BÁO cáo (dược PHÂN TÍCH) xác định độ nhạy của các catechin trong trà bằng phương pháp HPLC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y

XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY CỦA CATECHINS TRONG
TRÀ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

GVHD
LỚP
DANH SÁCH NHÓM


MỤC LỤC


MỞ ĐẦU
Sự tiêu thụ trà trở nên tăng lên một cách phổ biến ở Bắc Mỹ và trà hiện tại là một trong
những thức uống không cồn được tiêu thụ nhiều nhất trên toàn thế giới. Các nghiên cứu
đã chỉ ra rằng trà (Camellia sinensis – tên khoa học của cây trà) cung cấp một số lợi ích
cho sức khỏe, như là giảm cholesterol và béo phì, bảo vệ chống lại bệnh tim mạch và ung
thư. Catechin là chất chống oxy hóa mạnh được tìm thấy trong trà được cho là để cung
cấp một số các lợi ích sức khỏe. Thành phần của catechins trong trà thương mại tùy thuộc
vào loài, mùa, điều kiện làm vườn, và quan trọng nhất, mức độ của q trình oxy hóa
trong sản xuất process. Có bốn loại trà chính: trắng, xanh, ơ long, và đen. Mặc dù tất cả
các loại trà có nguồn gốc từ cùng cây Camellia sinensis, nhưng các phương pháp xử lý
đối với từng loại trà khác nhau. Ví dụ, trà trắng được làm khô tự nhiên bằng cách hoặc
phương pháp phơi nắng hoặc bay hơi trước khi được xử lý tối thiểu để ngăn chặn q
trình oxy hóa. Những phương pháp chế biến này nhằm bảo vệ hương vị trà và giữ được
nồng độ catechin cao. Trà xanh chiếm khoảng 20% tổng sản lượng trà sản xuất. Nó chủ
yếu phổ biến ở Nhật Bản và bộ phận Trung Quốc, nhưng sự phổ biến của nó đang gia
tăng ở các nơi khác trên thế giới do có tính phổ biến sẵn có và báo cáo lợi ích về sức
khỏe. Q trình sản xuất trà xanh thì tương tự như trà trắng, và do đó, nó cũng chứa một

nồng độ tương đối cao catechins.
Trà đen đại chiếm khoảng 78% sản lượng trà toàn cầu và là loại trà phổ biến nhất tại Hoa
Kỳ và Châu Âu. Nó được làm bằng cách oxy hóa hồn tồn các lá thu hoạch trong vài giờ
trước khi sấy khơ. Q trình oxy hóa đem đến cho trà một màu tối và đồng thời có gấp ba
lần hàm lượng caffeine. Do biến đổi trong các thành phần của catechin trà và lợi ích sức
khỏe tiềm năng của chúng, nó rất quan trọng để thiết lập một phương pháp phân tích đơn
giản và đáng tin cậy cho việc xác định các hợp chất này trong sản phẩm trà khác nhau.
Cơng trình nghiên cứu này mơ tả hiệu quả, nhanh và chính xác bởi phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định lượng catechins trong trà. Các catechin có nhiều nhất
trong các sản phẩm trà bao gồm catechin, epicatechin (EC), epigallocatechin (EGC),
epicatechin gallate (ECG), gallocatechin (GC), gallocatechin gallate (GCG) và
epigallocatechin gallate (EGCG). Phương pháp sử dụng một độ phân giải cao silica cột
2.2 μm Acclaim® C18 RSLC và bước sóng 280 nm để tách, phát hiện và định lượng
catechins trong trà trắng, xanh, đen, và hỗn hợp trà trắng và trà xanh. Ngoài ra, nghiên
cứu này đánh giá hai nguyên liệu tham khảo tiêu chuẩn (SRMs) được cung cấp bởi Viện
Tiêu chuẩn và Công nghệ Quốc gia (NIST) như là một phần của một nghiên cứu hợp tác.
Các nguyên liệu đối chứng (SRM 3255) là một chiết xuất trà xanh phun khô và mẫu
(SRM 3256) chứa đất và viên trà xanh đồng nhất. Phương pháp này chứng minh độ nhạy
tốt, tạo điều kiện cho việc phát hiện một loạt các catechin với nồng độ khác nhau dao
động từ 2.46 mg/g đối với catechin đến 80.8 mg/g đối với EGCG, và có tổng thời gian
chạy ít hơn 20 phút. Các báo cáo giới hạn sự phát hiện (LODs) sử dụng phương pháp dao
động từ 0.20 μg/mL đối với EG và catechin đến 1.17 μg/mL đối với GC, và giới hạn định
lượng (LOQs) dao động từ 0.59 μg/mL đối với EC đến 3.56 đối với GC. Phương pháp
được mô tả ở đây là lý tưởng cho việc phân tích đơn giản, nhạy, chính xác, nhanh chóng,
và thơng thường của catechins trong sản phẩm trà khác nhau.


TỔNG QUAN
1. Giới thiệu chung về trà
1.1.

Sinh thái học của trà
Tên khoa học của trà: Camellia sinensis (L.) O.Kuntze

I.

Trà được xếp trong phân loại thực vật như sau: ngành Hạt kín Angiospermatophyta, lớp
Ngọc lan (hai lá mầm) Magnoliopsida, phân lớp Sổ Dilleniidae, bộ Trà Theales, họ Trà
Theaceae, chi Trà Camellia (Thea.).

Angiospermatophyta,
Dilleniidae, bộ Tràlớp
Theales,
NgọcHình
họ
lanTrà
(hai
lá
mầm)
chi Trà Camellia
phân
(Thea.)
lớp Sổ
1.1.Theaceae,
Cây
trà Magnoliopsida,
Cây trà sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên chỉ có một thân chính, chia làm 3 loại: thân
gỗ, thân bụi, thân nhỡ (bán gỗ). Cành trà do mầm sinh dưỡng phát triển thành, trên cành
chia ra nhiều đốt, chiều dài biến đổi nhiều từ 1 – 10cm. Đốt trà càng dài là biểu hiện của
giống trà có năng suất cao. Lá trà mọc cách trên cành, mỗi đốt có một lá, hình dạng và
kích thước thay đổi tùy giống. Lá trà có gân rất rõ, rìa lá có răng cưa. Búp trà là giai đoạn

non của một cành trà, được hình thành từ các mầm dinh dưỡng, gồm có tơm (phần lá non
trên đỉnh chưa xịe) và 2 hoặc 3 lá non. Kích thước của búp trà thay đổi tùy giống và kỹ
thuật canh tác. Cây trà sau khi sinh trưởng 2 – 3 tuổi bắt đầu ra hoa, mọc từ chồi sinh
thực ở nách lá.
Trà là cây lâu năm, có chu kỳ s ống rất lâu, có thể đạt 60 – 100 năm hoặc lâu hơn. Tuổi
thọ kinh tế t ối đa của một cây trà thương mại vào khoảng 50 – 65 năm tùy thuộc điều
kiện môi trường và phương pháp trồng trọt.
1.2.
Phân bố trà
Trà xanh chiếm khoảng 20% tổng sản lượng trà sản xuất. Nó chủ yếu phổ biến ở Nhật
Bản và bộ phận Trung Quốc, nhưng sự phổ biến của nó đang gia tăng ở các nơi khác trên
thế giới do có tính phổ biến sẵn có và báo cáo lợi ích về sức khỏe.


Trà đen đại chiếm khoảng 78% sản lượng trà toàn cầu và là loại trà phổ biến nhất tại Hoa
Kỳ và Châu Âu.

1.3.

Thành phần hóa học của lá trà

Trà là một loại thức uống truyền thống đã có lịch sử hàng ngàn năm, quá trình nghiên
cứu về trà trên thế giới đã được thực hiện từ r ất lâu. Hiện nay thành phần hóa học của lá
trà đã được mơ tả t ương đối đầy đủ. Thành phần chủ y ếu của lá trà được mô tả trong
bảng sau:
Thành phần

% khối lượng chất khô

Catechin

25-30

(-)- Epigallocatechin gallate

8-12

(-)- Epicatechin gallate

3-6

(-)- Epigallo catechin

3-6

(-)- Epicatechin

1-3

(+)- Catechin

1-2

(+)- Gallocatechin

3-4

Flavonol và flavonol glucoside

3-4

Polyphenolic acid và dẫn xuất

3-4

Leucoanthocyanin

2-3

Chlorophyll và các chất màu khác

0.5-0.6

Khoáng

5-6

Caffeine

3-4

Theobromine

0.2

Theophylline

0.5

Amino acid

4-5

Acid hữu cơ

0.5-0.6

Monosaccharide

4-5

Polysaccharide

14-22

Cellulose và hemicellulose

4-7

Pectin

5-6

Lignin

5-6

Protein

14-17


Lipid
Các hợp chất dễ bay hơi

3-5
0.01-0.02

Bảng 1.1. Thành phần hóa học của lá trà non
1.3.1.
Polyphenol
Nhóm các hợp chất polyphenol là thành phần được quan tâm nhiều nhất trong lá trà. Các
hợp chất polyphenol của lá trà rất khác với các hợp chất polyphenol được tìm thấy trong
các loại cây khác. Các cấu tử chính chiếm đa số là các catechin (C, EC, EGCG, EGC,
ECG…). Ngoài ra trong thành phần polyphenol của trà cịn có một số chất khác với tỉ l ệ
thấp như các flavonol (quercetin, kaempferol, rutin…), các dẫn xuất glucoside như
myricetin-3-glucoside, kaempferol-3-glucoside, myricetin-3–rhamnoglucoside, quercetin3-rhamnoglucoside, kaempferol-3-rhamnodiglucoside …, các leucoanthocyanin, các hợp
chất polyflavonoid như theaflavin (theaflavin-3-gallate, theaflavin-3’-gallate, theaflavin3,3’-digallate...), thearubigin (procyanidine,
procyanidine gallate…). Các dạng hợp chất như theaflavin, thearubigin chiếm tỉ l ệ rất
thấp trong búp trà và lá trà non nhưng tăng dần tỉ lệ trong các lá trà già hơn.
1.3.2.
Caffeine
Caffeine (1,3,7-trimethyl xanthine; 1,3,7-trimethyl-1H-purine -2,6 (3H,7H)-dione), là
một dẫn xuất tạo thành từ purine, caffeine chủ y ếu được tổng hợp tại lá trà, chiếm
khoảng từ 3 – 5% lượng chất khơ trong lá trà, và hàm lượng này ít biến đổi trong quá
trình phát triển của lá trà. Điều đáng chú ý là hàm lượng caffeine trong lá trà cao hơn hàm
lượng caffeine tương ứng trong hạt cà phê (chiếm khoảng 1,5% trọng lượng khơ). Ngồi
caffeine, trong lá lá trà cịn có các dẫn xuất khác của methylxanthine như theobromine,
theophylline với hàm lượng thấp hơn (<0.1%).

1.3.3.
Acid amine
Các acid amine cơ b ản trong lá trà bao gồm aspartic, arginine, glutamic, serine,
glutamine, tyrosine, valine, phenylalanine, leucine, isoleucine and theanine (5-Nethylglutamine)…. Khoảng 50% acid amine trong lá trà tồn tại ở dạng tự do. Trong
đó theanine chiếm hàm lượng cao nhất, khoảng 50-60% tổng hàm lượng acid amine tự
do, tiếp theo là aspartic acid và arginine. Theanine là acid amine đặc trưng của cây trà,
theanine chỉ có thể được tìm thấy ở các cây họ trà và một số ít các lồi nấm.
Khác với phần lớn các acid amine khác được tổng hợp tại lá trà, theanine được tổng hợp
tại bộ rễ của cây trà và vận chuyển lên lá.
1.3.4.
Enzyme


Trong búp trà có hầu hết các loại enzyme nhưng chủ y ếu gồm 2 nhóm: nhóm enzyme
thủy phân gồm amilase, invectase, glucozidase, protease…; nhóm enzyme oxy hóa khử
gồm catalase, polyphenol oxidase và peroxidase… Trong số các enzyme trong lá trà,
enzyme polyphenol oxidase thu được nhiều sự
quan tâm do vai trị quan trọng trong q trình oxy hóa nhóm catechin của trà.
1.3.5.
Vitamin
Lá trà tươi có nhiều loại vitamin như nhóm vitamin tan trong dầu: A, D, E, F…, và nhóm
vitamin tan trong nước: B, PP, C…. Trong đó vitamin C chiếm hàm lượng cao nhất, có
thể đạt đến 280 mg/100 g trà khơ.
1.3.6.
Cacbohydrate
Nhóm carbohydrate có mặt trong lá trà bao gồm hợp chất cellulose, hemi-cellulose và
đường tự do. Các gốc đường tự do có mặt trong lá trà bao gồm glucose, fructose, sucrose,
raffinose and stachyose... Các đường polysaccharide gồm có galactose, arabinose,
galacturonic acid, rhamnose và ribose... Các đường tự do là nguồn nguyên liệu chính để
t ổng hợp catechin trong lá trà. Những nghiên cứu sử d ụng glucose đánh dấu bằng C14

( đồng vị carbon 14) đã chỉ ra rằng glucose là một trong những tiền
chất của polyphenol và acid amine (ngoại trừ theanine) trong lá trà.
1.3.7.
Các nhóm hợp chất khác
Protein
Protein chiếm khoảng 15% khối lượng chất khô của lá trà tươi, thay đổi tuỳ theo giống
trà, tuy nhiên ít biến đổi theo quá trình phát triển của lá trà.
Chất béo và các acid béo tự do
Các hợp chất lipid, phospholipid và các acid béo chiếm khoảng 5-6 % trong lá trà, hàm
lượng này biến đổi khá nhiều tuỳ theo từng giống trà khác nhau. Các acid béo tự do tìm
thấy trong lá trà có linolenic, linoleic, oleic và palmitic…
Carotenoid
β-carotene, lutein, violaxanthine và neoxanthine được tìm thấy trong lá trà.
Acid hữu cơ
Các acid như citric, tartaric, malic, oxalic, fumaric, caffeic, quinic, gallic, succinic,
chlorogenic, neo-chlorogenic, p-coumarylquinic, ellagic acid… đã được nhận diện trong
lá trà tươi.
Kim loại
Các chất vô cơ chiếm khoảng 5-6% khối lượng khô của trà, chiếm nhiều nhất là nhôm,
mangan, magie…. Hàm lượng các chất vô cơ trong lá trà biến đổi khá nhiều tuỳ theo thổ
nhưỡng vùng đất. Một điều đáng lưu ý là các một phần các kim loại, đặc biệt là nhơm,
tìm thấy trong trà dưới dạng phức chelate với các catechin,
Các chất dễ bay hơi (tinh dầu trà)
Thành phần tinh dầu trà chiếm tỉ l ệ r ất thấp trong tổng khối lượng của lá trà
(<0.01%). Các thành phần đã được nhận diện trong tinh dầu trà bao gồm linalol, deltacardinene, geraniol, nerolidol, alpha-terpineol, cis-jasmone, indole, beta- ionone, 1octanal, indole-3-carbinol, beta-caryophyllene….
2. Nhóm hợp chất Catechin trong trà
2.1.
Cấu tạo

Catechin là hợp chất thuộc họ flavonoid-3. Trong phân tử có 15C bao gồm hai vịng 6C
A và B được nối với nhau bởi 3 đơn vị carbon ở vị trí 2, 3, 4 hình thành một dị vịng C
chứa một nguyên tử oxy.
Về mặt cấu trúc, catechin là hợp chất flavanol, được đặc trưng bởi cấu trúc C6-C3-C6,
tương ứng với sự thay thế 2-phenyl bằng benzopyran và pyron. Trong cơng thức có
chứa 2 C bất đối ở vị trí 2 và 3, khơng chứa nối đơi ở vị trí 2, 3 và 4-oxo

Hình 2.1. Cấu tạo khung cơ bản của nhóm hợp chất catechin
2.2.
Tính chất hóa lý
Trà được biết là có 6 loại hợp chất catechin chính và một số lượng nhỏ các dẫn xuất
catechin khác. Các catechin được chia thành 2 nhóm: nhóm catechin tự do bao gồm C,
GC, EC, EGC (vị trí carbon số 3 có chứa nhóm thế hydroxyl) và nhóm đã bị ester hóa
hay nhóm galloyl catechin : ECG, EGCG (nhóm hydroxyl ở v ị trí carbon số 3 được thay
bằng một nhóm gallate). Các hợp chất catechin trong lá trà đã được tách ra từng chất ở
d ạng tinh khiết, ở thể r ắn chúng là những chất kết tinh khơng màu hình kim hoặc hình
lăng trụ, có vị chát dịu hoặc hơi đắng, tác dụng với FeCl3 cho kết tủa xanh thẫm hoặc
xanh nhạt tuỳ theo số lượng nhóm hydroxyl trong phân
tử. Các catechin đều dễ tan trong nước nóng, rượu, acetone, ethyl acetate tạo dung dịch
không màu, không tan trong các dung mơi khơng phân cực hoặc ít phân cực như benzene
hoặc chloroform.


Hình 2.2. Cơng thức cấu tạo của các catechin trong trà
Hàm lượng catechin trong búp trà cao nhất đạt đến khoảng 30% trọng lượng khô. Trong
các hợp chất catechin được tìm thấy trong trà, thành phần gallate chiếm đa số (trên 80%
tổng catechin). EGCG là thành phần đặc trưng của trà do chỉ được tìm thấy trong trà,
EGCG có thể chiếm đến hơn 50% tổng khối lượng các hợp chất catechin và khoảng 10%
tổng khối lượng khô của trà, tiếp theo là EGC và ECG (chiếm khoảng 10 - 20% tổng
catechin). Các hợp chất catechin (C, EC, GC) còn lại có hàm lượng thấp và khơng phải là

2.3.

thành phần đặc trưng của trà do cịn được tìm thấy trong cacao, nho, táo, hành…, với
mức độ phân bố r ộng hơn. Hàm lượng của các catechin trong lá trà luôn luôn thay đổi,
phụ thuộc vào giống trà, thời kỳ sinh trưởng, bộ phận cây trà, vị trí các lá trên búp trà và
các yếu tố khác về thổ nhưỡng, khí hậu, cách chăm bón…. Trong q trình phát triển của
lá trà, dưới tác dụng của các enzyme, các catechin bị chuyển dần thành các hợp chất
tannin và giảm dần hàm lượng trong lá trưởng thành.
Tác dụng sinh học của trà và của nhóm hợp chất catechin
2.3.1.
Tác dụng dược lý
Trà đã được sử d ụng như là một phương thuốc trong y học phương đông từ r ất lâu. Tuy
nhiên các hiểu biết về c ơ chế tác động của trà mới được bắt đầu nghiên cứu mạnh mẽ
trong thế kì 20. Trước đây, các tác dụng của trà được cho rằng là do tác động của thành
phần caffeine và vitamin C. Bắt đầu từ khoảng thập niên 70 của thế kỉ 20, việc nghiên
cứu chi tiết về trà đã chỉ ra rằng những tác dụng về m ặt dược lý
của trà là do sự có mặt rất nhiều của các nhóm hợp chất catechin trong trà. Nhiều cơng
trình đã công bố v ề tác dụng của trà và các chất trích ly từ trà lên nhiều bệnh khác nhau
như các bệnh ung thư, bệnh về đường tim mạch, bệnh tiểu đường, bệnh Alzheimer, bệnh
Parkison, bệnh béo phì, bệnh sỏi thận, bệnh về đường tiêu hóa, bệnh răng miệng…; ngồi
ra, trà cịn có tác dụng giảm hàm lượng cholesterol, làm giảm sự nhiễm độc do kim loại,
do phóng xạ….
Tác dụng ngăn chặn và chữa trị bệnh ung thư của trà và các hợp chất catechin được
nghiên cứu mạnh mẽ nhất. Khi tiến hành nghiên cứu in vivo, nhiều công trình cơng bố đã
cho thấy trà và các chất trích ly từ trà như EGCG, EGC, ECG ..của trà có khả năng tương
tác, ngăn chặn và hạn chế quá trình khơi mào, hình thành và phát triển của tế bào ung
thư. Trong giai đoạn khơi mào, các hợp chất catechin trung hồ các tác nhân bị kích hoạt
bởi cytochrome P450 enzyme, các tác nhân này có khả n ăng tương tác làm thay đổi cấu

trúc của ADN; ngăn chặn sự t ạo thành nitrosamine, một nhóm các hợp chất phát sinh từ
khói thuốc lá, các amine dị vịng trong thịt, cá nấu chín, các tác nhân được cho là có thể
gây ung thư. Các thử nghiệm in vivo cho thấy khả n ăng tương tác trực tiếp và tăng
cường hiệu quả c ủa EGCG, EC vào hệ thống bảo vệ bằng enzyme của tế bào, hạn chế sự
hình thành của các tác nhân gây biến đổi trong tế bào.
Trong giai đoạn bắt đầu của tế bào ung thư, EGCG có khả n ăng ức chế AP-1, một chất
dẫn truyền khơi mào cho sự phát triển của tế bào ung thư da; thể hiện khả năng ngăn
chặn protein kinase, enzyme kích hoạt tế bào trong giai đoạn phát triển của tế bào ung
thư, ức chế hoạt động của telomerase, làm giảm thời gian sống của tế bào ung thư.
Khi quá trình ung thư đã diễn ra, EGCG có thể can thiệp, ức chế hoạt động của
urokinase, enzyme đóng vai trị quan trọng trong quá trình phát triển và biến đổi của tế
bào ung thư, phá huỷ các dạng biến đổi đặc thù của tế bào gây ra do adevirus, hay ngăn
chặn quá trình tổng hợp ADN trong tế bào ung thư hepatoma, leukemia, và ung thư
phổi…


Các kết quả nghiên cứu in vivo, và các kết quả nghiên cứu trên động vật như chuột, thỏ
đều cho kết quả r ất tốt về khả n ăng ngăn chặn ung thư c ủa trà và các chất
catechin, tuy nhiên kết quả nghiên cứu trên người vẫn chưa cho thấy hiệu quả tương tự.
Một số cơng trình cơng bố catechin và trà có khả n ăng ngăn chặn ung thư ở người như
ung thư vòm họng, ung thư đường tiêu hóa, làm giảm khối u ung thư vú …tuy nhiên kết
quả c ũng mới mang tính cục bộ, chưa đạt được sự thống nhất cao.
2.3.2.
Hoạt tính chống oxy hóa
Có nhiều nghiên cứu đã khẳng định hoạt tính chống oxy hóa chính của trà là do hoạt tính
của các hợp chất polyphenol. Thật vậy trong một bài báo khoa học của Mai Tun, Vũ
Bích Lan và Ngơ Đại Quang nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol tách
chiết từ lá trà xanh để bảo quản hạt dầu cải đã đưa ra kết luận polyphenol chiết xuất từ lá
trà xanh thứ phẩm có tác dụng kháng oxy hóa rất rõ rệt và mạnh hơn nhiều so với acide
ascorbic và tocopherol. Tác dụng sinh học của các polyphenol trà hay của dịch chiết lá trà

xanh được giải thích là do chúng có tác dụng khử các gốc tự do, giống như tác dụng của
các chất antioxidant. Trong các polyphenol trà, những gốc có chức năng chống oxy hóa là
gốc ortho-3,4-dihydroxyl (catechol), hoặc các vị trí 3,4,5-trihydroxyl (gallate) của vịng
B, nhóm gallate ở vị trí C3 của vịng C, nhóm hydroxyl ở vị trí C5, C7 của vịng A.

Hình 2.3. Các nhóm có chức năng chống oxy hóa của các polyphenol
Cơ chế chống oxy hóa của trà thuộc cơ chế chống oxy hóa của các hợp chất phenol. Tính
chống oxy hóa của các ankylphenol thể hiện ở chỗ chúng có khả năng vơ hiệu hóa các


gốc peroxyt, do đó nó có thể cắt mạch oxy hóa. Sản phẩm đầu tiên xuất hiện là các gốc
phenol tạo thành do nguyên tử hydro của nhóm hydroxyl được nhường cho gốc peroxyt:

Hình 2.4. Cơ chế chống oxy hóa của polyphenol
Các gốc phenol rất ổn định, kém hoạt tính, nhờ vậy chúng khơng có khả năng sinh
mạch oxy hóa tiếp theo. Hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất ankylphenol được
tăng lên bằng cách hydroxyl hóa vào phân tử phenol, vì các hợp chất polyphenol có hoạt
tính tốt hơn monophenol.
Chúng có một số tính chất sau:
• Dạng khử của chúng có thể phản ứng với các gốc tự do, chuyển thành dạng oxy hóa:

Dạng hydroquinone
(Dạng khử)

Dạng quinon
(Dạng oxy hóa)

• Dạng oxy hóa của chúng có thể chuyển thành dạng lưỡng gốc và như vậy chúng có khả
năng phản ứng với hai gốc tự do nữa.

Đặc biệt dạng oxy hóa và dạng khử của chúng có thể tương tác với nhau thuận
nghịch tạo gốc Semiquinon:

Ngồi ra, các hợp chất catechin trong trà cịn có khả năng tạo phức kim loại chủ yếu là
Fe, Cu, đây là những chất xúc tác để tạo ra những gốc tự do. Tỉ lệ EGC, EGCG, ECG và
EC tạo phức với kim loại là 3:2, 2:1, 2:1, 3:1.
Cả 2 catechin và theaflavin có thể tạo phức với Fe (III). Theaflavin có thể tạo phức với Fe
(III) để tạo thành dạng phức, sau đó bị oxy hóa thành o-quinon và được chuyển đổi thành
dehdro theaflavin, theanaph thoquinon và polymer.
2.3.3.

Hoạt tính kháng khuẩn

Tháng 8/1996 giáo sư T. Shimaura công tác tại trường Đại học y khoa Showa (Nhật Bản)
đã có cơng trình diễn thuyết “về tác động diệt khuẩn E-coli-157” tại hội thảo chuyên đề
diệt khuẩn của trà xanh. Ông đã khẳng định rằng catechin trong trà xanh có khả năng
tiêu diệt các loại vi khuẩn làm hư hỏng thực phẩm và loại bỏ các độc tố do chúng gây ra.
Các thí nghiệm của ơng cho thấy trà xanh có thể diệt 100.000 khuẩn E. Coli trong vòng
5h. Cơ chế hoạt động của các catechin là phá hủy màng tế bào bên ngồi của vi khuẩn.
EGCG và ECG là catechin có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất. Catechin là polyphenol
có thể gây ra hiện tượng ngưng kết bằng cách tạo liên kết trực tiếp với protein. Đây là
tính chất đặc trưng của catechin chịu trách nhiệm cho hoạt tính kháng khuẩn.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng ra rằng thành phần của thành tế bào là yếu tố quyết
định đến khả năng kháng EGCG của vi khuẩn. Peptidogly trong thành tế bào vi khuẩn có
khảnăng ngăn chặn các hoạt động diệt khuẩn của EGCG. Peptidoglycan là một phức liên
kết ngang của polysaccharide và peptide. Thành tế bào của vi khuẩn gồm có 30-50 lớp
peptidoglycan bảo vệ vi khuẩn trước áp suất thẩm thấu. EGCG có thể trực tiếp liên kết

với peptidoglycan và làm tế bào bị đông tụ ngăn cản hoạt động sinh tổng hợp của vi
khuẩn. Catechin của trà có khả năng ức chế các enzym có nguồn gốc từ vi khuẩn.
Để ức chế hoạt động của enzyme EGCG liên kết trực tiếp với các phân tử sinh học
và gây ra hiện tượng ngưng kết làm mất hoạt tính của enzym.
II.

THỰC NGHIỆM

Sử dụng hệ thống SRD – 3600, tách nhanh bằng cột hóa tan LC của hãng Dionex
UltiMate® 3000 với 6 kênh khử khí ( P / N 5035,9230 ) và tổ chức rửa giải, bao gồm cả
điều chỉnh áp lực và chai thủy tinh 2L cho mỗi bơm (dung mơi rửa giải hấp thụ được duy
trì dưới khoảng trống heli hoặc nitơ từ 5 - 8 psi )
Bơm DGP 3600RS ( P / N 5040,0066 )
Tấm ngăn mẫu WPS - 3000TRS ( P / N 5840,0020 )
Mẫu lặp , 25 μl ( P / N 6820,2415 )
Cột ngăn điều nhiệt TCC - 3000RS ( P / N 5730,0000 )
Đầu dò huỳnh quang DAD - 3000RS ( P / N 5082,9920 )
Dòng di động Semi - Micro cho DAD - 3000 và MWD - 3000, SST, thể tích 2,5 μl , chiều
dài đường dẫn là 7 mm ( P / N 6080,0300 )
III.

TRANG THIẾT BỊ

Cột sắc ký Acclaim 120 C18, 2.2 mm, 2.1 × 150 mm (P / N 059.130)
Máy ly tâm được trang bị với 10 vị trí, rotor nhơmcố định góc (Beckman Spinchron R,
GS-6R Series, Beckman Coulter P / N 358.702 hoặc tương đương)
Hệ thống vặn tay phù hợp Viper ™ , SST Flex. -Cap., ID × L, 0,13 × 250 mm (P / N
6040,2325)
Viper fingertight hệ thống phù hợp, SST Flex. -Cap., ID × L, 0,13 × 350 mm (P / N
6040,2335)

Viper fingertight hệ thống phù hợp, SST Flex. -Cap., ID × L, 0,18 × 450 mm (P / N
6040,2365)
máy trộn tĩnh, pha trộn thể tích: 350 μl (P / N 6040,0040)
Bình tiêm thủy tinh với nắp và vách ngăn, 1,5 ml (P / N 055.427)


Bình vết Borosilicate thủy tinh và van đóng kín kèm theo, 20 ml (VWR P / N 66.022129)
IV.

HÓA CHẤT VÀ CÁC TIÊU CHUẨN

Thuốc thử nước cấp, loại I, kháng hoặc hơn 18 MΩ-cm, được lọc ngay lập tức qua một
bộ lọc 0,2 micron trước khi sử dụng (gọi đây là nước ion hóa [DI])
Acetonitrile, phân lớp HPLC (Honeywell P / N AH015-4)
Axit trifluoroacetic (TFA), 98% nguyên chất (Pierce P / N 208.901)
Epigallocatechin (Chromadex P / N ASB-00.005.145-010)
Epicatechin gallate (Chromadex P / N ASB-00.005.135-010)
Catechin (Chromadex P / N ASB-00.003.310-010)
Epicatechin (Chromadex P / N ASB-00.005.125-010)
Epigallocatechin gallate (Chromadex P / N ASB-00.005.150-010)
Gallocatechin (Sigma P / N G6657)
Gallocatechin gallate (Sigma P / N G6782)
MẪU
NIST SRM 3255: Camellia sinensis chiết xuất được sử dụng làm mẫu đối chứng
NIST SRM 3256: Viên nén có chứa trà xanh
Trà trắng
Trà trắng pha trộn với trà xanh
Trà xanh thương hiệu A
Trà xanh thương hiệu B
Trà đen

ĐIỀU KIỆN
V.

•
•
•
•
•
•
•
VI.

Cột: Acclaim 120 C18, 2.2 μm (2.1 × 150 mm)
Tốc độ dịng: 0.450 mL/min
Thể tích tiêm: 1.0 μl
Nhiệt độ khay: 4
Phát hiện: Hấp thụ, tia cực tím, 280 nm
Nhiệt độ cột: 25


Dung môi: A: 0,1% TFA, 5% acetonitrile
B: 0,1% TFA trong acetonitrile
Hệ thống
Áp lực ngược: ~6025–6200 psi trong khoảng gradient
Điều kiện Gradient: Thời gian (phút)

VII.

A%

B%

0.0

100.0

0.0

1.2

100.0

0.0

15.5

71.5

28.5

17.0

71.5

28.5

17.0

100.0

0.0

25.0

100.0

0.0

CHUẨN BỊ DUNG DỊCH VÀ HÓA CHẤT

Trifluoroacetic Acid (0.1%) trong Acetonitrile (5%)
Cho 100 ml acetonitril vào bình định mức có thể tích 2 lit, đã chứa khoảng 1700 ml nước
DI. Thêm 2 ml TFA vào bình định mức. Định mức đến vạch bằng nước DI và đảo ngược
bình nhiều lần để trộn đều.
Trifluoroacetic Acid (0.1%) trong Acetonitrile
Cho 900 ml acetonitril vào bình định mức có thể tmuc71it lit, sau đó thêm 1 ml TFA vào
bình. Định mức đến vạch bằng acetonitrile và đảo ngược bình nhiều lần để trộn đều.
Formic Acid (0.05%) trong 70% Methanol (dung môi chiết)


Chuyển 700 ml methanol vào bình định mức 1 lít và thêm 500 ml axit formic. Định mức
đến vạch bằng nước DI và đảo ngược nhiều lần để trộn.
Nồng độ chuẩn (1 mg / mL)
Nồng độ chuẩn Catechin của EGC, ECG, catechin, EC, EGCG, GC, và GCG được chuẩn
bị bằng cách cân chính xác 1 - 2 mg chất rắn và thêm 1-2 ml 0,05% axit formic trong
70% acetonitrile để làm thành dung dịch chuẩn có chứa 1,0 mg / ml cho từng catechin.
Các dung dịch đã được chuẩn bị trong lọ thủy tinh 1,5 ml, trộn và bảo quản ở -40 ° C cho
đến khi cần. Tất cả các nồng độ chuẩn có thể được lưu trữ cho đến sáu tháng ở -40 ° C
khi được bảo vệ trong ánh sáng.
Tiêu chuẩn làm việc và Tiêu chuẩn đối với phương pháp tuyến tính

Để chuẩn bị các tiêu chuẩn làm việc, sử dụng pipet hiệu chuẩn để cung cấp khối lượng
thích hợp của 1 mg / ml dung dịch chuẩn vào một lọ thủy tinh chứa axit formic 0,05%
trong acetonitrile 70%. Để chuẩn bị các tiêu chuẩn hỗn hợp catechin, kết hợp thích hợp
khối lượng của các dung dịch chuẩn riêng biệt của từng catechin trong mộtlọ thủy tinh
có chứa khối lượng axit formic 0,05% trong methanol 70%. Dung dịch chuẩn trung gian
có thể ổn định trong 3 tháng ở -40 ° C và khi thực hiện thí nghiệm thì hỗn hợp chuẩn có
thể ổn định trong 4 tuần ở 2-4 ° C.

VIII.

CHUẨN BỊ MẪU

Hai SRMs sử dụng trong tài liệu này: mẫu đối chứng (SRM 3255) và mẫu (SRM 3256) cung cấp bởi NIST, như một phần của nghiên cứu hợp tác. Tất cả các mẫu trà thương
mại được mua tại địa phương.
1. Mẫu đối chứng NIST

Chuẩn bị mẫu đối chứng NIST bằng cách cân 20 mg rắn, sau đó thêm 7 mL dung mơi
chiết. Trộn hỗn hợp, nghiền bằng sóng âm trong 90 phút, và ly tâm ở 5000 RPM trong 10
phút. Thu thập các lớp trong một lọ thủy tinh và thêm vào 7 mL dung môi làm thành giọt.
Trộn hỗn hợp, nghiền bằng sóng âm trong 90 phút, và ly tâm ở 5000 RPM cho 10 phút ở
4 ºC. Thêm vào bề mặt 7 mL để tạo ra tổng thể tích 14 mL. Lọc các mẫu: sử dụng 0.2


cellulose acetate lọc ống tiêm vơ trùng, và pha lỗng với tỉ lệ 1: 5 trong chiết xuất dung
môi trước khi phân tích.
2. Mẫu Trà thương mại và NIST SRM 3256

Chuẩn bị tất cả các mẫu bằng cách cân 60 mg rắn và thêm 7 mL dung môi chiết. Trộn hỗn
hợp, nghiền bằng sóng âm trong 90 phút, và ly tâm ở 5000 RPM trong 10 phút. Thu thập
phần nổi bề mặt trong một lọ thủy tinh và tiếp tục thêm vào 7 mL dung môi làm thành

giọt. Trộn hỗn hợp, nghiền bằng sóng âm trong 90 phút, và ly tâm ở 5000 RPM trong 10
phút. Thêm vào bề mặt 7 mL để tạo ra tổng thể tích 14 mL. Lọc các mẫu: sử dụng 0.2 m
cellulose acetate lọc ống tiêm vơ trùng và pha lỗng với tỉ lệ 1: 5 hoặc 1:20 trong dung
mơi chiết trước khi phân tích, tùy thuộc vào loại mẫu.
IX.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Tiêu chuẩn tách Catechin

Các điều tra ban đầu cho việc tách catechin sử dụng cột RSLC Acclaim 120 C18 2.2 μm,
định dạng 2.1 × 150 mm. Định dạng cột này đã được lựa chọn để tăng lưu lượng mẫu đưa
vào và giảm mẫu và lượng dung môi tiêu hao. Định dạng cột ngắn hơn cũng được đánh
giá, nhưng định dạng 2.1 × 150 mm đã được chọn bởi vì cột này có độ phân giải tốt nhất
các hợp chất của mẫu.


Hình 2 cho thấy biểu đồ sắc ký của một hỗn hợp chứa catechin chiếm ưu thế trong trà.
Ngoài ra, acid gallic tự do và lượng caffeine vừa phải luôn hiện diện tự nhiên trong trà;
và do đó đã bao gồm trong hỗn hợp chuẩn. Thời gian lưu của acid gallic, GC, EGC,
caffeine, catechin, EC, EGCG, GCG, và ECG tương ứng là 2.15, 4.60, 7.00, 7.25, 7.40,
8.70, 8.90, 9.30, và 10,7 phút. Tất cả các catechins được phân tích tốt và tổng thời gian
phân tích ít hơn 20 phút.
2. Phân tích mẫu sơ bộ

Trước khi phân tích các mẫu trà thương mại, mẫu và mẫu đối chứng NIST được đánh giá
sơ bộ catechin của chúng bằng cách sử dụng phương pháp mô tả sau đây. Mẫu và mẫu
đối chứng đã được chuẩn bị như mô tả trong phần Chuẩn bị mẫu. Các sắc ký chứng


minh rằng tất cả các peak đã được xác định, phương pháp này có thể được sử dụng để

nghiên cứu các tiêu chuẩn thích hợp khác.
3. Tiêu chuẩn phù hợp

Độ tuyến tính, LOD và LOQ được đánh giá để xác định sự phù hợp của các phương pháp
phân tích này. Để xác định phạm vi hiệu chuẩn thích hợp cho các hợp chất, mỗi mẫu
được phân tích và so sánh với một tiêu chuẩn catechin hỗn hợp. EGCG, catechin, GCG,
GC, EGC, ECG và EC trưng bày một đỉnh cao tuyến tính phản ứng khu vực trong phạm
vi tóm tắt trong Bảng 1.

Các LOD cho catechins được xác định dựa vào nồng độ của chất phân tích cung cấp một
chiều cao đỉnh của 3× (S / N = 3). các LOQ đã xác định được nồng độ chất phân tích
cung cấp một chiều cao đỉnh của 10× (S / N = 10). Các LOD dao động từ 0.20 g/mL đối
với EC đến 1.17 g/mL đối với GC, và LOQ dao động từ 0.59 g/mL đối với EC,


3.56g/mL đối với GC. Thời gian lưu độ chính xác của các tiêu chuẩn xuất sắc, với RSD
dao động từ 0.02% đối với ECG đến 0.18% đối với EGC. Điều này chứng minh độ chính
xác của nồng độ phân phối bởi các bơm DPG 3600RS. Diện tích peak có độ chính xác
dao động từ 1.00% đối với EGCG đến 1.51% đối với EC. Đỉnh cao độ chính xác dao
động từ 0.25% đối với EGC đến 1.70% đối với GC trên 30 chu trình.
4. Phân tích mẫu

Nồng độ Catechin được xác định trong mẫu đối chứng NIST và mẫu trước khi phân tích
các loại trà thương mại. Các mẫu và mẫu đối chứng đã được chuẩn bị như mô tả trong
phần Chuẩn bị mẫu. Bảng 2 tóm tắt các nồng độ catechin trong NIST và mẫu với một so
sánh với các giá trị được chứng nhận.


Nồng độ cho tất cả các catechins trong việc đối chứng là phù hợp với các giá trị của NIST
chứng nhận. EGCG là catechin có nồng độ cao nhất tới 60% tổng lượng catechin dựa trên

việc xác định trình bày ở đây, và 58% dựa trên giá trị chứng nhận của NIST.
Tổng hàm lượng catechin tính tốn bằng cách sử dụng phương pháp mô tả ở đây được
xác định là 709.6 mg/g, so với giá trị chứng nhận NIST là 716.8 ± 27 mg/g. So sánh kết
quả với các giá trị xác nhận của NIST rằng phương pháp này là chính xác để xác định
catechin.
Một mẫu tham khảo NIST cũng đã được đánh giá bằng phương pháp này. Các thí nghiệm
riêng biệt xác định nồng độ catechin trong các mẫu NIST dao động từ 2.46 mg/g đối với
catechin đến 80.8 mg/g đối với EGCG, so với giá trị chứng nhận là 2.60 mg/g đối với
catechin đến 71.7 mg/g đối với EGCG. Tổng hàm lượng catechin là 154.5 mg/g, so với
giá trị chứng nhận là 145.7 mg/g, mà là trong vòng 6% giá trị chứng nhận.
Một số thương hiệu khác nhau của các loại trà được đánh giá về lượng catechin của
chúng. Các mẫu điều tra trong nghiên cứu này bao gồm hai loại khác nhau của trà xanh,
bạch trà, một sự pha trộn của bạch trà với trà xanh và trà đen. Bạch trà ít được chế biến,
vì vậy nó được dự đốn có lượng catechin rất cao. Hình 3 cho thấy sự tách biệt của
catechins trong bạch trà. Nồng độ dao động từ 2.73 mg/g đối với EC đến 42.6 mg/g đối
với EGCG.Tổng hàm lượng catechin trong mẫu này là 98.5 mg/g.


Hình 4 cho thấy sự khác biệt của catechin có trong hai loại trà xanh thương mại. Nồng độ
catechin dao động từ 3.45 mg/g đối với catechin đến 64.0 mg/g cho EGCG trong thương
hiệu trà xanh A. Trong thương hiệu B, nồng độ catechin dao động từ 3.57 mg/g đối với
catechin đến 60.6 mg/g đối với EGCG. Những lợi ích sức khỏe từ việc tiêu thụ trà xanh
là do nồng độ của catechin cao, chiếm khoảng 30% trọng lượng khô của lá trà xanh.


Như thể hiện trong hình 4, catechin có nhiều nhất là EGCG, nó chiếm khoảng 50% tổng
hàm lượng các catechin. Một tách trà xanh có chứa 100-200 mg EGCG. Hàm lượng từng
catechin được xác định là tương tự cho cả hai thương hiệu trà xanh, với ngoại lệ là ECG.
Nhãn hiệu trà xanh A có 9.81 mg/g và thương hiệu B có 12.8 mg/g ECG. Tổng hàm
lượng catechin được xác định là tương tự cho cả hai mẫu trà xanh với tổng nồng độ xác

định tương ứng là 135.3 mg/g và 133.1 mg/g cho nhãn hiệu A và B,. Các dữ liệu cho thấy