Giáo trình vi sinh đại cương

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

GIÁO TRÌNH
Tài liệu lưu hành nội bộ

VI SINH ĐẠI CƯƠNG

AN GIANG, 8-2017
1


Chương 1
ĐỐI TƯỢNG VÀ LƯỢC SỬ NGÀNH VI SINH HỌC
1.1. ĐỐI TƯỢNG NGÀNH VI SINH HỌC
Vi sinh học (Microbiology, Microbiologie) là ngành khoa học nghiên cứu về cấu
tạo và hoạt động sống của vi sinh vật. Vi sinh vật học hiện đại ngày nay đi sâu vào việc
sử dụng vsv nhằm phục vụ lợi ích của con người và giữ vững hệ sinh thái trên trái đất.
Vi sinh vật (microorganism) là những sinh vật rất nhỏ, có cấu tạo đơn bào hoặc đa
bào rất kém phân hóa và chỉ có thể nhìn thấy với kính hiển vi.
Dựa vào sự tiến hóa của từng nhóm mà xếp loại chúng vào các nhóm, lớp, bộ và
họ khác nhau nhằm phục vụ cho nghiên cứu. Trong hệ thống phân loại tổng quát, vi
sinh vật gồm các nhóm:
- Vi sinh vật nhân nguyên (Prokaryotic) gồm vi khuẩn (Bacteria), xạ khuẩn
(Actinomycetes), Mycoplasma, Ricketxia (Rickettsias), Chlamydia, dạng L của vi
khuẩn (L-form) và tảo lam hay thanh thực vật (Cyanophyta).
- Vi sinh vật nhân thực (Eukaryotic) gồm nấm (Eumycetes), Rong tảo (Algae)
và nguyên sinh động vật (Protozoa).
- Nhóm virus là các vi sinh vật có mức độ tiến hóa thấp.
Giữa các nhóm vi sinh vật trên tuy có sự khác biệt nhau về hình thái, phân loại
nhưng chúng cũng có những đặc điểm chung giống nhau như:

- Kích thước nhỏ bé thường được đo bằng đơn vị µm (micromet), riêng virus
được đo bằng đơn vị nm (nanomet).
1 nm = 10-3 µm = 10-6 mm = 10-9 m.

Hình 1.1. Kích thước của một số nhóm sinh vật trong tự nhiên

2


- Sinh trưởng và phát triển nhanh.
- Hấp thu nhiều, chuyển hóa nhanh.
- Khả năng thích ứng và phát sinh biến dị rất cao.
- Phân bố rộng, chủng loài nhiều.
- Là một trong những đối tượng xuất hiện sớm nhất trên trái đất.

Hình 1.2. Vết tích của các vi sinh vật hóa thạch
Về mặt ứng dụng: ngành vi sinh học gồm có các chun ngành như vi sinh học
cơng nghiệp, vi sinh học thực phẩm, vi sinh học y học, vi sinh học thú y, bệnh lý thực
vật, vi sinh vật đất, vi sinh học nước, vi sinh học không khí,...
1.2 SƠ LƯỢC LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN NGÀNH VI SINH HỌC
1.2.1. Giai đoan phát hiện ra vi sinh vật
Người đầu tiên nhìn thấy và mơ tả vi sinh vật là Antoni Van Leeuwenhook (16321723) người Hà Lan. Leeuwenhook đã chế tạo ra chiếc kính hiển vi thơ sơ với độ phóng
đại từ 270 - 300 lần và quan sát thế giới vi sinh vật quanh Ơng như nước sơng hồ, nước
ao tù, nước cống và trong bựa răng. Năm 1695, Leeuwenhook xuất bản quyển "Phát
hiện của Leeuwenhook về những bí mật của giới tự nhiên" nhằm mơ tả lại tồn bộ quan
sát của Ơng về vi sinh vật.

(a)
Hình 1.3. (a) Antoni Van Leeuwenhook (632 – 1723); (b) Kính hiển vi do
Leeuwenhook chế tạo; (c) Hình vẽ các vi khuẩn trong miệng người.

3


Hình 1.4. Cấu tạo chi tiết kính hiển vi đầu tiên do Leeuwenhook chế tạo
Sau Leeuwenhook, nhiều loại vi sinh vật được mơ tả nhưng chỉ nhằm chứng minh
có sự hiện diện của thế giới vi sinh vật, việc mô tả và phân loại chúng một cách rất thô
sơ. Trong quyển "Hệ thống tự nhiên", Carl Linne (1707-1778), nhà phân loại thực vật
nổi tiếng trên thế giới đã xếp vi sinh vật vào một chi (genus) gọi là "Chaos", nghĩa là
hỗn loạn.
Cuối thế kỷ 18, những hiểu biết về vi sinh vật mới dần dần phong phú hơn, thu
hút nhiều nhà bác học đi sâu vào nghiên cứu thế giới nhỏ bé này và nhận thấy được sự
gắn bó chặt chẽ giữa chúng với đời sống.
1.2.2. Giai đoạn vi sinh học thực nghiệm
Người có cơng lớn nhất khai sinh ra vi sinh vật học thực nghiệm là nhà bác học
người Pháp Louis Pasteur (1822 – 1895), Ông đã đi vào nghiên cứu các hoạt động sinh
lí, sinh hóa của vi sinh vật và ứng dụng các vi sinh vật này trong quá trình lên men.
Qua quá trình nghiên cứu và thực nghiệm, Pasteur đã chứng minh vi sinh vật
không thể "tự sinh" hay "ngẫu sinh" như nhiều nhà bác học cùng thời chủ trương. Thí
nghiệm của Ơng được thực hiện trong bình cổ cong uốn khúc hình chữ U, trong bình có
chứa nước canh thịt đã đun sơi (Hình 1.5) và để yên lâu ngày vẫn không hư và không có
mùi hơi, nhưng nếu đập vỡ cổ bình thì ít lâu sau nước canh thịt sẽ hư thối vì nhiễm vi
sinh vật có sẵn trong khơng khí.

(a)

(b)

Hình 1.5. (a) Louis Pasteur, (b) Các loại bình cổ cong Pasteur sử dụng để bác bỏ
thuyết tự sinh.
4

Pasteur có cơng rất lớn với nhân loại vì đã giải quyết được phương pháp tẩy độc
rượu vang (đun đến 600C, giữ trong chai đậy kín), đưa đến phương pháp tẩy độc sữa,
thực phẩm vẫn còn áp dụng đến nay. Ngồi ra Ơng giải quyết được dịch bệnh tằm gai
(bệnh Pébrine) một dịch bệnh làm ngành nuôi tằm của Pháp bị suy sụp bằng cách chứng
minh bệnh này do vi sinh vật gây ra và truyền từ tằm bệnh sang tằm khỏe.
Pasteur đã chứng minh các bệnh truyền nhiễm ở người và động vật là do các vi
sinh vật gây nên. Từ năm 1878 đến 1880, Pasteur đã khám phá ra được ba chủng vi
khuẩn là liên cầu khuẩn (Streptococcus), tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) và phế cầu
khuẩn (Pneumococcus).
Xuất phát từ quan niệm một loại bệnh sẽ do một loại vi sinh vật nhất định do
nhiễm từ mơi trường bên ngồi gây nên, Pasteur đã thiết lập nên những nguyên tắc quan
trọng trong vơ khuẩn góp phần làm giảm đáng kể tỉ lệ tử vong hậu phẫu và hậu sản.
Năm 1880, Pasteur thành công trong việc tạo miễn dịch cho gà chống lại bệnh tả
bằng cách cho tiếp xúc với môi trường nuôi cấy vi khuẩn tả "già" (vi khuẩn này giảm
độc lực). Những con gà này sau đó có khả năng chống lại bệnh tả khi được tiêm vi
khuẩn độc lực mạnh. Ơng nhanh chóng áp dụng ngun lý này để tạo ra vaccin ngừa
bệnh cho cừu, dê chống lại bệnh than, vaccin tụ huyết trùng gà, bệnh heo bị đóng dấu,...
Cơng lao lớn nhất của Ơng đối với nhân loại là việc chế vaccin ngừa và trị bệnh
chó dại là bệnh nan y hiện giờ. Năm 1885, lần đầu tiên Pasteur đã dùng vaccin trị cho
một em bé bị chó dại cắn thốt khỏi bệnh. Ngày nay, khắp nơi trên thế giới đều có các
viện Pasteur để tiến hành các nghiên cứu chế tạo vaccin và thực hiện các chiến dịch
phòng chống lại các bệnh truyền nhiễm.
1.2.3. Giai đoạn sau Pasteur và vi sinh học hiện đại
Tiếp theo Pasteur, Robert Koch (1843-1910), người có cơng lớn trong phát triển
các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật. Ông đề ra phương pháp chứng minh một vi
sinh vật là tác nhân gây ra bệnh truyền nhiễm mà ngày nay mọi nhà nghiên cứu bệnh
học phải tuân theo, đó là qui tắc Koch (Postulate de Koch). Đến ngày 24-3-1882, Koch
đã công bố cơng trình khám phá ra vi trùng bệnh lao (một bệnh nan y thời đó) và gọi nó

là Mycobacterium tuberculosis. Khám phá đã mở đường cho việc chữa trị bệnh này.

Hình 1.6. Rober Kock đang quan sát mẫu trong phịng thí nghiệm.
5


Học trò của Kock là Juliyes Richard Petri (1852-1921) đã chế tạo ra được đĩa
Pêtri, một loại dụng cụ vẫn đang được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu vi sinh vật
hiện nay. Ông cũng đã nêu ra các biện pháp nhuộm màu vi sinh vật.
S. I. Vinogradxki (1856-1953) người Nga và M. W. Beijerinck (1851-1931) người
Hà Lan là những nhà vi sinh học có cơng lớn trong việc phát triển ngành vi sinh học đất.
Ivanopxki (1892) và Beijerrinck (1896) là những người phát hiện ra virus đầu tiên
trên thế giới khi chứng minh vi sinh vật nhỏ hơn vi khuẩn, qua được lọc bằng sứ xốp, là
nguyên nhân gây bệnh khảm cây thuốc lá.
Ngày nay, ngành vi sinh học đã phát triển rất sâu với nhiều nhà bác học có tên
tuổi và nhiều người tham gia nghiên cứu. Các nghiên cứu đã dần đi sâu vào bản chất
của sự sống ở mức phân tử và dưới phân tử, kỹ thuật cấy mô và tháo lắp ghép gen ở vi
sinh vật và ứng dụng kỹ thuật này để chữa bệnh cho người, gia súc và cây trồng,…

1. Antony van Leeuwenhoek (1632-1723);
2. Louis Pasteur (1822-1895);
3. Robert Koch (1843-1910);
4. Alexander Fleming (1881-1955);
5. J. D. Watson (1928-?)

Hình 1.7. Một số nhà sinh học tiêu biểu
1.3 HỆ THỐNG SINH GIỚI VÀ VỊ TRÍ CỦA CÁC NHÓM VSV
1.3.1 Khái niệm về giới sinh vật
Giới (Kingdom) là đơn vị phân loại lớn nhất hiện nay bao gồm những sinh vật có
chung những đặc điểm nhất định. Các hệ thống phân loại sinh vật là kết quả của hơn

200 năm nghiên cứu về hệ thống học.
Hệ thống các cơ thể ngày càng hợp lý nhờ những hiểu biết sâu sắc về sinh học
phân tử. Ngày nay, nhờ các phương pháp phân loại hiện đại như: hóa phân loại
(Chemotaxonomy), phân loại số (Numerical taxonomy), phân loại chủng loại phát sinh
(Phylogeney taxonomy),... mà khoa học đã xác định vị trí khá chính xác của các nhóm
cơ thể và mối liên hệ chủng loại phát sinh giữa chúng.
Thế giới sinh vật vô cùng phong phú và đa dạng. Để nghiên cứu chúng các nhà
khoa học phải dựa vào các tiêu chí về cấu tạo, dinh dưỡng, sinh sản,... để sắp xếp chúng
vào bậc thang phân loại và đặt tên.
Các sinh vật được sắp xếp theo thang phân loại từ thấp đến cao: Loài (Species),
Chi (Genus), Họ (Family), Bộ (Order), Lớp (Class), Ngành (Phylum) và Giới
(Kingdom). Hiện nay trên giới còn có một mức phân loại nữa gọi là lĩnh giới (Domain).
Ngồi ra cịn có các mức phân loại trung gian như Loài phụ (Subspecies), Chi phụ
(Subgenus), Họ phụ (Subfamily), Bộ phụ (Suborder), Lớp phụ (Subclass), Ngành phụ
(Subphylum).
Loài là bậc thang phân loại thấp nhất, giới là cấp phân loại cao nhất. Bất kỳ một
sinh vật nào cũng được sắp xếp vào một loài nhất định. Nhiều loài thân thuộc tập hợp
thành chi, nhiều chi thân thuộc tập hợp thành họ, nhiều họ thân thuộc tập hợp thành bộ,
nhiều bộ thân thuộc tập hợp thành lớp, nhiều lớp tập hợp thành ngành, nhiều ngành hợp
thành một giới. Để tránh nhầm lẫn người ta đặt tên loài theo nguyên tắc dùng tên kép
6


(theo tiếng Latinh). Tên thứ nhất là tên chi (viết hoa chữ cái đầu tiên), tên thứ 2 là tên
loài (viết thường) Ví dụ: Escherichia coli. Khi cần viết tắt ta chỉ viết tắt tên chi, tên loài
viết đầy đủ (bằng chữ thường). Ví dụ: E. coli.
1.3.2 Một số hệ thống phân loại sinh vật

1

2

3

4

1. Aristotle (384 – 322 TCN); 2. Carl Von Linne (1707 – 1778);
3. Ernst Heinrich Haeckel (1834 – 1919); 4. Robert Whittaker (1921-1981)

Hình 1.8. Một số nhà phân loại sinh vật tiêu biểu
Trước Linne có nhiều tác giả phân loại sinh vật nổi tiếng, đáng chú ý là Aristotle
(384 - 322 TCN) có nhiều đóng góp trong phân loại động vật.
Bảng 1.1. Một số hệ thống phân loại sinh vật

7


Hình 1.9. Hệ thống ba lĩnh giới (Domain) Carl R. Woese, 1990

Hình 1.10. Hệ thống phân loại 8 giới sinh vật (T. Cavalier – Smith, 1993)

Gần đây hơn có các hệ thống phân loại được nhiều người chú ý:

8


Hình 1.11. Hệ thống phân loại 6 giới sinh vật ( P. H. Raven and G. B. Johnson, 2002)
Trước khi ngành vi sinh vật được nghiên cứu tường tận như hiện nay, các nhà
nghiên cứu chia sinh vật làm 2 giới: giới thực vật (vegetalia) và giới động vật
(Animalia), vi sinh vật cũng xếp vào 2 giới trên như nấm, tảo và vi khuẩn được xếp vào

giới thực vật, còn nguyên sinh động vật (protozoa) được xếp vào giới động vật. Tuy
nhiên, với sự hiểu biết ngày càng sâu về vi sinh vật thì sự phân loại trên gặp nhiều khó
khăn và khơng hợp lý. Đến năm 1866, Ernest Haeckel, học trò của Darwin, đề nghị lập
thêm giới nguyên sinh vật (Kingdom protista) dành cho vi sinh vật. Đặc tính chung của
giới nguyên sinh vật gồm:
- Đơn vị sống là đơn bào, tự mỗi tế bào có thể tổng hợp lấy chất dinh dưỡng cần
thiết được (thực vật và động vật thì các tế bào chun hóa cao hơn và giữ một số nhiệm
vụ nhất định nên không thể sống độc lập được).
- Còn siêu vi khuẩn hay virus tuy khơng có cấu tạo tế bào nhưng cũng được xếp
chung vào giới nguyên sinh vật.
Giới nguyên sinh vật được chia ra làm 6 nhóm chính như sau:
a. Vi sinh vật nhân thực (giới nhân thực - chân hạch – Eukaryota) gồm những sinh
vật có nhân thực sự, nhân có màng bao bọc với tế bào chất của tế bào. Gồm 3 nhóm:
 Nhóm 1: Nguyên sinh động vật (protozoa): đơn bào, di động theo lối biến
hình trùng (amib) gần với động vật.
 Nhóm 2: tảo hay rong (Algae): đơn bào hoặc kết hợp thành khối đa bào
nhưng chưa chuyên hóa, có khả năng quang hợp
 Nhóm 3 (Eumycetes): đơn bào hoặc kết hợp thành khối đa bào nhưng các tế
bào chưa chun hóa, khơng quang hợp.
b. Vi sinh vật nhân nguyên (giới nhân nguyên - tiền hạch – Prokaryota) gồm các
vi sinh vật khơng có nhân thực sự, các chuỗi DNA tập trung thành vùng nhân nhưng
khơng có màng nhân bao bọc, nên không phân biệt với tế bào chất của tế bào. Gồm có:
 Nhóm 4: vi khuẩn (Schizomycetes) bao gồm vi khuẩn, dạng L của vi khuẩn
(L-form), xạ khuẩn (Actinomycetes), tảo lam hay vi khuẩn lam
(Cyanobacteria), Mycoplasma, Rickettsia, Chlamydia.
c. Các nhóm khác gồm
 Nhóm 5: siêu vi khuẩn hay virus: cấu tạo đơn giản, khơng có dạng tế bào, là
dạng sống thấp và đơn giản nhất của vi sinh vật.
9

 Nhóm 6: các dạng tế bào thực vật và động vật được ni cấy trong
phịng thí nghiệm (invitro) (cấy mơ) qua nhiều thế hệ đã trở nên đơn
bào, có khả năng sống tự lập trong mơi trường ni cấy.
Tóm lại, chúng ta có thể sắp xếp vi sinh vật theo các nhóm từ thấp đến cao,
theo mức tiến hóa, như sau:
Virus

Chưa có cấu tạo tế bào.

Giới nhân nguyên

Vi khuẩn, dạng L của vi khuẩn,
Mycoplasma, Ritketsia, Chlamydia, Xạ
khuẩn, Tảo lam.

Giới nhân thực

Protozoa, Tảo và Nấm.

Giới thực vật
Giới động vật
1.3.3 Những sai khác giữa các tế bào Prokaryote và Eukaryote
Nhóm sinh vật Nhân sơ và Nhân chuẩn có những sai khác cơ bản (Bảng1.5):
Bảng 1.2. Những sai khác giữa các tế bào Prokaryote và Eukaryote
Đặc điểm

Nhóm Nhân sơ
(Prokaryote)

Nhóm Nhân chuẩn
(Eukaryote)

* Tổ chức di truyền:
- Màng nhân
- Số NST
- Các NST chứa histon
- Hạch nhân
- Trao đổi di truyền

Chưa có
1
Khơng có
Khơng có
1 chiều qua plasmid

Có
>1
Có
Có
Bằng sự kết hợp giao tử

* Các cấu trúc của tế bào:
- Lưới nội chất
- Bộ máy Golgi
- Ti thể
- Các lisosome
- Các lạp thể

Khơng có

Khơng có
Khơng có
Khơng có
Khơng có

Có
Có
Có
Có
Có ở thực vật

- Kích thước ribosome
- Sợi thoi vô sắc
- Màng sinh chất
- Vách tế bào
(Peptidoglycan)

chứa

* Chức năng đặc trưng:
- Thực bào
- Ẩm bào
- Vị trí vận chuyển điện tử
- Dịng tế bào chất

70S
Khơng có
Khơng chứa steron
(trừ vi khuẩn lam)
PG Có murein ngoại trừ

Mycoplasma và vi
khuẩn cổ

80S ở nhân, 70S - bào quan
Có
Có chứa steron

Khơng có
Khơng có
Màng tế bào
Khơng có chuyển
động nội bào

Đơi khi có
Đơi khi có
Màng bào quan
Chuyển động nội bào rõ rệt

10

Khơng có


1.4. SỰ PHÂN BỐ VSV TRONG TỰ NHIÊN
Vi sinh vật phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Trên bề mặt hoặc bên trong tất cả các
vật thể sống hoặc không sống trong tự nhiên đều có nhiều ít vi sinh vật. Trong phần này
ta chỉ nghiên cứu về sự phân bố của vi sinh vật trong khơng khí, đất và nước.
1.4.1 Vi sinh vật trong khơng khí
Khơng khí khơng phải là môi trường thuận lợi cho vi sinh vật phát triển. Tuy
nhiên, trong khơng khí vẫn có vi sinh vật do cuốn theo bụi đất và sự hô hấp và bài tiết

của người và động vật.
Đa số vi sinh vật trong khơng khí là loại hoại sinh như cầu khuẩn, trực khuẩn có
bào tử, nấm mốc, nấm men. Nhiều khi trong khơng khí cũng có vi sinh vật gây bệnh
như trực khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis), trực khuẩn bạch hầu
(Corynebacterium diphtheriae), liên cầu khuẩn tan máu, tụ cầu khuẩn gây bệnh, trực
khuẩn ho gà, virus cúm, sởi, quai bị,... từ bệnh nhân hay người lành mang mầm bệnh
tiết ra.
Số lượng vi sinh vật trong khơng khí thay đổi tùy địa điểm, dân số, mùa trong
năm. Trên núi cao số lượng ít hơn dưới thấp. Nơi có tuyết phủ, 1 m3 khơng khí có 4 - 5
vi khuẩn. Khơng khí ở thành thị có nhiều vi sinh vật hơn ở nơng thơn. Những nơi đơng
dân cư, nơi cơng cộng thường có nhiều vi khuẩn, virus do người bài tiết ra làm ô nhiễm
bầu khơng khí trong một thời gian nhất định. Mơi trường ẩm thấp cũng có nhiều vi sinh
vật. Khơng khí quanh bệnh nhân có nhiều vi sinh vật hơn người lành.
Mặc dù vi sinh vật trong khơng khí khơng nhiều lắm, không sinh sản và phát
triển, nhưng cũng cần hết sức chú ý, vì khơng khí là phương tiện truyền vi sinh vật từ
chỗ này sang chỗ khác. Khơng khí cũng là nguồn nhiễm bẩn thực phẩm và gây nên một
số bệnh truyền nhiễm.
Sau những trận mưa lớn, khơng khí trở nên trong sạch. Các biện pháp trồng cây
xanh, xây dựng nhà cửa cao ráo thống khí, hàng ngày mở cửa phịng ở, phịng làm việc
cho khơng khí lưu thơng, để ánh sáng vào có tác dụng tốt trong việc làm sạch khơng
khí.
Trong một số trường hợp để khử trùng khơng khí, người ta thường dùng một vài
chất: acid lactic, formol, trietylenglycol, ozone, gần đây người ta dùng đèn phát tia tử
ngoại để sát trùng khơng khí các phịng mổ, phịng sản xuất và bảo quản lạnh trong
cơng nghiệp thực phẩm.
1.4.2 Vi sinh vật đất
Đất là môi trường thuận lợi cho vi sinh vật sống và phát triển (thức ăn, độ ẩm,
nhiệt độ, pH,...).
Số lượng và kết cấu hệ vi sinh vật thường xuyên thay đổi tùy theo loại đất, khu
vực địa lý, tầng đất, thời vụ và chế độ canh tác.

Thành phần vi sinh vật đất rất phức tạp bao gồm: vi khuẩn, xạ khuẩn, vi nấm, vi
tảo, động vật nguyên sinh. Riêng vi khuẩn rất phong phú, bao gồm vi khuẩn hiếu khí, kị
khí, tự dưỡng, dị dưỡng, vi khuẩn cố định đạm,...
Trong đất canh tác, có nhiều chất hữu cơ, thống khí, số lượng vi sinh vật lên tới
hàng triệu cá thể trong 1 g đất, đất hoang hóa và đất sa mạc có số lượng ít hơn.
Số lượng vi sinh vật thay đổi theo độ sâu của đất: trên bề mặt có ánh sáng mặt
trời, khơ ráo nên có ít vi sinh vật, ở độ sâu 0,5 – 25 cm có số lượng nhiều, 100 – 200 cm
số lượng bắt đầu giảm, ở độ sâu vài mét vi sinh vật ít tồn tại vì thiếu chất hữu cơ và ôxi.
11


Các nhóm vi sinh vật trong đất thường xuyên có liên quan với nhau, có khi tác
động tương hỗ lẫn nhau như Nitrosomonas và Nitrobacter, có khi chống đối nhau như
các loài vi khuẩn, vi nấm, xạ khuẩn phát sinh ra các chất kháng sinh ức chế sự phát triển
của các loại vi sinh vật khác.
Vậy hệ vi sinh đất chính là nguồn lây nhiễm cho nước, khơng khí. Rồi chúng theo
nước và khơng khí lan truyền khắp mọi nơi. Cần đề phòng vi sinh vật đất làm hư hỏng
lương thực thực phẩm và có thể gây một số bệnh hiểm nghèo như: bệnh than, bệnh uốn
ván, hoại thư sinh hơi, ngộ độc thịt,...
Mặt khác, vi sinh vật đất có tầm quan trọng đặc biệt trong sự hình thành chất mùn.
Trong đất cịn có những vi khuẩn cố định N2 sống tự do hoặc cộng sinh làm giàu thêm
nitơ cho đất. Nhưng ngược lại trong đất cũng có những vi khuẩn phản nitrate hóa, phản
sunfat hóa,... mức độ phì nhiêu của đất phụ thuộc vào sự hoạt động của chúng. Do đó ta
phải khống chế hoạt động của chúng để phát huy ảnh hưởng tốt, hạ thấp ảnh hưởng xấu,
đưa năng suất mùa màng lên cao. Đất cũng là nguồn tốt để phân lập VSV hữu ích.
1.4.3 Vi sinh vật nước
Nước là một vấn đề quan trọng trong đời sống cũng như trong công nghiệp thực
phẩm, dược phẩm,... Để hiểu rõ vấn đề này ta tìm hiểu sự phân bố vi sinh vật trong
nước, vấn đề làm sạch nước và vấn đề nước thải.
Cũng như đất, nước tự nhiên là một môi trường rất thuận lợi cho vi sinh vật tồn tại

và phát triển. Sự phát triển của vi sinh vật trong nước phụ thuộc vào một số yếu tố như
nhiệt độ, pH, nồng độ O2,..., trong đó quan trọng hơn cả là thức ăn trong nước. Nước
càng bị bẩn do xác bã hữu cơ - nghĩa là càng nhiều thức ăn thì càng chứa nhiều vi sinh
vật. Điều này ta sẽ thấy rõ khi nghiên cứu từng loại nước.
- Nước ngầm (nước mạch) có ít vi sinh vật là do nước đã được thấm qua các lớp
đất dày, vi sinh vật và các thức ăn hữu cơ được giữ lại trong lớp đất này. Nước ngầm
càng sâu thì càng sạch. Các giếng mạch nếu tìm được nguồn mạch tốt, sâu và có bảo vệ
để tránh nhiễm bẩn ở bờ thì sẽ cho ta nước rất tốt cho việc ăn uống.
- Nước ao, hồ bị nhiễm phân, rác rưởi có nhiều chất hữu cơ thì số lượng chủng
loại vi sinh vật tăng nhiều.
- Nước ở trong những hồ, biển lớn bụi bị lắng chìm nên số lượng vi sinh vật ít
hơn.
- Nước ở những vùng sơng, ngịi gần dân cư thì số lượng vi sinh vật nhiều hơn
vùng xa dân cư.
Nước trong tự nhiên có khả năng tự làm sạch do tác dụng của ánh sáng mặt trời và
do sự cạnh tranh sinh tồn mà hủy diệt lẫn nhau, hoặc là do chất kháng sinh của các thực
vật thủy sinh tiết ra.
Nước cũng là nguồn truyền bệnh nguy hiểm như vi khuẩn thương hàn (Salmonella
typhi, trực khuẩn lỵ (Shigella spp.), phẩy khuẩn tả (Vibrio cholerae),... ngoài những vi
sinh vật sống trong nước, cịn có những vi sinh vật gây bệnh do người và động vật làm ô
nhiễm. Các vi sinh vật gây bệnh này chỉ tồn tại trong nước một thời gian nhất định.
Chúng tồn tại trong nước lâu hay mau tùy theo nguồn nước, tính chất, nhiệt độ, pH...
của nước.

1.5 VAI TRÒ CỦA VSV TRONG ĐỜI SỐNG CỦA CON NGƯỜI
Cho đến nay, con người vẫn sử dụng các phương pháp vi sinh vật cổ điển như sản
xuất rượu, bia, men nở bột mỳ, các sản phẩm sữa nhờ vi khuẩn lactic; dấm nhờ vi khuẩn
acetic; chế biến tương, đậu nành nhờ nấm mốc,...
12

Hầu hết các chất kháng sinh đều do vi sinh vật tổng hợp.
Một số sản phẩm của vi sinh vật cũng được sản xuất nhờ các phương pháp vi sinh
vật hiện đại: carotinoid và steroid từ nấm mốc, acid glutamic và các aminoacid khác
cũng như nucleotit từ vi khuẩn. Nhiều enzyme quan trọng đều do vi sinh vật tổng hợp.
Chỉ có vi sinh vật mới có khả năng chuyển hóa các nguyên liệu đặc biệt, trữ lượng lớn
như dầu lửa, khí đốt, cellulose thành sinh khối hoặc các sản phẩm trung gian tiết vào
môi trường.
Năm 1982, hai nhà khoa học y học Australia Robin Warren và Barry Marshall đã
phát hiện ra vai trò của vi khuẩn Helicobacter pylori và cơ chế gây bệnh viêm loét dạ
dày và viêm ruột ở người (giải Nobel năm 2005).

Hình 1.12. Barry J. Marshall, J. Robin Warren và vi khuẩn Helicobacter
pyroli sống trong đáy dạ dày.
Kỹ thuật di truyền hiện đại có thể đưa một đoạn DNA bất kỳ vào vi khuẩn, buộc
chúng tổng hợp một protein tương ứng như hormon, kháng nguyên, kháng thể... Việc
chuyển các gene cố định N2 và các gene kháng sâu hại sang cây hay chuyền khả năng
điều trị các bệnh do khuyết tật sinh hóa gây nên, cũng đang được quan tâm đặc biệt.
Ở Việt Nam, chúng ta cũng đã dùng phương pháp trực tiếp bắn gene và phương
pháp gián tiếp chuyển gene bằng con đường plasmid để chế vaccine có kết quả. Tháng 2
năm 2004, viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh cũng đã giải mã thành cơng bộ gene
H5N1 (gây bệnh cúm ở người từ gà) để có hướng điều trị bệnh này.
Những thành tựu khoa học hiện nay, những kinh nghiệm của thế giới đã chứng
minh rằng: vi sinh học là ngành khoa học tuy mới phát triển nhưng có ý nghĩa về mặt lý
luận cũng như thực tiễn, có tương lai phát triển rực rỡ trong tương lai.

13


Chương 2

PHƯƠNG TIỆN VÀ THỦ THUẬT
TRONG NGHIÊN CỨU VI SINH HỌC
2.1. PHƯƠNG TIỆN
2.1.1 Kính hiển vi quang học
Độ phân giải của một hệ quang học là khả năng phân biệt các điểm không gian,
được định nghĩa bằng khoảng cách giữa hai điểm gần nhau nhất có thể phân biệt được
nhờ hệ quang học này. Độ phân giải của kính hiển vi quang học bị quy định bởi khả
năng phân giải của các thấu kính, mà ở đây bị giới hạn bởi hiện tượng nhiễu xạ ánh
sáng. Độ phân giải của kính hiển vi quang học sẽ bị giới hạn bởi bước sóng ánh sáng
khả kiến và chỉ số khẩu độ:

λ là bước sóng ánh sáng,
NA là thơng số khẩu độ.
Vì thế, độ phân giải của các kính hiển vi quang học tốt nhất chỉ vào khoảng vài
trăm nm. Ví dụ với hệ kính sử dụng ánh sáng xanh (λ = 550 nm), chỉ số khẩu độ đối với
khơng khí là 0,95 hoặc có thể đạt cao nhất là 1,5 nếu sử dụng dầu. Như vậy, độ phân
giải tốt nhất của hệ có thể đạt được khoảng dưới 200 nm. Có nghĩa là những điểm trong
khoảng cách này sẽ không thể nào phân biệt được.
Những kính hiển vi đầu tiên được phát minh vào năm 1590 tại Middelburg, Hà
Lan. Ba người thợ tạo kính là Hans Lippershey (người đã phát triển các kính viễn vọng
trước đó), Zacharias Janssen, cùng với cha của họ là Hans Janssen là những người đầu
tiên xây dựng nên những kính hiển vi sơ khai. Năm 1625, Giovanni Faber là người xây
dựng một kính hiển vi hồn chỉnh đặt tên là Galileo Galilei. Đến năm 1655, Robert
Hooke đã phát minh ra kính hiển vi quang học (photonic microscope) nhờ đó quan sát
được các tế bào. Các kính hiển vi thường (quang học) được hoàn thiện dần đến nay có
độ phóng đại cỡ 2000 lần.
Kính hiển vi quang học là một loại kính hiển vi sử dụng ánh sáng khả kiến để
quan sát hình ảnh các vật thể nhỏ được phóng đại nhờ một hệ thống các thấu kính thủy
tinh. Kính hiển vi quang học là dạng kính hiển vi đơn giản, lâu đời nhất và cũng là phổ
biến nhất. Các kính hiển vi quang học cũ thường phải quan sát hình ảnh trực tiếp bằng

mắt nhìn qua thị kính, nhưng các kính hiện đại hiện nay cịn được gắn thêm các LCD
camera hoặc các phim ảnh quang học để chụp ảnh.
2.1.1.1 Kính hiển vi thường
Kính gồm nhiều thấu kính quang học để phóng đại vật quan sát lên nhiều lần.
Kính có 2 hệ thống thấu kính: vật kính và thị kính. Mỗi bộ phận là một hệ thống thấu
kính hội tụ phức tạp. Vật để quan sát AB được đặt trước vật kính một khoảng cách lớn
hơn tiêu cự của vật kính một chút. Ảnh thật đảo ngược A’B’ của vật thu được ở bên kia
vật kính, nằm trong tiêu cự của thị kính. Qua thị kính ta thấy ảnh ảo A”B” được phóng
to lên của ảnh A’B’(Hình 2.1).

14


Vật kính

Thị kính

Mắt

Hình 2.1. Sơ đồ đường đi của các tia sáng khi quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi
Cấu tạo và chức năng của các bộ phận trong kính hiển vi: gồm 2 phần chính:
* Phần cơ học
- Chân kính.
- Giá đỡ ống kính.
- Thân ống kính.
- Mâm kính.
* Phần quang học
- Tụ quang gồm hệ thống thấu kính và chắn sáng. Một số kính cịn mang vịng
đỡ để mang kính lọc ánh sáng. Tụ quang được gắn trên giá đỡ, có thể nâng lên hay hạ
xuống.

- Vật kính: phần quan trọng nhất trong hệ thống quang học của kính hiển vi, nó
quyết định khả năng nhìn rõ của kính. Chúng là một hoặc có thể là hệ thống thấu kính
có tiêu cự ngắn, cho phép phóng đại vật. Nhờ có giá điều chỉnh nên các vật kính khác
nhau có thể xoay để thay đổi độ phóng đại. Bên ngồi mỗi vật kính có khắc độ phóng to
của vật kính (4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 100x,…) và các đặc tính khác. Một số vật kính
thường dùng (Bảng 2.1). Ba vật kính đầu khơng địi hỏi điều kiện độ dầy của lá kính.
Hai vật kính sau (vật kính khơ có độ phóng to cao và vật kính chìm) u cầu độ dầy của
lá kính là 0.17 mm.
Bảng 2.1. Đặc điểm của một số vật kính
Ký hiệu của vật kính

Độ phóng Trị số Độ dầy của Khoảng
cách
to
mở
lá
kính giữa vật kính và
(mm)
lá kính (mm)
Vật kính khơ
3,2/0.1
3,2
0,1
19,6
6,3/0.16
6,3
0,16
8,5
10/0.25
10

0,25
7,2
40/0.65
40
0,65
0,17
0,5
Vật kính chìm
HI100/1,25
100
1,25
0,17
0,06
- Thị kính: có cấu tạo đơn giản hơn vật kính gồm từ một đến hai thấu kính thủy
tinh cho phép tạo ra ảnh cuối cùng của vật quang sát qua hệ quang học và một chắn
15


sáng ở giữa. Trên mỗi thị kính có độ phóng đại, độ phóng đại thường khá nhỏ, thường
chỉ dưới 10x, được lắp đặt trong một ống trụ, cho phép thay đổi dễ dàng.
Ngồi các hệ thống trên các kính hiển vi cịn có thêm hệ thống chiếu sáng. Đơn
giản nhất là một gương phẳng hoặc một gương lõm để phản chiếu ánh sáng trời hoặc
ánh sáng của đèn, tạo thành cụm sáng chiếu xuyên qua vật quan sát. Để có thể điều
chỉnh được cường độ ánh sáng, có một hệ thống quang học gồm nhiều thấu kính có mục
đích biến chùm tia sáng thành chùm tia hội tụ nên tăng cường độ chiếu sáng lên.
Kính hiển vi quan sát vật nhờ các tia sáng chiếu xuyên qua vật nhờ đó có thể quan
sát được cơ cấu bên trong của vật nếu chúng được cắt mỏng ra. Yếu điểm của kính này
là khơng quan sát được hình dạng nổi bên ngồi của vật vì chỉ nhìn được vật trên một
mặt phẳng thẳng góc với ống ngắm.
Cách tính độ phóng to chung của kính hiển vi: L

L= Lt x Lv
L: độ phóng to của kính hiển vi
Lt: độ phóng to của thi kính
Lv: độ phóng to của vật kính

Thị kính

Thân ống kính

Giá đỡ ống kính
Vật kính

Bàn đặt mẫu vật
Tụ quang

Đèn

Chân kính

Hình 2.2. Kính hiển vi quang học
2.1.1.2. Kính phóng đại hai ống ngắm hay kính hiển vi soi nổi (loupe binoculare,
stereomicroscope): kính dùng để quan sát bên ngồi của vật với hình ảnh nổi của vật.
Độ phóng đại thường nhỏ, khơng q 200 lần. Kính gồm hai ống ngắm ghép song song
nhau và quan sát với hai mắt cùng một lúc. Nhờ đó chúng ta thấy được hình ảnh nổi.
Khác với kính hiển vi thường, kính này thường dùng tia sáng phản chiếu để quan sát.

16


Hình 2.3. Kính hiển vi soi nổi (kính phóng đại hai ống ngấm)

2.1.1.3 Kính hiển vi đáy đen (Darkfield microscope)
Kính hiển vi này gồm một kính hiển vi thường có gắn bộ hội tụ tia sáng
(condenser) đặc biệt. Bộ hội tụ này hoặc được cấu tạo đặc biệt hoặc được che ở phần
giữa, do đó ngăn các tia sáng chiếu thẳng vào vật và chỉ cho các tia sáng chiếu xiên vào
vật mà thơi (Hình 2.4).

Mẫu vật

Hình 2.4. Sơ đồ bộ tụ quang đáy đen trong một kính hiển vi đáy đen.
Khi quan sát sẽ thấy thị trường có màu đen, vì chỉ quan sát được với tia sáng xiên.
Nếu có vật, tia sáng xiên chiếu vào vật sẽ cho tia bức xạ, chúng ta quan sát được ảnh
bên ngoài của vật nhờ các tia bức xạ này.
Công dụng của kính hiển vi là có thể quan sát khơng cần nhuộm màu do đó quan
sát được vật đang cịn sống.
2.1.1.4 Kính hiển vi tương phản (Contrast phase microscope)
Cùng mục đích với kính hiển vi đáy đen, kính hiển vi tương phản dùng để quan
sát các vật quá nhỏ trong tình trạng vật đang sống (khơng nhuộm màu). Kính hiển vi
tương phản cho hình ảnh của vật rõ hơn kính hiển vi đáy đen và thấy được các chi tiết
bên trong.
Kính hiển vi này cũng chỉ là kính hiển vi thường, nhưng có gắn thêm hai bộ phận
17


đặc biệt: vòng mở tia sáng (annuar diaphragm) ở bộ phận điều chỉnh lưu lượng ánh sáng
và đĩa tạo tương phản hay tạo lệch pha (phase shifting element) đặt trong vật kính (Hình
2.5). Nhờ 2 bộ phận này, ánh sáng đi ngang qua vật quan sát được phân tích thành hai
chùm tia, một chùm tia sáng cứng đi ngang qua vật và chùm tia sáng bị khúc xạ đi qua
chung quanh vật. Vì vật chất trong vi sinh vật có chiết suất gần bằng nhau do đó rất khó
nhận thấy nếu không nhuộm màu (như khi ta quan sát một miếng thủy tinh đặt trong
chậu nước). Nhờ dùng 2 chùm tia có độ dài sóng khác nhau chiếu xuyên qua nên ta có

thể thấy được các vật khác nhau có chiết suất gần giống nhau.

Hình 2.5. Sơ đồ đường đi của các tia sáng trong kính hiển vi tương phản để tạo ra sự
lệch pha giúp cho thấy rõ các chi tiết bên trong mẫu vật hơn.
2.1.2 Kính hiển vi điện tử
2.1.2.1 Nguyên tắc
Kính hiển vi quang học ngày càng được cải tiến. Từ thập niên 1690 đến nay, kính
hiển vi từ một thấu kính đơn giản với độ phóng đại vài mươi lần, ngày nay chúng ta có
kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1500 - 2000 lần, thậm chí lên 2500 lần. Tuy
nhiên kính hiển vi quang học không thể vượt lên khỏi giới hạn trên được, do đó khơng
thể giúp chúng ta quan sát được virus. Lý do của giới hạn này là vì ánh sáng thường mà
chúng ta để quan sát trong kính hiển vi quang học, có độ dài sóng tương đối lớn (400 –
700 nm). Với độ dài sóng như vậy chúng ta khơng thể quan sát các vật nhỏ, như trong
Hình 2.6.

18


Hình 2.6. Thí dụ chứng minh vì sao kính hiển vi quang học khơng thể quan sát vật có
kích thước quá nhỏ (virus).
A. Với các hạt bụi mịn (bước sóng tia điện tử) bàn tay sẽ hiện rõ ra với các chi
tiết của các ngón tay.
B. Với các hạt bụi to hơn (bước sóng của ánh sáng thấy được), các ngón tay
khơng thể hiện ra được.
Điều quan trọng nữa là đối với kính hiển vi khơng phải số lần phóng đại mà cái
được gọi là giới hạn phân giải (resolution limit) tức giới hạn nhỏ nhất mà người ta phân
biệt được hai điểm kề sát nhau không chập lại thành một. Giới hạn này tuỳ thuộc bước
sóng ánh sáng, nên kính hiển vi thường chỉ phân biệt được khoảng cách nhỏ nhất
khoảng 0.2 µm. Do đó, hướng phát minh ra những dụng cụ giúp chúng ta quan sát được
những vật cực nhỏ được đặt ra. Năm 1931, Knoll và Ruska (Đức), đã lần đầu phát minh

ra kính hiển vi điện tử.
Kính hiển vi điện tử này áp dụng nguyên tắc là nếu một nguồn bắn điện tử đặt ở
một hiệu điện thế cao (khoảng 30 – 150 KV) sẽ bắn các tia điện tử có độ dài sóng rất
ngắn (0,5 nm). Các độ dài sóng này có thể bị từ trường làm lệch đường đi (giống như
thấu kính làm lệch đường đi của tia sáng) (Hình 2.7).

Hình 2.7. Nguyên tắc cấu tạo của kính hiển vi điện tử (A) So sánh với kính hiển
vi quang học (B)
Áp dụng nguyên tắc trên kính hiển vi điện tử được cấu tạo như sau:
19


2.1.2.2 Cấu tạo kính hiển vi điện tử xuyên thẳng (transmission electron microscope)

Hình 2.8. Ảnh chụp bên ngồi của một kính hiển vi điện tử xuyên thẳng.
Tất cả các bộ phận được đặt trong một trụ kín và tạo chân không bằng một bơm
hút. Trong chân không hoạt động của điện tử không bị cản trở.
Các điện tử bắn xuyên qua mẫu vật được các vật kính và thị kính bằng điện tử làm
tản rộng ra (phân kỳ), sau cùng hiện lên màng huỳnh quang có bộ máy chụp ảnh để
chụp ảnh khi cần. Tia điện tử khi xuyên qua mẫu vật sẽ bị ngăn cản hoặc khơng tùy theo
tính chất của mẫu vật sẽ hiện hình trên màng huỳnh quang thành ảnh đen trắng. Các nơi
của mẫu vật ngăn cản tia điện tử sẽ có màu đen.
Để có thể quan sát mẫu vật với kính hiển vi điện tử, mẫu phải được cắt (vi phẫu
thuật) thành những lát thật mỏng, bề dày dưới 1 µm, có thể đạt đến 0,02 µm. Để cắt
những lát mỏng như vậy mẫu vật cần được định hình, sau đó ngâm và đúc khn rồi cắt
lát với máy siêu vi phân. Dao để cắt lát làm bằng thủy tinh, để có thể tạo những cạnh
thật bén mới có thể tạo được những phẫu thức mỏng như vậy. Mẫu vật cần được nhuộm
với các chất cản điện tử để tạo ra sự tương phản của hình ảnh trên màng huỳnh quang.
Có rất nhiều hóa chất dùng để nhuộm mẫu vật, thường là basic lead citrate hoặc uranyl
acetate 1% hoặc phosphotungstic acid,...

Vĩ chứa mẫu vật là miếng lưới đồng, trên phủ một lớp phim thật mỏng bằng vật
chất không hấp thu hoặc không làm tản mất tia điện tử, phải bền, không bị tia điện tử
bắn thủng.
Ngồi ra để quan sát mẫu vật, có thể phủ lên trên một lớp mỏng kim loại
(shadowing). Thủ thuật này được thực hiện trong một lịng kín chân khơng, sợi kim loại
vàng hoặc palladium,... được đun nóng bằng điện và bốc hơi, hơi kim loại rơi xuống
phủ lên vật quan sát. Nếu vật quan sát được đặt nghiêng so với hướng phủ của kim loại,
sẽ có bóng ngã tùy theo chiều cao của vật, nhờ đó khi quan sát chúng ta thấy được hình
ảnh của vật nổi lên.
Ảnh do kính hiển vi điện tử cung cấp có thể quan sát trực tiếp được, cũng có thể
chụp ảnh nhờ một bộ phận chụp ảnh đặt bên dưới màng huỳnh quang.

20


2.1.2.3 Cấu tạo kính hiển vi soi nổi (scanning electron microscope)

Hình 2.9. Kính hiển vi điện tử soi nổi (scanning electron microscope)
Cũng với nguyên tắc trên, tia điện tử thay vì xun qua mẫu vật, trong kính hiển
vi điện tử soi nổi (scanning electron microscope) (cũng cịn gọi là kính hiển vi điện tử
quét) tia điện tử chiếu lên bề mặt của mẫu vật, phản chiếu lại và hiện hình ảnh bên ngồi
của mẫu vật lên mành huỳnh quang.
Để có thể quan sát với kính hiển vi điện tử nổi, mẫu vật cần được phủ bằng một
lớp kim loại, thường dùng vàng, để có thể phản chiếu các tia điện tử.
2.1.3. Máy ly tâm (Centrifuge)
Máy ly tâm là dụng cụ dùng để lắng các vật thể to trong một dung dịch hoặc để
phân tách các vật thể có khối lượng khác nhau trong một dung dịch. Các loại máy ly
tâm:
2.1.3.1. Bộ ly tâm quay tay (Hand-crank centrifuge)
Cấu tạo đơn giản, quay bằng tay, vận tốc quay thường kém (khoảng 700 - 1500

vịng/ phút, có loại đật tốc độ 3000 vịng/phút). Thường dùng để lắng tuyến trùng, bào
tử nấm, vi khuẩn.
2.1.3.2. Máy ly tâm thông thường (Centrifuge)
Quay bằng động cơ điện, vận tốc thực dùng tối đa khoảng 16000 vịng/ phút,
thơng thường là 3.000 vịng/ phút. Rất thơng dụng trong các phịng nghiên cứu vi sinh
học.
2.1.3.3. Máy siêu ly tâm (Ultracentrifuge)
Có vận tốc quay rất nhanh, có thể đạt đến 150.000 vòng/ phút. Tuy nhiên ở vận
tốc trên 25.000 vòng/ phút, máy cần có bộ phận tạo chân khơng cho nồi quay khơng bị
ma sát vì khơng khí, để tránh nguy hiểm. Ngồi ra, máy cịn được trang bị thêm bộ phận
làm lạnh ở nhiệt độ cố định. Máy rất cần thiết cho các nghiên cứu về virus.
Khi sử dụng máy ly tâm, nhất là máy siêu ly tâm cần quan tâm đến việc làm cân
bằng trọng lượng các ống ly tâm. Một sự chênh lệch nhỏ về trọng lượng giữa hai ống ly
tâm đối xứng nhau, có thể gây nguy hiểm chết người nếu với vận tốc quay lớn.

21


2.2. CÁC THỦ THUẬT CĂN BẢN TRONG NGHIÊN CỨU VI SINH HỌC
2.2.1. Nhuộm màu
Khi quan sát mẫu vi sinh vật qua kính hiển vi quang học, phần lớn cơ cấu bên trong
của vi sinh vật có chiết suất gần bằng nhau cho nên rất khó phân biệt. Để có thể quan sát
dễ dàng hơn chúng ta phải nhuộm màu vật. Tùy theo loại màu áp dụng toàn thể vi sinh vật
hoặc một vài cơ quan bên trong vi sinh vật ăn màu khiến cho hình ảnh các cơ quan này có
thể quan sát được rõ hơn.
Phần lớn màu nhuộm trong vi sinh học là các muối và được phân làm hai nhóm:
nhóm màu acid gồm các muối mà ion mang màu là anion (mang điện tích -) và nhóm các
bazơ có ion mang màu là cation (mang điện tích +). Thí dụ: sodium+ eosinate- là màu
eosin có tính acid và methylene blue (methylene+ chloride-) có tính bazơ.
Màu acid vì ion mang màu sẽ phối hợp với một bazơ để cho ra một muối màu. Cịn

màu bazơ vì ion mang màu có tác động như một bazơ, phối hợp với một acid cho ra một
muối màu.
Một cách tổng quát màu acid phối hợp chặt (ăn màu) với thành phần của tế bào chất
của tế bào và màu bazơ phối hợp (ăn màu) với thành phần của nhân tế bào (có tính acid).
Một số các màu nhuộm chỉ bao phủ ngoài mặt mẫu vật được nhuộm do quá trình
hấp thu hoặc là nó tan hay kết tủa chung quanh vật được nhuộm.
2.2.1.1 Nhuộm đơn
Phần lớn màu để nhuộm đơn thường dùng là methylene blue, crystal violet, basic
fuchsin. Chúng thuộc nhóm màu aniline (hắc in). Có rất nhiều cơng thức và thủ thuật để
nhuộm đơn mẫu vật. Đối với vi khuẩn, thường dùng dung dịch Loeffler's methylene blue
Dịch A
- Methylene blue:
0,3 g
- Ethyl alcohol 95%:
30 ml
Dịch B :
KOH (0,01%):
100 ml
Hòa hai dung dịch A và B lại, có Loffler's methylene blue. Để dành lâu được. Dung
dịch Loffler giúp quan sát được nhiều chi tiết về hình dạng và cấu trúc của tế bào
Đối với nấm, thường dùng dung dịch Lactophenol cotton blue:
Phenol (tinh thể tinh ròng)
20 g
Lactic acid
20 g
Glycerol
40 g
Cotton blue (methyl blue)
0,05 g
Nước cất

20 ml
Cotton blue nhuộm xanh nguyên sinh chất của nấm. Lactophenol có chiết xuất là
1,45 nên giúp quan sát nấm rõ ràng hơn. Lactophenol có làm cho tế bào hơi co lại nên
mẫu quan sát được hơi nhỏ hơn bình thường.
2.2.1.2 Nhuộm gram
Dùng để nhuộm vi khuẩn. Đây là phương pháp nhuộm màu có phân biệt, vì khơng
phải nhuộm tất cả vi khuẩn mà chỉ nhuộm một số chi vi khuẩn cịn các chi vi khuẩn khác
thì khơng ăn màu. Qua phương pháp nhuộm Gram, chúng ta chia vi khuẩn ra làm hai
nhóm, vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm. Phương pháp này rất quan trọng trong
việc phân loại vi khuẩn.
Để nhuộm gram, trước hết ta nhuộm mẫu vật với màu crystal violet (30 giây). Sau
khi rửa sạch màu, nhuộm thêm với dung dịch lugol iodine (30 giây). Tất cả vi khuẩn đều
ăn màu tím sẫm. Đem nhúng mẫu trong cồn 950 (20 giây đến 1 phút), cồn sẽ tẩy màu tím
trên một số vi khuẩn. Ta gọi các vi khuẩn cịn giữ màu tím là vi khuẩn gram dương (+),
còn vi khuẩn bị tẩy màu là gram âm (-). Để có thể phát hiện vi khuẩn gram (-), ta nhuộm
mẫu với màu đỏ eosin, hoặc đỏ safranin hoặc lục brillant green hoặc nâu Bismarck brown.

22


Vi khuẩn gram (+) có màu tím cịn vi khuẩn gram (-) có màu đỏ hoặc lục hoặc nâu tùy
hóa chất.
Lý do của vi khuẩn gram (-) bị khử màu tím bởi cồn 950 là do cấu tạo lý tính và hóa
tính của vách tế bào vi khuẩn 2 nhóm này khác nhau. Vi khuẩn gram (+) có vách dày cịn
vi khuẩn gram (-) có vách gồm nhiều lớp phức tạp. Cấu tạo lý tính và hóa tính của vách vi
khuẩn gram (+) đã tạo ra tình trạng giữ màu tím crystal violet và iod rất chặt nên khơng bị
cồn khử.

Hình 2.10. Nhuộm gram
2.2.1.3. Nhuộm roi

Đường kính roi của vi khuẩn rất nhỏ nên khó quan sát được qua kính hiển vi quang
học. Để quan sát được cần nhuộm màu đặc biệt. Nguyên tắc nhuộm trước hết là phủ lên
roi một lớp hóa chất để làm cho roi to ra và hóa chất này cũng giữ màu nhuộm. Hóa chất
để tơ phủ roi có thể là tannic acid, màu nhuộm có thể dùng pararosaniline.
2.2.2. Khử trùng
Trong khi nghiên cứu vi sinh vật, chúng ta thường áp dụng thủ thuật nuôi cấy vi
sinh vật thuần chủng. Trong một ống nghiệm hoặc lọ kín hoặc đĩa petri nếu chỉ chứa một
chủng loại vi sinh vật thì ta gọi là một mẻ cấy (inoculum).
Trong lúc ni cấy, để có thể giữ được một mẻ cấy thuần chủng, cần phải thực hiện
việc nuôi cấy trong điều kiện vơ trùng. Vi sinh vật có mặt ở khắp nơi, trong khơng khí,
hơi thở,... và trong mơi trường để nuôi cấy nên làm cho mẻ cấy bị nhiễm vi sinh vật lạ. Do
đó, chúng ta cần khử trùng môi trường và dụng cụ nuôi cấy.
2.2.2.1 Nguyên tắc: có 3 nguyên tắc trong khử trùng
Thanh trùng (Sterilization): Tiêu diệt tất cả vi sinh vật trên và trong dụng cụ cần
thanh trùng. Thường dùng nhiệt, hơi như formol, ethylen oxide,... các dung dịch hóa chất
như HgCl2, Sodium hypochloride,... hoặc dùng các tia cực tím, tia gamma. Hoặc tách vi
sinh vật ra khỏi dung dịch cần thanh trùng với phương pháp ly tâm, phương pháp lọc,...
Tẩy độc (disinfection): Chỉ diệt hoặc tách các vi sinh vật có thể gây nhiễm trùng,
không cần phải tách hoặc diệt tất cả các vi sinh vật. Thí dụ: tẩy độc sữa tươi (milk
pasteurization). Để bảo quản sữa tươi trong nhiều ngày ở nhiệt độ lạnh mà sữa không hư,
người ta đưa sữa lên đến 71 – 800C trong 15 - 30 giây. Ở nhiệt độ và thời gian này tất cả
các vi sinh vật chịu lạnh đều chết hết, chỉ còn lại vi sinh vật chịu nhiệt độ trung bình và vi
sinh vật chịu nóng. Hai nhóm này khơng phát triển được ở nhiệt độ lạnh của tủ tồn trữ (4 100C). Ngoài ra phương pháp tẩy độc này không làm mất dưỡng chất có trong sữa tươi.
Kiềm hãm (microbistasis): (statis là giữ lại, không cho phát triển thêm): không giết

23


vi sinh vật ngay mà chỉ giữ vi sinh vật trong tình trạng bất động (khơng gia tăng thêm mật
số) trong một thời gian lâu dài và sau đó vi sinh vật tự chết dần mà không sinh sản thêm.

Thường dùng các tác nhân như sự khô ráo, nhiệt độ lạnh, chất kháng sinh, các hóa chất
thuộc nhóm sulfonamic, một số màu nhuộm dung dịch ưu trương.
2.2.2.2. Phương pháp: các phương pháp thường dùng là:
* Phương pháp dùng nhiệt
Dùng nhiệt khô: áp dụng để thanh trùng các dụng cụ không cháy, thí dụ như kim
loại, thủy tinh,... Phần lớn vi sinh vật bị giết chết ở 1000C. Tuy nhiên có một số chi vi
khuẩn có khả năng tạo nội bào tử (nội bào tử còn được gọi là nha bào = endospore) và
chịu đựng được nhiệt độ này trong một thời gian. Do đó khi thanh trùng dụng cụ bằng
phương pháp nhiệt khô chúng ta phải dùng nhiệt độ 150 - 1800C trong tối thiểu 1 giờ hoặc
1200C trong tối thiểu 4 giờ, mới đảm bảo giết được vi sinh vật bám trên dụng cụ.
Dùng nhiệt ướt: để thanh trùng hoặc tẩy độc môi trường nuôi cấy, thực phẩm,
dụng cụ, hóa chất.
+ Thường dùng hơi nước sơi (1000C) tối thiểu là 1 giờ để tẩy độc, với mục
đích loại virus và một số vi khuẩn thường gặp. Thường áp dụng khi nghiên cứu virus.
+ Để thanh trùng vi khuẩn và nấm, phải dùng hơi nước sơi trong nồi kín để tạo
áp suất từ 1 kg/ cm2 trở lên, để đưa nhiệt độ lên đến 1210C. Thời gian thanh trùng tối thiểu
20 phút (nồi autoclave).
+ Đối với các hóa chất bị phân hủy ở nhiệt độ trên 1000C ta thanh trùng ở nhiệt
0
độ 100 C trong 1 giờ, sau đó để ở nhiệt độ thường (20 – 300C) trong 1 ngày. Hôm sau lại
thanh trùng ở nhiệt độ 1000C trong 1 giờ rồi để ở nhiệt độ thường. Lặp lại 3 lần (phương
pháp này còn gọi là Tyndallization) do:
 Ở 1000C giết tất cả các vi sinh vật ở dạng đang hoạt động trừ các dạng lưu
tồn như nội bào tử, bì bào tử,... Các dạng lưu tồn sẽ chuyển sang dạng hoạt
động khi trở lại nhiệt độ bình thường.
 Lần thứ hai để giết những vi sinh vật hoạt động trở lại này.
 Lần thanh trùng thứ ba nhằm đảm bảo diệt tất cả vi sinh vật cịn sót lại sau
hai đợt thanh trùng trước.
Lưu ý: Khi sử dụng nồi thanh trùng bằng hơi nước cần kiểm tra lại xem đó là nồi
autoclave hay nồi thanh trùng Tyndall (Tyndallization).

* Phương pháp dùng hóa chất: có nhiều hóa chất có khả năng diệt vi sinh vật được dùng
để thanh trùng như:
- Các halogens
 CaCl2: ở nồng độ từ 0,5 -5%, chất tác động thanh trùng là chlor. Thường
dùng khử độc nước dùng trong thành phố.
 Iodine: là một chất thanh trùng tốt nhưng ít dùng hơn vì đắt và có màu.
Trước đây, ngành y tế dùng cồn iod 2% để thanh trùng vết thương.
- Các kim loại nặng
 Chlorua thủy ngân (Bichloride of mercury) HgCl2: dùng ở dạng dung dịch
1‰ hoặc 1/5000. Dùng khử độc ngồi mặt mẫu vật khi ni cấy.
 Sulfat bạc: thuốc nhỏ mắt dành cho trẻ sơ sinh (1%).
 Sulfat đồng: dùng để diệt rong xanh (làm xanh nước) trong hồ nước và là
thuốc diệt nấm trong nông nghiệp.
Lưu ý là các kim loại nặng là những chất lưu tồn rất bền ngoài thiên nhiên, trong
dây chuyền thực phẩm. Nó là một trong các chất gây ơ nhiễm cho môi trường sống. Cần
hết sức thận trọng trong khi sử dụng. Không được đổ các chất này ra cống thoát nước khi
chưa xử lý .
- Các chất khác

24




Phenol: là chất chống vi sinh vật rất tốt, được dùng trong y khoa, như tẩy
rửa phòng mổ. Vào thời sau Pasteur, các bác sĩ phải rửa tay bằng acid
phênic lỗng trước khi vào phịng mổ.
 Cồn: cồn ethyl và cồn isopropyl được dùng để thanh trùng như rửa tay,
thanh trùng vết thương khi chích. Cồn ethyl dùng thanh trùng tốt nhất ở
70%. Dùng nồng độ cao hơn 95% hoặc 100%, hiệu quả kém hơn.

 Xà bông: dùng rửa tay, dụng cụ.
 Chất tẩy: bột giặt tổng hợp có tính thanh trùng tốt, nhất là với virus.
 Formol: có tính thanh trùng mạnh, giết được bào tử vi khuẩn. Formol bốc
hơi nhanh, nên formol có thể thanh trùng nhà cửa, phòng ốc hoặc dụng cụ.
Điều kiện tốt nhất để hơi formol phát huy tác dụng thanh trùng là ẩm độ
70% và nhiệt độ khoảng 220C. Formol hịa nước cũng có khả năng thanh
trùng mạnh.
* Phương pháp dùng tia sáng
- Tia cực tím (ultraviolet light): là sóng điện từ có bước sóng ngắn hơn ánh sáng
nhìn thấy (400 – 700 nm) nhưng dài hơn tia X (tia Rontgen) (10 nm – 100 pm), tia cực
tím có tính thanh trùng mạnh, diệt được cả bào tử vi khuẩn. Phổ tia cực tím có thể chia ra
thành tử ngoại gần (380 – 200 nm) và tử ngoại xa hay tử ngoại chân không (200 – 10 nm).
Chỉ có các tia cực tím 230 - 280 nm, đặc biệt là 253,7 nm, là có tác dụng thanh trùng
mạnh nhất. Dùng thanh trùng phòng, dụng cụ. Cần bảo vệ mắt.
Ghi chú:
1 mµ (mili-micromét) = 1 nm (nanomét) = 10-3 µm (micromét) = 10-6 mm
1 mµ = 1 x 10-6 mm = 1 x 10-9 m.
1 pm = 10-3 nm = 10-6 µm = 10-12 m
- Tia âm cực (cathode ray): tức tia điện tử có khả năng thanh trùng và xuyên qua
kim loại mỏng. Dùng thanh trùng dụng cụ y khoa đã đóng gói, thịt, rau cải và thực phẩm
khác đã đóng gói.
* Phương pháp lọc
Ruột bằng sứ xốp của bình lọc nước, các loại giấy lọc đặc biệt nhờ có các lỗ hỏng
nhỏ nên có thể để cho các chất lỏng đi qua nhưng ngăn cản vi khuẩn, nấm lại, nên có thể
dùng để thanh trùng hoặc tẩy độc.
Màng lọc cực mịn (ultra-filter) được làm bằng collodion cellulose acetate hoặc
những chất tương tự có lỗ rất nhỏ nên được dùng cho rất nhiều mục đích. Kích thước lỗ
lọc có thể từ 0,005 – 1 µm. Nhờ đó có thể dùng màng lọc thích nghi để loại tất cả vi sinh
vật, kể cả virus nhỏ nhất ra khỏi dung dịch muốn thanh trùng.
2.2.3. Ly tâm

Ly tâm được sử dụng nhiều trong nghiên cứu về vi sinh học. Nguyên tắc của
phương pháp ly tâm là khi một vật bị tác dụng bởi ly tâm sẽ bị lôi kéo bởi một lực và di
chuyển theo chiều hướng ly tâm. Khối lượng của vật bị tác dụng càng lớn, lực ly tâm càng
lớn. Trong một dung dịch có chứa vi sinh vật, nếu chịu tác dụng của ly tâm, các vi sinh
vật có kích thước to sẽ chịu tác dụng của lực ly tâm lớn có khuynh hướng di chuyển về
phía đáy ống nếu lực ly tâm thắng được độ nhớt của chất lỏng. Ở một tốc độ quay nhất
định, các vật to sẽ bị lắng vào đáy ống. Còn các vật nhỏ sẽ còn lơ lửng trong dung dịch.
Nguyên tắc này được áp dụng trong:
- Tẩy độc dịch chứa vi khuẩn: lắng vi khuẩn xuống đáy ống, dịch bên trên không
chứa vi khuẩn. Ở tốc độ 6000 vịng/phút trong 20 phút ta có thể lắng tất cả vi khuẩn trong
nước xuống đáy ống. Các vi sinh vật nhỏ hơn, như virus thì hãy cịn lơ lửng trong nước.
Như vậy, chúng ta có thể tách vi khuẩn ra khỏi dịch chứa virus với phương pháp ly tâm.
- Thu thập hay cô đọng vi sinh vật trong một huyền phù với mật số cao hơn: ly
25