Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số độc tố nhóm pyrrolizidine alkaloids trong thực phẩm chức năng từ thảo dược

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời
một số độc tố nhóm Pyrrolizidine Alkaloids
trong thực phẩm chức năng từ thảo dược
NGUYỄN XUÂN TRƯỜNG
Ngành Công nghệ thực phẩm

Giảng viên hướng dẫn:

1. PGS.TS. Cung Thị Tố Quỳnh
2. TS. Trần Cao Sơn

Viện:

Công nghệ sinh học và Công nghệ Thực phẩm

HÀ NỘI, 2020


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời
một số độc tố nhóm Pyrrolizidine Alkaloids
trong thực phẩm chức năng từ thảo dược
NGUYỄN XUÂN TRƯỜNG
Ngành Công nghệ thực phẩm

Giảng viên hướng dẫn:

Viện:

1. PGS.TS. Cung Thị Tố Quỳnh

Chữ ký của GVHD

2. TS. Trần Cao Sơn

Chữ ký của GVHD

Công nghệ sinh học và Công nghệ Thực phẩm

HÀ NỘI, 2020


CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên tác giả luận văn : Nguyễn Xuân Trường
Đề tài luận văn: Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số độc
tố nhóm Pyrrolizidine alkaloids trong thực phẩm chức năng từ thảo dược
Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm
Mã số SV: CB170131

Tác giả, Người hướng dẫn khoa học và Hội đồng chấm luận văn xác nhận
tác giả đã sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên bản họp Hội đồng ngày 30/6/2020
với các nội dung sau:
- Bổ sung Danh mục chữ viết tắt;

- Bổ sung kết quả khảo sát thông số nguồn ESI(+) trong mục kết luận;
- Sửa lỗi chính tả

Giáo viên hướng dẫn

Hà Nội, ngày tháng năm 2020
Tác giả luận văn

Nguyễn Xuân Trường
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

Mẫu 1c


LỜI CẢM ƠN
Qua thời gian học tập và nghiên cứu thực hiện luận văn dưới sự chỉ dẫn của
PGS.TS. Cung Thị Tố Quỳnh và TS. Trần Cao Sơn, tôi xin chân thành cảm ơn
sâu sắc tới:
PGS.TS. Cung Thị Tố Quỳnh - bộ môn Quản lý chất lượng Viện Công nghệ
sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và TS. Trần
Cao Sơn – Phó Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc
gia đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn tôi thực hiện đề tài này.
Ban Lãnh đạo Cục An toàn thực phẩm và Ban Lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm
an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện thuận lợi nhất giúp đỡ tơi để
hồn thành nhiệm vụ nâng cao kiên thức trong quá trình đào tạo.
Các thầy, cô Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường
Đại học Bách Khoa Hà Nội đã giảng dạy và giúp đỡ tơi trong q trình học tập và
nghiên cứu tại Trường.
Tất cả anh chị em đồng nghiệp phòng Quản lý tiêu chuẩn và kiểm nghiệm,
Cục An tồn thực phầm đã động viên, chia sẽ với tơi về những khó khăn trong

cơng việc trong thời gian tơi tham gia học tập và nghiên cứu.
Các anh chị kỹ thuật viên tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm
Quốc gia đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong q trình thực hiện tại phịng thử nghiệm.
Và cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm cổ
động cho tơi trong q trình học tập và thực hiện luận văn.
Trân trọng cảm ơn!
Tác giả luận văn

Nguyễn Xuân Trường


MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................... iii
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................... v
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN ................................................................................. 2
1.1. Tổng quan về Pyrrolizidine alkaloids ............................................................ 2
1.1.1. Khái quát về Pyrrolizidine alkaloids ........................................................... 2
1.1.2. Nguồn thực vật chứa độc tố Pyrrolizidine alkaloids ................................... 5
1.1.3. Độc tính của PAs......................................................................................... 7
1.1.4. Quy định hiện hành đối với PAs ................................................................. 8
1.2. Phương pháp xác định độc tố PAs ................................................................. 8
1.2.1. Phương pháp chiết ....................................................................................... 8
1.2.2. Phương pháp làm sạch .............................................................................. 10
1.2.3. Phương pháp xác định ............................................................................... 11
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 14
2.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................... 14
2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ....................................................................... 14
2.2.1. Thiết bị, dụng cụ ....................................................................................... 14

2.2.2. Dung mơi, hóa chất ................................................................................... 15
2.2.4. Chuẩn bị dung dịch chuẩn ......................................................................... 15
2.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 16
2.3.1. Khảo sát các điều kiện xác định độc tố PAs bằng LC-MS/MS ................ 16
2.3.2. Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu ............................................................. 16
2.3.3. Thẩm định phương pháp ........................................................................... 17
2.3.4. Đánh giá hàm lượng độc tố PAs trên một số đối tượng TPBVSK có
nguồn gốc thảo dược trên thị trường ................................................................... 17
2.4. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................. 17
2.4.1. Phương pháp xử lý mẫu ............................................................................ 17
i


2.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) ........................ 18
2.4.3. Phương pháp thẩm định. ........................................................................... 18
2.4.4. Phương pháp lấy mẫu ................................................................................ 19
2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................... 20
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN....................................................... 21
3.1. Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số PAs trong
TPBVSK .............................................................................................................. 21
3.1.1. Khảo sát điều kiện LC-MS/MS ................................................................. 21
3.1.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu .................................................................. 26
3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng nền ............................................................................. 32
3.2. Thẩm định phương pháp .............................................................................. 33
3.2.1 Độ đặc hiệu................................................................................................. 33
3.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)........................ 34
3.2.3. Khoảng tuyến tính ..................................................................................... 36
3.2.4 Độ lặp lại và độ thu hồi .............................................................................. 38
3.2.5 Độ lặp lại khác ngày ................................................................................... 40
3.3. Ứng dụng phương pháp để phân tích một số sản phẩm TPBVSK có

nguồn gốc thảo dược trên thị trường ................................................................... 40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 44

ii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ACN

Acetonitrile

PAs

Pyrrolizidine alkaloids

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

SPE

Cột chiết pha rắn

LOD

Giới hạn phát hiện

LOQ

Giới hạn định lượng

TPBVSK

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe

iii


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Các loài thực vật chứa PAs gây độc trên người và động vật ................ 5
Bảng 1.2. Một số nghiên cứu sử dụng cột SPE SCX .......................................... 11
Bảng 1.3. Một số nghiên cứu xác định PAs bằng LC-MS/MS ........................... 13
Bảng 2.1.Các độc tố PAs được sử dụng trong nghiên cứu ................................. 14
Bảng 2.2. Pha dung dịch chuẩn trung gian.......................................................... 16
Bảng 2.3. Pha dung dịch chuẩn làm việc của PAs .............................................. 16
Bảng 3.1. Các điều kiện MS/MS phân tích PAs ................................................. 21
Bảng 3.2. Các thơng số tối ưu của MS để phân tích các PAs ............................. 22
Bảng 3.3. Điều kiện gradient............................................................................... 24
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nền mẫu ..................................................................... 32
Bảng 3.5. Tỷ lệ ion của các PAs ......................................................................... 33
Bảng 3.6. Độ lặp lại và độ thu hồi của Echimidine ............................................ 38
Bảng 3.7. Độ lặp lại và độ thu hồi của Intermidine ............................................ 39
Bảng 3.8. Độ lặp lại và độ thu hồi của Jacobine ................................................. 39
Bảng 3.9. Độ lặp lại và độ thu hồi của Senecionine ........................................... 39
Bảng 3.10. Độ lặp lại khác ngày ......................................................................... 40
Bảng 3.11. Kết quả phân tích mẫu thực tế .......................................................... 41

iv


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc của PAs và các dạng khác nhau của nó .................................. 2
Hình 1.2. Các nhóm PAs phân loại theo base necine ........................................... 3
Hình 1.3. Cấu trúc của một số acid necic điển hình ............................................. 3
Hình 1.4. Một số PAs phổ biến ............................................................................. 4
Hình 3.1. Sắc đồ Ichimidine và Jacobine sử dụng cột C18 và cột TSK Gel ...... 23
Hình 3.2. Sắc đồ tổng các PAs ............................................................................ 24
Hình 3.3. Sắc đồ MRM của từng PAs................................................................. 25
Hình 3.4. Biểu đồ kết quả khảo sát dung mơi chiết ............................................ 27
Hình 3.5. Biểu đồ kết quả khảo sát nhiệt độ ....................................................... 28
Hình 3.6. Biểu đồ kết quả khảo sát nồng độ acid ............................................... 29
Hình 3.7. Biểu đồ kết quả khảo sát cột SPE ....................................................... 30
Hình 3.10. Đường chuẩn trên nền dung mơi và nền mẫu thực ........................... 32
Hình 3.11. Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn PAs .......... 34
Hình 3.12. Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn tại mức nồng độ 0,3 µg/kg ............... 35
Hình 3.13. Đường chuẩn phân tích Echimidine.................................................. 36
Hình 3.14. Đường chuẩn phân tích Intermedine ................................................. 37
Hình 3.15. Đường chuẩn phân tích Jacobine ...................................................... 37
Hình 3.16. Đường chuẩn phân tích Senecionine................................................. 38

v



MỞ ĐẦU
Hiện nay, xu hướng trong việc sử dụng các sản phẩm thực phẩm bảo

vệ sức khỏe (TPBVSK) từ nguồn gốc thảo dược, chủ yếu xuất phát từ các
bài thuốc y học cổ truyền đang ngày càng phổ biến. Phần lớn các sản phẩm
TPBVSK này đều chưa được kiểm chứng về một số độc tính tiềm ẩn. Hơn
nữa, phần lớn các thảo dược được sử dụng trong các sản phẩm này không
được truy xuất rõ ràng về nguồn gốc xuất xứ. Nhiều loại thảo dược có chứa
các độc tố tự nhiên có thể gây hại đến sức khỏe người sử dụng.
Một trong số các độc tố tự nhiên đang ngày càng thu hút sự quan tâm
của các nhà khoa học trên giới đó là các alkaloid nhân pyrrolizidine
(Pyrrolizidine alkaloids - PAs). PAs là một nhóm các hợp chất có độc tính,
được sinh ra bởi một số lồi thực vật do đó được xếp vào nhóm độc tố thực
vật (phytotoxin). Con người có thể bị ngộ độc khi sử dụng các lồi thực vật
có chứa độc tố PAs như trà thảo dược hoặc các loại thuốc truyền thống, tiêu
thụ ngũ cốc hoặc các sản phẩm ngũ cốc bị nhiễm độc tố.
Ngày nay, hơn 6.000 loài thực vật (chiếm khoảng 3% thực vật trên
tồn thế giới) được biết có khả sinh tổng hợp PAs, chủ yếu các loài thực vật
thuộc họ Mồ hơi (Boraginaceae), họ Cúc (Asteraceae) và họ Đậu
(Fabaceae). Trong đó, khoảng 600 loại PAs đã được xác định và mô tả có
khả năng gây nhiễm độc cấp tính và mãn tính trên gan, độc tính trên gen và
nhiễm sắc thể, đơi khi có liên quan đến sự hình thanh một số khối u phát
triển trên da, bàng quang, não, tủy sống, tụy và đường tiêu hóa.
Giới hạn tối đa cho phép của các PAs trong thực phẩm đã được thiết
lập ở một số nước trên thế giới. Tuy nhiên tại Việt Nam mới chỉ ban hành
TCVN 12053:2017 về quy phạm thực hành kiểm soát cỏ dại để ngăn ngừa
và giảm thiểu nhiễm pyrrolizidine alkaloid trong thực phẩm và thức ăn
chăn ni. Hiện nay, chưa có phương pháp chính thức để kiểm nghiệm độc
tố PAs trong thực phẩm thực phẩm nói chung và các thảo dược nói riêng.
Do đó, đề tài “Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số
Pyrrolizidine alkaloids trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc
thảo dược” đã được thực hiện với các mục tiêu như sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định đồng thời một số

độc tố PAs trong thảo dược bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ.
2. Ứng dụng phương pháp để sơ bộ đánh giá mức nhiễm độc tố PAs
trong một số loại TPBVSK có nguồn gốc thảo dược trên thị
trường.
1


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Pyrrolizidine alkaloids
1.1.1. Khái quát về Pyrrolizidine alkaloids
Pyrrolizidine alkaloids (PAs) là nhóm hợp chất chuyển hóa thứ cấp
có mặt trong khoảng 3% thực vật trên toàn thế giới, chủ yếu từ các họ thực
vật thuộc họ Mồ hơi (Boraginaceae), ví dụ Heliotropium spp., họ Cúc
(Asteraceae), ví dụ Senecio spp. và họ Đậu (Fabaceae), ví dụ Crotalaria
spp.
Về mặt cấu tạo hóa học, PAs là một nhóm các alkaloid có nguồn gốc
từ ornithine được phân bố trong 1 số lồi thực vật có hoa. Chúng hiếm khi
ở dạng tự do như một base pyrrolizidine, thay vào đó được tìm thấy ở dạng
ester (monoester, diester hoặc macrocyclic diesters) hoặc pyrrolizidine
alkaloids N–oxides (PANOs) [18].

Hình 1.1. Cấu trúc của PAs và các dạng khác nhau của nó
Nhân pyrrolizidine, bao gồm hai vòng năm cạnh bão hòa với một
nguyên tử nitơ giữa chúng, đơi khi có một liên kết đơi ở vị trí 1,2, thường
dẫn đến độc tính tăng cường. Chúng cũng có thể có một nhóm alcohol tại
C-1, một nhóm alcol ở vị trí C-7 (di-hydroxylated) và trong 1 số ít trường
hợp nhóm alcohol thứ ba xuất hiện ở vị trí C-2 hoặc C-6 (tri-hydroxylated)
[18].
Theo cấu trúc của base necine, PAs có thể được phân loại thành bốn
nhóm: Retronecine, Heliotridine, Otonecine và Platynecine (Hình 1.2)

trong đó, duy chỉ có platynecine được bão hịa ở vị trí C-1,2. Ngồi ra, từ
2


đặc điểm cấu trúc, có thể thấy otonecine là khác biệt nhất trong tất cả các
loại, vì nó bị oxy hóa ở C-8 và có một vịng đơn. Retronecine và
Heliotridine là các đồng phân quang học không đối quang, với định hướng
khác biệt ở vị trí C-7 [18].

Hình 1.2. Các nhóm PAs phân loại theo base necine
Các base necine có thể được ester hóa bởi các acid béo đơn giản
(như acid angelic, acid tiglic), các monocarboxylic ở C-7 (acid trachelantic
và viridifloric) hoặc acid dicarboxylic ở C-10 (acid senecic và acid
isatinecic) (Hình 1.3).

Hình 1.3. Cấu trúc của một số acid necic điển hình
Sự kết hợp của các cấu trúc nêu trên dẫn đến các dạng mono-ester
hoặc di-ester. Trong các acid monocarboxylic, đặc trưng của họ
3


Boraginaceae, một số có nhóm hydroxyl ở C-9 được ester hóa bằng acid
hydroxyisopropylbutanoic, chẳng hạn như intermedine (Hình 1.4A). Trong
trường hợp có một acid necic thứ hai, nó thường xảy ra trong nhóm
hydroxyl của C-7, dưới dạng acid angelic hoặc acid tiglic, như trong
echimidin (Hình 1.4C). Các thụ thể macrocyclic, đặc trưng từ họ
Asteraceae, cũng đã được mô tả, tương ứng với C-7 và C-9 được ester hóa
bằng acid dicarboxylic, chẳng hạn như jacobine (Hình 1.4B) hay
seneconine (Hình 1.4D) [18]. Đây là các PAs được quan tâm nhất hiện nay.

A. Echimidine

B. Jacobine

C. Intermedine
D. Senecionine
Hình 1.4. Một số PAs phổ biến
Cấu trúc của một PA bất kì có thể dẫn đến độc tính là [31]:
- Sự có mặt của liên kết đơi ở vị trí C1-2 trong base necine;
- Sự có mặt của một hoặc hai nhóm hydroxyl ở vị trí C-7 và C-9
trong base necine;
- Ester hóa của ít nhất một trong các nhóm hydroxyl trong base
necine;

4


- Ester hóa của nhóm hydroxyl với acid monocarboxylic hoặc acid
dicarboxylic.
1.1.2. Nguồn thực vật chứa độc tố Pyrrolizidine alkaloids
Mặc dù hơn 6000 lồi thực vật được báo cáo có chứa PAs, nhưng
gây trực tiếp ngộ độc ở người và động vật thường chỉ liên quan đến một số
loài nhất định. Cụ thể, các loài thực vật được báo cáo là có liên quan đến
ngộ độc ở người thường gặp ở 3 họ thực vật gồm họ Cúc, họ Mồ hôi và họ
Đậu, được nêu chi tiết trong bảng 1.1 [2].
Bảng 1.1. Các loài thực vật chứa PAs gây độc trên người và động vật
Họ
Asteraceae

Loài

Eupatorium cannabinum L.; Adenostyles alliariae (Gouan)Kern; Emilia
sonchifolia(L.) DC.;
Petasites hybridus (L.) PH Gaertn., B. Mey & Scherb.;
Petasites spurius (Retz) RCHB; S. jacobaea; Senecio vulgaris L.; T.
farfara; Senecio nemorensisL.; Ageratum conyzoides L.; Chromolaena
odorata (L.) R. M. King & H.Rob.; Eupatorium chinense L.; Eupatorium
fortunei Turcz.; Eupatorium japonicum Thunberg ex Murray.; Cacalia
hastata L.; Cacalia hupehensis Hand-Mazz.; Crassocephalum
crepidioides (Benth.) S. Moore; Farfugium japonicum (L.)
Kitam.; Gynura bicolor (Roxb. ex Willd.) DC.; Gynura divaricata (L.)
DC.; Gynura segetum; Ligularia dentata (A.Gray) Hara; Petasites
japonicus (Siebold & Zucc.) Maxim.; Senecio argunensis Turcz.; Senecio
integrifolius (L.) Clairv.; Senecio scandensBuch.-Ham. Ex D.
Don; Syneilesis aconitifolia (Bunge) Maxim.; Matricaria
chamomilla L.; Gynura pseudochina (L.) DC.; Gynura japonica (Thunb.)
Juel; Packera candidissima (Greene) W. A. Weber; Solanecio
mannii(Hook.f.) C. Jeffrey; Solanecio tuberosus(Sch. Bip. ex A. Rich.)
C. Jeffrey var. tuberosus; Bidens pilosa L.; Senecio longilobus Benth.

Boraginaceae Alkanna tinctoria (L.) Tausch; Anchusa officinalis L.; Borago
officinalis L.; Cynoglossum officinale L.; Heliotropium
arborescens L.; Lithospermum officinale L.; Myosotis
scorpioidesL.; Symphytum asperum Lepech; Symphytum
caucasicum Bieb.; Symphytum officinale L.; Symphytum
tuberosum L.; Symphytum × uplandicum Nyman; Arnebia
euchroma (Royle) I. M. Johnst.; Cordia myxa L.; Cynoglossum
amabile Stapf & J. R. Drumm; Cynoglossum
lanceolatum Forssk.; Cynoglossum zeylanicum (Vahl)
Brand; Cynoglossum grande Dougl. ex Lehm.; Cynoglossum
virginianum L.; Arnebia benthamii (Wall. ex G.Don.)

Johnst.; Heliotropium indicum; Lappula intermedia (Ledeb.)
5


Popov; Lithospermum erythrorhizon Siebold & Zucc.
Fabaceae

Crotalaria albida Roth; Crotalaria assamica Benth.; Crotalaria
pallida Aiton; Crotalaria sessiliflora L.; Crotalaria tetragona Andrews

Trong số này, một số loài thực vật sinh sống phổ biến ở Việt Nam
gồm:
- Senecico jacobaea: Cỏ lưỡi chó (Cúc dại), họ Cúc Asteraceae.
- Senecio vulgaris: Cúc bạc, họ Cúc Asteraceae.
- Tussilago farfara: Khoản đông hoa, họ Cúc Asteraceae.
- Crotalaria sessiliflora: Lục lạc lá ổi tròn/ Muồng lá ổi, họ Đậu Fabaceae.
- Crotalaria pallida: Lục lạc 3 lá tròn/ Muồng lá tròn, họ Đậu Fabaceae.
- Crotalaria tetragona : Lục lạc 4 cạnh, họ Đậu Fabaceae.
- Crotalaria albida : Lục lạc sợi/ Muồng sợi, họ Đậu Fabaceae.
- Crotalaria assamica : Lục lạc lá ổi dài/ Muồng 1 lá, họ Đậu Fabaceae.
- Borago officinalis: Lưu ly, họ Mồ hơi Boraginacea.
- Heliotropium indicum: Vịi voi, họ Mồ hôi Boraginacea.
- Symphytum officinalis: Liên mộc/ Hoa chuông, họ Mồ hôi Boraginacea.
- Lithospermum erythrorhizon: Tử thảo, họ Mồ hôi Boraginacea.
Hàm lượng PAs trong thực vật thường thay đổi từ 100 mg/kg đến
40.000 mg/kg (tính theo chất khơ). Hàm lượng PAs cao nhất được ghi nhận
là 180.000 mg/kg ở loài Senecio riddelli [14]. Cả thành phần và nồng độ
của PAs có thể dao động theo điều kiện khí hậu và môi trường, độ tuổi và
sự đa dạng của cây. Hơn nữa, các bộ phận khác nhau của thực vật có hàm
lượng PAs khác nhau, một số trong đó có thể có mặt chủ yếu ở dạng Noxide. Ví dụ, trong loài Senecio vulgaris và Senecio jacaobaea, các bộ

phận được xếp hạng theo nồng độ giảm dần của PAs là: hoa và hạt > lá >
thân cây > rễ. Các nhà nghiên cứu khác báo cáo rằng rễ của Symphytum
officinale tập trung nhiều PAs hơn (từ 1.400 đến 8.300 mg /kg) so với lá (từ
15 đến 55 mg/kg) [26].

6


1.1.3. Độc tính của PAs
1.1.3.1. Nhiễm độc gan
Gan là cơ quan chính bị ảnh hưởng bởi các độc tố PAs, chủ yếu là do
hoạt động sinh học xảy ra trong cơ quan này. Dấu hiệu ngộ độc có thể bao
gồm nôn mửa, tổn thương gan và tiêu chảy kèm chảy máu [8].
Ngộ độc PAs trên gan có thể xảy ra cấp tính hoặc mãn tính, với các
triệu chứng khác nhau. Nhiễm độc cấp tính có thể gây ra hoại tử xuất
huyết, gan to và cổ trướng; tắc nghẽn tĩnh mạch gan, dẫn đến tổn thương
gan và rối loạn chức năng tế bào nhu mơ. Nhiễm độc mãn tính có thể gây ra
hoại tử tế bào gan, xơ gan và sự gia tăng của biểu mô ống mật; suy gan và
tử vong là mức độ độc tính cao nhất [28].
1.1.3.2. Độc tính gen và ung thư
Một số nghiên cứu đã chứng minh PAs có khả năng gây độc tính gen
trên động vật thí nghiệm, có thể dẫn đến sự hình thành và phát triển các
khối u. Năm 1954, Schoental và cộng sự phát hiện ra rằng retrorsine có khả
năng gây ra các khối u trong các nghiên cứu thực nghiệm trên động vật [9].
Các khối u phát triển ở gan, phổi, bàng quang, da, não, tủy sống, tụy và
đường tiêu hóa. Các PAs gây ra tác dụng này thuộc nhóm heliotridine,
retronecine và otonecine.
Hơn nữa, các PAs có liên quan đến ung thư da, vì chúng có thể dẫn
đến tăng nhạy cảm ánh sáng ở động vật. Phylloerythrin, một porphyrin có
nguồn gốc từ sự phá hủy chất diệp lục do vi sinh vật có trong đường tiêu

hóa, đi qua tuần hồn và được bài tiết qua gan vào mật. Tuy nhiên, gan bị
hư hại do PAs không thể loại bỏ phylloerythrin, dẫn đến sự tích tụ của nó
trong máu và da. Phylloerythrin tiếp xúc với ánh sáng mặt trời, các chất
chuyển hóa của nó có thể gây ra oxy hóa và peroxid hóa pilid trong các mơ
da và cuối cùng kích hoạt sự hình thành các khối u [14].
Hiện nay, chưa có bất kỳ báo cáo nào về trường hợp ung thư ở người
do hậu quả trực tiếp của việc tiêu thụ thực phẩm nhiễm PAs. Tuy nhiên, với
các nghiên cứu trên các loài gặm nhấm, như việc gây ra các khối u gan
thơng qua sự tác động trên DNA, chương trình độc học quốc gia ở Hoa Kỳ
đã tuyên bố một số PAs được “dự đoán là chất gây ung thư trên người”
[30].

7


1.1.3.3. Các loại độc tính khác
Các PAs có thể gây các tổn thương khác trên hệ tuần hoàn (như suy
tim sung huyết), hệ thần kinh (như chóng mặt, đau đầu, có thể dẫn đến mê
sảng và mất ý thức). Ngồi ra, PAs có thể vượt qua nhau thai và gây độc
cho gan ở trẻ sơ sinh của một người phụ nữ tiêu thụ trà thảo dược được chế
biến từ loài Tussilago farfara L. [8],[31].
1.1.4. Quy định hiện hành đối với PAs
Với sự tiêu thụ ngày càng tăng của các loại thuốc thảo dược, ngộ độc
PAs đã bắt đầu được coi là một vấn đề sức khỏe nghiêm trọng. Do đó, một
số nước đã thiết lập các quy định về kiểm soát hàm lượng PAs trong thực
phẩm. Tại Hoa Kỳ, FDA đã ra lệnh cấm tất cả các chế phẩm từ cây liên
mộc (Symphytum officinale L. Boraginaceae) [30].
Tại Liên minh châu Âu, Cơ quan an toàn thực phẩm châu Âu (EFSA)
đã khuyến nghị sử dụng tối đa 0,35 µg PAs /ngày đối với người có trọng
lượng 50 kg [15]. Áo đã loại trừ tất cả các sản phẩm có PAs từ thị trường

và ở Hà Lan, tất cả thực phẩm, chế phẩm thảo dược và chiết xuất thực vật
chứa PAs được giới hạn ở 1 µg/L trong sản phẩm [32].
Tại Việt Nam, mới chỉ ban hành Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN
12053:2017 (CAC/RCP 74-2014) của Bộ Khoa học và Công nghệ về quy
phạm thực hành kiểm soát cỏ dại để ngăn ngừa và giảm thiểu nhiễm
pyrrolizidine alkaloid trong thực phẩm và thức ăn chăn ni, chưa có quy
định cụ thể nào giới hạn nồng độ pyrrolizidine trong thực phẩm [1].
1.2. Phương pháp xác định độc tố PAs
Hiện nay, có nhiều phương pháp có thể được sử dụng để xác định
PAs trong thảo dược như các phương pháp sàng lọc (ELISA, sắc ký lớp
mỏng) hay các phương pháp phân tính khẳng định như sắc ký khí; phương
pháp sắc ký lỏng với detector UV, DAD, FLD và MS. Bất kể phương pháp
nào được lựa chọn, việc phân tích độc tố PAs trong mẫu thường gồm 3 giai
đoạn: chiết, làm sạch và xác định độc tố (định tính, định lượng) [12].
1.2.1. Phương pháp chiết
Mục đích của việc chiết là thu được càng nhiều các PAs từ nền mẫu
càng tốt vào dung môi phù hợp cho kỹ thuật làm sạch và xác định sau đó.
Việc chiết dung môi là sự chuyển các chất từ pha rắn vào pha lỏng do đó
cịn được gọi là chiết rắn lỏng.
8


PAs là các hợp chất hữu cơ có bản chất tương đối phân cực. Do đó
chúng hịa tan khá tốt trong dung môi hữu cơ phân cực như methanol,
acetonitrile. Cả dạng base tự do và N-oxid đều hòa tan dễ dàng trong
methanol và cả trong acid loãng. Đây là những dung môi được sử dụng
nhiều nhất.
1.2.1.1. Chiết bằng dung môi hữu cơ
Nguyên liệu thực vật thường được ngâm trong methanol, đun sôi
hoặc trộn đồng nhất bằng cách sử dụng máy siêu âm [12]. MeOH có thể

được acid hóa (ví dụ với acid tartaric), nhưng những ưu điểm của điều này
chưa được kiểm chứng [24]. Đôi khi, MeOH được kết hợp với CHCl3 để
chiết xuất các base PAs tự do từ nguyên liệu thực vật, nhưng hiện nay việc
sử dụng dung mơi clor hóa gây ra những lo ngại về ơ nhiễm môi trường
cũng như khả năng xảy ra phản ứng của hydrochloric dư với các nhóm PAs
epoxide [10],[17].
Lebanda và cộng sự [22] so sánh một số dung môi hữu cơ để chiết
xuất senkirkine và senecionine từ loài Tussilago spp. Hiệu suất cao nhất thu
được khi chiết nóng với tỉ lệ hệ dung môi methanol và dung dịch acid citric
ở pH = 2 (50:50). Quá trình chiết xuất trong 15 phút. Sau đó cần khuấy ở
nhiệt độ phịng trong nước ở pH 7 và chiết Soxhlet với methanol trong 48h.
Tuy nhiên q trình chiết Soxhlet có thể làm mất PAs đồng thời tăng thời
gian q trình chiết.
Bên cạnh đó việc chiết xuất bằng MeOH nóng (100°C) trong một
thời gian ngắn (2 h) cũng cho hiệu suất tốt. Hiệu suất cao nhất của các
alkaloid thu được khi chiết bằng methanol nóng chứa 1% acid tartaric,
nhưng cần loại bỏ acid trước khi phân tích bằng HPLC [24].
1.2.1.2. Chiết bằng acid lỗng
Nghiên cứu của Crew và cộng sự (2010) [12] chỉ ra rằng các nguyên
liệu thực vật được chiết bằng H2SO4 hoặc HCl loãng đều cho hiệu suất cao.
Hösch và cộng sự đã thực hiện thí nghiệm so sánh các quy trình chiết
khác nhau của lồi Senecio leucophyllus sấy khơ trong khơng khí. Phương
pháp 1: 4 g mẫu thử với 3 x 80 mL HCl 2.5%; phương pháp 2: 2,5 g mẫu
thử với 1 x 150 mL MeOH, chiết lặp với 3 x 100 mL MeOH; phương
pháp3: 2,5 g mẫu thử với 400 mL MeOH trong 10 phút sau đó ủ trong 6, 16
hoặc 21 giờ; phương pháp 4: chiết Sohlex với 2,5 g thực vật bằng MeOH
trong 6, 16 hoặc 21 giờ. Kết quả cho thấy khi chiết với HCl 2,5% cho độ
thu hồi cao hơn. Khi chiết với acid, hiệu suất tốt nhất thu được khi được
chiết với sự có mặt của nhiệt độ. Đồng thời, chiết Sohlex có xu hướng làm
9

giảm tỉ lệ thu hồi các PANOs và hiệu suất khơng có sự khác biệt khi chiết
với các thời gian khác nhau [19].
Schuzl và cộng sự đã sử dụng H2SO4 0,05M để phân tích PAs trong
169 mẫu trà dược liệu các loại. Mẫu được thêm 2 x 10 mL dung mơi chiết,
sau đó lắc trong 20 phút, siêu âm 15 phút, ly tâm 6000 vòng trong 5 phút.
Gộp dịch, điều chỉnh pH 6-7, sau đó làm sạch bằng chiết pha rắn SPE với
cột C18. Mẫu đưuọc làm giàu bằng thổi khơ N2. Hịa cặn bằng 1 ml MeOH
- H20 (5:95) sau đó phân tích trên LC-MS/MS [29].
Joosten và cộng sự đã so sánh 2 dung môi chiết là acid HCOOH 2%
và H2SO4 0,25M để phân tích PAs và PANO trong mẫu thực vật, sử dụng
phương pháp LC-MS/MS để phân tích. Kết quả cho thấy khơng có sự khác
biệt khi sử dụng hai loại dung môi chiết này [20].
Mathon và cộng sự cũng sử dụng phương pháp LC-MS/MS kết hợp
với dung mơi chiết là H2SO4 0,05M để phân tích 9 PAs trong mẫu thực vật.
Phương pháp có giới hạn định lượng 1 ng/mL; khoảng tuyến tính từ 1 –
100 ng/mL; độ thu hồi nằm trong khoảng từ 91 – 114 % [23].
Griffin và cộng sự sử dụng dung môi chiết H2SO4 0,05M để phân
tích 10 PAs và 4 PANOs trong mẫu trà. Mẫu sau khi cân được chiết với
dung môi trong thời gian 30 phút ở 40oC, làm sạch và làm giàu bằng cột
chiết pha rắn SCX và thổi khô N2. Giới hạn phát hiện của phương pháp đối
với các PAs là 0,4 µg/kg, giới hạn định lượng 1,3 µg/kg [16].
1.2.2. Phương pháp làm sạch
Bước làm sạch thường áp dụng cho các kỹ thuật phân tích khẳng
định nhằm loại trừ các ảnh hưởng của nền mẫu. Hơn nữa, làm sạch thường
kèm theo q trình làm giầu mẫu do đó giảm được giới hạn phát hiện của
phương pháp. Kỹ thuật làm sạch mẫu thường được sử dụng nhất sau khi
chiết PAs từ nguyên liệu thực vật là chiết pha rắn.
Chiết pha rắn (SPE) là kỹ thuật phổ biến được áp dụng để làm sạch

mẫu. Dịch chiết mẫu được đưa qua cột SPE đã được hoạt hóa, chất phân
tích được giữ lại trên cột, các tạp chất được rửa qua cột, sau đó sử dụng
dung mơi có ái lực mạnh hơn với chất phân tích để rửa giải các chất này ra
khỏi cột. Dịch rửa giải có thể được cơ đến cạn sau đó hịa lại trong một
dung mơi thích hợp nhằm làm giầu mẫu. Do các PAs có tính phân cực và
độ tan khác nhau, nên khó lựa chọn được một loại cột đặc hiệu cho tất cả
các PAs.
10


Cột SPE loại đa cực (Ví dụ: HLB) (vừa có nhóm thân nước và thân
dầu) được một số nghiên cứu sử dụng để làm sạch khi phân tích PAs. Dịch
chiết nước của các PAs (khơng hịa tan trong dung mơi hữu cơ) có thể được
cho qua cột sau đó các PAs được rửa giải bằng dung mơi hữu cơ có bổ
sung thêm amoniac. Khi áp dụng cho nền mẫu mật ong, phương pháp cho
kết quả tốt, tuy nhiên kết quả không lặp lại đối với một số PA dạng diester
và đã được thay thế bằng các phương pháp trao đổi cation [12],[16].
Cột C8 hoặc C18 là cột chứa các pha tĩnh không phân cực như
octylsilane hoặc octadecylsilane (C8 hoặc C18). Hosch và cộng sự đã
chứng minh rằng pha tĩnh C18 có độ thu hồi tốt hơn so với pha tĩnh C8
[19]. Mroczek và cộng sự chỉ ra rằng việc sử dụng chất hấp thụ C18 có thể
rửa giải các tạp chất do tính đặc hiệu thấp [24].
Cột SPE trao đổi cation (SCX) là phương pháp phổ biến nhất sử
dụng polymer mạnh để cô lập cả các base tự do và N-oxid. Bằng việc sử
dụng cột này, các PA tự do và N-oxid của chúng có thể được phân lập đồng
thời với năng suất cao, khả năng làm sạch và tập trung mẫu [7]. Một số
nghiên cứu cụ thể sử dụng cột SCX được tổng hợp trong bảng 1.2.
Bảng 1.2. Một số nghiên cứu sử dụng cột SPE SCX
Tác giả

Nền mẫu

Dung mơi
chiết

LOQ

Griffin [16]

Trà

H2SO4 0,05M

1,3 µg/kg

Betteridge [4]

Mật ong

H2SO4 0,05M

-

Zhou [33]

Thực vật

HCl 0,05 M

3,9 µg/kg

Dubecke [13]

Mật ong; Phấn ong

H2SO4 0,05M

1 µg/kg

Kempf [21]

Mật ong

H2SO4 0,05M

10 µg/kg

1.2.3. Phương pháp xác định
Một số phương pháp có thể được sử dụng để định tính và định lượng
PAs trong nguyên liệu thực vật hoặc các chế phẩm của nó bao gồm ELISA,
GC hoặc LC-MS.

11


1.2.3.1. ELISA
Thơng qua albumine huyết thanh bị, kháng ngun liên kết enzyme
(AG-E) có thể được tổng hợp và sử dụng để sản xuất của kháng thể (đa
dòng cũng như đơn dịng) ở chuột. Phương pháp này rất nhạy và khơng cần
phải làm sạch phức tạp. Nhược điểm của phương pháp này là chỉ áp dụng

được cho một chất hoặc một nhóm PAs có cấu trúc tương đồng [5],[27].
1.2.3.2. Sắc ký khí
Sắc khí khí với detector khối phổ hoặc NPD đã được một số tác giả
nghiên cứu để phân tích các PAs. Tuy nhiên, một vấn đề của kỹ thuật này
là các PAs N-oxid phải được khử thành các base tự do và dẫn xuất trước
khi được phân tích [12].
Michael Kempf và cộng sự sử dụng phương pháp GC-MS để phân
tích PAs trong mẫu mật ong. Mẫu được chiết với H2SO4 0,05M, làm sạch
qua cột SPE SCX, rửa giải bằng NH4OH 6%/MeOH, làm giàu bằng thổi
khơ N2, sau đó dẫn xuất bằng 100 µL LiAlH4 1M/THF trong 3h ở nhiệt độ
4oC. 500 µL CH2Cl2 và 5 giọt NaOH 10% được thêm vào để dừng phản
ứng. Mẫu tiếp tục được thổi khô và hịa cặn lại bằng 50 µL MSTFA và
phân tích trên GC-MS. Phương pháp có giới hạn định lượng 10 µg/kg, độ
thu hồi 83 ± 3% đối với các PAs [21].
Joosten và cộng sự sử dụng GC-NPD để phân tích PAs trong mẫu
thực vật. Mẫu được chiết với 15 mL H2SO4 0,1M trong 1h, sau đó lọc lấy
phần dịch và kiềm hóa với 5 mL NH4OH và làm sạch qua cột Extrelut. Các
PAs được rửa giải bằng 120 mL CH2Cl2, sau đó thổi khơ và hịa cặn, phân
tích trên sắc ký khí. Phương pháp có giới hạn định lượng 0,03 mg/g [20].
1.2.3.3. Sắc ký lỏng khối phổ
Sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) đã được sử dụng rất phổ
biến do khả năng xác định đồng thời các PAs trong cùng một quy trình
chiết, làm sạch và định lượng. LC-MS/MS có nhiều ưu điểm vượt trội như
độ nhạy tốt, độ đặc hiệu cao, thời gian phân tích nhanh, xử lý mẫu khơng
q phức tạp như sắc ký khí đã được nhiều tác giả nghiên cứu để xác định
PAs trong các nền mẫu. Bảng 1.3 giới thiệu một số nghiên cứu xác định
PAs bằng LC-MS/MS.

12

Bảng 1.3. Một số nghiên cứu xác định PAs bằng LC-MS/MS
Kỹ thuật
LCMS/MS

LOQ

Tác giả

Nền mẫu

Số lượng
PAs

Bodi [6]

Trà, thảo dược,
thuốc, mật ong

17

ESI (+)

0,18-6,4
µg/kg

Dubecke
[13]

Mật ong, phấn

hoa

14

ESI (+)

1,0-3,0
µg/kg

Joosten [20]

Thực vật

25

ESI (+)

1,0-2,0
µg/kg

Zhou [33]

Thực vật

7

ESI (+)

3,9 µg/kg

Mudge [25]

Thực vật, mật
ong

5

ESI (+)

1,2-1,8
µg/kg

Griffin [16]

Mật ong

14

ESI (+)

1,3-6,3
µg/kg

Crews [11]

Mật ong

5

APCI (+)

6,0 µg/kg

Beales [3]

Mật ong

15

APCI (+)

-

Có thể thấy rằng, phần lớn các nghiên cứu sử dụng nguồn ion hóa
phun điện tử (ESI) ở chế độ ion dương để xác định đồng thời nhiều PAs
trong cùng một lần phân tích. Nguồn ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển
(APCI) cũng được sử dụng nhưng có giới hạn định lượng cao hơn, hơn nữa
APCI ít thơng dụng hơn.
Trong nghiên cứu này, sắc ký lỏng khối phổ hai lần với nguồn ESI
đã được sử dụng để khảo sát các điều kiện xác định các PAs trong các mẫu
thực phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc thảo dược hướng đến đạt được độ
nhạy đáp ứng yêu cầu của châu Âu (1 µg/kg).

13


CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng trong nghiên cứu này là 4 loại độc tố PAs được trình bày

trong bảng 2.1.
Bảng 2.1.Các độc tố PAs được sử dụng trong nghiên cứu
TT

Độc tố PAs

Ký hiệu

Công thức
phân tử

Khối lượng
phân tử

1

Senecionine

Sn

C18H25NO5

335

2

Echimidine

Em

C20H31NO8

413

3

Intermedine

Im

C15H25NO5

299

4

Jacobine

Jb

C18H25NO6

351

Đối tượng mẫu được lựa chọn để xác nhận giá trị sử dụng của
phương pháp và để ứng dụng phương pháp bao gồm một số nền mẫu thực
phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc thảo dược trên thị trường: chè túi lọc,
dạng siro uống, dạng viên.
2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
2.2.1. Thiết bị, dụng cụ

2.2.1.1. Thiết bị
-

Máy sắc ký lỏng khối phổ gồm sắc ký lỏng HPLC LC20AD-XR của
Shimadzu và khối phổ ABSciex Triple Quad 5500.

-

Máy đồng nhất mẫu, Phillips.

-

Hệ thống chiết pha rắn SPE, Waters.

-

Cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg), Metter Toledo.

-

Máy lắc xoáy, IKA.

-

Máy ly tâm Mikro 200R, Hettich.

-

Máy rung siêu âm.
14

2.2.1.2. Dụng cụ
-

Cột chiết pha rắn SPE SCX, Supelco.

-

Micropipet có thể tích điều chỉnh được 20-200 µL, 100-1000 µL và
1000-5000 µL.

-

Bình định mức: 10, 50 mL.

-

Ống ly tâm 50 mL.

-

Vial loại 1,8 mL.

-

Màng lọc mẫu 0,22 µm.

2.2.2. Dung mơi, hóa chất
Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích.

- Methanol (Merck)
- Acetonitrile (Merck)
- Acid formic (Merck)
- Acid sulfuric 98% (Merck)
- Amoni hydroxide (Merck)
- Nước cất hai lần.
2.2.3. Chất chuẩn
-

Chuẩn Jb 5 mg, PhytoLab, độ tinh khiết 99,5%.

-

Chuẩn Em 10 mg, PhytoLab, độ tinh khiết 99,5%.

-

Chuẩn Im 10 mg, PhytoLab, độ tinh khiết 99,5%.

-

Chuẩn Sn 10 mg, PhytoLab, độ tinh khiết 99,5%.

2.2.4. Chuẩn bị dung dịch chuẩn
-

Chuyển tồn bộ mỗi chất chuẩn vào bình định mức 10 mL, định mức
tới vạch bằng MeOH, lắc đều, thu được các dung dịch chuẩn gốc
Jacobine 500 µg/mL, Echimidine 1000 µg/mL, Intermidine 1000
µg/mL, Senecionine 1000 µg/mL. Bảo quản ở -3oC – -8 oC, sử dụng

trong 1 năm.

-

Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 10 µg/mL: hút mỗi dung dịch
chuẩn gốc theo bảng 2.2 vào bình định mức 10 mL, định mức tới
15