Xác định sự sai khác di truyền của dê nản đinh hóa với một số giống dê khác bằng phương pháp mã vạch dna

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN PHƢƠNG NAM
Tên đề tài:
XÁC ĐỊNH SỰ SAI KHÁC DI TRUYỀN GIỮA DÊ NẢN ĐỊNH HÓA VỚI
MỘT SỐ GIỐNG DÊ KHÁC BẰNG PHƢƠNG PHÁP MÃ VẠCH DNA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính Quy

Chun ngành

: Cơng nghệ Sinh học

Khoa

: CNSH-CNTP

Khóa học

: 2013 - 2017

Thái Nguyên, năm 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN PHƢƠNG NAM
Tên đề tài:
XÁC ĐỊNH SỰ SAI KHÁC DI TRUYỀN GIỮA DÊ NẢN ĐỊNH HÓA VỚI
MỘT SỐ GIỐNG DÊ KHÁC BẰNG PHƢƠNG PHÁP MÃ VẠCH DNA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính Quy

Chun ngành

: Cơng nghệ Sinh học

Lớp

: 45-CNSH

Khoa

: CNSH-CNTP

Khóa học

: 2013 - 2017

Ngƣời hƣớng dẫn

: 1. TS. Dƣơng Văn Cƣờng
2. ThS. Ma Thị Trang

Thái Nguyên, năm 2017


i

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hồn thành đƣợc tốt khóa luận tốt
nghiệp này ngồi sự nỗ lực cá nhân, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, giúp đỡ, chỉ
bảo động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình. Nhân dịp hồn thành luận văn
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc nhất tới thầy giáo: TS. Dƣơng Văn Cƣờng,
Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trƣờng Đại học Nông Lâm
Thái Nguyên, ThS. Ma Thị Trang và cán bộ tại Bộ môn Sinh học Phân tử và Công
nghệ Gene – Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên đã ln tận tình chỉ
bảo, trực tiếp hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suất thời gian thực hiện đề tài cũng
nhƣ trong q trình hồn chỉnh luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học Sự Sống – Đại học
Thái Nguyên, các thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực
phẩm, Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, các cán bộ, anh chị làm việc tại Bộ
môn Sinh học Phân Tử và công nghệ Gene - Viện Khoa học Sự Sống – Đại học
Thái Nguyên đã giúp đỡ tạo điều kiện để tôi học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, động
viên, chia sẻ giúp đỡ để tôi vƣợt qua mọi khó khan trong q trình học tập và hoàn
thành luộn văn.
Xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày tháng 6 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Phƣơng Nam


ii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Các mẫu dê Nản nghiên cứu .....................................................................18
Bảng 3.2. Trình tự mồi cho phản ứng PCR...............................................................19
Bảng 3.3. Danh mục các thiết bị đƣợc sử dụng ........................................................19
Bảng 3.4. Danh mục các loại hóa chất đƣợc sử dụng ...............................................20
Bảng 3.5. Thành phần phản ứng PCR .......................................................................22
Bảng 4.1: Kết quả đo độ tinh sạch DNA ...................................................................25
Bảng 4.2. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của chỉ thị COI của 10 mẫu dê
Nản và 2 mẫu trên NCBI ...........................................................................................31


iii

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Dê Nản ở xã Kim Phƣợng huyện Định Hóa ...............................................5
Hình 4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số dê Nản ...................................................24
Hình 4.2. Kết quả PCR chỉ thị COI của các mẫu dê Nản .........................................25
Hình 4.3: Kết quả giải trình tự chỉ thị COI các mẫu Dê Nản theo giá trị QV ..........27
Hình 4.4. Kết quả kiểm tra sự sai khác giữa các lần lặp lại của thí nghiệm .............28
Hình 4.5: Kết quả BLAST chỉ thị COI của mẫu D42 với chỉ thị COI của Capra
aegagrus hircus đã cơng bố trên NCBI .....................................................................29
Hình 4.6: So sánh vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của 10 mẫu
nghiên cứu với 3 chỉ thị COI trên NCBI ...................................................................30
Bảng 4.3. Hệ số tƣơng đồng khi phân tích trình tự gene COI của các mẫu dê Nản
với trình tự trên ngân hàng mã vạch DNA (BOLD) .................................................32

Hình 4.7: Cây phân loại dựa trên trình tự chỉ thị COI của dê Nản và 3 mẫu dê trên
thế giới .......................................................................................................................33


iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ, thuật ngữ viết tắt
BLAST

Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ
Basic Local Alignment Search Tool

Bp

Base pair – cặp bazơ nitơ

COI

Cytochrome C oxidase Subutnit I

DNA

Deoxyribonucleic Acid

dNTP

Deoxyribonucleotide Triphosphate

dATP

DeoxyAdenine Triphosphate

dCTP

DeoxyCytosine Triphosphate

dGTP

DeoxyGuanine Triphosphate

dTTP

DeoxyThymine Triphosphate

ddNTP

Dideoxynucleotide Triphosphate

ddATP

DideoxyAdenine Triphosphate

ddCTP

DideoxyCytosine Triphosphate

ddGTP

DideoxyGuanine Triphosphate

ddTTP

DideoxyThymine Triphosphate

EDTA

Etilendiamin tetraaxetic acit

Kb

Kilo base – Kilo bazo nito

NCBI

Nation Cetrer for Biotechnology Information (trung
tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ sinh học)

PCR

Polymerase Chain Recation

QV

Quality value


v

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. ii
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... iv
PHẦN : 1MỞ ĐẦU .....................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
1.2. Mục tiêu của đề tài ...............................................................................................2
1.2.1. Mục tiêu tổng quát ............................................................................................2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể ..................................................................................................2
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn..............................................................................2
1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ..............................................................................2
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài ...............................................................................3
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU .............................................4
2.1. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu ....................................................................4
2.1.1. Nguồn gốc của Dê .............................................................................................4
2.1.2. Vị trí phân loại của Dê ......................................................................................4
2.2. Cơ sở khoa học của đề tài ....................................................................................6
2.2.1. Giới thiệu về công nghệ mã vạch DNA ............................................................6
2.2.2. Mã vạch DNA sử dụng trong xác định loài ở động vật và thực vật .................7
2.2.2.1. Mã vạch DNA ở thực vật ...............................................................................7
2.2.2.2. Mã vạch DNA ở động vật ..............................................................................9
2.3. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số ................................................................10
2.4. Phƣơng pháp điện di DNA trong gel agarose ....................................................11
2.5. Kỹ thuật PCR .....................................................................................................12
2.6. Phƣơng pháp xác định trình tự các nucleotide ...................................................12
2.7. Tình hình nghiên cứu DNA mã vạch gene trong và ngồi nƣớc .......................13
2.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới ...................................................................13
2.7.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ....................................................................16

vi

PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........18
3.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ......................................................................18
3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu......................................................................................18
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu .........................................................................................18
3.2. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu ..............................................................................19
3.2.1 Thiết bị .............................................................................................................19
3.2.2. Hóa chất ..........................................................................................................20
3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................................20
3.4. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................20
3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................................21
3.5.1. Lấy mẫu mô tai................................................................................................21
3.5.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số .............................................................21
3.5.3. Phƣơng pháp PCR ...........................................................................................22
3.5.4. Phƣơng pháp xác định trình tự các nucleotide ................................................23
3.5.5. Phân tích dữ liệu ..............................................................................................23
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................24
4.1. Kết quả tách DNA tổng số .................................................................................24
4.2 Kết quả PCR khuếch đại chỉ thị COI của các mẫu .............................................25
4.3. Kết quả phân tích các chỉ thị DNA bacoding.....................................................26
4.3.1. Kết quả phân tích chất lƣợng giải trình tự ......................................................26
4.3.2. Kết quả phân tích chỉ thị COI .........................................................................28
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................34
5.1. Kết luận ..............................................................................................................34
5.2. Đề nghị ...............................................................................................................34
I.Tài liệu tham khảo tiếng việt ..................................................................................35
II. Tài liệu tham khảo tiếng anh ................................................................................35
III. Tài liệu từ internet ...............................................................................................37

1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ở Việt Nam hiện nay chăn nuôi đang là một trong những ngành rất quan
trọng, chiếm tỷ trọng khá cao trong nền kinh tế. Trong những năm qua, bên cạnh
việc phát triển chăn nuôi trâu, bò Nhà nƣớc cũng rất quan tâm đến phát triển chăn
ni dê. Vì thế ngành chăn ni dê của nƣớc ta ngày càng phát triển, do cần ít vốn,
quay vịng nhanh, tận dụng đƣợc lao động và thích hợp với vùng miền núi nơi điều
kiện kinh tế ngƣời dân còn khó khăn. Chăn ni dê cung cấp nhiều loại sản phẩm
phục vụ đời sống con ngƣời nhƣ: thịt, sữa, lông, da, sừng, móng và cung cấp một
nguồn phân bón khá lớn phục vụ cho sản xuất nông nghiệp. Sữa dê cung cấp một
nguồn protein rất quan trọng cho con ngƣời, đặc biệt sữa dê rất hiếm khi nhiễm
khuẩn lao nhƣ sữa bò [6].
Theo Tổng cục Thống kê, số đầu dê năm 2015 của tồn vùng trung du và
miền núi phía Bắc đạt trên 898.295 con, chiếm 51,6% tổng đàn dê của cả nƣớc.
Trong đó chiếm phần lớn là các loại dê có nguồn gốc từ Ấn Độ (Barbari,
Jamunapari, Beetal), từ Pháp, Mỹ, Úc (Saanen, Alpine, Boer) [24]. Các loại dê này
có khối lƣợng sữa và trọng lƣợng cơ thể lớn hơn một số giống dê bản địa nên đƣợc
nuôi dƣỡng và cho lai với các giống dê bản địa ở nƣớc ta. Điều này dẫn đến số
lƣợng dê bản địa đang dần bị giảm đi, bị lai tạp với các giống dê khác làm mất đi
một số nguồn gene quý, trong đó dê Nản Định Hóa là một ví dụ.
Định Hóa là huyện miền núi phía Tây Bắc của tỉnh Thái Nguyên với địa hình
chiếm phần lớn là đồi núi các dãy núi đá vôi hiểm trở, rất phù hợp với việc chăn thả
dê, đặc biệt là với dê cỏ. Chính vì thế ở huyện Định Hóa hay nói chính xác hơn là
khu vực quanh dãy núi Nản ở đây ngƣời dân đã có truyền thống lâu đời về chăn
ni dê, nên ở đây đã hình thành giống dê Nản mang thƣơng hiệu riêng của khu
vực. Dê Nản chất lƣợng thịt tốt thơm ngon, tỷ lệ nạc cao, chịu đựng mức dinh

dƣỡng thấp hơn các loại dê khác có khả năng sinh trƣởng và phát triển nhanh, đặc
biệt dê Nản có khả năng sinh trƣởng khá tốt trong điều kiện thời tiết bất lợi, vì nó đã
thích nghi với điều kiện tự nhiên sẵn có của huyện Định Hóa. Giá thành của thịt dê


2

Nản khá cao, nhƣng hiện nay số lƣợng dê Nản thuần cịn lại rất ít do đó khơng đủ
đáp ứng nhu cầu của thị trƣờng. Theo số lƣợng thống kê của sở Nông nghiệp &
PTNT tỉnh Thái Nguyên, thời điểm tháng 10 năm 2015 đàn dê ni ở huyện Định
Hóa có 18.404 con, trong đó chủ yếu là dê lai, đàn dê Nản hiện cịn rất ít (Ƣớc chỉ
cịn khoảng 2.000 con). Vì số lƣợng Dê nản cịn ít nên rất dễ bị lai tạp với các loại
dê khác, gây mất đi nguồn gene quý nên cần có các biện pháp phân biệt để bảo tồn.
Các phƣơng pháp phân loại học tuyền thống về hình thái, sinh lý, hóa sinh có
ƣu điểm là nhanh chóng và đơn giản song lại phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm
của các điều tra viên nên thiếu tính chính xác dẫn đến có nhiều sự nhầm lẫn. Với sự
tiến bộ của kĩ thuật di truyền, phƣơng pháp mã vạch DNA đã trở thành một cụ hỗ
trợ cho các phƣơng pháp truyền thống để đƣa ra các kết quả cuối cùng một cách
chính xác nhất. Hiện nay, vùng gene COI nằm trong ti thể đƣợc coi là vùng gene
chuẩn trong xây dựng mã vạch DNA để nhận dạng lồi động vật và đƣợc cơng nhận
bởi tổ chức mã vạch quốc tế [25]
Xuất phát từ những lý do trên tôi lựa chọn đề tài “Xác định sự sai khác di
truyền của dê Nản Đinh Hóa với một số giống dê khác bằng phương pháp mã
vạch DNA”.
1.2. Mục tiêu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu tổng quát
Xác định sự sai khác di truyền của dê Nản Đinh Hóa với một số giống dê
khác bằng mã vạch DNA.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
- Khuếch đại và giải trình tự chỉ thị COI (Cytochrome C oxidase Subutnit I)

- Xác định sự sai khác di truyền giữa dê Nản Định Hóa và một số giống
dê khác.
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Kết quả của đề tài bổ sung dữ liệu cho nguồn gene dê và mở ra triển vọng
ứng dụng công nghệ sinh học trong phân loại và định danh loài.


3

1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Là cơ sở khoa học để góp phần bảo tồn nguồn gene dê Nản Định Hóa
khơng bị lai tạp gây mất đi nguồn gene quý.
- Nghiên cứu bảo tồn và phát triển dê Nản giúp xây dựng thƣơng hiệu đặc
sản địa phƣơng góp phần xóa đói giảm nghèo cho các hộ chăn nuôi miền núi và
thúc đẩy phát triển kinh tế của địa phƣơng cũng nhƣ trong khu vực.


4

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU
2.1. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Nguồn gốc của Dê
Nhiều nhà khoa học ở các nƣớc khác nhau đã nghiên cứu về nguồn gốc của
dê nhà, tuy còn nhiều ý kiến khác nhau nhƣng đại đa số các nhà khoa học cho rằng
dê là một trong những loại vật nuôi đƣợc thuần hóa sớm nhất.
Ngƣời ta cho rằng dê nhà ngày nay (Capra hircus) có nhiều nguồn gốc khác
nhau. Tổ tiên trực tiếp của dê nhà gồm 2 nhóm dê rừng chính:
+ Dê rừng Bezoar (Capra aegagrus) đƣợc tìm thấy ở Iran và các nƣớc vùng

tiểu Á, là tổ liên của phần lớn dê nhà đang đƣợc nuôi ở châu Á và châu Âu. Nó
đƣợc coi là nhóm tổ tiên thứ nhất của dê nhà. Dê thuộc nhóm này có sừng thẳng
nhƣng xoắn vặn.
+ Dê rừng Markhor (Capra Falconeri), nhóm này có sừng cong vặn về phía
sau và đƣợc coi là nhóm tổ tiên thứ 2 của dê nhà, còn thấy ở vùng núi Hymalaya và
đang đƣợc nuôi nhiều ở hai bên sƣờn phía Đơng là Tây của dãy núi này. Nhóm
Markhor phân bố ở Afghanistan và vùng Kashimir – Karakorum.
Hiện nay, ngƣời ta thấy rằng khu vực nuôi dê lâu đời nhất là các nƣớc Trung
Đơng, sau đó đến Ấn Độ và Ai Cập, tiếp đến là các nƣớc châu Âu, châu Á và châu
Phi. Khu vực nuôi dê mới nhất là Đơng Nam Á [6].
2.1.2. Vị trí phân loại của Dê
Về phân loại động vật học, dê thuộc giới động vật (Animalia), ngành động
vật có dây sống (Chordata), phân ngành động vật có xƣơng sống (Vertebrata), lớp
động vật có vú (Mammalia), bộ guốc chẵn (Artiodactyla), họ trâu bò (bovidae), họ
phụ dê cừu (capra rovanae), thuộc loài dê (Capra) [6].
2.1.3. Giới thiệu về dê Nản
 Đặc điểm ngoại hình:


5

Theo khảo sát ban đầu dê Nản có thân hình thấp nhỏ so với các giống dê ngoại
nhập. Khối lƣợng cơ thể sơ sinh khoảng 1,7-1,9 kg. Dê Nản trƣởng thành chỉ đạt từ
25 -30 kg/con. Tính trung bình thì dê đực nặng khoảng 25 kg, và dê cái nặng
khoảng 20 kg. Dê Nản có đầu to, đơi tai nhỏ, ngắn và dựng đứng lên, cặp sừng cũng
ngắn, sắc lông màu trắng hoặc đen, có con khoang trắng đen hoặc màu cánh gián,
cổ ngắn có bờm và có râu cằm. Hình 2.1 là hình ảnh của dê Nản đƣợc chụp tại xã
Kim Phƣợng huyện Định Hóa.

Hình 2.1. Dê Nản ở xã Kim Phượng huyện Định Hóa

 Chế độ ăn uống:
Qua quan sát ban đầu Dê Nản ăn nhiều loại cỏ, lá và cành non của nhiều loại
cây đặc biệt là cây họ đậu, các loại củ quả và hạt ngũ cốc, các phụ phẩm nông
nghiệp. Ngƣời ta nuôi dê Nản theo phƣơng thức chăn thả trên núi vào ban ngày,
nhốt vào chuồng từ chiều tối. Mỗi ngày cho mỗi con dê ăn thêm khi đã về chuồng 1
– 2 kg cỏ non và lá cây họ đậu, 200 - 300g thức ăn tổng hợp (cám gạo, bột ngô, bột
săn, bột đậu tƣợng trộn với một chút muối). Đối với dê cái đang chửa thì tăng 1,5
lần, dê cái đang ni con thì tăng gấp 2 - 3 lần lƣợng thức ăn thêm đó. Mỗi con dê


6

đực giống mỗi ngày cho ăn khoảng 3,5 - 4,0 kg lá cỏ tƣơi, 1 - 1,5 kg lá ngô hoặc lá
đậu hoặc lá những cây họ đậu khác giàu chất đạm và 0,3 - 0,4 kg thức ăn tinh.
 Tập tính sinh sản:
Dê Nản thành thục sớm, tuổi phối giống lần đầu 6-7 tháng, đẻ 1,4 lứa/năm và
1,3 con/lứa, khoảng 2 năm đẻ 3 lứa, mỗi lứa 1-2 con. Dê cái mang thai trung bình từ
145 - 155 ngày là đẻ. Dê con lúc mới đẻ đến khi cai sữa mất khoảng 3 tháng. Dê cái
non phải đạt 7 tháng tuổi và có trọng lƣợng xấp xỉ 24 kg mới cho phối giống lần đầu.
2.2. Cơ sở khoa học của đề tài
2.2.1. Giới thiệu về công nghệ mã vạch DNA
Phân loại sinh vật thƣờng dựa trên các khóa phân loại về chỉ tiêu về hình
thái, sinh lý, hóa sinh. Tuy nhiên trong nhiều trƣờng hợp, mẫu vật chƣa phát triển
đầy đủ các đặc tính hình thái, hoặc chúng bị hƣ hỏng các bộ phận ngoài, hoặc mẫu
vật chết đã khiến q trình nhận diện mẫu vật trở nên khó khăn thậm chí là khơng
thể. Vì vậy cần có những phƣơng pháp bổ sung để nhận diện nhanh chóng, chính
xác hơn.
Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử,
một phƣơng pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành và
đƣợc gọi là phƣơng pháp phân loại học phân tử. Phƣơng pháp này dựa trên các

dữ liệu thông tin về hệ gene (DNA) trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của
chúng (protein). Tùy mục đích hoặc đối tƣợng nghiên cứu, ngƣời ta có thể lựa
chọn các gene (đoạn DNA) khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gene.
Năm 2003, Paul Hebert - nhà nghiên cứu đại học Guelph, Canada là ngƣời
sáng lập ra phƣơng pháp mã vạch DNA – đây là một phƣơng pháp dùng để nhận
diện các lồi. Mã vạch sử dụng trình tự nucleotide ngắn lấy từ một phần thích hợp
trong hệ gene của sinh vật nhƣ một chuỗi ký tự duy nhất giúp nhận diện hai lồi
sinh vật với nhau [17]. Ơng đề xuất sử dụng một trình tự ngắn của một gene đƣợc gọi
là Cytochrome c oxidase 1 (COI) có chiều dài khoảng 650 bp, đây là một trình tự
DNA có chứa trong tất cả các lồi động vật, tuy nhiên các trình tự này có thể sử dụng
để phân biệt các lồi động vật. Đoạn gene COI đƣợc tìm thấy trong ty thể. Hệ gene ty
thể của động vật là một mục tiêu tốt để phân tích hơn bộ gene nhân vì thiếu các đoạn


7

intron và việc phát sinh loài thƣờng tập trung vào các gene trong ty thể, 13 gene mã
hóa cho protein trong ty thể động vật là những vùng gene có nhiều tiềm năng để dùng
làm mã vạch DNA bởi vì sự thêm và mất các trình tự dẫn đến một sự thay đổi trong
khung đọc rất hiếm xảy ra, trong đó COI có đủ các yếu tố quan trọng để có thể sử
dụng làm mã vạch DNA [16]. Lợi thế của việc sử dụng đoạn COI trong xác định loài
là đoạn gene này đủ ngắn để đƣợc giải trình tự một cách nhanh chóng và rẻ tiền
nhƣng cũng đủ dài để xác định đƣợc các biến thể giữa các loài. Một mã vạch DNA
điển hình cần đáp ứng đƣợc các u cầu sau:
(1) Có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều lồi
(2) Trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao.
(3) Có khả năng phân biệt đồng thời đƣợc nhiều lồi.
Có năm bƣớc chính liên quan đến xác định lồi bằng trình tự đoạn mã vạch
DNA. Đầu tiên, một mẫu vật phải đƣợc thu gom và xác định bởi các nhà phân loại.
Một mẫu mô đƣợc lấy từ mẫu và tiến hành tách chiết thu DNA tổng số, sau đó trình

tự DNA đích đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR và đƣợc giải trình tự để tạo ra một
mã vạch. Cuối cùng, các mã vạch đƣợc nhập vào hệ thống ngân hàng dữ liệu Barcode
(BOLD). Nó là một hệ thống trực tuyến để giúp các nhà nghiên cứu thu thập, quản lý
và phân tích mã vạch DNA. Mỗi mục đƣợc tổ chức trong BOLD có thơng tin nhƣ tên
phân loại, hình ảnh của lồi, GPS tọa độ nơi mà lồi đó đã đƣợc tìm thấy và trình tự
mã vạch. Thơng tin này có thể truy cập thơng qua BOLD cho bất cứ ai trên thế giới
và có nhiều ứng dụng bao gồm cả giám sát mơi trƣờng, an tồn thực phẩm và y học.
Ví dụ, mã vạch DNA sẽ đƣợc sử dụng để xác định các ấu trùng của loài xâm
hại, phát hiện ra các loài mới xác định các loài gây ra một vết cắn, chích hoặc
ngộ độc, xác minh thực vật hay thành phần động vật trong thực phẩm [11].
2.2.2. Mã vạch DNA sử dụng trong xác định loài ở động vật và thực vật
2.2.2.1. Mã vạch DNA ở thực vật
Hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng vì vậy vấn đề về phân loại và
định danh sẽ không dễ dàng và tốn nhiều thời gian. Việc định danh lồi dựa vào các
đặc điểm bên ngồi khơng cho kết quả cao, trong khi số lƣợng lồi ln luôn biến


8

động và có những lồi đã tuyệt chủng mà chƣa hề biết đến. Vì vậy, cần có một biện
pháp thích hợp để giả quyết vấn đề này [8]. Sự ra đời của một công nghệ gọi là “mã
vạch DNA” là một cơng cụ hữu ích trong việc phân loại và định danh lồi. Đoạn
gene sử dụng làm mã vạch có thể tìm thấy ở tất cả các sinh vật (hoặc ít nhất là trong
tất cả các thành viên của một nhóm lồi), các trình tự nucleotide sẽ giống nhau hoặc
rất giống nhau ở các cá thể trong cùng một loài, nhƣng khác nhau giữa các lồi.
Chính vì vậy, khu vực này có thể đƣợc sử dụng cho nhận dạng các lồi bằng cách so
sánh trình tự của nó trong sinh vật thử nghiệm với trình tự từ tài liệu tham khảo đặc
biệt từ các cơ sở dữ liệu [11].
Mã vạch DNA đã đƣợc sử dụng một cách hiệu quả ở động vật, tảo và nấm,
nhƣng vẫn còn những cuộc tranh luận về việc sử dụng các vùng DNA chuẩn để áp

dụng cho thực vật. Năm 2005, nhóm PWG (Plant Working Group) đã đƣa ra 5 vùng
gen nằm trong lạp thể có tiềm năng để sử dụng làm mã vạch cho thực vật bao gồm
vùng matK (mã hóa cho maturase và có vị trí trong gen trnK), vùng rpoB (tiểu đơn
vị RNA polymerase), rpoC1(tiểu đơn vị RNA polymerase), accD (tiểu đơn vị của
acetyl CoA carboxylase) và UBBAXH (trƣớc đây đƣợc biết đến nhƣ ycf5; gen mã
hóa protein tham gia vào quá trình sinh tổng hợp cytochrome c). Năm 2007, trong
một nghiên cứu tiếp theo đã đề xuất thêm hai vùng gen nằm trong DNA plastid đó
là hai locus rbcL và matK dùng để xác định các cây hạt trần, hạt kín, dƣơng xỉ, bút
tháp và rêu. Hiệu suất xác định loài của sự kết hợp hai locus này đạt 72%. Ngoài ra
các vùng khác nhƣ psbA-trnH thuộc plastid và ITS1-5.8S rRNA-ITS2 thuộc DNA
ribosome hạt nhân cũng đƣợc thử nghiệm nhƣ mã vạch bổ sung [9].
Kỹ thuật này rất hữu ích trong các nghiên cứu phân loại học, sinh thái và tiến
hóa. Ngồi ra, nó có thể đƣợc sử dụng trong các lĩnh vực nhƣ: Bảo tồn, khoa học
pháp y và các ngành công nghiệp thực phẩm. Việc nghiên cứu mã vạch DNA thực
vật đã vƣợt xa mục đích so sánh vùng DNA khác nhau để tiến tới những ứng dụng
thực tế hơn nhƣ: Cung cấp cái nhìn sâu hơn vào phân loại học ở cấp độ loài, nhận
diện và phân chia ranh giới giữa các loài; hỗ trợ nhận diện các mẫu vật chƣa đƣợc
nhận biết hoặc chƣa xác định đƣợc thuộc loài nào.


9

Có một số tiêu chí để lựa chọn một trình tự có thể đƣợc sử dụng nhƣ một mã
vạch DNA. Các trình tự đƣợc sử dụng làm mã vạch phải có trong tất cả các lồi của
một đơn vị phân loại lớn, trình tự đó phải đảm bảo đủ ngắn khoảng 400 - 800bp để
có thể phân lập đƣợc từ các mẫu vật đã bị hƣ hỏng, suy giảm về chất lƣợng và để
khuếch đại một cách dễ dàng, không tốn kém. Trình tự của mã vạch DNA cũng
giữa các lồi cần có sự giống nhau đến 70% song cũng phải chứa khoảng 30% trình
tự khác nhau để có thể xác định và phân biệt đƣợc các loài với nhau [11].
2.2.2.2. Mã vạch DNA ở động vật

Với hàng triệu loài cùng với những biến đổi không ngừng trong từng giai
đoạn sống thế giới động động vật đặt ra một thách thách lớn trong việc phân loại và
định danh các loài. Một hệ thống phân cho thế giới động vật sẽ có thể bao gồm ít
nhất hàng triệu lồi khác nhau [13]. Phân loại hiện đại xuất hiện từ giữa thế kỷ 18,
đã mơ tả đƣợc khoảng 1,7 triệu lồi. Các nhóm động vật lớn hơn thƣờng đƣợc mơ tả
đầu tiên, trong khi nhiều sinh vật nhỏ hơn vẫn chƣa đƣợc biết đến. Tuy nhiên, ngay
cả các loài động vật lớn hơn vẫn có những nghi ngờ về nhận dạng giữa các lồi. Hệ
sinh vật của trái đất có thể chứa từ 10 đến 100 triệu loài sinh vật nhân chuẩn. Vì
vậy, để định danh lồi thơng qua các đặc điểm hình thái thì con số trên là quá lớn,
bên cạnh đó cũng có một số lĩnh vực khác liên quan đến việc xác định lồi nhƣ:
Đấu tranh chống bn bán các loài nguy cấp đang trong nguy cơ tuyệt chủng, giám
sát thủy sản, xác định và kiểm soát sự lây lan của các loài vật gây hại hoặc bệnh,
xác định dòng tuyệt chủng. Với sự đa dạng sinh học cao nhƣ vậy thì việc tìm ra một
cơng nghệ cho việc phân loại là vô cùng quan trọng.
Năm 2003, Paul Hebert đề xuất "mã vạch DNA" (DNA Barcode) nhƣ là một
cách để xác định loài, mã vạch DNA là một chuỗi nucleotide ngắn lấy từ một phần
thích hợp của hệ gen đƣợc sử dụng để xác định ở mức độ loài. Ông đề xuất xây
dựng một hệ thống phân loại cho động vật dựa trên sự đa dạng trong chuỗi
cytochrome c oxidase tiểu đơn vị 1 (COI) [13]. Gen cytochrome c oxidase tiểu đơn
vị 1 trong ty thể cung cấp một số lợi thế so với DNA nhân: có thể nhân lên nhanh
chóng, thiếu các đoạn intron và có số lƣợng bản sao cao. Những đặc điểm đó rất


10

quan trọng đối với sự khuếch đại bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và sử
dụng nhƣ là một marker phân tử [15]. Lƣu ý rằng trình tự gen COI chỉ dùng để xác
định các động vật có xƣơng sống và cơn trùng, nó khơng thể dùng cho tất cả các
nhóm động vật, chẳng hạn đối với bọt biển và san hơ thì vùng gen này rất bảo thủ,
nhƣng lại có sự biến đổi quá cao ở các loài lƣỡng cƣ và giáp xác, trong khi ở các lồi

nhƣ giun trịn, sán lá và tardigrades (lồi gấu nƣớc) thì vùng gen này có sự sắp xếp lại
lớn nên sẽ làm ngăn cản việc sử dụng các cặp mồi phổ biến trong phản ứng PCR.
Ngoài locut gen CO1, các đoạn gen khác trong ty thể Cytb (cytochrome b), gen
ribosome 12S, 16S cũng đƣợc dùng nhƣ ADN mã vạch trong nhận dạng ở động vật.
2.3. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số
Tách chiết DNA là cần thiết bởi các thực nghiệm của công nghệ gene đều
tiến hành với DNA. DNA là phân tử có kích thƣơc lớn, do đó trong q trình thao
tác cần tránh mọi tác nhân cơ học hoặc hóa học mạnh để bảo đảm độ nguyên vẹn về
cấu trúc để thực hiện các khâu nghiên cứu tiếp theo.
Tùy vào từng loại mẫu vật mà có phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số khác
nhau, nhƣng nguyên lý chung gồm những bƣớc sau:
Bƣớc 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân (tế bào Eukaryote). Thông
thƣờng tế bào, mô đƣợc nghiền trong nitơ lỏng -1960C hoặc dùng hỗn hợp chất tẩy
(SDS, Sarcosyl) và proteinase K. Khi đó màng tế bào, màng nhân sẽ bị phá vỡ và
giải phóng DNA ra mơi trƣờng và phân hủy các protein liên kết với DNA.
Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là
các protein, mẫu đƣợc lắc mạnh trong một dung dịch phenol và chloroform, dung
dịch này có tác dụng làm biến tính protein đồng thời khơng hịa tan DNA, sau khi li
tâm sẽ tủa thành lớp nằm giữa pha nƣớc và pha phenol/chloroform. Pha nƣớc có
chứa DNA đƣợc thu nhận lại.
Bƣớc 3: Tủa DNA, mục đích của việc kết tủa là nhằm thu nhận DNA dƣới
dạng cô đặc, một phần nhằm bảo vệ chúng ra khỏi sự phân hủy các enzym, mặt
khác có thể hịa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. Có thể tủa
DNA trong ethanol (2,5 dung tích ethano l/1 dung tích mẫu), mơi trƣờng có nồng độ


11

muối cao, nhiệt độ thấp, tuy nhiên cũng có thể tủa trong isopropanol (1 thể tích
isopropano l/1 thể tích mẫu), không cần muối. Sau khi thu nhận DNA, cặn tủa cần

phải rửa trong ethanol 70% để loại bỏ muối hoặc isopropanol dính vào.
Bƣớc 4: Hịa tan DNA. Kết tủa DNA sau khi rửa bằng cồn và để khô tự
nhiên đƣợc hòa tan trong TE hoặc nƣớc cất để bảo quản DNA phục vụ cho các
nghiên cứu tiếp theo.
2.4. Phƣơng pháp điện di DNA trong gel agarose
Phƣơng pháp điện di DNA dựa vào đặc tính của các nucleic acid là các đại phân tử
tích điện âm nên khi chịu tác dụng của lực điện trƣờng với điện thế và cƣờng độ thích hợp
chúng sẽ di chuyển về phía cực dƣơng của điện trƣờng. Phƣơng pháp điện di đƣợc thực
hiện phụ thuộc vào kích thƣớc, cấu hình của DNA, loại gel, nồng độ gel và cƣờng độ dịng
điện. Các phân tử có kích thƣớc nhỏ sẽ di chuyển về phía cực dƣơng nhanh hơn các phân
tử có kích thƣớc lớn. Đây cũng chính là cơ sở để có thể sàng lọc các dịng tái tổ hợp bằng
phƣơng pháp so sánh kích thƣớc.
Các bƣớc của phƣơng pháp điện di đƣợc tiến hành nhƣ sau:
Chuẩn bị gel
+ Cân 1 gam agarose cho vào 99 ml dung dịch TAE 1X, đun sơi trong lị vi sóng sao
cho agarose tan hồn tồn. (nồng độ 1%)
+ Để gel nguội đến 600C, đổ gel vào khuôn đã cài sẵn lƣợc và đợi cho gel đông lại.
+ Nhấc lƣợc khỏi bản gel và đặt bản gel vào bể điện di.
+ Đổ dung dịch đệm TAE vào bể điện di sao cho ngập bản gel.
Tra mẫu điện di
+ Tỷ lệ tra: Trộn theo tỉ lệ 1 µl loading dye với 5 µl mẫu.
+ Cài đặt chƣơng trình điện di ở hiệu điện thế 100-110 V, 100-200 mA, trong 30 phút
(khi vị trí vạch mầu chạy đƣợc khoảng 2/3 bản gel).
Nhuộm gel
+ Bản gel đƣợc lấy ra khỏi bể điện di và nhuộm với ethidium bromide (nồng độ 30
µl/l) trong 15 phút.
+ Soi và chụp ảnh bản gel bằng máy chụp ảnh gel.


12

2.5. Kỹ thuật PCR
Phƣơng pháp PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985.
Phƣơng pháp PCR cho phép khuếch đại, tạo ra số lƣợng bản sao rất lớn của gen trong
một thời gian ngắn. Phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của DNA
và nguyên lý tổng hợp DNA. Trên cơ sở trình tự của đoạn DNA khn, đoạn mồi, các
nucleotide tự do và enzyme DNA polymerase có thể tổng hợp đƣợc đoạn DNA đích
mong muốn [3].
Phản ứng PCR khếch đại gene đích mong muốn đƣợc lập lại nhiều lần các chu
kỳ nhân gene, trong một thời gian ngắn số lƣợng bản sao DNA tạo thành sẽ tăng theo
cấp số nhân.
 Phản ứng PCR gồm các bƣớc chủ yếu sau:
Bƣớc biến tính: Hai mạch đơn của phân tử DNA tách đôi dƣới tác dụng của
nhiệt độ. Bƣớc này thƣờng đƣợc tiến hành ở 94 – 950C sẽ làm đứt các lien kết hydro
của phân tử DNA, hai mạch DNA tách rời nhau thành 2 mạch đơn, làm khuân cho
quá trình tổng hợp, giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.
Bƣớc gắn mồi: Nhiệt độ của phản ứng đƣợc hạ thấp. Trong hỗn hợp phản
ứng lúc này có mặt hai mạch đơn DNA vừa tách khỏi nhau và hai mồi. Mỗi đoạn
mồi sẽ nhận biết và bám vào một sợi DNA mạch đơn theo nguyên tắc bổ sung.
Nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào độ dài và trình tự mồi, thông thƣờng nằm trong
khoảng 45-600C và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút
Bƣớc kéo dài: Nhiệt độ 720C là nhiệt độ thích hợp nhất cho hoạt động của
enzyme DNA polymerase. Enzyme DNA polymerase xúc tác hoạt động tổng hợp
các nucleotide tự do vào cuối đoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung và cuối cùng một
đoạn DNA mới đƣợc tổng hợp
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ liên tục, thông thƣờng thực hiện khoảng
20-40 chu kỳ [2].
2.6. Phƣơng pháp xác định trình tự các nucleotide
Giải trình tự là phƣơng pháp xác định thứ tự sắp xếp của 4 nucleotide
(adenine, guanine, cytosine và thymine) trên một phân tử DNA. Với việc phát triển

13

phƣơng pháp giải trình tự tự động việc xác định trình tự DNA của sinh vật đã trở
nên dễ dàng hơn. Các thơng tin về trình tự DNA của hệ gen sinh vật đã trở nên
không thể thiếu cho các quá trình nghiên cứu sinh học cơ bản, cũng nhƣ trong các
lĩnh vực chẩn đoán hoặc pháp y.
Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc của phƣơng pháp dideoxynucleotide cải
tiến của Sanger, đó là sử dụng các phân tử triphosphate dideoxynucleotide (ddNTPs)
nhƣ là các điểm kết thúc trong quá trình tổng hợp chuỗi DNA. Các thành phần sử
dụng trong phƣơng pháp này đó là: Mẫu DNA sợi đơn, DNA mồi, Enzyme taq-DNA
polymerase, bốn loại dNTPs, dung dịch đệm và có thêm một lƣợng nhỏ ddNTP
(trong đó có một loại đánh dấu bằng cách gắn với một phân tử huỳnh quang). Mẫu
DNA đƣợc chia thành bốn phản ứng riêng biệt có chứa tất cả bốn deoxynucleotides
chuẩn (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) và polymerase DNA. Mỗi phản ứng chỉ đƣợc thêm
vào một trong bốn dideoxynucleotide (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP), các
dideoxynucleotide này bị mất 2 nguyên tử oxy ở vị trí carbon thứ 3 và carbon thứ 4.
Do đó khi mạch DNA đang tổng hợp bị gắn một ddNTP thì khơng có nhóm 3’-OH ở
nucleotide cuối cùng nên mạch đang tổng hợp không đƣợc tiếp tục kéo dài vì vậy
phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại [8]. Mỗi ddNTP sử dụng đƣợc gắn với một phân tử
huỳnh quang và mỗi nucleotide cho một màu khác nhau. Các đoạn DNA thu đƣợc
đƣợc phân tách theo kích thƣớc bằng điện di trên cùng một ống mao quản. Các đoạn
DNA khác nhau sẽ phân tách trên gel mao quản và xuất hiện dƣới dạng các đỉnh và
màu đi kèm. Các đỉnh đƣợc phát hiện bằng cách sử dụng nguồn laser. Đọc trình tự
DNA bằng cách xác định màu của đỉnh khi chúng đi qua thiết bị phát hiện và thông
tin này sẽ đƣợc chuyển trực tiếp đến một máy tính và sẽ xác định đƣợc trình tự của
đoạn DNA [26].
2.7. Tình hình nghiên cứu DNA mã vạch gene trong và ngồi nƣớc
2.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 2010, Locke SA và cộng sự đã sử dụng vùng mã vạch COI để phân biệt
Diplostomum spp (ấu trùng ký sinh trong mắt cá). Tiến hành thu thập đƣợc 497 mẫu
ấu trùng từ mắt cắc lồi cá của sơng St. Lawrence ở Canada. Sử dụng chỉ thị mã


14

vạch ITS và COI để phân loại các loài gây bệnh nghiêm trọng. Tuy nhiên kết quả
cho thấy chỉ thị COI cho kết quả phân biệt tốt hơn [22].
Năm 2012, Emre Keskin và cộng sự đã sử dụng tiểu đơn vị COI ty thể để
làm sáng tỏ tính đa dạng di truyền của các lồi cá nƣớc ngọt khơng phải là bản địa.
Thơng qua tồn bộ dữ liệu tìm thấy có 145 chuỗi COI. Sự khác biệt về mã vạch COI
giữa các quần thể cùng loài là thấp, đặc biệt đối với quần thể C. gibelio, G.
holbrooki và L. gibbosus lần lƣợt là 0,5%, 0,6% và 0,3%. Kết quả của chúng tơi cho
thấy rõ ràng tính hiệu quả của phƣơng pháp mã vạch DNA cho cả nhận dạng ở cấp
độ loài và cho thấy sự khác biệt giữa các quần thể, có thể đƣợc sử dụng để quản lý
hiệu quả các loài xâm lấn và các chiến lƣợc bảo tồn đối với các loài bản địa và đặc
hữu [21].
Năm 2015, Joana Costa và cộng sự nghiên cứu trên loài Hypericum nằm
trong số các cây thuốc đang ngày càng đƣợc sử dụng vì lợi ích sức khoẻ. Hypericum
perforatum nổi tiếng với các đặc tính chống viêm, chống trầm cảm và chống virut,
cũng nhƣ một chất chữa bệnh. Trong y học cổ truyền Bồ Đào Nha, Hypericum
androsaemum đƣợc sử dụng chủ yếu cho tính chất bảo vệ gan và lợi tiểu. Nghiên
cứu này nhằm tìm kiếm khả năng sử dụng hai ứng viên mã vạch DNA mini (ITS1
và matK) để chứng thực H. perforatum và H. androsaemum trong truyền thống. Các
kết quả phân tích từ ITS1 và matK là cơ sở để phát triển các thử nghiệm PCR đặc
hiệu cho từng loài và PCR trong thời gian thực kết hợp với Phân tích Độ Phân giải
Cao (HRM), nhƣ những cách tiếp cận đơn giản để phân biệt đáng tin cậy của cả hai
lồi. Các vùng mã vạch đã thành cơng trong việc nhận dạng PCR đặc trƣng cho
từng nhóm đối tƣợng. Khu vực ITS1 cho thấy một số sự biến đổi nội bộ từ các kết

quả sắp xếp, làm ảnh hƣởng đến phân tích HRM, trong khi matK cho thấy là một
mã vạch mini thích hợp cho sự khác biệt của cả hai lồi bằng PCR thời gian thực
cùng với phân tích HRM. Các xét nghiệm đã đƣợc áp dụng có hiệu quả cho thảo
mộc [14].
Năm 2015, Locke SA và cộng sự đã sử dụng mã vạch DNA nghiên cứu tính
đa dạng của ấu ấu trùng Diplostomidae (Platyhelminthes: Digenea) trong mắt cá


15

nƣớc ngọt. Ấu trùng ở một số loài Diplostomidae (Platyhelminthes: Digenea) sống
trong mắt cá và khó xác định đƣợc các lồi dựa trên hình thái học. Ở đây, phân tích
dựa trên khoảng cách mã vạch cytochrome c oxidase 1, và trong một số mẫu, các
chuỗi đƣợc chuyển mã bên trong (ITS-1, 5.8S, ITS-2) đƣợc thực hiện cho hơn 2000
Diplostomidae từ Châu Phi, Trung Đông, Châu Âu, Châu Á Và châu Mỹ. Hai mƣơi
hai loài Diplostomum, Tylodelphys và Austrodiplostomum đƣợc phân biệt. 52 loài
gồm 12 loài đƣợc xác định, sáu loài ở hai quần thể loài và 34 loài giả định, và 33/52
đã đƣợc mô tả trong các nghiên cứu trƣớc đó. Hầu hết (23/40) các lồi khơng xác
định, giả định phân biệt bởi cytochrome c oxidase 1 khoảng cách đƣợc hỗ trợ bởi ít
nhất một dịng bổ sung. Khi cƣờng độ lấy mẫu của 52 loài tăng lên, sự thay đổi
cytochrome c oxidase 1 giảm giữa và tăng lên trong các lồi, trong khi quy mơ
khơng gian ở các lồi đó đƣợc lấy mẫu khơng có hiệu lực. Tuy nhiên, sự thay đổi
giữa các lồi ln ln vƣợt q sự thay đổi trong các lồi. Các mối liên kết vịng
đời mới, hồ sơ địa lý và lƣu trữ, và dữ liệu di truyền đã đƣợc ghi nhận ở một số loài,
bao gồm Tylodelphys jenynsiae, Tylodelphys immer và Diplostomum ardeae [19].
Năm 2016, Mariana L. Lyra đã tiến hành nghiên cứu mã vạch DNA trong
đánh giá tính đa dạng di truyền và ƣớc tính độ phong phú của các lồi lƣỡng cƣ.
Vùng 5 'của tiểu đơn vị oxidase (COI) là rất quan trọng để thu thập mã vạch DNA
của các loài lƣỡng cƣ. Các tác giả đã nghiên cứu điều kiện PCR mới và thử nghiệm
mồi mới AnF1 + AnR1) làm tăng hiệu quả của việc phục hồi mã vạch ở lƣỡng cƣ.

Kết quả thấy rằng nhiệt độ gia tăng thấp cho chu kỳ PCR cải thiện đáng kể hiệu quả
khuếch đại. Có thể khơi phục chuỗi COI đối với 100% lồi đƣợc phân tích (N =
161), bao gồm ~ 15% các loài đƣợc biết đến từ Brazil (77 chi và 23 họ). Đó là một
cải tiến quan trọng đối với các nghiên cứu trƣớc đây. Đánh giá sơ bộ về sự đa dạng
lồi cho thấy số lồi có thể bị đánh giá thấp khoảng 25%. Kết luận chỉ ra rằng mã
vạch DNA là một phƣơng pháp hiệu quả, đơn giản và đƣợc chuẩn hóa để xác định
sự đa dạng bí ẩn ở động vật lƣỡng cƣ và sử dụng nó trong kiểm kê đa dạng sinh học
và trên khắp quần thể rộng khắp các loài đã biết [20].


16

2.7.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Năm 2014, Dƣơng Văn Tăng, Vũ Đình Duy, Trần Thị Việt Thanh thuộc
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tiến hành đề tài “Đánh giá khả
năng sử dụng mã vạch COI trong việc định loại động vật tại bảo tang thiên nhiên
Việt Nam” tiến hành với Ba mẫu có tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam ký hiệu
GN.bttnvn, GC.bttnvn, BHM.bttnvn đƣợc giám định hình thái ban đầu và đƣợc định
tên là Gấu ngựa (Ursus thibetanus), Gấu chó (Helarctos malayanus) hoặc tên đồng
nghĩa (Ursus malayanus) và Báo hoa mai (Panthera pardus) đƣợc sử dụng cho phân
tích này. DNA tổng số đƣợc tách từ mẫu mơ cơ, sau đó tiến hành phản ứng PCR.
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng kít Extraction Gel của Qiagen và xác định trình
tự bằng cặp mồi Barcode LCO1490/ HCO2198 của chƣơng trình DNA Barcoding.
Kết quả đã khuyếch đại đƣợc vùng gen COI, ở Gấu chó, Gấu ngựa có cùng kích
thƣớc 623 bp cịn ở Báo hoa mai là 653 bp. Phân tích bằng phần mềm máy tính
Mega 5.2.2 và chƣơng trình BLAST trên ngân hàng gen quốc tế cho thấy các mẫu
vật Gấu ngựa, Gấu chó, Báo hoa mai có tên chính xác nhƣ đã định loại bằng hình
thái. Kết quả mẫu nghiên cứu GN.bttnvn, GC.bttnvn, BHM.bttnvn đã đăng ký thành
công vơi Genbank với các mã số công bố KF986481, KF986482 và KF986483.
Mức độ tƣơng đồng của các trình tự từ các mẫu nghiên cƣu Gấu ngựa, Gấu chó và

Báo hoa mai so với dữ liệu công bố trên GenBank lần lƣợt là 99%, 99,5% và
99,85%. Với kết quả thu đƣợc, vùng gen COI có thể đƣợc sử dụng để giám định các
mẫu động vật quý hiếm không nguyên vẹn [1].
Năm 2014, Dƣơng Thúy Yên thuộc Đại học Cần Thơ tiến hành nghiên cứu
“So sánh trình tự một số gen mã vạch của cá rô đầu vuông và cá rô đồng tự nhiên”
thu ở xã Vĩnh Thuận Tây, huyện Vị Thủy, tỉnh Hậu Giang, nơi phát hiện cá rô đầu
vuông với mẫu cá rô tự nhiên đƣợc thu ở 3 nơi, gồm Rừng U Minh Hạ - Cà Mau,
vƣờn quốc gia Tràm Chim, Tam Nông – Đồng Tháp và Châu Thành A – Hậu
Giang. Số mẫu thu của mỗi dòng cá là 40 mẫu. Nghiên cứu này nhằm kiểm tra giả
thuyết trên dựa vào sự so sánh trình tự 3 gen mã vạch trong ty thể (gen Cytochrom
C oxidase subunit 1- COI và Cytochorome b-Cyt b) và trong nhân (Gen Rhodopsin
– Rho) giữa cá rô đầu vuông và cá rô tự nhiên thu ở 3 tỉnh. Kết quả tìm thấy 3 dạng
trình tự của gen COI (trong 15 mẫu), 3 dạng của gen Cyt b (21 mẫu) và 1 dạng gen


17

Rho (7 mẫu) trong các mẫu nghiên cứu. So sánh trình tự gen COI và Cyt b của cá rơ
trong nghiên cứu này tƣơng đồng trên 99% với cá rô Anabas testudineus có sẵn ở
cơ sở dữ liệu của GenBank và hệ thống BOLD [5].
Năm 2015, Nguyễn Phƣơng Thảo và Dƣơng Thúy Yên tiến hành nghiên cứu
đề tài “So sánh đặc điểm hình thái và DNA mã vạch của hai loài cá bống trân Butis
butis và Butis humeralis”. Đề tài so sánh đặc điểm hình thái và trình tự gene
cytochrome C oxidase subutnit I (COI) của hai “loài” cá bống trân Butis butis và
Butis humeralis đã đƣợc công bố trong các nghiên cứu trƣớc để kiểm chứng việc
định danh hai lồi. Kết quả về hình thái, chúng giống nhau ở hình dạng thân, mõm,
màu sắc và cấu tạo cơ gốc vi ngực và một số chỉ tiêu đo. Tuy nhiên, chúng khác
nhau ở vạch và màu sắc của mắt, vị trí bắt đầu của vi lƣng và vi hậu mơn, tỉ lệ dài
đầu/khoảng cách hai mắt và cao thân/cao cuống đi. Về trình tự gene COI, các
mẫu của hai lồi giống nhau ở mức 99-100%. Khoảng cách di truyền giữa 2 loài

(0,003±0,001) tƣơng đƣơng với khoảng cách di truyền trong cùng một lồi. Nhƣ
vậy, 2 nhóm cá bống trân là cùng một loài. Loài này khác với loài B. butis ở
Genbank (giống trình tự gene COI ở mức 86%), chứng tỏ việc phân loại loài của cá
B. butis trên thế giới chƣa rõ ràng và cần tiếp tục đƣợc nghiên cứu [4].
Năm 2015, Trần Thị Việt Thanh và cộng sự đã tiến hành đề tài “Sử dụng mã
vạch DNA (DNAbarcodes) trong việc xác định mẫu chim tại bảo tàng thiên nhiên Việt
Nam”. Trên cơ sở sử dụng mã vạch DNA (Cytochrome c oxidase 1-CO1), đã giám
định tên loài cho 4 mẫu chim thuộc họ Khƣớu (Timaliidae): 005_BTTNVN (Khƣớu
mào cổ trắng), 028_BTTNVN (Lách tách đầu đốm), 045_BTTNVN (Lách tách mày
trắng) và 055_BTTNVN (Khƣớu mặt đen). DNA tổng số đƣợc tách từ mẫu máu, sau
đó tiến hành phản ứng PCR, tinh sạch sản phẩm PCR và xác định đƣợc trình tự
nucleotide vùng gen Barcode (CO1) với kích thƣớc khoảng 650 bp cho mỗi mẫu. Kết
quả về vùng gen CO1 đã chỉ ra mức độ tƣơng đồng di truyền cao, 99,7%
(028_BTTNVN/Alcippe castaneceps), 99,8% (045_BTTNVN/ Alcippe vinipectus),
99,28% (99,2-99,5%; 055_BTTNVN/Garrulax affinis) và mẫu 005_BTTNVN thuộc
giống Ynhina, đƣợc xác định bởi tên loài Y. diademata trên GenBank. Các dẫn liệu di
truyền thu thập đƣợc cho mỗi mẫu đều tƣơng đồng với phân loại bằng hình thái. Bốn
trình tự nucleotide vùng gen CO1 của mẫu chim nghiên cứu đã đƣợc đăng ký trên
GenBank với các mã số: KP768404, KP768405, KP708406, KP768407 [7].