BÁO cáo (dược PHÂN TÍCH) xác định các hợp chất phenolic trong táo và sản phẩm chế biến từ táo bằng HPLC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y
-----

Chuyên đề :
XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT
PHENOLIC TRONG TÁO VÀ
CÁC SẢN PHẨM CHẾ BIẾN CỦA TÁO
BẰNG HPLC
GVHD:

Tháng


MỤC LỤC

I. PHẦN MỞ ĐẦU...............................................................................................................1
1.1 Tóm tắt............................................................................................................................ 1
1.2 Giới thiệu........................................................................................................................ 1
II. NỘI DUNG...................................................................................................................... 3
2.1 Vật liệu và phương pháp...............................................................................................3
2.1.1 Vật liệu......................................................................................................................... 3
2.1.2 Phương pháp...............................................................................................................3
2.2 Kết quả và thảo luận......................................................................................................4
III. KẾT LUẬN.................................................................................................................... 9
IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................9


I. PHẦN MỞ ĐẦU
1.1 Tóm tắt
Mục đích của nghiên cứu sơ bộ này là để đánh giá thành phần của các hợp chất

phenolic trong táo và các sản phẩm chế biến của nó.
Bốn giống táo : “Jonagold ’’, “Sampion ’’, “Idared ’’ và “Topaz ” đã được thu hoạch
khi chín đồng loạt trong mùa năm 2004 và được chế biến thành nước ép trong và nước ép
đục cũng như nước sốt táo theo công nghệ công nghiệp tiêu biểu.
Thành phần của phenol được phân tích bằng phương pháp HPLC sử dụng một loại
mới của cột sắc ký Phenomenex Fusion RP.
Tính trung bình, tổng hàm lượng của các hợp chất phenolic được xác định khi khảo sát
các loại trái cây tươi là 857 mg/kg trọng lượng tươi . Các nhóm phong phú nhất là flavonol (
417 mg/kg ), tiếp theo là các axit phenolic ( 229 mg/kg ). Sự khác biệt có ý nghĩa được tìm
ra khi so sánh thành phần của các nhóm phenol khác nhau trong các giống điều tra. Hàm
lượng axit phenolic cao nhất trong giống “Idared”. Giống “Sampion” có thành phần nhiều
nhất là các flavonol ( 477 mg/kg) và có lượng axit phenolic thấp nhất. Một hàm lượng cao
Quercetin glycosides được tìm thấy trong các giống “Jonagold ”và “Topaz ”.
Chế biến táo thành nước sốt táo đã làm biến đổi một lượng nhỏ thành phần phenolic.
Khi chế biến thành các loại nước ép tối màu chỉ có 53% phenolic được tìm thấy trong các
loại nước ép. Hàm lượng phenol bị mất nhiều hơn trong các loại sản phẩm nước ép sáng
màu. Ảnh hưởng mạnh mẽ của nhiệt độ lên thành phần phenolic được tìm ra khi sản xuất
nước trái cây . Nước ép sản xuất với Panzym MK ở 50°C chứa 40% phenolics nhưng các
loại nước ép được sản xuất với Rohapect MA Plus tại 20°C chỉ chứa 19% của phenolics ban
đầu .
1.2 Giới thiệu
Các nguồn cung cấp chính của các hợp chất phenolic trong khẩu phần là những loại
trái cây và rau quả, bao gồm táo và các sản phẩm táo qua xử lý. Những lợi ích của các hợp
chất phenolic gần đây đã là chủ đề của nhiều cuộc thảo luận ( Manach et al , 2004; .
Scalbert et tại , năm 2005). Hàm lượng phenol trong khẩu phần được ước tính khoảng 1
gram mỗi ngày. Cao hơn đáng kể so với tất cả các chất chống oxy hóa thực phẩm khác, bao
gồm vitamin C, vitamin E và carotenoid ( Scalbert và Wiliamson, 2000).
1

Nhiều hợp chất phenolic khác nhau đã được xác định trong táo. Hai phân nhóm chính
của polyphenol là flavonoid và các axit phenolic. Một số flavonoid quan trọng nhất trong
táo:
₋

Quercetins, tồn tại ở các dạng glycosylated ( flavonol )

₋

Catechin, epicatechin và oligome của nó ( proanthocyanidins ), quyết định vị chát và

cay, đắng.
Một số các axit phenolic phổ biến nhất trong táo:
₋ Axit caffeic, tồn tại ở dạng este hóa với axit quinic ( chlorogenic axit )
₋ p- coumaric acid, tồn tại ở dạng este hóa với axit quinic ( pcoumarylquinic axit ).
Ngồi ra trong táo cịn có hợp chất phenolic khác là dihydrochalcones ( phloretin
glycosides ) .
Nồng độ của các hợp chất phenolic rất khác nhau ở các phần khác nhau của táo.
Quercetin glycosides và flavonol có chủ yếu trong da (Oszmiański và Lee, 1994; . Thielen
et al , 2005; . Awad et al, 2000).
Dihydrochalcones có trong lõi và hạt giống ( Thielen et al . , 2005) . Phenolic axit có
chủ yếu ở vỏ (Awad et al, 2000; . . Russel et al, 2002).
Trên thực tế, các phenolics khác nhau trong các phần khác nhau của quả ảnh hưởng
đến nồng độ của phenolics trong sản phẩm nước ép, xay nhuyễn và sản phẩm táo xử lý. Chỉ
một lượng nhỏ các glycoside quercetin và dihydrochalcones được chiết xuất trong q trình
sản xuất nước ép vì glycoside quercetin có mặt chủ yếu trong da và dihydrochalcones có
mặt chủ yếu trong hạt. Khả năng oxi hóa của nhóm phenolic cũng ảnh hưởng đến nồng độ
của phenolics (Oszmiański và Lee, 1990). Trong thời gian chế biến, các thành tế bào hư hại
và các rào cản tự nhiên tách enzyme và các cơ chất biến mất.
Polyphenoloxidase (PPO), enzyme oxy hóa chính gắn vào thành tế bào, bắt đầu phân

huỷ các hợp chất phenolic, axit ascorbic và các thành phần khác của dịch ngâm (Mayer và
Harel, 1979). Polyphenoloxidase xúc tác q trình oxy hóa orthodiphenols thành quinon,
chất này ban đầu nó khơng màu. Quinones rất nhạy cảm và có thể trải qua phản ứng phi
enzyme với các phenolics khác, protein và axit amin, ngưng tụ sắc tố nâu (Zimmer, 1999).

2


Việc xác định hàm lượng phenolics trong táo và các sản phẩm từ táo là chủ đề nghiên
cứu sâu rộng. Có một số phương pháp HPLC để tách và định lượng hợp chất polyphenolic
trong táo và sản phẩm táo xử lý (Spanos et al, 1990;.. Schieber et al, 2001; Tsao và Yang,
2003). Tuy nhiên, những thay đổi về chất lượng và số lượng của các hợp chất phenolic
trong khi chế biến chưa được hiểu rõ.
II. NỘI DUNG
2.1 Vật liệu và phương pháp
2.1.1 Vật liệu
Nghiên cứu được thực hiện vào năm 2004 và 2005 tại cục lưu trữ và xử lý Viện
Nghiên cứu trồng cây có trái và nghề trồng hoa ở Skierniewice, Ba Lan. Hàm lượng
Phenolics được đo trong bốn giống táo: 'Jonagold', 'Sampion', 'Idared' và 'Topaz'. Táo được
thu hoạch khi chín đồng loạt. Sau đó được chế biến thành nước ép trong, nước ép đục, và
xốt táo theo quy trình cơng nghiệp. Nước ép táo trong được chế biến bằng Panzym MK tại
50°C hoặc Rohapect MA Plus tại 20°C. Các loại nước ép đục được sản xuất mà không cần
nghiền với enzymation, 200 mg/kg acid ascorbic được thêm vào nước ép đục.
Hóa chất đạt tiêu chuẩn ACS ( American Chemical Society): natri axetat, axit
chlorogenic, axit p-coumaric, catechin, epicatechin, phloridzin và quercetin đã được mua từ
Sigma-Aldrich. Nước sử dụng để phân tích HPLC lần đầu tiên được thanh lọc bằng cách sử
dụng hệ thống Elix 3 và sau đó sử dụng hệ thống SimplicityTM (Millipore). Dung môi tinh
khiết dùng cho sắc ký được mua từ Baker.
2.1.2 Phương pháp
Để xác định các hợp chất phenolic trong trái cây tươi, ba mươi quả táo được cắt làm 8

phần bằng một con dao gốm và được đông lạnh đến -25°C trước khi nghiền thành bột
Cho HPLC, 10g bột táo được đồng nhất trong một phút với dung dịch methanol 70%
(Ultra Turrax® T 25 cơ bản IKA® -WERKE). Cặn được chuyển sang một bình định mức
50 ml, sau đó cho methanol 70% vào đến vạch 50ml. Hỗn hợp được lọc qua giấy lọc
Whatman số 1. Dịch lọc được bảo quản ở -18°C trước khi phân tích.
Các mẫu nước trái cây được pha lỗng trước khi tiêm. Các mẫu nước sốt và các loại nước
ép trong đã được lọc, pha loãng và chiết xuất với methanol 70% trong một bể nước siêu âm

3


mười phút trước khi tiêm mẫu. Trước khi HPLC, tất cả các mẫu được pha loãng 1: 3 (v/v)
với natri axetat đệm (dung môi A).
HPLC sử dụng một hệ thống Agilent 1100 Series HPLC với một đầu dò DAD.
Polyphenolic được tỏch bng mt Phenomenexđ Fusion ct RP (250mm ì 4.6mm, 3mm)
với một cột bảo vệ. Tướng động bao gồm 10,2% axit axetic trong 2 mM sodium acetate
(dung môi A) và acetonitrile (Dung mơi B). Tỷ lệ dịng chảy đã được giữ ổn định ở 0,5
ml/phút với tổng thời gian chạy của 72 phút ở 25 oC. Hệ thống này được chạy với một
chương trình gradient: 3% B (0-20 phút); 3-35% B (45 phút); 35-90% B (3 phút); 90-90% B
(4 phút); 90-0% B (1 phút). Các cột đã được cân bằng 10 phút ở điều kiện ban đầu. Thể tích
mẫu tiêm vào là 20 ml. Một hồ sơ tách đại diện được trình bày trong (Bảng 1) và (Hình 1).
Các dữ liệu được xây dựng thống kê phân tích phương sai, tiếp theo có nghĩa là tách
biệt với nhiều tầm t-test của Duncan tại P ≤0.05

Hình 1. Ví dụ về phenolics tách: 1-flavonol; 2-axit phenolic; 3 -dihydrochalcones;
4-quercetin glycosides
2.2 Kết quả và thảo luận
Nồng độ của các hợp chất phenolic trong các giống được đánh giá là 857 mg/kg trọng
lượng tươi (Bảng 1). Sự phân bố các phân nhóm của hợp chất phenolic rất khác nhau tùy
vào giống táo. Flavonol có nhiều nhất trong giống táo 'Sampion' (477 mg/kg). Các axit

4


phenolic có nhiều nhất trong giống 'Idared' và thấp nhất trong giống 'Sampion'. Các giống
chứa nhiều glycoside quercetin nhất là 'Topaz' và 'Jonagold'.
Tổng hàm lượng phenolics trung bình trong bốn giống là (857 mg/kg), bao gồm chủ
yếu là các flavonol (417 mg/kg) và các axit phenolic (229 mg/kg).
Bảng 1. Hàm lượng các hợp chất phenolic trong trái cây [mg/kg]
Phenolics
group Cultivar
Jonagold
Sampio
Idared
[mg/kg]
n
Flavonol their dimers
317
477
374
Dihydrochalcones
119
118
97
Acid phenolic
235
146
364
Glycosides Quercetin
87
65

41
Total phenolics
839
840
910

Average
Topaz
446
85
192
83
840

417
119
229
69
857

Trong sản xuất nước xốt táo , hàm lượng phenolics về cơ bản đã không thay đổi. Trong
việc sản xuất các loại nước ép đục , hàm lượng phenolics giảm 47 % . Trong việc sản xuất
các loại nước ép trong với Panzym MK, hàm lượng phenolics giảm 65% . Trong việc sản
xuất các loại nước ép trong với Rohapect MA Plus, hàm lượng phenolics giảm 81 % ( Bảng
6 ).
Kết quả xác định polyphenol được trình bày trong bảng 2-6.
Bảng2. Hàm lượng của các flavonol trong trái cây và sản phẩm chế biến
Product
Fruit
Sauce

Cloudy juice
Clear juice at 500C
Clear juice at 20C

Jonagold

Cultivar
Sampion
Idared

Topaz

371.1 hi
387.8 i
209.4 e
62.5 b
15.5 a

477.4 k
462.3 ik
284.9 f
267.5 f
158.3 d

446.3 i
452.5 i
329.8 g
219.8 e
108.1 c

373.6 hi
359.7 h
82.7 b
70.8 b
12.9 a

Ghi chú: Trung bình đánh dấu trong cùng một lô khác biệt không đáng kể với P = 0,005
Bảng 3: Hàm lượng của dihydrochalcones trong trái cây và sản phẩm chế biến
Cultivar
5


Product
Fruit
Sauce
Cloudy juice
Clear juice at 500C
Clear juice at 20C

Jonagold

Sampion

Idared

Topaz

119.4 h
88.8 fg
37.6 bc

42.3 c
19.3 a

117.8 h
71.5 e
40.2 c
58.8 d
28.6 ab

97.0 g
86.8 fg
42.6 c
55.8 d
24.1 a

85.0 f
52.6 d
23.2 a
41.8 c
19.9 a

Bảng4: Hàm lượng của các phenolic acid trong trái cây và sản phẩm chế biến
Product
Fruit
Sauce
Cloudy juice
Clear juice at 500C
Clear juice at 20C

Jonagold

Cultivar
Sampion
Idared

Topaz

235.1 j
262.5 k
213.4 i
69.5 c
51.9 ab

145.1 g
120.6 f
106.2 e
88.1 d
46.1 a

191.7 h
156.1 g
150.1 g
71.5 c
62.5 bc

346.3 l
353.2 l
225.0 ij
115.6 ef
51.0 ab

Bảng5: Hàm lượng của quercetin glycosides trong trái cây và sản phẩm chế biến
Product

Jonagold

Cultivar
Sampion
Idared

Topaz

Fruit
87.5 fg
65.2 de
41.2 c
82.9 f
Sauce
92.6 g
74.0 e
65.6 de
112.1 h
Cloudy juice
9.6 a
5.1 a
5.0 a
7.1 a
0
Clear juice at 50 C
35.2 c

21.3 b
20.9 b
57.9 d
Clear juice at 20C
5.9 a
3.1 a
2.4 a
7.3 a
Bảng6: Hàm lượng tổng cộng của phenolics trong trái cây và sản phẩm chế biến.
Product
Fruit
Sauce
Cloudy juice
Clear juice at 500C
Clear juice at 20C

Jonagold

Cultivar
Sampion
Idared

Topaz

839.4 hi
853.1 i
469.9 e
215.5 b
92.4 a

840.0 hi
762.5 g
462.2 e
460.2 e
251.2 bc

840.1 hi
806.6 h
539.4 f
412.0 d
207.7 b

909.6 j
912.2 j
377.3 d
274.7 c
90.2 a

6


Trong sản xuất nước xốt táo, hàm lượng flavonol về cơ bản đã không thay đổi, hàm
lượng dihydrochalcones giảm đáng kể, các phenolic acid chỉ giảm một lượng nhỏ, và hàm
lượng quercetin glycosides thậm chí tăng lên, có thể do sự bay hơi (Bảng 2, 3, 4 và 5). Sự
giảm sút trong hàm lượng dihydrochalcones có khả năng là kết quả của công nghệ chế biến
(công nghệ xử lý).Trước khi sản xuất nước xốt táo, các lõi đã được loại bỏ. Lõi và hạt chứa
nhiều flavonol nhất (Awad et al, 2000;.. Thielen et al,2005).
Trong việc sản xuất các loại nước ép trong, mức độ mỗi lớp của chất phenol giảm
đáng kể.
Hàm lượng Phenolics là cao nhất trong các loại nước ép tối màu (Bảng 4). Hàm lượng

Quercetin glycosides trong các loại nước ép tối màu trung bình trên 7 mg/l (Bảng 5). Điều
này có thể là do nồng độ khác nhau của các hợp chất phenolic trong các mô quả. Do thời
gian chế biến ngắn và nhiệt độ thấp trong sản xuất nước trái cây tinh khiết, glycosides
quercetin vẫn còn ở vỏ trong bột táo nghiền. Phenolic acid được phân phối đồng đều hơn
trong vỏ và đã tốt hơn chiết xuất trong các loại nước ép.
Trên cơ sở dung tích riêng của nhóm các hợp chất phenolic trong nước ép đục, các
giống táo có thể được chia thành hai nhóm. Trước tiên bao gồm hai giống truyền thống,
thích hợp để chế biến, 'Idared' và 'Jonagold', hai giống này có hàm lượng axit phenolic cao
nhất ( bảng 4). Thứ hai bao gồm các giống 'Sampion' và giống kháng bệnh nấm vảy 'Topaz’
là hai giống chứa hàm lượng flavonols cao nhất (bảng 2). Điều này có thể là do sự khác biệt
trong cân bằng polyphenol oxidase (PPO) (Kuczyń ski, 1995; Cụm ę dek et al., 2000). Hoạt
tính PPO trong 'Sampion' thấp hơn trong tất cả các giống táo phổ biến. Thật không may,
khơng có dữ liệu cho Topaz.
Mức độ phenolics trong nước ép đục là phù hợp với các tài liệu (Markowski, 199 8;
Will and Dietrich, 2005). Tuy nhiên mức độ bảo quản phenolic phụ thuộc đáng kể vào việc
bổ sung acid ascorbic trong sản xuất nước trái cây (Markowski, 1998). Thêm nhiều axít
ascorbic ngăn cản q trình oxy hóa của phenolics vì hàm lượng phenolics cao hơn trong
nước ép đục.
Nước ép trong được sản xuất từ táo 'Sampion' với Panzym MK ở 50°C có cùng hàm
lượng phenolics như nước ép đục ( bảng 5). Điều này có thể là do hoạt tính PPO rất thấp
trong 'Sampion' và một tỷ lệ thấp của enzym làm sẫm màu (Kuczyń ski, 1995). Trong các
7


giống táo khác, mức độ của phenolics giảm. Hàm lượng từng nhóm phenolic của nước ép
trái cây trong được sản xuất với Panzym MK lúc 50°C khác biệt đáng kể so với nước ép trái
cây đục. Nhóm chi phối là axit phenolic, và hàm lượng của flavonols là thấp hơn trong nước
ép trái cây đục (bảng 2 và 4) ngoại trừ 'Sampion' và 'Idared', sự khác biệt là không đáng kể
về mặt thống kê.
Hàm lượng Dihydrochalcones và glycoside quercetin đã cao hơn trong các loại nước ép

trong được sản xuất với Panzym MK ở 50°C so với các loại nước ép đục (bảng 3 và 5). Đây
có thể là do sự khai thác tốt hơn các chất từ da và hạt, do nhiệt độ tăng lên và hoạt tính của
enzym.
Việc sử dụng enzyme mới Rohapect MA Plus, hoạt động tối ưu tại 20°C gây ra sự sụt
giảm đáng kể hàm lượng phenolic (160 mg/l trái ngược với 341 mg/l của nước ép trong
được sản xuất với Panzym MK tại 50°C). Trong đó các axit phenolic giảm mạnh nhất (bảng
4).
Hàm lượng của glycoside quercetin là rất thấp và so sánh với các loại nước ép đục(bảng 5).
Khơng có khác biệt đáng kể về hàm lượng quercetin glycosides trong các loại nước ép đục
và nước ép trong sản xuất với Rohapect MA Plus tại 20°C, mặc dù xử lý enzym kéo dài một
giờ. Điều này chứng minh rằng nhiệt độ có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình chiết xuất
quercetin gycosides. Trong thời gian xử lý enzym với Panzym MK ở 50°C, hàm lượng của
glycoside quercetin là trên trung bình cao hơn gần tám lần trong các loại nước khác. Điều
này không thể được giải thích bởi liều lượng và hiệu suất của enzyme vì năng suất ép là như
nhau cho cả nước trái cây (82%).
Các loại nước ép đục làm từ 'Sampion' và 'Topaz' có hàm lượng flavonol cao nhất . Điều
này có vẻ như khơng phụ thuộc vào các kỹ thuật sản xuất nước trái cây hoặc nhiệt độ trong
quá trình xử lý enzyme. Nước ép từ 'Jonagold' và 'Idared' phân phối của các hợp chất
phenolic là điển hình cho nước trái cây và chứa hàm lượng cao nhất các axit phenolic (chủ
yếu là axit chlorogenic). Nước ép từ '' Sampion 'và' Topaz ' chứa hàm lượng cao flavonol
(chủ yếu là epicatechin). Nghiên cứu thêm là cần thiết về vai trị của hoạt tính PPO.

8


Hình 2: Tổng hàm lượng phenolics trong táo và sản phẩm chế biến từ táo
III. KẾT LUẬN
1. Mặc dù các giống cây trồng khác biệt đáng kể về hình thái, tất cả đều chứa khoảng
cùng một lượng phenolics, phong phú nhất trong số đó là các flavonols.
2. Nước xốt táo chứa nhiều phenolics hơn so với nước trái cây.

3. Nước ép đục chứa nhiều các hợp chất phenolic hơn nước ép trong.
4. Trong sản xuất nước trái cây, các hợp chất phenolic được chiết xuất có hiệu quả khi
nhiệt độ trong quá trình xử lý enzyme là cao hơn.
IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO
/>
9