Nghiên cứu phương pháp xác định một số steviol glycosides trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------------------

LƢU THỊ HUYỀN TRANG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ STEVIOL
GLYCOSIDES TRONG THỰC PHẨM BẰNG
PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------

LƢU THỊ HUYỀN TRANG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ STEVIOL
GLYCOSIDES TRONG THỰC PHẨM BẰNG
PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 8440112.03

Cán bộ hƣớng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Thị Ánh Hƣờng
TS. Trần Cao Sơn

Hà Nội - 2020


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC BẢNG
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN......................................................................................3
1.1. Tổng quan về cây cỏ ngọt………………………………………………………3
1.1.1. Giới thiệu……………………………………………………………………..3
1.1.1.1. Thực vật học..………………………………………………………………3
1.1.1.2. Tác dụng.……………………………..…………………………………….4
1.1.1.3. Liều dùng an toàn ở ngƣời………………………………………………….6
1.1.2. Thành phần hóa học trong cây cỏ ngọt……………………………………….7
1.2. Tổng quan về Steviol glycoside………………………………………………...8
1.2.1. Giới thiệu……………………………………………………………………..8
1.2.2. Tính chất vật lý, hóa học……………………………………………………10
1.2.3. Ứng dụng thực tế của Steviol glycosides…………………………………...11
1.3. Các phƣơng pháp xác định Steviol glycosides…………………...…………...12
1.3.1. Sắc ký lớp mỏng…………………………………………………………….13
1.3.2. Phƣơng pháp quang phổ…………………………………………………….14
1.3.3. Phƣơng pháp điện di mao quản……………………………………………..15
1.3.4. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ…………………………………………17
1.3.5. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao UV-Vis/PDA…………………….19
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................27
2.1. Mục tiêu nghiên cứu………………………………………………………….27
2.2. Nội dung nghiên cứu…………………………………………………………27
2.3. Đối tƣợng nghiên cứu………………………………………………………...27

2.4. Nguyên vật liệu – thiết bị, dụng cụ…………………………………………..28


2.4.1. Nguyên vật liệu……………………………………………………………..28
2.4.2. Thiết bị, dụng cụ……………………………………………………………28
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu...…………………………………..……………….29
2.5.1. Phƣơng pháp phân tích……………………………………………………..29
2.5.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu…………………………………………………….31
2.5.3. Xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp………………………………...32
2.5.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu………………………………………………….33
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................34

3.1.Lựa chọn các điều kiện phân tích sắc ký……………………………………..34
3.1.1. Khảo sát nồng độ đệm……………………………………………………..34
3.1.2. Khảo sát pH pha động……………………………………………………..36
3.1.3. Khảo sát nhiệt độ cột………………………………………………………38
3.1.4. Điều kiện tối ƣu phân tích một số Steviol glycosides bằng HPLC………..39
3.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu………………………………………………..40
3.2.1. Khảo sát dung môi chiết mẫu………………………………………………40
3.2.2. Khảo sát nhiệt độ chiết mẫu………………………………………………..41
3.2.3. Khảo sát thời gian chiết mẫu……………………………………………….42
3.2.4. Khảo sát điều kiện làm sạch qua SPE……………………………………...42
3.3. Thẩm định phƣơng pháp…………………………….……………………….44
3.3.1. Xây dựng đƣờng chuẩn…………………………………………………….44
3.3.2. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp………………..46
3.3.3. Độ lặp lại…………………………………………………………………..47
3.3.4. Đánh giá độ thu hồi………………………………………………………..51
3.4. Phân tích mẫu thực tế………………………………………………………..56
KẾT LUẬN............................................................................................................60
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................... 62

PHỤ LỤC ..............................................................................................................68


LỜI CẢM ƠN
Luận văn này đƣợc hoàn thành với sự hỗ trợ, giúp đỡ, động viên của các
Thầy Cô, gia đình và bạn bè, đồng nghiệp.
Với tình cảm chân thành, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.
Nguyễn Thị Ánh Hƣờng và TS. Trần Cao Sơn là những ngƣời thầy đã tận tâm
hƣớng dẫn, giúp đỡ và động viên tơi trong suốt q trình làm luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn tới các quý Thầy, Cô trong Bộ mơn Hóa Phân
tích, khoa Hóa Học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội
đã tâm huyết truyền dạy kiến thức và luôn tạo điều kiện tốt nhất để tôi đƣợc học tập,
nghiên cứu tại đây.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện, TS. Vũ Thị Trang và các anh
chị đồng nghiệp tại khoa Dinh dƣỡng và phụ gia thực phẩm, Viện Kiểm nghiệm an
toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình
làm luận văn.
Lời sau cùng, xin đƣợc bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới những ngƣời thân
trong gia đình, tới những ngƣời bạn, tới lãnh đạo và các đồng nghiệp khoa Dinh
dƣỡng và Phụ gia thực phẩm – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc
gia đã luôn động viên, ủng hộ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất trong suốt thời
gian học tập và hoàn thành luận văn.


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
AOAC

Tiếng Anh
Association of Official Analytical

Communities

Tiếng Việt
Hiệp hội các cộng đồng phân tích
Lƣợng

ăn

vào

ADI

Acceptable Daily Intake

TLC

Thin-layer chromatography

Sắc ký lớp mỏng

CE

Capillary Electropherosis

Điện di mao quản

HPTLC

High-performance thin-layer
chromatography

hằng

ngày

chấp nhận đƣợc

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

HPLC

High performance liquid chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

GC

Gas chromatography

Sắc ký khí

GC-MS

Gas chromatography mass spectrometry

Sắc ký khí khổi phổ

LC-MS

Liquid chromatography mass pectrometry

Sắc ký lỏng khối phổ

MDL

Method detection limit

Giới hạn phát hiện phƣơng pháp

MQL

Method quantification limit

Giới hạn định lƣợng phƣơng pháp

MS

Mass spectrometry

Khối phổ

PDA

Photometric Diode Array

Mảng Diot quang

RP-

Reverse phase high performance liquid

HPLC

chromatography

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

SPE

Solid phase extration

Chiết pha rắn

UV-Vis

Ultraviolet - Visible

Tử ngoại – Khả kiến

Sắc ký lỏng pha đảo


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Lá cây cỏ ngọt ................................................................................................ 3
Hình 1.2: Khung cấu trúc cơ bản của Steviol glycosides .............................................. 8
Hình 1.3: Thành phần chính của Steviol glycosides trong lá cỏ ngọt: a. Stevioside;

b. Rebaudioside A ......................................................................................... 9
Hình 2.1: Hệ thống thiết bị HPLC-PDA ..................................................................... 29
Hình 2.2: Quy trình xử lý mẫu dự kiến ........................................................................ 31
Hình 3.1: Sắc ký đồ của các Steviol glycosides ở 25ppm tại nồng độ pha động
5mM. ........................................................................................................... 35
Hình 3.2: Sắc ký đồ của các Steviol glycosides ở 25ppm tại nồng độ pha động
10mM .......................................................................................................... 35
Hình 3.3: Sắc ký đồ của các Steviol glycosides ở 25ppm tại nồng độ pha động
20mM .......................................................................................................... 35
Hình 3.4: Sắc ký đồ của các Steviol glycosides ở 25ppm tại nồng độ pha động
50mM .......................................................................................................... 36
Hình 3.5: Sắc ký đồ của các Steviol glycosides ở pH = 7 ........................................... 37
Hình 3.6: Ảnh hƣởng của pH đến độ phân giải của Stevioside và Rebaudioside A.....37
Hình 3.7: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycosides ở nhiệt độ cột 20oC ................... 38
Hình 3.8: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycosides ở nhiệt độ cột 40oC ................... 38
Hình 3.9: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycosides ở nhiệt độ cột 60oC ................... 39
Hình 3.10: Sắc ký đồ của các chất Steviol glycoside ở nhiệt độ cột 79oC .................. 39
Hình 3.11: Hàm lƣợng của các Steviol glycosides khi sử dụng các dung môi chiết
khác nhau .................................................................................................... 40
Hình 3.12: Hiệu suất thu hồi (H%) của các Steviol glycosides khi làm sạch trên cột
C18 và HLB ................................................................................................ 43
Hình 3.13: Quy trình xử lý mẫu tối ƣu......................................................................... 44
Hình 3.14: Đồ thị tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ RebA ............................ 45
Hình 3.15: Đồ thị tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ Stevioside ..................... 45


Hình 3.16: Kết quả phân tích tổng hàm lƣợng Steviol glycosides của mẫu cỏ ngọt và
đƣờng ăn kiêng ........................................................................................... 57
Hình 3.17: Kết quả phân tích tổng hàm lƣợng Steviol glycosides của mẫu nƣớc giải
khát ............................................................................................................. 58

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Cấu trúc của các chất nhóm Steviol glycosides và độ ngọt so với đƣờng
sucrose .......................................................................................................... 9
Bảng 1.2: Mức quy định giới hạn sử dụng Steviol glycosides trong thực phẩm ......... 11
Bảng 1.3: Tóm tắt kết quả một số phƣơng pháp xác định Steviol glycosides ............. 23
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH đến thời gian lƣu của nhóm chất
Steviol glycosides ....................................................................................... 37
Bảng 3.2: Hàm lƣợng của các chất Steviol glycosides (mg/g) thu đƣợc với dung
môi chiết khác nhau .................................................................................... 41
Bảng 3.3: Hàm lƣợng của các chất Steviol glycosides ở các nhiệt độ khác nhau ....... 41
Bảng 3.4: Hàm lƣợng Steviol glycosides (mg/g) thu đƣợc với thời gian chiết khác
nhau............................................................................................................. 42
Bảng 3.5: Quy trình làm sạch qua SPE ........................................................................ 43
Bảng 3.6: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của các chất Steviol
glycosides .................................................................................................. 44
Bảng 3.7: Đƣờng hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ Steviol
glycosides ................................................................................................... 46
Bảng 3.8: Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp (MDL) và giới hạn định lƣợng của
phƣơng pháp (MQL) của các Steviol glycosides ....................................... 47
Bảng 3.9: Độ lặp lại khi phân tích các Steviol glycosides trong mẫu lá cỏ ngọt ......... 48
Bảng 3.10: Độ lặp lại khi phân tích các Steviol glycosides trong mẫu đƣờng ăn
kiêng... ........................................................................................................ 49
Bảng 3.11: Độ lặp lại khi phân tích các Steviol glycosides trong mẫu nƣớc ngọt.. .... 50
Bảng 3.12: Độ thu hồi của các chất Steviol glycosides trên nền mẫu lá cỏ ngọt ........ 52
Bảng 3.13: Độ thu hồi của các chất Steviol glycosides trên nền mẫu đƣờng ăn
kiêng. .......................................................................................................... 53
Bảng 3.14: Độ thu hồi của các chất Steviol glycosides trên nền mẫu nƣớc giải khát. 54
Bảng 3.15: Bảng kết quả độ thu hồi so với yêu cầu của AOAC .................................. 55

Bảng 3.16: Kết quả phân tích một số mẫu thực tế trên nguyên liệu đƣờng cỏ ngọt,
cây cỏ ngọt, đƣờng ăn kiêng ....................................................................... 56
Bảng 3.17: Kết quả phân tích một số mẫu thực tế trên mẫu trà giảm cân và nƣớc
giải khát ...................................................................................................... 57


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay lƣợng đƣờng con ngƣời tiêu thụ ngày càng cao do thói quen trong
bữa ăn hàng ngày, dẫn đến nguy cơ về các bệnh béo phì, tiểu đƣờng ngày càng tăng.
Để ngăn ngừa nguy cơ này, các loại đƣờng thơng thƣờng đang có xu hƣớng đƣợc
thay thế bằng các chất phụ gia tạo ngọt nhƣng không sinh năng lƣợng nhƣ
saccharin, natri cyclamate, sucralose, acefulfame K và aspartame. Các loại đƣờng
này có ƣu điểm là rẻ tiền và tiện dụng nhƣng nhƣợc điểm là có thể gây ảnh hƣởng
xấu đến sức khoẻ con ngƣời nếu sử dụng với một thời gian kéo dài. Vì vậy hiện nay
tâm lý chung của ngƣời tiêu thụ, đặc biệt ngƣời bị tiểu đƣờng là tìm về với những
sản phẩm thiên nhiên, trong đó nhóm những chất tạo ngọt thiên nhiên ví dụ nhƣ cây
cỏ ngọt có nhiều ƣu thế và đang đƣợc ƣa chuộng nhất.
Nhóm Steviol glycosides là nhóm hợp chất tạo ngọt tự nhiên thu đƣợc từ lồi
cỏ ngọt, có mức độ ngọt gấp 75 – 300 lần so với đƣờng kính [13]. Đây là loại chất
tạo ngọt khơng sinh năng lƣợng, có tác dụng trong điều trị bệnh tiểu đƣờng, hạ
đƣờng huyết, béo phì, sâu răng, tăng huyết áp, kháng vi khuẩn, kháng nấm, kháng
virus, kháng viêm. Nhiều sản phẩm nhƣ kẹo, bánh ngọt, đƣờng cho ngƣời ăn kiêng
và các loại nƣớc ngọt đã đƣợc sản xuất sử dụng chất tạo ngọt Steviol glycosides.
Mặc dù đây là các hợp chất thu đƣợc từ thiên nhiên, không sinh năng lƣợng khi tiêu
thụ vào cơ thể, nhƣng Ủy ban chuyên gia quốc tế về phụ gia thực phẩm (JECFA)
vẫn đƣa ra mức hấp thụ hàng ngày chấp nhận đƣợc đối với các hợp chất này (mức
ADI) là 4 mg/kg trọng lƣợng cơ thể.
Hiện nay tại Việt Nam chƣa có nhiều phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng các

chất nhóm Steviol glycosides trong thực phẩm, chỉ có một vài nghiên cứu về phân
tích và chiết tách các thành phần này trong nguyên liệu thô. Do đó, việc xây dựng
đƣợc một phƣơng pháp phân tích đồng thời các hợp chất này là rất cần thiết và có ý
nghĩa thực tế trong việc cung cấp thơng tin cần thiết cho các nhà quản lý và ngƣời
tiêu dùng để lựa chọn và điều chỉnh hợp lý khẩu phần dinh dƣỡng hàng ngày.
Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đƣợc sử dụng rất phổ biến hiện nay và

1


phƣơng pháp này cho thấy khả năng tách cao đối với các hợp chất đƣờng cỏ ngọt
với nhiều ƣu điểm nhƣ độ nhạy và độ chính xác cao, hóa chất phổ biến, quy trình
phân tích đơn giản. Từ những luận giải nêu trên, đề tài: “Nghiên cứu phƣơng pháp
xác định một số Steviol glycosides trong thực phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký
lỏng” đƣợc thực hiện với mong muốn đóng góp phần nhỏ vào việc xây dựng một
quy trình phân tích hiệu quả trong lĩnh vực đánh giá chất lƣợng sản phẩm thực
phẩm với chỉ tiêu là nhóm Steviol glycosides.

2


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây cỏ ngọt

1.1.1. Giới thiệu
1.1.1.1. Thực vật học
Cỏ ngọt (Stevia rebaudiana) là một loài thực
vật thuộc chi Stevia, thuộc họ hoa hƣớng dƣơng
(Asteraceae) [40]. Cỏ ngọt là cây lâu năm có thân rễ
khoẻ, ít phân nhánh, mọc nông từ 0-30 cm tuỳ

thuộc vào độ phì nhiêu, tơi xốp và mực nƣớc ngầm
của đất. Cỏ ngọt có dạng thân bụi, chiều cao 50-60
cm, thâm canh tốt có thể đạt 80-120 cm. Lá mọc
từng cặp đối nhau hình thập tự, mép lá có từ 12-16
răng cƣa, lá hình trứng ngƣợc, lá trƣởng thành dài
Hình 1.1. Lá cây cỏ ngọt

khoảng 50-70 mm rộng 17-20 mm [24].

Về đặc tính sinh học của cây cỏ ngọt: Sau khi gieo hạt 9-10 ngày thì mọc,
nhiệt độ thích hợp cho việc nẩy mầm từ 20-25oC, ẩm độ 60-85%, nhiệt độ dƣới
15oC hạt không nẩy mầm, trên 35oC hạt sẽ chết. Nhiệt độ thích hợp nhất cho cây
phát triển từ 25-30oC, độ ẩm 70-75%. Nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao cây sinh
trƣởng chậm. Cỏ ngọt là cây ƣa độ ẩm vừa phải, nếu úng ngập, hạn hán lâu đều gây
hại và có thể chết cây [40].
Cây cỏ ngọt có nguồn gốc từ các vùng của Brazil và Paraguay (Nam Mỹ)
hiện đƣợc trồng ở nhiều nơi trên thế giới để làm chất tạo ngọt và làm thuốc, là
nguồn gốc của các sản phẩm làm ngọt đƣợc gọi chung là stevia và đƣợc bán dƣới
nhiều tên thƣơng mại khác nhau [11]. Các hợp chất hóa học tạo ra vị ngọt của nó là
các glycosides steviol khác nhau (chủ yếu là Stevioside và Rebaudioside ), có độ

3


ngọt gấp 75 lần 300 lần so với đƣờng mía [10]. Ngày nay, nhiều nƣớc trên thế giới
đã phát triển việc dùng loại cây này trong đời sống.
1.1.1.2. Tác dụng
Đƣờng cỏ ngọt có độ ngọt gấp nhiều lần so với đƣờng mía và có thể đƣợc sử
dụng thay thế cho đƣờng mía. Các hợp chất này khi tiêu hóa khơng bị phá vỡ cấu
trúc hóa học, khơng chuyển hóa trong cơ thể con ngƣời, khơng tạo ra năng lƣợng an

tồn cho những ngƣời cần kiểm soát lƣợng đƣờng trong máu. Điều này có ý nghĩa
vơ cùng lớn, đặc biệt là trong bối cảnh của hiện nay, con ngƣời đang tìm kiếm
những thực phẩm tự nhiên và an toàn đối với sức khỏe do tỷ lệ ngƣời mắc bệnh tiểu
đƣờng và béo phì tăng cao và mối lo ngại đối với an toàn thực phẩm ngày càng tăng
khi các chất làm ngọt hóa học đang đƣợc sử dụng rộng rãi [10].
Steviol glycosides đƣợc coi là an toàn [13]; tuy nhiên, các nghiên cứu trên
động vật cho thấy có một số tác động bất lợi do steviol aglycone [10]. Khi sử dụng
đƣờng cỏ ngọt ở ngƣỡng hàm lƣợng cao trong thời gian dài có thể ảnh hƣởng bất lợi
tới sức khỏe. Tại nhiều nƣớc trên thế giới, Stevioside đƣợc dùng làm chất tạo vị
ngọt thay thế các loại đƣờng mía hoặc đƣờng hóa học [2]. Cỏ ngọt phơi khơ, sấy
khơ có thể làm trà. Bột lá khơ có thể trộn với bột làm bánh để thay thế đƣờng.
Trong đầu thập niên 1970, ngƣời Nhật bắt đầu trồng cây và đƣa vào sản xuất
công nghiệp để thay thế các chất làm ngọt nhân tạo nhƣ cyclamate hay saccharin.
Nhật Bản cũng là Quốc gia đầu tiên ở châu Á sử dụng Stevioside nhƣ một chất làm
ngọt trong ngành công nghiệp thực phẩm và dƣợc phẩm. Chúng chiếm 40% thị
trƣờng chất làm ngọt trong năm 2005 tại đất nƣớc này và là nƣớc tiêu dùng lớn nhất
thế giới [13]. Cỏ ngọt hiện nay đƣợc trồng và tiêu thụ ở nhiều nƣớc châu Á
nhƣ: Trung Quốc (từ năm 1984), Hàn Quốc, Thái Lan và Malaysia [24]. Nó cũng
đƣợc tìm thấy ở Nam Mỹ và Israel [13]. Ngƣời dân Trung Quốc xem cỏ ngọt nhƣ
một dƣợc liệu thiên nhiên rất tốt để giúp làm giảm cân, giúp ăn ngon và tiêu hóa tốt.
Hiện nay chất tạo ngọt Stevioside đang đƣợc sử dụng trong kẹo gum, bánh ngọt và
trong các loại nƣớc ngọt nhƣ Coca Cola,…. Hơn nữa, ở các Quốc gia Châu Á và

4


Nam Mỹ đƣờng cỏ ngọt đƣợc công nhận và đƣợc cho phép sử dụng nhƣ một chất
phụ gia. Ngƣợc lại các Quốc gia phƣơng Tây (Anh, Pháp, Hoa Kỳ, Úc Châu,
Canada, v.v…) lại chƣa công nhận đƣờng cỏ ngọt là chất phụ gia để tạo vị ngọt nhƣ
các chất aspartame, natri cyclamate mà chỉ đƣợc xem là một loại thực phẩm bổ

sung.
Tại Việt Nam, từ năm 1988, cỏ ngọt đã đƣợc nhập và trồng ở nhiều vùng nhƣ
Hà Giang, Cao Bằng, Hà Tây, Lâm Đồng... Từ năm 1990 Công ty Dƣợc liệu TWI
hƣớng dẫn kỹ thuật trồng trên diện tích sản xuất công nghiệp để cung ứng cho nhu
cầu trong nƣớc và xuất khẩu.
Cỏ ngọt không tạo năng lƣợng nên rất thích hợp để giảm cân. Cỏ ngọt khơng
làm bẩn răng, không gây sâu răng, bảo vệ vệ sinh răng miệng và cũng giúp vào việc
làm lành các vết thƣơng ngoài da, bổ tim, lợi tiểu, làm giảm huyết áp ở những ngƣời
huyết áp cao, và đặc biệt nhất là đối với những ngƣời bị bệnh tiểu đƣờng, cỏ ngọt
giúp tuyến tụy trong việc tiết chất insulin. Một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng cỏ
ngọt có thể mang lại lợi ích điều trị chống tăng đƣờng huyết, chống viêm, chống
khối u, chống tiêu chảy, lợi tiểuvà tác dụng điều hòa miễn dịch.
Một số tác dụng của cây cỏ ngọt đã đƣợc đánh giá [14]:
-

Hỗ trợ điều trị đau dạ dày: Trong cây cỏ ngọt có khá nhiều hoạt chất giúp giảm
các cơn đau và chứng bệnh đƣờng tiêu hóa, đặc biệt là rối loạn dạ dày. Do vậy,
cây cỏ ngọt chính là một loại thuốc bổ giúp chống lại các bệnh rối loạn dạ dày,
giảm đau và tiêu hóa tốt.

-

Chăm sóc răng miệng: Nhờ chứa nhiều hoạt chất kháng khuẩn mạnh, sử dụng
nƣớc cây cỏ ngọt súc miệng thƣờng xuyên giúp ngăn ngừa chảy máu chân răng
ở những ngƣời mắc bệnh viêm lợi và giúp chăm sóc tốt hơn cho răng miệng.

-

Chăm sóc da: cỏ ngọt đƣợc xem là một nguyên liệu tự nhiên chăm sóc da khá
tốt, có tác dụng giảm tiết bã nhờn, làm giảm các vết nhăn, giúp làn da trở lên

sáng trắng hơn, chống viêm da và ngăn ngừa mụn trứng cá.

5


-

Chăm sóc tóc: Giúp tóc đẹp, mƣợt và giảm các vấn đề về gàu và da đầu.

-

Giải nhiệt, lợi tiểu: Có tác dụng giúp thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu hiệu quả. Cây
cỏ ngọt có thể sử dụng kết hợp với các loại nhân trần, cam thảo, trà atiso uống
mỗi ngày nhƣ nƣớc bình thƣờng, khơng chỉ giúp thanh nhiệt, giải độc, loại nƣớc
này cịn có cơng dụng lợi tiểu hiệu quả.

-

Trị tiểu đƣờng, béo phì, cao huyết áp: Nghiên cứu trên 40 bệnh nhân cao huyết
áp độ tuổi 50 cho thấy uống chè cỏ ngọt trong một tháng, kết quả huyết áp ổn
định hơn, lợi tiểu, ngƣời khỏe và hoạt bát hơn. Cỏ ngọt và Stevioside có vị ngọt
sẽ làm giảm nhu cầu chất đƣờng và chất bột của ngƣời bệnh, vì thế sẽ làm giảm
đƣờng huyết. Liều dùng theo thử nghiệm ở Braxin là mỗi lần 0,25 g steviosid
(hoặc 2,5 g lá cỏ ngọt), ngày 4 lần, uống trong nhiều ngày. Ngồi ra cỏ ngọt và
Stevioside cịn chữa béo phì do có vị ngọt sẽ làm giảm nhu cầu đƣờng và tinh
bột của cơ thể, nên cũng có tác dụng chữa béo phì. Liều dùng 0,5 – l g
steviosidchiara dùng 3-4 lần trong ngày, uống nhiều ngày. Lá cỏ ngọt hoặc
Stevioside còn thƣờng dùng làm chất điều vị cho các loại trà thuốc.
Tại Việt Nam, cũng đã có một số chế phẩm trà thuốc có cỏ ngọt nhƣ trà

actisơ - stevia. Trà sâm quy - stevia có sâm, tam thất, đƣơng quy, thục địa, táo, long
nhãn, ngũ gia bì và cỏ ngọt. Trà túi lọc Sotevin có dừa cạn, hoa cúc, hoa hoè và cỏ
ngọt.
1.1.1.3. Liều dùng an tồn ở người
Tính an tồn của steviol glycosides đã đƣợc xác nhận trong nhiều nghiên cứu
độc tính bao gồm độc tính cấp tính và bán cấp tính, độc tính sinh sản, độc tính di
truyền và gây ung thƣ. Do đó, steviol glycosides đƣợc coi là an toàn đối với cơ thể
ngƣời. Một số nghiên cứu Nồng độ Stevioside trong một số nƣớc giải khát ở Nhật
Bản đƣợc ghi nhận là 0,005 - 0,007%. Nếu một ngày uống 1 lít nƣớc thì lƣợng
steviosid đƣa vào cơ thể là 0,05 - 0,07 g tƣơng ứng với khoảng lg lá Cỏ Ngọt. Đây
là liều lƣợng an tồn, đã đƣợc Chính phủ Nhật cho phép. Ủy ban chuyên gia quốc tế

6


về phụ gia thực phẩm (JECFA) đƣa ra mức tiêu thụ chấp nhận hàng ngày đối với
các hợp chất này, mức ADI là 4 mg/kg trọng lƣợng cơ thể.

1.1.2. Thành phần hóa học trong cây cỏ ngọt.
Chất cơ bản tạo nên độ ngọt tự nhiên của loại cây cỏ ngọt là các hợp chất
Steviol glycosides, hợp chất này ngọt gấp 300 lần đƣờng mía (saccarose) [13],
khơng lên men, ít năng lƣợng và có vị rất thơm ngon, những ngƣời phải kiêng
đƣờng nhƣ bệnh nhân tiểu đƣờng có thể sử dụng hợp chất này để thay thế đƣờng
trong các bữa ăn hàng ngày. Cỏ ngọt thƣờng đƣợc thu hái, phơi khô và có thể sử
dụng cho mọi lứa tuổi.
Thành phần trong lá (tính theo % chất khơ) chứa 6,2% protein, 5,6% chất
béo, 52,8% carbohydrate, 15% Stevioside và khoảng 42% chất hòa tan trong nƣớc
là các diterpenoid glycosides và gồm có Stevioside (5 – 10%), rebauvioside A (2 –
4%), rebauvioside C (1 – 2%), và dulcoside A (0,5 – 1%), một số hợp chất khác là
rebauvioside B, D và E. Chất ngọt Stevioside có vị ngọt gấp 300 lần hơn đƣờng mía

(saccharose). Stevioside rất ổn định ở nhiệt độ cao 198oC (388 độ F), khơng bị sạm
màu và caramel hóa [11].
Bên cạnh Stevioside, Rebaudioside có hàm lƣợng ít hơn nhƣng ngọt hơn
Stevioside 1,2 – 1,5 lần. Ngoài ra, trong thành phần cỏ ngọt chứa một hàm lƣợng
thấp các chất: stigmasterol, sitosterol, campesterol, flavonoid, và cosmosiin,
caryophyllen, spathuienol. Một số khoáng đa lƣợng và vi lƣợng đƣợc tìm thấy
trong cỏ ngọt là Ca, Mg,…Về mặt sinh vật học, sự hiện diện của gibberellin A20
trong cỏ ngọt đã chứng minh steviol có thể chuyển hóa thành gibberillin. Phần chiết
stevia có tính chất ức chế rotavirus, chống vi khuẩn Helicobacter pylori, đƣợc ứng
dụng trong điều trị khối u [21]. Những flavonoid trong cây (4,75%) có tính chất
chống vi khuẩn Bacillus subtilus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli... Các thí
nghiệm trên chuột cho thấy chất này ức chế sự phát triển ung thƣ da.

7


1.2. Tổng quan về Steviol glycoside

1.2.1. Giới thiệu
Steviol glycosides là một nhóm glycoside có nguồn gốc từ cây cỏ ngọt , có
thể đƣợc sử dụng làm chất làm ngọt. Bao gồm tám diterpene glycoside: Stevioside,
steviolbioside, Rebaudiosides A, B, C, D và E, và dulcoside A. Steviol glycoside
trong cỏ ngọt đã đƣợc báo cáo là ngọt hơn từ 30 đến 320 lần so với sucrose. Chúng
có cấu trúc tƣơng tự nhau steviol aglycon ở C-4 và C-13 liên kết với mono-, dihoặc trisaccharide: glucose hoặc rhamnose hoặc cả hai [11]. Khung cấu trúc của
nhóm Steviol glycosides và thành phần chính đƣợc thể hiện trong hình 1.2 và 1.3.
Cấu trúc bảy chất phân tích trong nhóm Steviol glycosides và độ ngọt so với đƣờng
sucrose đƣợc thể hiện trong bảng 1.1.

Hình 1.2: Khung cấu trúc cơ bản của Steviol glycosides

8


a.

b.

Hình 1.3: Thành phần chính của steviol glycosides trong lá cỏ ngọt: a. Stevioside;
b. Rebaudioside A
Bảng 1.1: Cấu trúc của các chất nhóm Steviol glycosides và độ ngọt so với đường
sucrose
Độ ngọt so
Hợp chất

1

2

Chuỗi R

Chuỗi R

với sucrose
[24].

Stevioside

β – Glc

Steviolbioside

β – Glc

Rebaudioside B

H

Rebaudioside C

β – Glc

β - Glc - β - Glc (2
β - Glc – (3

β - Glc – (3

1)

9

100-125
1)

1)

1)

1)

β - Glc - β - Glc (2

β - Glc – (3

1)

1)

β - Glc - α - Rha (2
β - Glc – (3

300

1)

β - Glc - β - Glc (2

β - Glc - β - Glc
(2

1)

β - Glc - β - Glc (2

H

Rebaudioside A

Rebaudioside D

β-Glc-β-Glc (2

1)

1)

250-50

300-350

50-120

250-450


Độ ngọt so
Hợp chất

Chuỗi R1

Chuỗi R2

với sucrose
[24].

Dulcoside A

β – Glc

β - Glc - α - Rha (2

1)

50-120

1.2.2. Tính chất vật lý, hóa học
Stevioside là một loại bột trắng, tan tốt trong nƣớc, ethanol, methanol và
không nên sử dụng trực tiếp. Khi đun nóng ở 100oC trong 1 giờ, dung dịch
Stevioside ở pH 3-9 cho thấy vị ngọt ít thay đổi và không thay đổi ở 22oC trong 5
tháng [29,33]. Tuy nhiên, sự phân hủy xảy ra ở pH=10. Ngoài ra, có ghi nhận một
số thay đổi của Stevioside và Rebaudioside trong đồ uống có ga do bị acid hóa với
phosphor và acid citric trong quá trình bảo quản ở 37oC. Gia nhiệt ở 60oC trong 6
ngày làm mất 0% - 6% độ ngọt. Tiếp xúc ánh sáng mặt trời trong vịng 1 tuần khơng
ảnh hƣởng đến Stevioside, nhƣng dẫn đến mất 20% Rebaudioside A. Nhờ độ ổn
định cao, Stevioside là một chất làm ngọt phù hợp cho thực phẩm kể cả nấu chín và
cho đồ uống. Stevioside cịn ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật trong khoang
miệng [26].
Trong số các thành phần của cỏ ngọt, Rebaudioside A đƣợc đặc biệt quan
tâm nhờ hƣơng vị đƣợc yêu thích. Trong thực tế, Stevioside lại là chất chiếm phần
lớn trong nhóm (60-70% tổng hàm lƣợng glycoside) nhƣng có dƣ vị đắng cùng
hƣơng vị cam thảo còn Rebaudioside A chiếm khoảng 30-40% tổng hàm lƣợng
glycoside và khơng có dƣ vị đắng (hậu vị cam thảo kéo dài lâu) [26]. Nếu
Rebaudioside A có hàm lƣợng bằng Stevioside có thể loại bỏ dƣ vị đắng của sản
phẩm. Tác dụng làm ngọt của các chất này hồn tồn là hƣơng vị, khơng đƣợc tiêu
hóa do khơng xảy ra phản ứng đƣờng phân khi ăn vì cơ thể ngƣời khơng thể chuyển
hóa stevia. Do đó, các chất này có ít giá trị dinh dƣỡng, là chất có thể thay thế
đƣờng tự nhiên cho bệnh nhân tiểu đƣờng và những ngƣời trong chế độ ăn kiêng
kiểm soát carbohydrate [41].

10

Steviolbioside là chất tạo ngọt có hoạt tính sinh học, rất hiếm trong cây cỏ
ngọt. Ngồi cơng dụng là phụ gia thực phẩm tạo ngọt, Steviolbioside còn đƣợc sử
dụng nhƣ chất trung gian sử dụng trong nhiều loại thuốc. Steviolbioside có hoạt tính
chống bệnh lao. Ngồi ra, steviolbioside đã đƣợc sử dụng trong các thử nghiệm
nghiên cứu điều trị nhiễm HIV-1.

1.2.3. Ứng dụng thực tế của Steviol glycosides
Trong thực phẩm, chiết xuất Steviol glycosides chủ yếu đƣợc sử dụng làm
chất làm ngọt trong sản xuất đồ uống trái cây và sữa, món tráng miệng, sữa chua,
bánh kẹo lạnh, sản phẩm hƣơng vị và dƣa chua. Stevioside và Rebaudioside A có
tính ổn định dƣới nhiệt độ cao đƣợc sử dụng trong chế biến thực phẩm và khơng bị
hóa nâu hoặc caramen khi đun nóng. Đối với các sản phẩm có tính acid, các Steviol
glycosides này cũng có tính ổn định cao [18,19].
Các hợp chất này đƣợc sử dụng nhƣ một chất làm ngọt của thực phẩm, có mã
hóa quốc tế INS 960 [32], có mức quy định giới hạn sử dụng trong thực phẩm theo
thông tƣ 24/2019/TT-BYT về hƣớng dẫn quản lý phụ gia trong thực phẩm. Mức
quy định giới hạn sử dụng Steviol glycosides trong thực phẩm đƣợc thể hiện trong
bảng 1.2.
Bảng 1.2: Mức quy định giới hạn sử dụng Steviol glycosides trong thực phẩm
Loại thực phẩm

Mức sử dụng tối đa (mg/kg)

Đồ uống từ sữa, có hƣơng liệu và/hoặc lên men

200

Các sản phẩm tƣơng tự sữa bột hoặc cream bột

330

Đồ tráng miệng từ sữa

330

Kem lạnh thực phẩm, bao gồm nƣớc hoa quả
ƣớp lạnh và kem trái cây
Quả ngâm dấm, dầu hoặc nƣớc muối

270
100

11


Loại thực phẩm

Mức sử dụng tối đa (mg/kg)

Mứt, thạch, mứt quả

360

Sản phẩm quả lên men

115

Sản phẩm kẹo cứng, kẹo mềm, kẹo nuga…

700

Kẹo cao su

3500

Đồ uống từ đậu nành

200

Sản phẩm thịt, thịt gia cầm và thịt thú xay nhỏ
đã qua xử lý nhiệt
Đồ gia vị

100
30

Thực phẩm bổ sung

2500

Đồ uống hƣơng liệu

200

Đồ uống có cồn hƣơng liệu (bia, vang và đồ

200

uống có cồn làm lạnh)

Một số nghiên cứu độc tính trên động vật đã cho thấy các dữ liệu đầu tiên về
tác động bất lợi đến sức khỏe. Do đó, các tổ chức quan tâm đến sức khỏe cộng đồng
cũng đã đƣa ra mức tiêu thụ chấp nhận hàng ngày cho hợp chất Steviol glycosides,
mức ADI là 4 mg/kg thể trọng/ngày (cơ quan an tồn thực phẩm châu Âu – EFSA).
Do đó, cần có phƣơng pháp xác định hàm lƣợng các chất Steviol glycosides trong
nguyên liệu cỏ ngọt cũng nhƣ các sản phẩm thực phẩm nhằm đánh giá chất lƣợng
an toàn thực phẩm, góp phần kiểm sốt đƣợc mức tiêu thụ của ngƣời tiêu dùng.
1.3. Các phƣơng pháp xác định Steviol glycosides
Trên thế giới và tại Việt Nam đã có một số cơng trình nghiên cứu đƣợc cơng
bố về các phƣơng pháp xác định các hợp chất tạo ngọt tự nhiên này bao gồm
phƣơng pháp quang phổ, phƣơng pháp điện di mao quản và các phƣơng pháp sắc

12


ký: sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV (PDA) và sắc ký
lỏng khối phổ. Một số phƣơng pháp phân tích đƣợc liệt kê dƣới đây là tài liệu tham
khảo cho nghiên cứu.

1.3.1. Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một dạng của sắc ký hấp phụ dạng rắn – lỏng, là
kĩ thuật quan trọng dùng trong phân tích nhanh với lƣợng mẫu nhỏ. Sắc ký lớp
mỏng đƣợc thực hiện trên một tấm kính, nhựa hoặc nhơm, đƣợc phủ một lớp mỏng
của vật liệu hấp phụ thƣờng là silica gel, oxit nhôm, hoặc cellulose. Sắc ký lớp
mỏng đã đƣợc phát triển nhƣ là một kỹ thuật định tính nhanh chóng và đơn giản.
Tuy nhiên, với cơng nghệ hiện đại, TLC có thể cũng là một cơng cụ của định lƣợng.
Đã có một số cơng trình nghiên cứu sứ dụng phƣơng pháp TLC scanner để xác định
hàm lƣợng nhóm Steviol glycosides đã đƣợc cơng bố.
Vikas Jaitak và các cộng sự [39] đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng
hiệu năng cao (HPTLC) để phân tích Steviol glycosides trong cỏ ngọt. Bột lá cỏ

ngọt khô đƣợc chiết với hỗn hợp dung dịch MeOH/H2O (80:20, v/v) trong 12 giờ ở
nhiệt độ phòng và lặp lại ba lần. Dung dịch đƣợc bay hơi đến khô và chiết phân
đoạn với hexane, chloroform, ethyl acetate và butanol. Sử dụng Na2SO4 để loại
nƣớc và cô ở áp suất thấp tại 50 ± 5oC thu đƣợc các chiết xuất hexan (30,0 g),
chloroform (10,0 g), ethyl acetate (10,5 g) và butanol (150,2 g) tƣơng ứng. Khai
triển chuẩn và mẫu đƣợc thực hiện trên tấm silicagel 60 F254 (20 cm × 10 cm) có độ
dày 0,20 mm và thuốc thử gồm acid acetic: acid sulfuric: ethanol (01:01:10, v/v/v).
Phƣơng pháp có độ nhạy và tính đặc hiệu cao. Đƣờng chuẩn là tuyến tính trong
khoảng 160–960 ng/điểm đối với steviolbioside, 1–6 g/điểm đối với Stevioside và
0,5–3 g/điểm đối với Rebaudioside A với hệ số tƣơng quan tốt (0,998–0,999).
Phƣơng pháp HPTLC đƣợc phát triển và xác nhận giá trị sử dụng để phân
tích 7 Steviol glycosides trong 6 loại thực phẩm. Morlock và cộng sự [28] đã sử
dụng dung môi chiết mẫu là methanol. Pha động sử dụng trong nghiên cứu là ethyl
acetate - acetic acid - methanol (3:1:1, v/v/v). Phƣơng pháp có độ chính xác thông

13


qua độ thu hồi đạt 92 - 120%, độ lặp lại 3,1 - 5,4% và độ tái lặp 4,0 - 8,4% đƣợc xác
định đối với Stevioside trong nền sữa. Phƣơng pháp HPTLC cho Rebaudioside A
đƣợc so sánh với kết quả của phƣơng pháp HPLC cho thấy kết quả của hai phƣơng
pháp có sự khác nhau khơng có ý nghĩa thống kê.
Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng là một phƣơng pháp tách phát triển và cũng đã
đƣợc nhiều tác giả trên thế giới áp dụng để tách và xác định một số Steviol
glycosides trong một số đối tƣợng khác nhau. Tuy nhiên phƣơng pháp lại tốn kém
và ít đƣợc sử dụng ở phịng thí nghiệm của Việt Nam.

1.3.2. Phương pháp quang phổ
Mizukami và cộng sự [20] sử dụng enzyme hesperidinase để thủy phân
Stevioside tạo ra steviol và glucose. Sau đó steviol đƣợc đo gián tiếp thông qua việc

xác định hàm lƣợng glucose. Hydrogen peroxide đƣợc tạo ra bởi phản ứng oxy hóa
glucose, sẽ phản ứng với 2, 2’-azino-di- (acid 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic)
(ABTS) tạo thành sản phẩm oxidized ABTS, đƣợc đo phổ hấp thụ phân tử ở bƣớc
sóng 600 nm.
Trình tự của phản ứng nhƣ sau:
Stevioside + 3H2O

Steviol + 3Glucose

Glucose + O2 + H2O

Gluconic acid + H2O2

H2O2 + ABTS

Oxidized ABTS

Quá trình thủy phân enzyme của Stevioside xảy ra trong 2 giờ khi đƣợc ủ ở
50oC với 1 mg hesperidinase trong 1,0 mL dung dịch đệm citrat phosphat, pH 4,0.
Quá trình thủy phân mất 5 giờ nếu xảy ra ở 40oC và 2 giờ nếu ở 50 oC. Do đó, q
trình thủy phân đƣợc thực hiện ở 50oC trong 2 giờ. Ngƣợc lại, quá trình thủy phân
enzyme của Rebaudioside A mất 48 giờ để hoàn thành và 10% Rebaudioside A
khơng thủy phân trong vịng 2 giờ. Độ thu hồi trung bình của 40, 50 và 80 µg
Stevioside đƣợc thêm vào 0,1 mL dịch chiết metanol lá cỏ ngọt chứa 116 µg

14


Stevioside lần lƣợt là 95,0; 98,8 và 96,7%. Độ lặp lại với RSD% là 1,7% và độ tái
lặp thực hiện trong 6 ngày với RSD% là 5,8% cho thấy phƣơng pháp có độ chính

xác tốt. Kết quả đo các mẫu lá cỏ ngọt bằng phƣơng pháp đo quang và phƣơng pháp
TLC cho kết quả có sự khác nhau khơng có ý nghĩa thống kê.
Udompaisarn và cộng sự [34] đã xây dựng một phƣơng pháp enzym để xác
định hàm lƣợng Stevioside. Β-glucosidase tái tổ hợp BT_3567 (rBT_3567) từ
Bacteroides thetaiotaomicron HB-13 có sự thủy phân chọn lọc Stevioside tại liên
kết β-1,2-glycosidic để tạo ra rubusoside và glucose. Sự kết hợp của enzyme này
với glucose oxidase và peroxidase cho phép định lƣợng hàm lƣợng Stevioside trong
các mẫu Stevia bằng cách sử dụng phƣơng pháp dựa trên phép đo màu. Các phản
ứng để xác định Stevioside có thể đƣợc hồn thành trong vịng 1 giờ ở 37°C. Việc
xác định Stevioside bằng cách sử dụng enzyme so với kết quả thu đƣợc từ định
lƣợng HPLC (r2 = 0,9629, n = 16). Phần trăm biến thiên hệ số (CV) của các thử
nghiệm trong ngày (n = 12) và giữa các ngày (n = 12) thấp hơn 5% và độ chính xác
là 95−105%. Phân tích này chứng minh rằng phƣơng pháp enzym đƣợc phát triển
trong nghiên cứu này là cụ thể, dễ thực hiện, chính xác và mang lại kết quả tốt.
Phƣơng pháp quang phổ là một phƣơng pháp phổ biến tại các phịng thí
nghiệm trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng. Tuy nhiên phƣơng pháp lại
có độ nhạy và chọn lọc kém dẫn đến độ chính xác khơng cao, để phân tích nhóm
Steviol glycosides các bƣớc xử lý mẫu phức tạp.

1.3.3. Phương pháp điện di mao quản
Các tác giả J. Liu và cộng sự [22] đã dùng kỹ thuật điện di mao quản và
HPLC detector UV để tách các Steviol glycosides trong đƣờng cỏ ngọt bao gồm
Stevioside, Rebaudioside A, Rebaudioside C và dulcoside. Nhóm tác giả tập trung
nghiên cứu các điều kiện phân tích bằng kỹ thuật điện di mao quản, kết quả nhận
thấy kỹ thuật này đơn giản, có thể tách đƣợc 4 hợp chất nghiên cứu. Mẫu đƣờng cỏ
ngọt chiết trong nƣớc deion và làm sạch qua cột SPE. Sử dụng kỹ thuật HPLC để

15