Nấm đảm sinh tổng hợp laccase có khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính được sử dụng để nhuộm vải may quân trang

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (870.42 KB, 7 trang )

(1)<div class='page_container' data-page=1>

NẤM ĐẢM SINH TỔNG HỢP LACCASE CÓ KHẢ NĂNG

LOẠI MÀU THUỐC NHUỘM HOẠT TÍNH ĐƯỢC SỬ DỤNG

ĐỂ NHUỘM VẢI MAY QUÂN TRANG

Phùng Khắc Huy Chú

1,3*

, Đào Thị Ngọc Ánh

, Đặng Thị Cẩm Hà

Tóm tắt: Từ 6 trong số 45 mẫu nấm đảm được thu thập, phân lập từ rừng Quốc 
gia Ba Vì, Hà Nội, đã lựa chọn được chủng FBV40 có khả năng sinh tổng hợp 
laccase thô cao nhất. Dựa theo các đặc điểm hình thái và trình tự vùng 
ITS1-5,8S-ITS2 chủng FBV40 được xác định thuộc chi Rigidoporus và được đặt tên là 
Rigidoporus sp. FBV40. Hoạt tính laccase thơ cao nhất của chủng này đạt 107.708 
U/l trên môi trường TSH1 sau 8 ngày ni cấy và có khả năng loại 8 màu thuốc 
nhuộm hoạt tính thương mại sử dụng để nhuộm vải may quân trang ở mức độ khác 
nhau, hiệu suất loại màu MN.FBN với nồng độ 100 mg/L đạt cao nhất 88,11% khi 
có mặt 200 µM ViO sau 24 h. Ở nồng độ màu MN.FBN là 10 mg/L thì hiệu suất loại 
màu đạt 92,72%. Từ các minh chứng thu được cho thấy laccase sinh tổng hợp bởi 
chủng nấm đảm FVB40 có khả năng ứng dụng trong xử lý nước thải nhà máy dệt 
nhuộm vải may quân trang cho quân đội.

Từ khóa: Laccase, Rigidoporus, Loại màu, Thuốc nhuộm hoạt tính, Vải quân trang.

1. MỞ ĐẦU

Laccase là enzyme ngoại bào thuộc nhóm oxidoreductase là một trong số ít các enzyme
đã được nghiên cứu từ thế kỷ thứ 19. Sự quan tâm đối với các loại laccase đã được gia tăng
trong những năm gần đây do tiềm năng ứng dụng chúng trong việc khử độc các chất ô nhiễm
và trong xử lý sinh học các hợp chất phenol [7, 4]. Chúng chỉ cần oxy nguyên tử trong phản
ứng xúc tác, vì vậy chúng phù hợp đối với các ứng dụng công nghệ sinh học trong xử lý hỗn
hợp các chất ô nhiễm khi được cố định trên các chất mang phù hợp [13]. Vai trò của laccase
đã được xác định khi ứng dụng trong loại màu thuốc nhuộm, phân hủy sinh học các hóa chất

thải có độc tính như các hợp chất hữu cơ clo, các hydrocarbon thơm mạch vịng, các chất
vịng thơm có nitro và thuốc chất trừ sâu và chế tạo sensor sinh học [11, 6].

Hiện nay, công nghiệp dệt nhuộm sử dụng khoảng 2/3 tổng lượng thuốc nhuộm và tiêu
thụ một lượng lớn nước và hoá chất [5]. Các hoá chất được sử dụng đa dạng về thành phần
hoá học, chủng loại từ các hợp chất vô cơ để tổng hợp đến các sản phẩm hữu cơ. Có
khoảng 100.000 loại thuốc nhuộm thương mại với trên 7.105 tấn thuốc nhuộm được sản
xuất hàng năm. Các vấn đề nảy sinh đối với ô nhiễm bởi thuốc nhuộm là khả năng sinh ra
các chất gây ung thư như benzidine và các hợp chất vòng thơm khác [4]. Hầu hết các
phương pháp hiện tại để xử lý nước thải dệt nhuộm không đạt hiệu quả và không kinh tế
như mong muốn. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển phương pháp mới dựa trên laccase
chuyên hoạt động như là chất xúc tác là giải pháp có tiềm năng cao trong loại màu thuốc
nhuộm có các cấu trúc hoá học đa dạng như vậy [15]. Hiện tại, chưa có cơng bố nào về
việc nghiên cứu loại màu thuốc nhuộm trong cơng nghiệp quốc phịng khi sử dụng laccase
hay hỗn hợp của nhiều laccase để xử lý loại hình ơ nhiễm này.

</div>
(2)<div class='page_container' data-page=2>

với các phổ cơ chất đặc biệt và nghiên cứu nâng cao tính ổn định là rất quan trọng để triển
khai ứng dụng ở quy mô công nghiệp.

Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả thông báo kết quả nghiên cứu phân lập, phân
loại chủng nấm đảm có khả năng sinh tổng hợp laccase, lựa chọn môi trường nuôi cấy để
sinh tổng hợp laccase cao và so sánh khả năng loại một số màu thuốc nhuộm hoạt tính
thương mại được sử dụng trong công đoạn nhuộm vải may quân trang của nhà máy
X20/Bộ Quốc phòng.

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 
2.1. Vật liệu

Các chủng nấm đảm được thu thập từ đất và gỗ mục ở độ cao trên 600m rừng Quốc gia
Ba vì, thành phố Hà Nội.

2.2. Hóa chất và mơi trường ni cấy

Tám loại màu tổng hợp hoạt tính được cung cấp bởi nhà máy X20, Tổng Cục cơng
nghiệp Quốc phịng, Bộ Quốc phòng. Sử dụng các môi trường nuôi cấy TSH1 (100 ml
dịch chiết khoai tây, 10 g/L glucose, 1 g/L cám gạo, 5 g/L bột đậu tương, 100 µM Cu2+);
PDB (Dịch chiết khoai tây 200g/l, 10g/l glucose); PDB + 1%BDT (Dịch chiết khoai tây
200g/l, 10g/l glucose, 10g/l bột đậu tương); Czapeck (Saccharose 30 g/l, MgSO4 0,5 g/l,
KH2PO4 1 g/l, NaCl 1 g/l, NaNO3 2 g/l, KCl 0,5 g/l, FeSO4 0,01 g/l, pH 7); Dịch chiết
khoai tây (Khoai tây 200g/l, pH 7); MEG (KH2PO4 1 g/l, Na2HPO4 4 g/l, NaCl 0,2 g/l,
MgSO4 0,2 g/l, CaCO3 0,5 g/l, cao men 4 g/l, cao malt 2 g/l, glucose 4 g/l, pH 6,5) và Vis
(pepton 3 g/l, glucose 10 g/l, KH2PO4 0,6 g/l, ZnSO4 0,001 g/l, K2HPO4 0,4 g/l, FeSO4
0,0005 g/l, MnSO4 0,05 g/l, MgSO4 0,5 g/l, pH 6).

2.3. Phân lập chủng nấm

Các mẫu nấm và đất có gỗ mục được thu thập tươi từ rừng Quốc gia Ba Vì, mang về
phịng thí nghiệm chụp ảnh. Sau đó, tiến hành đo hoạt tính laccase của các mẫu tươi (gọi là
hoạt tính in-situ). Tiến hành phân lập, làm sạch trên môi trường thạch chứa dịch chiết
khoai tây, agar 18g/l và bổ sung guaniacol 1 % để song song nhận biết khả năng sinh tổng
hợp oxydoreductase (laccase, LiP và MnP) thông qua vịng màu nâu đỏ là sản phẩm oxy
hóa guaniacol.

2.4. Phương pháp xác định hoạt tính laccase

Để phân biệt chính xác laccase, LiP hay MnP được sinh tổng hợp bởi chủng nấm
nghiên cứu, hoạt tính laccase đã được xác định dựa trên sự oxy hóa ABTS
(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) của laccase theo phương pháp của Eggert [1].
2.5. Phân loại chủng nấm

DNA tổng số của nấm được tách chiết theo mô tả của Eric và Boehm. Sản phẩm PCR
được nhân lên từ DNA tổng số với cặp mồi ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’
và ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATG-3’) [18]. Trình tự các đoạn gene được xử lý
bằng phần mềm FinchTV và so sánh với các chủng được công bố trên GenBank (NCBI
database). Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng phần mềm MEGA 6.06.

2.6. Sàng lọc khả năng loại các màu hoạt tính bằng laccase thơ

</div>
(3)<div class='page_container' data-page=3>

trong 10 phút và đệm natri acetate 20 mM pH4. Hiệu quả loại màu thuốc nhuộm được
đánh giá trong vịng 24 giờ và được tính bằng công thức:

D = 100*(Ai - At)/Ai
Trong đó: D: Phần trăm loại màu thuốc nhuộm (%);

Ai: Độ hấp thụ ban đầu;
At: Độ hấp thụ tại thời gian t.

2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ CGK ViO lên khả năng loại màu thuốc 
nhuộm MN.FBN

Tổng thể tích phản ứng loại màu MN.FBN là 5 ml gồm đệm 20 mM natri acetate pH 4,
màu thuốc nhuộm (nồng độ 100 mg/L), dịch laccase thô (nồng độ cuối 1.000 U/l) và nồng
độ CGK ViO với các nồng độ 0; 100; 200; 400; 600; 800 và 1000 µM. Mẫu đối chứng có
chứa màu, enzyme bị biến tính nhiệt ở 100oC trong 10 phút và đệm natri acetate 20 mM
pH4. Hiệu suất loại màu được tính tốn ở các khoảng thời gian khác nhau trong vịng 24
giờ. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

2.8. Nghiên cứu khả năng loại màu ở các nồng độ khác nhau bởi laccase thơ chủng 
FBV 40

Tổng thể tích loại màu MN.FBN là 5ml gồm đệm 20 mM natri acetate pH 4, màu thuốc
nhuộm ở các nồng độ màu 5; 10; 15; 20; 30; 40 và 50 mg/L, dịch laccase thô nồng độ cuối
1000 U/L và nồng độ CGK là 600 µM. Mẫu đối chứng có chứa màu ở các nồng độ khác
nhau, enzyme bị biến tính nhiệt ở 100oC trong 10 phút và đệm natri acetate 20 mM pH4.
Hiệu suất loại màu được tính tốn ở các khoảng thời gian khác nhau trong vòng 24 giờ.
Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
Các chủng nấm đã được phân lập

Từ 45 mẫu nấm và đất có gỗ mục được thu thập tại khu vực lấy mẫu, sau khi xử lý bề
mặt được lắc và gạt trên môi trường PDA bổ sung chất chỉ thị guaiacol 0,01%. Sau 4 ngày
ni cấy, 6 chủng nấm có hệ sợi phát triển tốt, lan rộng trên bề mặt môi trường, hệ sợi nấm
bơng xốp có màu trắng, khơng mịn và tạo vịng nâu đỏ trên mơi trường có chứa chất chỉ thị
guaiacol. Hoạt tính laccase insitu hiện trường cũng đã được tiến hành. Kết quả thu được
chứng tỏ các chủng này có khả năng sinh tổng hợp các enzyme ngoại bào thuộc nhóm
peroxidase (MnP, LiP) hoặc oxidoreductase (laccase). Các kết quả được thể hiện ở bảng 1.

Bảng 1. Các chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp laccase.

Tên mẫu Mặt trước (B) Mặt sau (C) Hoạt tính in situ

(U/L)

A46 35

</div>
(4)<div class='page_container' data-page=4>

BT5 50

BT8 23

BT9 25

FBV40 150

Chú thích: Hình thái khuẩn lạc (mặt trước - B và mặt sau - C) và hoạt tính laccase in 
situ (là hoạt tính của mẫu ngay trước khi phân lập) của các chủng nấm được nuôi cấy trên 
môi trường PDA bổ sung 0,01% guaiacol làm chất chỉ thị.

Dựa vào kết quả đo hoạt tính enzyme laccase tại bảng 1, cho thấy chủng FBV40 có
hoạt tính cao nhất, khả năng phát triển nhanh nên được lựa chọn để nghiên cứu phân loại,
khả năng sinh tổng hợp laccase và khả năng loại màu thuốc nhuộm. Chủng nấm được phân
loại bằng sự kết hợp cả hai phương pháp truyền thống và so sánh độ tương đồng giữa trình
tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 của chủng với các chủng đại diện trên GenBank.

Hình 1. Hình thái sợi và bào tử của chủng FBV40 dưới kính hiển vị điện tử quét 
JOLE với độ phân giải x 1.500.

</div>
(5)<div class='page_container' data-page=5>

cặp mồi ITS1-ITS4 của chủng nấm FBV40. Sử dụng các phần mềm đã được mô tả ở phần
phương pháp, cây phát sinh chủng loại đã được xây dựng ở hình 2. Từ cây phát sinh chủng
loài cho thấy chủng FBV40 gần gũi nhất với các đại diện thuộc chi Basidiomycetes với
mức độ tương đồng 96 đến 99% tương ứng với các chủng là B. sp. HKC4 được thu thập từ
vùng biển Hawai (Mỹ) [10] và chủng B. sp. C2-14 được thu thập từ rặng san hồ ở Phúc
Kiến (Trung Quốc) và 93 đến 99% với chi đại diện của Rigidoporus lần lượt là R. Vinctus 
C1-9được phân lập từ vùng biển san hô của vùng biển Phúc Kiến và R. Vinctus FRIM 142
được phân lập từ rừng nhiệt đới ở Malaysia (). Hiện chưa có
nhiều nghiên cứu về đặc điểm hình thái cũng như khả năng sinh tổng hợp laccase của các
chủng nấm trên. Từ cây phát sinh chủng loại, đặc điểm hình thái, chủng nấm FBV40 thuộc
chi Rigidoporus và được đặt tên là Rigidoporus sp. FBV40.

Hình 2. Cây phát sinh chủng loại chủng FBV40.

</div>
(6)<div class='page_container' data-page=6>

Môi trường phù hợp để sinh tổng hợp laccase

Bảy môi trường nuôi cấy đã được lựa chọn để khảo sát khả năng sinh tổng hợp laccase
thô của chủng FBV40, kết quả được mơ tả ở hình 3.

Từ kết quả ở hình 3, trên môi trường TSH1 chủng FBV40 có khả năng sinh tổng hợp
laccase thô cao nhất lên tới 107.708 U/L sau 8 ngày nuôi cấy. Tiếp đến là ở môi trường PDB
có bổ sung 1% bột đậu tương đạt 41.343 U/L sau 6 ngày nuôi cấy và ở các môi trường
Czapeck, Vis và MEG với hoạt tính lần lượt thu được là 5; 13; 12 và 68,7 U/L mặc dù đây
đều là các môi trường cơ bản để ni cấy nấm nhưng hoạt tính laccase thơ thu được lại rất
thấp. Theo nghiên cứu của Cambria và cs về chủng nấm R. lignosus có hoạt tính lần lượt là
120.000 U/L và 75.000 U/L khi bổ sung chất cảm ứng là phenylhydrazine,
guaniancol trong mơi trường ni cấy có bổ sung 25mM Nito và 500 µg/L
CuSO4 trong mơi trường sau 21-24 ngày nuôi cấy [8]. Ở Việt Nam, khi nghiên
cứu khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng nấm Trichoderma sp. FCP3 phân lập từ gỗ
mục ở rừng Quốc gia Cúc Phương hoạt tính đạt cao nhất khi bổ sung NaNO3 và KNO3 (tỷ lệ
3:7) với nồng độ 3 g/l vào mơi trường và có hoạt tính là 132 U/l. Như vậy, có thể thấy rằng
thành phần mơi trường ni cấy có ảnh hưởng rất lớn tới khả năng sinh tổng hợp laccase
của chủng FBV40. Môi trường TSH1 là môi trường phù hợp nhất trong số các mơi trường
khảo sát để FBV40 có khả năng sinh tổng hợp laccase có hoạt tính cao nhất.

Hiệu suất loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bởi laccase thơ

Với mục đích sử dụng enzyme thơ để phục vụ khảo sát khả năng loại màu thuốc nhuộm
hoạt tính để nhuộm vài may quân trang, chủng nấm FBV40 được nuôi lắc trên môi trường
TSH1 và hoạt tính laccase cao nhất thu được sau 8 ngày ni cấy là 107.708U/L. Kết quả
chứng minh rằng laccase thô từ chủng FBV40 trên có khả năng loại được các màu hoạt
tính ở mức độ khác nhau, khi sử dụng phương pháp đánh giá khả năng loại màu trên thiết
bị UV-VIS. Kết quả loại màu được trình bày ở bảng 2.

Bảng 2. Khả năng loại màu một số thuốc nhuộm hoạt tính sử dụng 
trong qn đội bằng laccase thơ chủng FBV40.

C

T

MT BES

T

C

NY S3R

C

T

MY BES

C

</div>
(7)<div class='page_container' data-page=7>

Chú thích: C- Đường biểu diễn màu đối chứng; T- Đường biểu diễn màu thí nghiệm. 
Đối với các màu thuốc nhuộm hoạt tính khi không sử dụng CGK, laccase của chủng
nấm FBV40 có ít khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính được sử dụng trong nghiên
cứu này. Hiệu suất loại các màu này bởi laccase thô chủng FBV40 khi khơng có CGK dao
động trong khoảng từ 1 đến 5,56% sau 24 giờ thí nghiệm, cao nhất chỉ đạt 5,56% đối với
màu MR.EBR.

Hiệu suất loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bởi laccase thơ khi sử dụng CGK là ViO sau
24 giờ khá cao. Với hiệu suất loại màu hoạt tính thương mại nằm trong khoảng rất rộng từ
4,22% đến 88,11%, trong đó, hiệu suất loại màu thấp nhất là màu MY-BES chỉ đạt 4,22%
và cao nhất đối với màu MN. FBN lên tới 88,11% sau 24h phản ứng. Kết quả thu được

cho thấy vai trò của CGK trong phản ứng loại màu của laccase bởi chủng FBV40 đối với
các màu thuốc nhuộm hoạt tính từ nhà máy X20, trong đó, đặc biệt là khả năng loại màu
MN.FBN với hiệu suất tăng từ 0,22% đến 88,11% và màu NN.SG từ 0,11% đến 77,05%.
Đặc biệt, hiệu suất loại màu khơng có sự biến động lớn sau 24 giờ khi có mặt của CGK.
Từ kết quả này cho thấy vai trò của CGK rất quan trọng trong việc loại màu thuốc nhuộm
bởi laccase thô chủng FBV40. Số liệu thực nghiệm cho thấy, enzyme thô chủng FBV40 có
hiệu quả cao trong việc loại các màu thuốc nhuộm thuộc nhóm màu có 2 gốc azo và có
màu xanh lá cây hoặc xanh đen (đây là những màu được sử dụng chính để nhuộm vải may
quân trang cho quân đội hiện nay), cịn những màu mang nhóm màu có gốc azo đơn và có
màu vàng, đỏ hoặc xanh da trời, laccase thô từ chủng FBV40 loại màu kém hơn rất nhiều.
Theo nghiên cứu khi sử dụng 09 chủng trong tập đoàn HN1 đã loại màu được 83,89% đối
với màu 100 mg/L Reactive Blue 222 (MN.FBN) sau 15 h nuôi lắc [2]. Khi loại màu RB
222 bằng phản ứng phenton thì loại màu được gần 90% và tăng lên đạt 96,88% và đạt
95,23% sau khi xử lý hiếu khí bằng 2 chủng nấm đảm trắng P.ostreatus IBL-02 và P. 
chrysosporium IBL-03 [14]. Chủng Pseudomonas sp. D4 được phân lập từ nước thải nhà
máy nhuộm có khả năng loại màu cao nhất đối với màu 100 mg/l RB 222 sau 24 h đạt 70%
ở pH 7 và nhiệt độ nuôi cấy 350C [18]. Hiện chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu trong nước
và quốc tế về sử dụng laccase thô để loại màu RB 222. Khi nghiên cứu khả năng loại màu
của laccase tinh sạch với hoạt tính 20 U/L rLac15 thu từ chủng vi khuẩn nước biển khi có