ thể là IL-7Rα và thụ thể γc. Trong đó, thụ thể IL-7R
(CD127) cũng là thụ thể của các lymphoprotein mô đệm tuyến ức (TSLP) [175]
và chuỗi  (CD132) là thụ thể của IL-2, IL-4, IL-9, IL-15 và IL-21 [29], điều