Tối ưu phương pháp xác định adenosine trong một số thự phẩm chức năng đông trùng hạ thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

Họ và tên tác giả luận văn
Lê Thị Thúy

TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN
TỐI ƯU PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ADENOSINE TRONG MỘT SỐ
THỰC PHẨM CHỨC NĂNG ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
(Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm)

Hà Nội – Năm 2014


Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này ngồi sự nỗ lực, cố gắng của bản thân tơi đã
nhận được sự giúp đỡ tận tình của thầy cơ, gia đình và bạn bè.
Với lịng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cám ơn TS. Vũ Hồng Sơn Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và TS. Lê Thị Hồng Hảo - Viện Kiểm nghiệm

an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn và tạo điều
kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp này.
Tơi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo trong khoa
Viện Công nghệ sinh học và Cơng nghệ thực phẩm cùng tồn thể các thầy cơ giáo
trong trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, những người đã giúp đỡ và dẫn dắt tôi
trong suốt thời gian học tập tại trường.
Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè là người
đã luôn ở bên cạnh động viên, giúp đỡ và chia sẻ mọi khó khăn với tơi trong suốt
q trình học tập.

Hà Nội, ngày

tháng
Học viên

Lê Thị Thúy

năm 2014


Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung
thực và chưa từng được sử dụng.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện báo cáo này đã
được cảm ơn và các thơng tin trích dẫn trong báo cáo này đã được ghi rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày

tháng

Học viên

Lê Thị Thúy

năm 2014


Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

MỞ ĐẦU
Ở Việt Nam, thực phẩm chức năng tuy mới xuất hiện gần đây trong sự đón
nhận dè dặt của người tiêu dùng nhưng nó đã ngày càng lan rộng như một làn sóng
rộng khắp. Hiện nay, đi cùng với sự phát triển kinh tế cịn tồn tại những vấn nạn về
xã hội, ơ nhiễm mơi trường, những ám ảnh về vệ sinh an tồn thực phẩm và nỗi lo
về sức khỏe bệnh tật khiến cho sản phẩm thực phẩm chức năng trở thành hy vọng,
là cứu cánh cho mỗi người và mỗi gia đình. Đặc biệt là các sản phẩm tăng cường
sức khỏe như đông trùng hạ thảo. Sách y học cổ truyền của Trung Quốc coi đơng
trùng hạ thảo là vị thuốc có tác dụng “Bổ phế ích can, bổ tinh điền tuỷ, chỉ huyết
hố đàm”, “Bổ phế ích thận, hộ dưỡng tạng phủ”, “Tư âm tráng dương, khư bệnh
kiện thân”; là loại thuốc “Tư bổ dược thiện”, có thể chữa được “Bách hư bách tổn”.
Bên cạnh đó, các nghiên cứu cổ truyền cũng như các thực nghiệm hiện đại đều xác
định đông trùng hạ thảo hầu như khơng có tác dụng phụ đối với cơ thể người và
động vật. Đặc điểm vượt trội của đông trùng hạ thảo là hàm lượng rất cao adenosine
trong thành phần (5,08890 mcg/g) giúp cơ thể luôn dồi dào năng lượng để hoạt

động hiệu quả và nhanh chóng xố đi các triệu chứng mệt mỏi.
Adenosine là hợp chất có vai trị quan trọng trong q trình chuyển hoá
năng lượng của cơ thể như: giúp cải thiện tuần hoàn ngoại biên và tim mạch; cải
thiện năng lực cơ bắp, giảm sinh trưởng của tế bào xấu, tăng lượng oxy trong
máu… Vì vậy, việc bổ sung adenosine hàm lượng cao cho cơ thể là vô cùng cần
thiết giúp cơ thể luôn dồi dào năng lượng để hoạt động hiệu quả. Tuy nhiên, điều
kiện nuôi cấy đông trùng hạ thảo khác nhau dẫn đến thành phần của nguyên liệu và
hàm lượng hoạt chất chính này cũng khác nhau.
Hiện nay, để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng, các nhà sản xuất không
ngừng cải tiến công nghệ để đưa ra những dòng sản phẩm mới nhưng một vấn đề
đặt ra là chất lượng của các sản phẩm này trên thị trường như thế nào. Trên thực tế,
có những sản phẩm thực phẩm chức năng công bố hàm lượng đông trùng hạ thảo rất
cao với giá bán rất đắt nhưng khi phân tích cho thấy chất lượng khơng đạt được như
cơng bố. Nhiều người tiêu dùng mất tiền mà khơng có được tác dụng như mong

1


Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

muốn. Do đó, việc phát triển kỹ thuật phân tích thành phần hoạt chất chính adenosine trong các sản phẩm thực phẩm chức năng đông trùng hạ thảo là vơ cùng
cần thiết. Nó là cơng cụ giúp cho các nhà quản lý kiểm soát tốt chất lượng của các
sản phẩm thực phẩm chức năng nhằm đảm bảo quyền lợi cho người tiêu dùng.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Tối ưu phương pháp xác
định adenosine trong một số thực phẩm chức năng đông trùng hạ thảo bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC" với các mục tiêu sau:
- Tối ưu phương pháp định tính và định lượng adenosine trong nguyên liệu và thực
phẩm chức năng đông trùng hạ thảo

- Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng adenosine trong một số nguyên
liệu và sản phẩm thực phẩm chức năng đông trùng hạ thảo.
Trên thế giới đã công bố một số phương pháp phân tích adenosine trên các
kỹ thuật: sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, sắc ký lỏng khối phổ LC-MS… Phù hợp
với điều kiện phịng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao HPLC để xác định hàm lượng adenosine trong các sản phẩm thực phẩm
chức năng đông trùng hạ thảo. Phương pháp có độ nhạy và độ chính xác cao.

2


Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về đông trùng hạ thảo
1.1.1. Đặc điểm của đông trùng hạ thảo [21, 38, 40]
Cordyceps (đông trùng hạ thảo) là một loài nấm dược liệu quý hiếm và kỳ
lạ thuộc ngành Ascomycotina, lớp Asiomycetes, được coi là một thần dược có giá
trị rất cao trong y học Trung Quốc trong nhiều thế kỷ. Đó là một dạng cộng sinh
giữa một lồi nấm túi có tên khoa học là Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. với sâu
non (ấu trùng) của một lồi cơn trùng thuộc chi Hepialus. Thường gặp nhất là sâu
non của lồi Hepialus armoricanus. Ngồi ra cịn 40 lồi khác thuộc chi Hepialus
cũng có thể bị Cordyceps sinensis ký sinh.
Cordyceps xuất phát từ tiếng Latinh "Cord" = "chùy", "ceps" = "đầu".
Nấm có dạng giống con sâu, với đi là một cành nhỏ, mọc lá. Khi sấy khơ, nó có
mùi tanh như cá, đốt lên có mùi thơm. Phần "lá" hình dạng giống ngón tay, dài
khoảng 4 – 11 cm, trọng lượng khoảng 0,06g do sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu
non mà thành. Đầu sâu non giống như con tằm, dài chừng 3–5 cm, đường kính

khoảng 0,3 - 0,8 cm. Bên ngồi có màu vàng sẫm hoặc nâu vàng với khoảng 20-30
vằn khía, vằn khía ở gần đầu nhỏ hơn, có 8 cặp chân, nhưng 4 đơi ở giữa là rõ nhất.
Chất đệm nấm hình que cong mọc ra từ mình sâu non, dài hơn sâu non một chút.
Sâu non dễ bẻ gãy, ruột bên trong căng đầy, màu trắng hơi vàng, chất đệm nấm khá
dai và bên trong ruột hơi rỗng, có màu trắng ngà. Khi nấm đạt đến độ thành thục
nhất tiêu thụ đến 99% chất dinh dưỡng từ thân sâu và sâu biến thành xác khô.
Nấm quả thể thành thục sẽ phát tán các bào tử ra chung quanh khoảng vài cm,
nếu gặp gió có thể phát tán cao hơn. Vào mùa đông sâu bị nhiễm bào tử nấm
qua ăn phải bào tử nấm hoặc qua các hơi thở của sâu. Nấm phát triển bằng chất
dinh dưỡng của sâu, khi sử dụng hết chất dinh dưỡng của sâu làm sâu chết khô.
Đến mùa hè, nấm phát triển thành cây mọc ra từ đầu sâu vươn ra khỏi mặt đất.
Thời gian để nấm phát triển thành dạng quả thể kéo dài trong cơ thể sâu cả các
tháng mùa đông đến cuối xuân đầu hè. Chỉ phát hiện được đông trùng hạ thảo vào

3


Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

mùa hè ở một số cao nguyên cao hơn mặt biển từ 3500 đến 5000m như: Tây Tạng,
Tứ Xuyên, Thanh Hi, Cam Túc, Vân Nam của Trung Quốc.
1.1.2. Phân loại đông trùng hạ thảo [38, 40]
Đông trùng hạ thảo được Miles Berkeley mô tả lần đầu tiên vào năm
1843 với tên gọi là Sphaeria sinensis. Đến năm 1878, khi nghiên cứu về loài này
Pier Andrea Saccardo chuyển loài này sang chi Cordyceps. Đến năm 2007, khi tiến
hành phân loại 2 họ Cordycipitaceae và Clavicipitaceae, kết quả đã tách một số chi
Cordyceps

sang

chi

Ophiocordyceps

và

tạo

nên

một

họ

mới

là

Ophiocordycipitaceae.
Chi nấm Cordyceps có tới 350 lồi khác nhau, riêng ở Trung Quốc đã tìm
thấy 60 loài. Tuy nhiên cho đến nay người ta mới chỉ nghiên cứu nhiều nhất được 2
loài Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. và Cordyceps militaris (L. ex Fr.) Link. Loài
thứ hai được gọi là nhộng trùng thảo.
Dưới đây là hình ảnh của một số đơng trùng hạ thảo

Hình 1.1. Hình ảnh của Cordyceps sinensis

Hình 1.2. Hình ảnh của Cordyceps militaris

4


Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

1.1.3. Thành phần của đông trùng hạ thảo [33, 35, 40]
Đông trùng hạ thảo là mội lồi nấm rất q hiếm và có giá trị kinh tế rất cao
bởi trong thành phần cấu tạo của nó có chứa rất nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học
có giá trị như: các hợp chất nucleoside, các polysaccharide, protein và các hợp
chất nitragenous, sterol, vitamin, khoáng chất...
* Nucleosides [20]
Đây là thành phần chính có giá trị đặc biệt trong đông trùng hạ thảo,
gồm

một

số

hợp

chất

như:

guanosine,

uridine,

deoxyuridines,

2’3’dideoxyadenosine, hydroxyethyladenosine, cordycepin [3’-deoxyadenosine],
cordycepin triphosphate, guanidine, deoxyguanidine... Trong đó, adenosine là một
nucleoside có hoạt chất sinh học chính để đánh giá chất lượng của đơng trùng hạ
thảo. Đây là hợp chất tự nhiên có giá trị dược liệu thần kỳ.
Dưới đây là cấu tạo của một số nucleoside:

.
Hình 1.3. Cấu tạo của một số nucleoside trong đông trùng hạ thảo
Theo nghiên cứu của H.Fan và cộng sự [23] đã tiến hành phân tích để xác
định hàm lượng nucleosides của Cordyceps sinensis tự nhiên, nuôi trồng và

5


Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

cordyceps militaris nuôi trồng, kết quả phân tích cho thấy hàm lượng các nucleoside
khác nhau ở các đông trùng hạ thảo khác nhau và địa điểm nuôi trồng khác nhau là
khác nhau. Hơn nữa, trong đơng trùng hạ thảo có chứa một số nucleoside chiếm tỷ
lệ cao hơn như: adenosine, guanosine, uridine, cordycepin. Đặc biệt, trong
cordyceps sinensis tự nhiên hàm lượng adenosine cao trong khi hàm lượng của
cordycepin thấp hơn và ngược lại trong cordyceps militaris ni trồng. Kết quả
phân tích được chỉ ra trong bảng sau:
Bảng 1.1. Hàm lượng của 13 nucleoside trong đông trùng hạ thảo

* Polysaccharides
Một số các polysaccharides và các chất dẫn xuất đường khác như là acid
cordycepic [d-mannitol]. Nghiên cứu cho thấy những polysaccharides này có
hiệu quả trong việc điều tiết đường trong máu, chống di căn và hiệu quả chống
ung thư và tăng cường miễn dịch.
* Proteins và các hợp chất nitragenous
Cordyceps chứa protein, peptide và 17 acid amin thiết yếu khác. Ngồi
ra cịn chứa một số dipeptide cyclic không phổ biến bao gồm cyclo -[Gly-Pro],

6


Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

cyclo - [Leu-Pro], cyclo -[Ala-Leu], cyclo - [Ala-Val] và Cyclo - [Thr-Leu].
Khối lượng nhỏ các polyamine bao gồm 1,3 diamino propane, cadaverine,
spermidine, spermine và pustrescine đã được nhận dạng. Hợp chất này được
chứng minh là có tác dụng kháng sinh.
* Sterols
Một số các sterol được tìm thấy trong đơng trùng hạ thảo gồm:
ergosterol, delta - 3- ergosterol, ergosterol peroxide, 3-sitosterol, daucosterol
và campasterol. Các hợp chất này có liên quan tới sex-steroid chống rối loạn
tình dục.
* Các thành phần cấu tạo khác
Ngồi các thành phần chính ở trên trong đơng trùng hạ thảo cịn có chứa
một số các thành phần khác có giá trị rất cao như:
- Các vitamin cần thiết cho cơ thể (trong 100g đơng trùng hạ thảo có 0,12 mg
vitamin B12; 29,19 mg vitamin A; 116,03 mg vitamin C, ngồi ra cịn có vitamin

B2, vitamin E, vitamin K...)
- Chứa 28 acids béo bão hòa, chưa bão hòa và các dẫn xuất
- Các hợp chất phân cực đã được chiết xuất từ đông trùng hạ thảo gồm:
hợp chất hydrocarbon, alcohol và aldehyde. Đặc biệt là hợp chất chuỗi
hydrocarbon aromatic polycylic (PAH) được sản xuất bởi Cordyceps sinensis.
Đây được coi là hợp chất chuyển hóa thứ cấp. Những hợp chất này phản ứng
với polypropylene được sử dụng trong các túi nuôi trồng nấm sẽ sản sinh ra các
sản phẩm phụ gây độc đối với đông trùng hạ thảo, làm chậm sự tăng trưởng và
kéo dài thời gian sinh trưởng của lồi này. Thậm chí những polypropelene và
sản phẩm phụ PAH sẽ giết chết các sinh vật có lợi cho sự phát triển của đơng
trùng hạ thảo. Vì vậy, nấm cordyceps sinensis phải được trồng trong cốc hoặc
những vật chứa đựng bằng kim loại. Những hợp chất PAH này có trong mơi
trường sống, nhưng là chất dễ bay hơi (không ổn định) và dễ bị mất đi nếu bị
khô.

7


Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

1.1.4. Tác dụng của đông trùng hạ thảo [33, 35, 40]
Đông trùng hạ thảo được coi là một thần dược quý hiếm được sử dụng khá
phổ biến trong khoảng 200 năm trước đây ở Trung Quốc và các nước ở Phương
Đơng. Đến năm 1976, nó đã được biết đến và sử dụng rộng rãi tại các nước phương
tây. Đã có rất nhiều nghiên cứu và phát hiện ra rất nhiều các hợp chất có hoạt tính
sinh học và những tác dụng dược liệu quý hiếm từ loài nấm này.
- Theo dược điển Trung Quốc (2005), đơng trùng hạ thảo có tác dụng bổ
phổi, thận, cầm máu, tan đờm, điều trị ho mãn tính, điều trị ra mồ hôi trộm và đảm

bảo phục hồi sức khỏe nhanh cho người bị bệnh và tăng cường sức đề kháng.
- Có khả năng cải thiện chức năng gan: chống xơ gan, viêm gan mãn tính và
tiểu mãn tính và bệnh gan có liên quan. Thử nghiệm lâm sàng cho thấy khi sử dụng
các TPCN đông trùng hạ thảo trên 33 bệnh nhân viêm gan B và 8 bệnh nhân xơ gan.
Kết quả 71,9% được cải thiện với test thymol turbidity và 78,6% được cải thiện với
test SGPT.
- Cải thiện chức năng thận: Nghiên cứu ở Trung Quốc cho thấy 51% số bệnh
nhân đã cải thiện được bệnh thận mãn tính khi sử dụng 1 tháng các sản phẩm từ
đơng trùng hạ thảo.
- Tăng khả năng hấp thụ O2, có khả năng làm giảm bệnh phổi mãn tính
- Cải thiện chức năng tim
- Bảo vệ cơ thể chống lại các gốc tự do
- Giảm kích thước của khối u và chống lại ung thư: Dùng polysaccharides
phân đoạn CI-P và CI-A, chiết xuất từ đông trùng hạ thảo với liều 1-10mg/kg
trọng lượng mỗi ngày cho chuột bị khối u thấy có tác rất hiệu quả với khối u
sarcoma 180. Mijuno 1999 đã nghiên cứu β-(1-3)-D-glucan, phân đoạn CO-N,
có dẫn xuất từ đơng trùng hạ thảo Cordyceps ophioglossoides có tác dụng
chống lại chuỗi tế bào sarcoma 180 thường được thử nghiệm trên chuột có khối
u với liều 0,5mg/kg tiêm có thể kiềm chế sự phát triển của khối u này với tỷ lệ
đạt > 98%.

8


Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

Nhiều nghiên cứu điều trị bệnh nhân ung thư ở Trung Quốc và Nhật Bản
có sử dụng đông trùng hạ thảo thấy hiệu quả rất quả rõ ràng. Trong một nghiên

cứu điều trị 50 bệnh nhân bị ung thư phổi với liều điều trị là 6g/ngày cùng với
hoá trị, khối u giảm xuống 46%. Khi sử dụng sản phẩm này để điều trị các loại
ung thư khác nhau với liều 6g/ngày trong vòng hai tháng cho thấy bệnh được
cải thiện đáng kể, kiểm tra tế bào bạch cầu thấy tăng cao ở các bệnh nhân có
khối u giảm 50%.
- Tăng cường khả năng miễn dịch: Nhiều kết quả nghiên cứu đã cho thấy hợp
chất β -glucan làm tăng cường khả năng miễn dịch và ngăn ngừa bệnh tật của cơ
thể. Nó có hai chức năng điều chỉnh tăng hoặc giảm miễn dịch. Khi các bệnh
nhân bị thiếu khả năng miễn dịch, như ở bệnh nhân ung thư, viêm gan B và
HIV được sử dụng đông trùng hạ thảo hỗ trợ điều trị, kết quả cho thấy số lượng
và tác động của bạch cầu trong máu tăng. Ngược lại với bệnh nhân tăng miễn
dịch quá cao như bệnh bạch cầu (lymphoma) hoặc các bệnh thấp khớp
(rheumatoid arthritis) khi dùng đông trùng hạ thảo cho thấy số lượng và tác
động của bạch cầu trong máu giảm ngược lại số lượng hồng cầu lại tăng. Quá
trình này diễn biến là do các cơ chế trong các pha sản xuất máu khác nhau. Các
tế bào máu tất cả được sản xuất trong tuỷ xương. Chúng ra khỏi tuỷ xương đầu
tiên ở dạng chưa thành thục và sau đó xâm nhập vào các cơ quan khác trở thành
thành thục với các dạng khác nhau của tế bào máu như hồng cầu, tế bào T. Khi
có mặt của đơng trùng hạ thảo, nó ảnh hưởng lên các cơ chế khác nhau sản sinh
hồng cầu, bạch cầu và tế bào T. Ở đây, nó trực tiếp ảnh hưởng tới q trình
biến đổi các tế bào máu ở dạng chưa thành thục thành thành thục.
Ngồi ra có một số chất khác có tác dụng ức chế miến dịch như: cyclosporin
là chất chống đối chính được sử dụng cho việc cấy ghép các bộ phận trên cơ thể
người có nguồn gốc từ các lồi Cordyceps subsessilis .
- Giúp duy trì lượng cholesterol tốt: Theo một số nghiên cứu Cordyceps
sinensis có khả năng giảm lượng cholesterol tổng xuổng 10-21% và triglycerid

9

Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

xuống 9-26% đồng thời làm tăng hàm lượng cholesterol có tỷ trọng phân tử cao
(HDL - High density Lipoprotein) từ 27 - 30%
- Giúp hỗ trợ các triệu chứng lão hóa: Nghiên cứu lâm sàng trên một số bệnh
nhân lớn tuổi bị mệt mỏi và các triệu chứng liên quan đến lão hóa sau khi sử dụng
các sản phẩm từ đông trùng hạ thảo trong 30 ngày. Biểu hiện mệt mỏi của họ đã
giảm 92%, cảm giác của họ về lạnh giảm 89% và hiện tượng chóng mặt giảm 83%,
một số bệnh nhân có vấn đề hô hấp được cải thiện rõ rệt.
- Cải thiện chức năng tình dục
Ngồi ra, một số hợp chất có hoạt tính sinh học được sử dụng nhiều trong
lĩnh vực y học như: 2’3’- dideoxyadenosine (được coi là chất antiretroviruses ban
đầu cho điều trị lây nhiễm HIV dưới các tên thương mại như DidannosineTM,
VidexTM).
Hơn nữa, các nghiên cứu cổ truyền cũng như các thực nghiệm hiện đại đều
xác định đông trùng hạ thảo hầu như khơng có tác dụng phụ đối với cơ thể người và
động vật. Liều uống đông trùng hạ thảo an tồn đối với chuột thí nghiệm là trên
45g/1kg thể trọng.
Hiện nay, đã có hơn 600 cơng bố về đông trùng hạ thảo, con số này ngày
càng tăng do có nhiều phát hiện bí ẩn và những tác dụng dược liệu của loài nấm quý
hiếm này. Với công nghệ sinh học hiện đại, người ta đã chứng minh được nhiều tác
dụng dược lý, chữa bệnh của các chất có trong đơng trùng hạ thảo là hữu hiệu.
Trong đó, một thành phần hoạt chất chính có vai trị quyết định đến chất lượng của
đông trùng hạ thảo là adenosine.
1. 2. Giới thiệu về adenosine
1.2.1. Cấu tạo của adenosine [10]
Adenosine là một purin nucleoside. Đây là hợp chất chứa N2 có cấu trúc
phân tử hai vịng gồm một phân tử adenine liên kết với một đường ribose nhờ liên

kết β-N9-glycosidic.
Công thức phân tử: C10H13N5O4, khối lượng phân tử 267,241g/mol
Tên thương mại: adenocard
Công thức cấu tạo của adenosine:

10


Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

Hình 1.4. Cơng thức cấu tạo của adenosine
Adenosine là một nucleoside được tạo ra do sự phá vỡ adenosine
triphosphate (ATP). Đây là nguồn năng lượng chính cho hệ thống vận chuyển của
cơ thể và hoạt động của enzymes. Hầu hết các ATP bị thủy phân thành adenosine
diphosphate (ADP), sau đó nó bị dephosphoryl hóa tạo adenosine monophosphat
(AMP). Cuối cùng AMP bị dephosphorylate nhờ enzyme 5' - nucleotidase tạo thành
adenosine nhờ màng tế bào.
Con đường chuyển hóa từ ATP thành adenosine trong cơ thể như sau:

Hình 1.5. Con đường chuyển hóa thành adenosine trong cơ thể
1.2.2. Tính chất của adenosine [10]
Adenosine ở dạng bột tinh thể màu trắng, tan nhiều trong nước và đặc biệt ít
tan trong cồn.
Trong cơ thể adenosine được tạo thành do sự thủy phân AMP bởi enzyme 5'nucleotidase, một phần bị chuyển hóa ngược trở lại tạo thành AMP bởi enzyme
adenosine kinase, một phần chuyển hóa thành inosine nhờ enzyme adenosine
deaminase, sau đó chuyển hóa thành hypoxanthine nhờ enzyme nucleosidase và
thành xanthin nhờ enzyme xanthinoxydase, sản phẩm cuối cùng của sự chuyển hóa

11


Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

là tạo thành acid uric. Trong huyết tương, sự chuyển hóa thành inosine và
hypoxanthin xảy ra rất nhanh. Thời gian bán hủy của adenosine trong invitro và
invivo khoảng vài giây. Trong nội bào adenosine được tạo ra trong các nơron thần
kinh và các tế thần kinh đệm của hệ thống miễn dịch.
Adenosine được chứng minh là chất đối kháng cạnh tranh với
methylxanthine như cafein và theophyllin với cơ chế tác động như sau: Adenosine
được tạo ra trong quá trình hoạt động của cơ thể. Khi nồng độ đủ cao nó sẽ gắn với
recceptor (thụ thể) làm cho hệ thần kinh phát ra tín hiệu nghỉ ngơi dấn đến sự mệt
mỏi và gây ra buồn ngủ. Do có cấu trúc phân tử gần giống với cafein nên cafein
cạnh tranh với adenosine trong việc liên kết với receptor đặc hiệu. Điều này làm cho
hệ thần kinh sẽ chỉ đạo cho cơ thể phát ra tín hiệu làm việc thay cho nghỉ ngơi.
Một số tác giả [28] đã nghiên cứu và chỉ ra rằng adenosine làm tăng nồng độ
của cAMP nội bào trong não chuột, những lập luận này cho rằng thụ thể adenosine
tồn tại trong hệ thống thần kinh trung ương (CNS) và hàm lượng adenosine trong
dịch não tủy lớn hơn trong huyết tương và nó có khả năng vượt qua hàng rào máu
não. Adenosine được hấp thu rất nhanh trong các tế bào máu làm cho nồng độ của
adenosine trong các tế bào này rất thấp.
1.2.3. Tác dụng dược lý của adenosine
Adenosine là một nucleoside nội sinh ảnh hưởng nhiều quá trình sinh lý của
cơ thể, nó có mặt ở khắp các cơ quan trong cơ thể và đóng vai trị quan trọng trong
q trình trao đổi chất của cơ thể như chuyển hóa năng lượng cũng như truyền tín
hiệu cAMP. Trong đó, ATP là một nucleotide gồm có adenosine và 3 nhóm
phosphate. Đây là hợp chất cao năng được sử dụng trong các hoạt động chuyển hóa

năng lượng của tế bào và giữa các phản ứng xảy ra trong cơ thể. ADP là một coenzyme gồm một phân tử adenosine và 2 phân tử acid phosphoric, là một chất trung
gian quan trọng trong sự chuyển hóa của tế bào. AMP cịn được gọi là adenyclic
acid: là este phosphoric của adenosine
Adenosine tham gia vào cấu tạo tất cả các chất dịch của cơ thể bao gồm các
dịch lỏng của hệ thống miễn dịch. Trong hệ thống mạch máu nói chung và trong

12


Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

não nói riêng, adenosine tạo ra bởi tế bào nội mô đi vào trong kẽ khơng gian của tế
bào, nơi có chứa các thụ thể gắn purin gây ra sự giãn mạch. Một vài tác giả đã báo
cáo rằng có thể adenosine được tạo thành do sự tách ra của các tế bào thần kinh cuối
hoặc các tế bào thần kinh đệm. [19], [28]
Adenosine có khả năng tương tác với cặp protein G (là một nhóm protein lớn
bao hàm những thụ thể màng sinh chất có khả năng cảm nhận được các phân tử bên
ngồi tế bào và kích thích các q trình truyền dẫn tín hiệu để tạo ra phản ứng thích
hợp cho tế bào). Nó được giải phóng ra khỏi tế bào và tồn tại ở ngoại bào. Sau đó,
nó khuyếch tán vào màng tế bào của các tế bào xung quanh nơi mà nó liên kết với
cấu trúc bề mặt tế bào đặc biệt nhận ra nó và có khả năng tiếp nhận thông tin hoặc
vật thể của một đối tượng cụ thể nào đó gọi là receptor (thụ thể) adenosine. Có 4
loại thụ thể adenosine là A 1 , A 2A , A2B and A 3. Trong đó, thụ thể A 1 bắt cặp với
G i/o làm giảm nồng độ cAMP, thụ thể A 2A bắt cặp với protein Gs có tác dụng kích
thích hoạt động cyclase adenylate. Trong khi đó, thụ thể A2B và A 3 bắt cặp với
G q để kích thích hoạt động của enzyme phospholipase. [32]
Adenosine có vai trị quan trọng, có khả năng tác động lên nhiều cơ quan
trong cơ thể như:

* Tác dụng kháng viêm [32]
Adenosine được chứng minh là một chất có khả năng kháng viêm tại thụ thể
A 2A . Nồng độ adenosine ngoại bào trong tế bào bình thường là khoảng 300
nM. Tuy nhiên, để đáp ứng với tổn thương tế bào (ví dụ như trong mơ viêm hoặc
thiếu máu cục bộ), nồng độ này được nhanh chóng nâng 600-1,200 nM. Vì vậy,
chức năng chính của adenosine chủ yếu là ngăn ngừa tổn thương mô trong trường
hợp thiếu oxy, thiếu máu cục bộ, co giật, tăng cường tuần hoàn mạch vành, mạch
não.
* Tác dụng lên tim [10]
Adenosine được chứng minh là phân tử có khả năng phát tín hiệu ngoại bào
vì nó trực tiếp kiểm sốt các chức năng của mơ tim và mạch máu gây co thắt cơ tim
cực mạnh làm thay đổi lưu lượng máu, là tác nhân gây giãn động mạch vành, đồng

13


Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

thời nó có khả năng bảo vệ tim trong việc chống lại một số chuyển hóa có hại cho
sức khỏe bằng cách giảm sự trao đổi chất tại cơ tim và tăng lưu lượng máu ở động
mạch vành thông qua 2 cơ chế khác nhau:
- Đầu tiên, nó sẽ làm giảm nhu cầu năng lượng của các mô bằng cách tác
dụng ức chế trực tiếp lên chức năng của tế bào nhu mô chứng minh bằng hiệu lực
co bóp của tế bào cơ tim.
- Thứ hai, nó có khả năng gián tiếp bảo vệ các mô bằng cách cung cấp một
môi trường thuận lợi hơn cho các tế bào nhu mơ, duy trì tính ngun vẹn của các
mô bằng cách điều chế chức năng của hệ thống miễn dịch.
Do đó, adenosine được ứng dụng trong dược học để sản xuất thuốc chống

loạn nhịp tim với cơ chế tác động như sau: Adenosine là chất chủ vận purin, tác
động trên các thụ thể P1 và P2. Tiêm tĩnh mạch nhanh adenosin làm chậm sự dẫn
truyền qua nút nhĩ thất và làm mất nhịp nhanh kịch phát trên thất do mạch vào lại ở
nút nhĩ thất. Tác dụng dược lý của thuốc gồm giãn mạch vành, giãn mạch ngoại
biên, giảm lực co cơ tim, ức chế nút xoang và dẫn truyền nút nhĩ thất. Trong nhịp
nhanh trên thất, nhịp xoang phục hồi ở 85 - 95% người bệnh. Thuốc cũng có ích
trong nghiên cứu điện sinh lý học để xác định vị trí của blốc nhĩ thất.
* Tác dụng lên phổi [10]
Một số nghiên cứu chứng minh rằng adenosine có khả năng điều chỉnh chức
năng của nhiều tế bào khác nhau liên quan viêm đường hô hấp như bạch cầu trung
tính, bạch cầu ái toan, tế bào lympho và đại thực bào. Hơn nữa, thụ thể adenosine
A1 có khả năng liên kết với cặp protein G i/o và làm giảm nồng độ của cAMP gây ra
co thắt phế quản, Ngồi ra, adenosine có khả năng kích hoạt một số cơ chế bảo vệ
riêng như chống lại sự tổn thương phổi. Trong đó vai trị của các thụ thể (A1, A2A,
A2B, và A3) ngày càng được ứng dụng nhiều đặc biệt A2B được sử dụng trong việc
điều trị các bệnh viêm nhiễm và hen suyễn mãn tính.
* Tác dụng lên hệ thống thần kinh trung ương [32]
Adenosine được chứng minh như một chất điều hịa miễn dịch, nó cịn là
chất điều biến thần kinh chính ở trong não tủy, và là chìa khóa trong việc mở máu

14


Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

não vì adenosine có mặt ở các dịch lỏng trong cơ thể và trong không gian kẽ, đặc
biệt nó tham gia nhiều vào q trình chuyển hóa của cơ thể, vì vậy nó có ảnh hưởng
lớn đến các rối loạn thần kinh như: thiếu não cục bộ, động kinh, các bệnh thối hóa

thần kinh và đau dây thần kinh. Vì vậy, adenosine đã được sử dụng nhiều trong y
học để nghiên cứu sản xuất một số loại thuốc mới dùng để điều trị một số bệnh liên
quan đến hệ thống thần kinh...
* Tác dụng lên tóc [10]
Adenosine được chứng mính có khả năng kích thích sự phát triển của tóc ở
những người có tóc thưa
Với những tác dụng như trên mà adenosine được coi là thành phần hoạt chất
chính quyết định đến chất lượng của các sản phẩm TPCN từ đông trùng hạ thảo.
1.3. Phương pháp xác định adenosine
Trên thế giới, việc xác định hàm lượng adenosine trong TPCN nói chung và
trong TPCN đơng trùng hạ thảo nói riêng là vấn đề đang rất được quan tâm. Nhiều
nhà khoa học tiến hành nghiên cứu xác định hợp chất này bằng nhiều phương pháp
khác nhau trên các đối tượng như nguyên liệu đông trùng hạ thảo, mẫu TPCN, sữa
ong chúa…Dưới đây là một số phương pháp phổ biến đã được tiến hành thực
nghiệm.
1.3.1. Phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC)
Đây là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển
qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ được
chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và
được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi
đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định cho từng chất cần
phân tích. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu
thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác
nhau. Kết quả, thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự tách có thể là
cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời

15


Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha
động.
Theo tác giả Ma Yan, Wang Yu, Yu Rong Min [29] đã tiến hành xác định
nucleoside trong Cordyceps sinensis bằng phương pháp TLC. Theo đó, dịch chiết
được phân tích sử dụng bản mỏng silica GF 254 sử dụng 1% CMC-Na, dung môi
gồm chloroform-ethylacetate-isopropanol-water-ammonia(8∶2∶6∶0.5∶0.12), được
phát hiện tại 2 bước sóng 254 nm và và 300nm. Phương pháp rất đơn giản với độ
lệch chuẩn tương đối trong khoảng 0,73-0,98% với độ thu hồi cao từ 95.270% 96,366%.
Phương pháp đơn giản, tuy nhiên có sử dụng nhiều dung mơi hữu cơ rất độc
hại.
1.3.2. Phương pháp điện di mao quản (CE) và điện di mao quản gắn khối phổ
(CE-MS)
Đây là phương pháp tách các chất phân tích là các ion hoặc các chất khơng
ion nhưng có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp chứa
đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trường. Do độ linh độ điện di của các ion khác
nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
Một phương pháp rất đơn giản được ứng dụng để xác định các thành phần
hoạt tính sinh học trong đơng trùng hạ thảo bằng phương pháp điện di mao quản đã
được công bố bởi một số tác giả Yang Gengliang, Li Hai Ying và một số cộng sự
thuộc trường cao đẳng hóa học và khoa học mơi trường thuộc đại học Hà BắcTrung Quốc [39]. Trong đó, adenosine, adenin, uridine đã được tách và phân tích
định lượng

sử dụng dung

dịch

đệm dinatritetraborate

15 mM/L

và

natridihydrogenphosphat 14 mM/L (pH =9,5) và 5% phần thể tích MeOH , dịng
điện thế 18kV và detector bước sóng 254 nm. Hệ số tương quan của phương pháp r
≥ 0,9985.
Theo tác giả Feng-Qing Yang và cộng sự [15] đã tiến hành xác định 12
nucleosides và nucleobases gồm (cytosine, adenine, guanine, cytidine, cordycepin,
adenosine, hypoxanthine, guanosine, inosine, 2-deoxyuridine, uridine and

16


Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

thymidine) trong một số loài đông trùng hạ thảo tự nhiên và nuôi trồng khác nhau
bằng phương pháp điện di mao quản gắn khối phổ (CE-MS). Theo đó, mẫu được
cân 0,2 g, thêm 10 ml H2O nhiệt độ 950C, tiến hành rung siêu âm ở nhiệt độ 75oC
trong 30 phút, sau đó dịch chiết sẽ được làm lạnh xuống nhiệt độ phòng, lọc qua
màng 0,25 μm, tỷ lệ dịch chiết mẫu và nội chuẩn (5-chlorocytosine arabinoside
0,14mg/mL) là 1 : 1. Hỗn hợp dịch chiết tiêm vào hệ thống CE -MS với điều kiện
như sau: pha động gồm đệm formic 10mM chứa 10% methanol, với tốc độ dòng 3
μL/phút, tốc độ dòng và nhiệt độ của khí là 6 lít/phút và 350oC. Kết quả phân tích
cho thấy: hàm lượng nucleosides và nucleobases trong cordyceps sinensis là (9138
±4823 μg/g cao hơn so với Cordyceps militaris là (3722 ± 1446μg/g) ngoại trừ
hypoxanthin và inosine, hàm lượng cordycepin trong cordyceps militaris cao và hầu

như không phát hiện trong một số loại nấm đông trùng hạ thảo khác.
Phương pháp này với ưu điểm tiết kiệm, lượng hóa chất sử dụng rất ít, có thể
phân tích được nhiều nhóm chất khác nhau. Tuy nhiên, độ nhạy kém đồng thời tính
ổn định khơng cao, thiết bị khơng phổ biến cho các phịng thí nghiệm. Do đó, việc
tiến hành thực nghiệm u cầu kỹ thuật phân tích chuẩn xác trong các điều kiện
khắt khe.
1.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng
1.3.3.1. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS)
Đây là một phương pháp nhanh, nhạy và được phát triển nhiều hiện nay. Sau
khi qua cột tách, chất phân tích được hóa hơi, các hợp chất hữu cơ trung hồ bị ion
hố thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang điện dương hoặc âm, các
gốc tự do. Sau đó, các ion đựơc đưa sang bộ phận tách theo khối lượng. Từ các tín
hiệu thu được, dựa vào khối lượng ion phân tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnh
ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ liệu các ion và mảnh ion,
người ta định tính và định lượng được chất phân tích một cách chính xác.
Tác giả Lan-Fang Huang và cộng sự [24] đã tiến hành tách và xác định thành
phần hoạt tính của Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris gồm adenin,
hypoxanthin, adenosine, và cordycepin và các sản phẩm chuyển hóa của nó bằng

17


Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

phương pháp khối phổ LC/ESI -MS. Sử dụng nội chuẩn là 2- chloroadenosine, sử
dụng pha động gồm H2O, MeOH, và acid formic (85:14:1), cột VP - ODS (2,0 x
150mm) của hãng Shimadzu, lựa chọn ion (SIM) [M + H]+ tại m/z là 136, 137,268,
252, 302 để phân tích định lượng cho 4 thành phần hoạt chất trên, đường chuẩn

được xây dựng cho adenin 1,4 -140 μg/ml, 0,6 - 117,5 μg/ml hypoxanthine, 0,5 128,5 μg/ml cho adenosine và 0,5 -131,5 μg/ml cho cordycepin, giới hạn phát hiện
và giới hạn định lượng cho adenin là 0,5 - 1,4 μg/ml, 0,2 và 0,6 μg/ml cho
hypoxanthin, 0,1 và 0,5 μg/ml cho adenosine và cordycepin, độ thu hồi của phương
pháp trong khoảng 93,7 -107%.
Cũng theo tác giả Fang - Qiu Guo và cộng sự [14] tiến hành phân tích và xác
định nucleosides trong Cordyceps sinensis và sản phẩm chuyển hóa của nó bằng
phương pháp HPLC- với detector PDA gắn MS. Mẫu nguyên liệu được làm khô ở
35oC trong 2h, 1g mẫu được cân và chiết với H2O, sau đó hỗn hợp này được rung
siêu âm 2h, lọc và thổi khô, cặn được hịa bằng MeOH và đem phân tích trên hệ
thống LC-MS, sử dụng pha động gồm amonium acetate 40 mM; pH 5,2 và kênh B
là MeOH với chương trình gradient, sử dụng cột VP- ODS (2 x 150 mm), chế độ
chọn lọc ion m/z là 113, 137, 245, 127, 152, 136, 268, 252 và 302, với chế độ quét
và chọn lọc ion (SIM) ở nhiệt độ 40oC, sử dụng nội chuẩn là 2 -chloroadenosine,
độ đúng và độ chính xác của phương pháp trong khoảng 1,5 - 5,3% và -3,5 - 5,0%.
Giới hạn phát hiện và định lượng của phương pháp là 0,1 - 0,6 μg/ml và 0,5 -2,0
μg/ml, độ thu hồi của phương pháp 92,0 -107%.
Một phương pháp xác định nucleosides, nucleosibases và sản phẩm chuyển
hóa của chúng trong đông trùng hạ thảo tự nhiên và nuôi trồng bằng phương pháp
chiết áp suất lỏng và sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao gắn khối phố
(HPLC- ESI - MS/MS) đã được nghiên cứu bởi nhóm tác giả H. Fan và cộng sự
[23]. Theo đó, mẫu được chiết sử dụng áp suất lỏng (PLE) sử dụng hệ thống Dionex
ASE 200 của hãng (Dionex, Sunnyvale,CA,USA), mẫu được cân khoảng 0,5g , sau
đó trộn cùng với diatomaceous với tỷ lệ 1: 2 và đặt trong một lõi thép 11ml, sử dụng
MeOH làm dung môi chiết với các điều kiện: nhiệt độ 160oC, thời gian chiết 5 phút,

18


Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

áp suất chiết 1,034 x 104 KPa, dịch chiết được thổi khô và tiến hành rung siêu âm 5
phút và hòa cặn với 5ml amonium acetate 5mM ở nhiệt độ phịng , sau đó dịch chiết
được định mức vào bình 10 ml với amonium acetate và sử dụng 2 -deoxyuridine
(1μg/ml) làm chất nội chuẩn. Sau đó mẫu được tiêm vào hệ thống sử dụng cột C18
ZOR-BAX Eclipse XDB (150mm×4,6mm ×3,5μm) và tiền cột ZORBAX ODS
(12,5mm×4,6mm × 5μm), pha động gồm amonium acetate 5mM và MeOH với
chương trình gradient, tốc độ dịng 0,5 ml/phút và nhiệt độ buồng cột 25oC, detecor
UV tại bước sóng 254 nm để phân tích định lượng dùng chế độ SRM và chế độ
SIM , với điều kiện ESI -MS như sau: sử dụng khí N2, 10 lít/phút, nhiệt độ 350oC,
áp suất 40 psi, và thế điện cực là 4,5 kV. Phương pháp có khoảng tuyến tính, độ
chọn lọc, độ đúng và độ thu hồi và thời gian phân tích ngắn.
Tuy nhiên, với phương pháp chiết mẫu rất phức tạp và thiết bị phân tích hiện
đại, chi phí lớn nên khó áp dụng.
1.3.3.2. Phương pháp sắc ký lỏng tạo cặp ion (IP-RP-LC–MS)
Tác giả F.Q.Yang và cộng sự [16] tiến hành xác định nucleotide, nucleoside
gồm uridine-5'-monophosphat (UMP), adenosine-5-monophosphat (AMP),
guanosine-5'monophosphat (GMP), 7 nucleosides gồm: adenosine, guanosine,
uridine, inosine, cytidine, thymidine, cordycepin và sáu nucleobases gồm adenine,
guanine , uracil, hypoxanthine, cytosine, thymine và các sản phẩm chuyển hóa của
chúng trong đơng trùng hạ thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng tạo cặp ion gắn khối
phổ, trong đó sử dụng acid pentadecafluarooctanoic (PDFOA) 0,25 mM làm chất
tạo cặp, cột Agilent ZORBAX SB-Aq (250 mm x 4,6mm x 5 μm), tiền cột Zobax
SB-C18 (12,5 mm x 4,6mm x 5 μm), detector PDA tại bước sóng 260 nm, pha
động gồm PDFOA 0,25 mM trong H2O và ACN theo chương trình gradient, phần
khối phổ gồm thiết bị phun điện tử ESI, với chế độ ion dương MS và phát hiện bởi
chế độ MS/MS, phổ khối được quét m/z 50 -800, chế độ chọn ion (SRM) và lọc ion
(SIM) được sử dụng, sử dụng khí N2, tốc độ 10 lít/phút, nhiệt độ 350oC, áp suất
40psi, điện áp mao mạch 4,5 kV. Mẫu đông trùng hạ thảo được cân và thêm 10 ml

H2O ở 95 -100OC sau đó được chiết hồi lưu với nước ở 100oC trong 30 phút, ly tâm,
lọc và định mức với tỷ lệ 9:1 với nội chuẩn 5-chlorocytosine arabinoside 0,1mg/mL,
sau đó tiêm vào hệ thống sắc ký. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng

19


Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

của phương pháp thấp với LOD và LOQ tương ứng của 16 thành phần là 0,16 và
0,41 μg/ml.
Tác giả Pilar Vinas và cộng sự [31] thuộc trường đại học Murcia - Thụy Sỹ
đã nghiên cứu xác định nucleosides trong thực phẩm bổ sung cho trẻ em bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao tạo cặp ion với detector mảng diod gắn với
khối phổ thời gian bay dùng chế độ ion hóa áp suất khí quyển. Sử dụng pha động
gồm đệm format 0,1M pH 5,5 chứa N,N-dimethylhexylamine (DMHA) 0,01M và
MeOH với tỷ lệ 95 : 5, detector UV-VIS cài đặt tại bước sóng 252, 260, 271 nm,
tách được thực hiện trên cột C18 Gemini-NX (150mm×4.6mm ×5μm), tốc độ dòng
0,7 ml/phút, chế độ ion âm sử dụng điện thế mao quản 1 kV, dùng chế độ khối phổ
thời gian bay gắn với ion hóa khí quyển (ESI -TOF) với nhiệt độ khí 350oC, tốc độ
dịng khí 11 lit/phút và áp suất khí 58 psi. Mẫu được kết tủa với acid trichloacetic
3%, sau đó được ly tâm, gạn vào bình định mức tới 5 ml và định mức bằng H2O,
dung dịch được lọc qua màng và tiêm vào hệ thống để phân tích. Phương pháp được
ứng dụng để phân tích các nucleosides trong các mẫu thực phẩm dành cho trẻ em
với độ lặp lại và độ thu hồi cao.
Đây là phương pháp thường được ứng dụng để tách nhiều chất có tính chất
tương tự nhau, tuy nhiên, phương pháp yêu cầu nồng độ của chất tạo cặp cao (5 -20
mM) làm giảm độ nhạy và độ chọn lọc của tín hiệu chất phân tích. Hơn nữa, các

thiết bị phức tạp, đắt tiền và khơng phải phịng thí nghiệm nào cũng có điều kiện để
thực hiện phương pháp này.
1.3.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC)
Tác giả F.Q. Yang, J. Guan, S.P. Li [17] tiến hành xác định nhanh và đồng
thời 14 nucleosides và nucleobases gồm ( adenine, adenosine, cytosine, cytidine,
uracil, uridine, guanine, guanosine, hypoxanthin, inosine, thymine, thymidine, 2'deoxyuridine and cordycepin) có trong đơng trùng hạ thảo nuôi trồng sử dụng
phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng. Trong đó, sử dụng hệ thống UPLC
Acquity của hãng Waters với cột Acquity UPLC BEH C18 và chương trình rửa giải
gradient gồm acid acetic 0,5M và ACN. Mẫu được chiết sử dụng hệ thống Dionex

20


Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

ASE 200. Mẫu được trộn với diatomaceous với tỷ lệ 1: 1, để trong lõi thép 1 lít và
được chiết với MeOH với điều kiện như sau: nhiệt độ chiết 160oC, thời gian chiết 5
phút, áp suất 1.034×104 kPa. Dịch chiết MeOH được thổi khơ ở 40oC, cặn được hòa
với 10 ml H2O loại ion, lọc qua màng và tiêm vào hệ thống UPLC. Phương pháp
phân tích đồng thời 14 nucleosides có hệ số tương quan bội R2 > 0,9995. LOD và
LOQ tương ứng nhỏ hơn 11,9 và 47,0 ng/ml với thể tích tiêm mẫu 1 μl. Độ lệch
chuẩn tương đối của cả 14 nucleosides này đều nhỏ hơn 1,8%. Phương pháp rất phù
hợp để phân tích 14 nucleosides và nucleobases trong đơng trùng hạ thảo ni trồng
và có thể ứng dụng để phân tích nhanh các sản phẩm dược phẩm và dịch sinh học.
Đây là một phương pháp hiện đại được sử dụng có hiệu suất cao, độ phân
giải và độ nhạy cảm cao, tiết kiệm dung mơi. Tuy nhiên, chi phí cho thiết bị rất lớn,
quy trình chiết mẫu phức tạp chưa phổ biến cho các phịng thí tại Việt Nam nên việc
ứng dụng khó khăn.

1.3.3.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Phương pháp này rất phù hợp cho việc xác định adenosine trong thực phẩm
nói chung và TPCN đơng trùng hạ thảo nói riêng. Do đó, nó được sử dụng rộng rãi
ở nhiều phịng thí nghiệm. Đã có rất nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng phương
pháp này để xác định adenosine.
Theo Chien-Yu Chang, Ming-Yong Lue và Tzu-Ming Pan [13] tiến hành xác
định một số nucleosides gồm: adenosine, cordycepin và Ergosterol trong nấm
Antrodia camphorata nuôi trồng bằng phương pháp HPLC. Theo đó, mẫu được
chiết bằng H2O ở 1000C trong 1h. Sau đó, dịch chiết được ly tâm 20200 vịng trong
10 phút. Phần dịch trong được lọc qua màng 0,45 μm và được tiêm vào hệ thống
HPLC với điều kiện phân tích: cột C18 (250mm x 4.0mm x 5μm) với pha động
gồm: Kênh A: H2O, kênh B = ACN/MeOH = 1:1, kênh C = HCl 0,1N, kênh D =
NH4H2PO4 0,1N (điều chỉnh pH 4,0 sử dụng H3PO4), tiến hành chạy theo chương
trình rửa giải gradient như sau:
Thời gian (phút) % Kênh A % Kênh B % Kênh C % Kênh D
0-15

60-30

0-30

20

20

15-20

30-60

30-0

20

20

21


Luận văn thạc sĩ

Lê Thị Thúy

Nhóm tác giả Lei Huang, Qizhang Li, Yiyuan Chen, Xuefei Wang and
Xuan Wei Zhou [25] xác định và phân tích cordycepin và adenosine trong sản phẩm
của lồi Cordyceps. Mẫu được đồng nhất, sau đó, cân chính xác 1 g vào ống ly tâm
50 ml, thêm 10 ml MeOH:H2O = 50:50 (v/v) để rung siêu âm ở công suất 75W, ly
tâm. Phần dịch chiết của 3 lần ly tâm được gộp lại và định mức tới thể tích xác định,
lọc qua màng 0,45 μm trước khi bơm vào hệ thống HPLC, sử dụng cột pha ngược
C18 (Waters Symmetry Shield RP 18- 150 nm x 4,6 mm x 5μm). Chuẩn
Cordycepin và adenosine được mua từ Sigma. Dung dịch chuẩn của hỗn hợp 2 chất
này được tiêm 5 lần với các thể tích khác nhau để xây dựng đường chuẩn. Điều kiện
chạy máy được cài đặt như sau: Pha động gồm H2O:MeOH = 92:8 theo chương
trình isocratic với tốc độ dịng 1 ml/phút. Bước sóng phát hiện được cài đặt ở 210 400 nm và nhiệt độ buồng cột 300C. Thể tích tiêm mẫu 10 μl. Đường chuẩn được
xây dựng ở nồng độ 2,5- 120 μg/ml, LOD = 0,25 μg/ml.
Cũng theo nhóm tác giả Lichen và cộng sự [27] đã tiến hành xác định nhanh
adenosine và cordycepin trong đông trùng hạ thảo. Mẫu được chiết với H2O, sau đó
dịch chiết được phân tích trên cột Eclipse XDB -CN. Pha động gồm MeOH:H2O
theo tỷ lệ 7:93 theo chương trình isocractic, sử dụng detector PDA tại bước sóng
260 nm. Phương pháp có độ tin cậy cao với độ thu hồi trong khoảng từ 93,8 102,9% với độ lệch chuẩn tương đối nhỏ hơn 3,62% (n=5). Giới hạn định lượng của
phương pháp tương ứng với adenosine và cordycepin là 0,21 và 0,083mg/lít.

Phương pháp đơn giản, nhanh, độ chính xác cao và giá thành thấp.
Tác giả Xiao Feng Xue, Jin Hui Zhou, Li Ming Wu, Liang Hu Fu, Jing Zhao
[37] tiến hành phân tích adenosine trong sữa ong chúa. Trong đó, adenosine được
chiết với EtOH:H2O = 80:20. Dịch chiết mẫu được phân tích trên hệ thống HPLC
sử dụng cột sắc ký C18 (Waters symmetry) và chương trình rửa giải gradient với
hỗn hợp 2 dung môi kênh A là acid phosphoric 0,4% và kênh B là MeOH. Xác định
tại bước sóng 257nm. Độ thu hồi trong khoảng 91,6- 98,3% với RSD% < 5,3 %.
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) tương ứng là 0,017 và
0,048μg/ml. Phương pháp được ứng dụng để phân tích hàm lượng adenosine trong
45 sản phẩm sữa ong chúa với hàm lượng adenosine trong khoảng từ 5,9 - 2057,4
mg/kg.

22