Khảo sát một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của nấm mốc aspergillus niger

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG
KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP KHOA

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG
ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
ENZYME CELLULASE CỦA NẤM MỐC
ASPERGILLUS NIGER

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI:
LÂM TUẤN KIỆT
LÊ HOÀNG THỤY ANH NHƯ

NĂM 2013


TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG
KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP KHOA

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG
ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
ENZYME CELLULASE CỦA NẤM MỐC
ASPERGILLUS NIGER

GVHD: THS. LÊ HOÀNG BẢO NGỌC

BAN GIÁM HIỆU

LÃNH ĐẠO ĐƠN VỊ
THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

NĂM 2013

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa

Cảm tạ
Xin chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu trường Đại học An Giang. Ban chủ nhiệm khoa Nông
nghiệp và tài nguyên thiên nhiên, Bộ môn Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện
để chúng em hoàn đề tài nghiên cứu khoa học.
Hội đồng phản biện đã góp ý và bổ sung để đề tài của chúng em được
hoàn thiện hơn về mặt lý thuyết tạo cơ sở thuận lợi cho tiến hành thí nghiêm.
Ban quản trị thiết bị thí nghiệm trường Đại học An Giang đã tạo điều
kiện thuận lợi cho việc sử dụng các dụng cụ và thiết bị trong quá trình tiến
hành thí nghiệm.
Cơ Dương Thị Huỳnh Như và cơ Đặng Thị Như Thủy đã tận tình
hướng dẫn chúng em trong việc sử dụng các thiết bị.
Đặc biệt là cô Lê Hồng Bảo Ngọc đã ln hỗ trợ rất nhiều cho chúng
em hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học.

Đại học An Giang – 2013

i

Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa

Tóm lược
Đề tài “Khảo sát một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng
sinh tổng hợp enzyme cellulase của nấm mốc Aspergillus niger” được tiến
hành tại phịng thí nghiệm Khoa Nơng nghiệp – Tài nguyên thiên nhiên,
trường Đại học An Giang. Mục đích của đề tài là xác định ảnh hưởng của
nhiệt độ, thời gian nuôi cấy, pH, nguồn cơ chất cảm ứng, hàm lượng đường bổ
sung (glucose), nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của
nấm mốc Aspergillus niger.
Nghiên cứu được tiến hành trên 5 thí nghiệm:
- Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ni cấy đến
q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger
- Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến quá trình
sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger
- Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng (cellulose) và
hàm lượng cơ chất bổ sung vào mơi trường ni cấy đến q trình sinh tổng
hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger
- Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường (glucose) bổ sung
vào mơi trường ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm
mốc Aspergillus niger
- Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ và hàm lượng nitơ bổ
sung vào môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ
nấm mốc Aspergillus niger
Kết quả thí nghiệm:
- Nhiệt độ và thời gian ni cấy tối ưu là 30oC và 15 giờ
- pH môi trường nuôi cấy tối ưu là pH = 5
- Cơ chất và hàm lượng bổ sung tối ưu là rơm với tỷ lệ 10%
- Hàm lượng đường (glucose) bổ sung tối ưu với tỷ lệ là 0,1%
- Nguồn nitơ và hàm lượng bổ sung tối ưu là pepton với tỷ lệ là 0,1%

- Thành phần môi trường nuôi cấy cơ bản cuối cùng (trấu 56,25%, cám
43,75%), các thành phần khác bổ sung theo tỷ lệ % trên môi trường nuôi cấy
cơ bản (cám, trấu).

Đại học An Giang – 2013

ii


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa

Mục lục
Nội dung
Trang
Cảm tạ.............................................................................................................i
Tóm lược.........................................................................................................ii
Mục lục ...........................................................................................................iii
Danh sách bảng ...............................................................................................vii
Danh sách hình................................................................................................viii
Danh sách các chữ viết tắt ...............................................................................x
Chương 1 Giới thiệu ......................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................1
1.2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................2
1.3. Nội dung...................................................................................................2
Chương 2 Lược khảo tài liệu .......................................................................4
2.1. Giới thiệu chung về enzyme .....................................................................4
2.1.1. Khái niệm enzyme .................................................................................4
2.1.2. Các nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme ........................................4
2.1.2.1. Nhiệt độ ..............................................................................................4
2.1.2.2. Nồng độ cơ chất..................................................................................4

2.1.2.3. Độ pH .................................................................................................5
2.1.2.4. Các chất ức chế enzyme......................................................................5
2.2. Tổng quan về enzyme cellulase ................................................................5
2.2.1. Sơ lược về enzyme cellulase ..................................................................5
2.2.2. Cơ chất cellulose....................................................................................6
2.2.3. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase ...................................................8
2.2.4. Hoạt lực của enzyme cellulase (cơ chế thủy phân cellulose ) .................9
2.3. Nấm sợi Aspergillus niger ........................................................................10
2.3.1. Phân loại nấm Aspergillus niger ............................................................10
2.3.2. Đặc điểm cấu tạo ...................................................................................11
2.3.3. Các đặc tính và cấu trúc của hệ cellulase từ Aspergillus niger................12
2.3.4. Nguồn phân lập......................................................................................13
2.4. Giới thiệu thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn Aspergillus niger.......13
2.4.1. Cám .......................................................................................................13
2.4.2. Trấu .......................................................................................................14
2.4.3. Cơ chất cảm ứng....................................................................................14
2.5. Kỹ thuật nuôi cấy......................................................................................15
2.6. Các phương pháp thu nhận enzyme ..........................................................15

Đại học An Giang – 2013

iii


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa

2.6.1. Các phương pháp phá vỡ tế bào .............................................................15
2.6.2. Phương pháp lọc ....................................................................................16
2.6.3. Chiết rút enzyme....................................................................................16
2.7. Một số nghiên cứu về thu nhận enzyme cellulase......................................17

2.7.1. Nghiên cứu trong nước ..........................................................................17
2.7.2. Nghiên cứu ngoài nước..........................................................................17
Chương 3 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu ..................................19
3.1. Phương tiện nghiên cứu ............................................................................19
3.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..........................................................19
3.1.2. Nguyên liệu ...........................................................................................19
3.1.3. Dụng cụ, thiết bị ....................................................................................19
3.1.4. Hóa chất ................................................................................................19
3.2. Phương pháp tiến hành .............................................................................20
3.2.1. Quy trình sản xuất..................................................................................20
3.2.2. Giải thích quy trình................................................................................20
3.2.2.1. Sản xuất bột giống Aspergillus niger...................................................20
3.2.2.2. Chuẩn bị nguyên liệu ..........................................................................21
3.2.2.3. Trộn giống vi sinh vật.........................................................................21
3.2.2.4. Nuôi cấy .............................................................................................21
3.2.2.5. Thu enzyme ........................................................................................21
3.3. Tiến hành thí nghiệm ................................................................................22
3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi
cấy đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus
niger................................................................................................................22
3.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH mơi trường ni cấy đến
hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger..........23
3.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng
(cellulose) đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc
Aspergillus niger .............................................................................................24
3.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường (glucose)
bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng
hợp từ nấm mốc Aspergillus niger...................................................................25
3.3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt tính
enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger ........................26

Chương 4 Kết quả và thảo luận ....................................................................28
4.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ni cấy đến
hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger..........28

Đại học An Giang – 2013

iv


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa

4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến hoạt
tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger .................29
4.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng (cellulose)
đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus
niger................................................................................................................31
4.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường (glucose) bổ sung
vào mơi trường ni cấy đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ
nấm mốc Aspergillus niger ..............................................................................32
4.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt tính enzyme
cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger .....................................33
Chương 5 Kết luận và khuyến nghị..............................................................36
5.1. Kết luận ....................................................................................................36
5.2. Khuyến nghị .............................................................................................36
Tài liệu tham khảo.........................................................................................37
Phụ chương A Phương pháp chuẩn bị thí nghiệm.......................................40
1. Chuẩn bị mơi trường ni cấy......................................................................40
2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme endoglucanse (phương pháp DNS)
(Whitaker, 2003) .............................................................................................40
2.1. Nguyên tắc ...............................................................................................40

2.2. Chuẩn bị mẫu ...........................................................................................40
2.2.1. Dung dịch CMC (1 %)...........................................................................41
2.2.2. Pha hỗn hợp Na2CO3/NaHCO3 ..............................................................41
2.3. Chuẩn bị thuốc thử ...................................................................................41
2.4. Tiến hành..................................................................................................41
2.5. Tính kết quả..............................................................................................41
3. Xây dựng đường chuẩn glucose...................................................................42
4. Tạo pH thích hợp cho q trình nuôi cấy nấm Aspergillus niger bằng dung
dịch đệm citrate (pH = 3,0 – 6,2) .....................................................................43
Phụ chương B Một số hình ảnh thí nghiệm..................................................44
Phụ chương C Kết quả phân tích thống kê ..................................................49
3.3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ni cấy đến q
trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger................49
3.3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến quá trình
sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger ........................50
3.3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng (cellulose) và
hàm lượng cơ chất bổ sung vào mơi trường ni cấy đến q trình sinh tổng hợp
enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger ..............................................51

Đại học An Giang – 2013

v


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa

3.3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường (glucose) bổ sung vào
mơi trường ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc
Aspergillus niger .............................................................................................53
3.3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ và hàm lượng nitơ bổ sung

vào mơi trường ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm
mốc Aspergillus niger......................................................................................54

Đại học An Giang – 2013

vi


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa

Danh sách bảng
Trang
Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng của cám ..................................................... 14
Bảng 2: Thành phần của nguyên liệu rơm, bã mía, mùn cưa ......................... 15
Bảng 3: Bố trí các nghiệm thức ở thí nghiệm 1............................................. 23
Bảng 4: Bố trí các nghiệm thức ở thí nghiệm 2............................................. 24
Bảng 5: Bố trí các nghiệm thức ở thí nghiệm 3............................................. 25
Bảng 6: Bố trí các nghiệm thức ở thí nghiệm 4............................................. 26
Bảng 7: Bố trí các nghiệm thức ở thí nghiệm 5............................................. 27
Bảng 8: Lượng cơ chất cho vào trong q trình thí nghiệm........................... 42
Bảng 9: Kết quả đo OD dựng đường chuẩn glucose...................................... 42
Bảng 10: Bảng pha dung dịch đệm citrate (pH = 3,0 – 6,2)........................... 43
Bảng 11: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ni cấy đến hoạt tính của
enzyme cellulase .......................................................................................... 49
Bảng 12: Phân tích phương sai của Hoat tinh - TN1 ..................................... 49
Bảng 13: So sánh trung bình nghiệm thức - TN1 .......................................... 50
Bảng 14: Ảnh hưởng của pH môi trường ni cấy đến enzyme
cellulase ....................................................................................................... 51
Bảng 15: Phân tích phương sai của Hoat tinh theo pH – TN2 ....................... 51
Bảng 16: So sánh trung bình nghiệm thức - TN2 .......................................... 51

Bảng 17: Ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng (cellulose) và hàm lượng cơ
chất bổ sung đến hoạt tính enzyme cellulase................................................. 51
Bảng 18: Phân tích phương sai của Hoat tinh – Loại 3 tổng bình phương – TN3
..................................................................................................................... 52
Bảng 19: So sánh trung bình nghiệm thức – TN3 ......................................... 52
Bảng 20: So sánh trung bình nghiệm thức– Đối chứng_TN3 ........................ 53
Bảng 21: Ảnh hưởng của hàm lượng đường (glucose) bổ sung vào mơi trường
ni cấy đến hoạt tính enzyme cellulase ....................................................... 53
Bảng 22: Phân tích phương sai của Hoat tinh – Loại 3 tổng bình phương – TN4
..................................................................................................................... 53
Bảng 23: So sánh trung bình nghiệm thức – TN4 ......................................... 54
Bảng 24: Ảnh hưởng của nguồn nitơ và hàm lượng nitơ bổ sung vào mơi
trường ni cấy đến hoạt tính enzyme cellulase............................................ 54
Bảng 25: Phân tích phương sai của Hoat tinh – Loại 3 tổng bình phương – TN5
..................................................................................................................... 55
Bảng 26: So sánh trung bình nghiệm thức – TN5 ......................................... 55
Bảng 27: So sánh trung bình nghiệm thức – Đối chứng_TN5 ....................... 55

Đại học An Giang – 2013

vii


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa

Danh sách hình
Trang
Hình 1: Cấu tạo phân tử cellulose .............................................................. 7
Hình 2: Cấu trúc của ligno-cellulose.......................................................... 7
Hình 3: Cấu trúc của CMC ........................................................................ 8

Hình 4: Cơ chế hoạt động của 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase .............. 9
Hình 5: Cơ chế hoạt động của 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase ........... 9
Hình 6: Cơ chế hoạt động của β-D-glucoside glucohydrolase.................... 9
Hình 7: Nấm Aspergillus niger .................................................................. 11
Hình 8: Cấu trúc tinh thể endoglucanase (EC.3.2.1.4)
từ Aspergillus niger ................................................................................. 13
Hình 9: Quy trình sản xuất chế phẩm enzym cellulase từ
nấm Aspergillus niger................................................................................ 20
Hình 10: : Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến quá trình
sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger ................. 28
Hình 11: Ảnh hưởng của pH mơi trường ni cấy đến q trình sinh tổng
hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger ................................ 30
Hình 12: : Ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng (cellulose) và hàm
lượng cơ chất bổ sung vào môi trường nuôi cấyđến quá trình sinh tổng
hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger ................................. 31
Hình 13: : Ảnh hưởng của hàm lượng đường (glucose) bổ sung vào
môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ
nấm mốc Aspergillus niger ........................................................................ 32
Hình 14: Ảnh hưởng của nguồn nitơ và hàm lượng nitơ bổ sung vào
môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ
nấm mốc Aspergillus niger ........................................................................ 34
Hình 15: Đường chuẩn glucose.................................................................. 43
Hình 16: Mẫu bột giống sau khi ni cấy 7 ngày ....................................... 44
Hình 17: : Bột giống có mật độ bào tử 8,97.106 CFU /g bột bào tử ............ 44
Hình 18: Mẫu ni cấy Aspergillus niger từ 13-24h .................................. 44
Hình 19: Mẫu ni cấy Aspergillus niger từ 38-48h ................................. 45
Hình 20: Dịch lọc enzyme thơ ................................................................... 45
Hình 21: Enzyme sau khi ủ với CMC ở 400C trong 30 phút....................... 46
Hình 22: Dung dịch Na2CO3/NaHCO3 ....................................................... 46
Hình 23: Hỗn hợp enzyme và CMC sau khi cho

dung dịch Na2CO3/NaHCO3....................................................................... 46
Hình 24: Hỗn hợp enzyme và CMC được xử lý ở 100 0C ........................... 47

Đại học An Giang – 2013

viii


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa

Hình 25: Mẫu enzyme (đã cho thuốc thử DNS) trước khi đun ................... 47
Hình 26: Mẫu enzyme (đã cho thuốc thử DNS) sau khi đun ở 1000C......... 48
Hình 27: Mẫu enzyme (đã cho thuốc thử DNS và đun ở 1000C) được
pha loãng với 16 ml nước cất dùng để đo OD............................................ 48

Đại học An Giang – 2013

ix


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa

Danh mục các chữ viết tắt
CMC
CBD
CBH
CMCase
DEAE
HEC
PE

Đại học An Giang – 2013

Carboxymethyl cellulose
Cellulose binding domain
Cellobiohydrolase
Carboxymethyl cellulase
Diethylaminoethanol
Hydroxyethyl cellulose
Polimer ethylen

x


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa

Chương 1
Giới thiệu
1.1. Đặt vấn đề
Enzyme là một chất xúc tác sinh học được ứng dụng rộng rãi trong
nhiều ngành công nghiệp do đó cơng nghệ sản xuất enzyme mang lại lợi
nhuận rất lớn cho nhà sản xuất (Nguyễn Đức Lượng, 2004), thực tế đã có hàng
nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế giới, các chế phẩm này đã
được khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp
và ứng dụng. Các chế phẩm enzyme phổ biến như amylase, protease, catalase,
cellulase, lipase, glucoseoxydase…(Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa,
2007).
Cellulase là một trong những enzyme có nhiều ứng dụng nhất trong
công nghiệp và sản xuất ngày nay. Cellulase là enzyme đa cấu tử gồm:
exoglucanase hay C1 (EC 3.2.1.91), endoglucanase hay Cx (EC 3.2.1.4) và βglucosidase (EC 3.2.1.21), có khả năng hoạt động phối hợp để thủy phân

cellulose thành glucose (Trần Thạnh Phong, 2004). Cellulase được ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, xử lý rác thải, sản
xuất nhiên liệu sinh học...
Trong nông nghiệp để chế biến thức ăn chăn nuôi, cần bổ sung
cellulase trực tiếp vào thức ăn sẽ làm tăng khả năng đồng hóa thực phẩm trong
đường tiêu hóa động vật, tăng khả năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn động
vật…
Trong công nghiệp thực phẩm, để chế biến thực phẩm như sản xuất cà
phê ở Việt Nam việc sử dụng phức hệ enzyme cellulase và pectinase tăng khả
năng ly trích dịch quả để xử lý bóc vỏ cà phê…
Trong cơng nghệ xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh, cellulase
có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hoá các hợp chất kiểu
lignocellulose và cellulose trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua
các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các các sản phẩm giàu năng
lượng khác.
Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ, ở giai đoạn đường hóa
của q trình sản xuất ethanol, amylase là thành phần chính trong q trình
thủy phân tinh bột. Tuy nhiên, bổ sung một số enzyme phá hủy thành tế bào
như cellulase, hemicellulase có vai trị quan trọng, giúp tăng lượng đường tạo
ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase, dẫn tới hiệu suất thu
hồi rượu tăng lên 1,5 %.

Đại học An Giang – 2013

1


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa

Theo Bhat (2000), khoảng 20 % trong số 1 tỷ USD là doanh thu từ

enzyme cellulase, hemicellulase và pectinase trên thế giới. Thị trường enzyme
công nghiệp sẽ tăng từ 1,7 - 2,0 tỷ USD đến năm 2005. Ở nước ta, nhu cầu sử
dụng các chế phẩm enzyme trong đó có cellulase trong chế biến thức ăn chăn
nuôi và trong các ngành công nông nghiệp khác ngày càng nhiều, hằng năm
chúng ta phải nhập ngoại một lượng lớn các nguồn enzyme này (Trần Thạnh
Phong, 2004).
Việc tận dụng phụ phế liệu công nông nghiệp làm nguồn carbon để sản
xuất cellulase bởi Aspergillus niger bằng phương pháp lên men chìm và lên
men bán rắn rất được nhiều nước trên thế giới quan tâm.
Việt Nam là một nước có nền nơng nghiệp nhiệt đới đa dạng, phong
phú và ngày càng phát triển. Vì vậy, mà nguồn phụ phế liệu nơng nghiệp rất
dồi dào như bã mía, cám gạo, rơm rạ… chứa một lượng cellulose và
hemicellulose cao có thể sử dụng làm nguồn carbon để cảm ứng cho
Aspergillus niger sinh tổng hợp cellulase bằng phương pháp lên men bán rắn.
Ngồi ra, đây cịn là nguồn cơ chất rẻ tiền và ổn định để sản xuất cellulase trên
quy mô lớn.
Hiện nay, có rất nhiều loại mơi trường được sử dụng để nuôi cấy cho
Aspergillus niger sinh tổng hợp cellulase nhưng hiệu suất cịn giới hạn. Vì vậy
đề tài “Khảo sát một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng
hợp enzyme cellulase của nấm mốc Aspergillus niger” được tiến hành nhằm
tìm ra được các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
cellulase từ Aspergillus niger làm tiền đề cho việc nghiên cứu quy trình sản
xuất chế phẩm enzyme celluase trong nước.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian nuôi cấy, pH, nguồn cơ
chất cảm ứng, hàm lượng đường bổ sung (glucose), nguồn nitơ đến khả năng
sinh tổng hợp enzyme cellulase của nấm mốc Aspergillus niger.
1.3. Nội dung
- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến quá trình sinh
tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger

- Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường ni cấy đến q trình sinh tổng hợp
enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger
- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng (cellulose) và hàm lượng cơ
chất bổ sung vào mơi trường ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme
cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger

Đại học An Giang – 2013

2


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa

- Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường (glucose) bổ sung vào mơi trường
ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus
niger
- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ và hàm lượng nitơ bổ sung vào môi
trường ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc
Aspergillus niger

Đại học An Giang – 2013

3


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa

Chương 2
Lược khảo tài liệu
2.1. Giới thiệu chung về enzyme

2.1.1. Khái niệm enzyme
Enzyme là các hợp chất protein xúc tác cho các phản ứng hóa học (Đỗ
Quý Hai, 2008) với mức đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp.
Enzyme có trong tế bào sống, là các chất xúc tác sinh học (Phạm Thị Trân
Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2007). Trong phản ứng enzyme xúc tác các phân
tử lúc bắt đầu của quá trình được gọi là cơ chất, enzyme sẽ biến đổi chúng
thành các phân tử khác nhau. Enzyme có hiệu suất xúc tác lớn hơn tất cả các
chất xúc tác hữu cơ và vơ cơ khác. Enzyme khơng chỉ có thể xúc tác trong cơ
thể sống, mà sau khi tách ra khỏi hệ thống sống chúng vẫn giữ được hoạt tính
xúc tác ở những điều kiện nhất định. Enzyme có tính đặc hiệu cao, mỗi
enzyme chỉ tác dụng trên một hay một số cơ chất nhất định ở nhiệt độ và áp
suất bình thường.
2.1.2. Các nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme
2.1.2.1. Nhiệt độ
Mỗi enzyme hoạt động tốt nhất ở khoảng nhiệt độ tối ưu. Nhiệt độ thích
hợp cho enzyme cellulase hoạt động 550 C, bền ở 30 - 450 C (Zhuang và ctv,
2007). Khi nhiệt độ lệch sang hai bên nhiệt độ tối ưu, hoạt động của enzyme
giảm và tốc độ phản ứng sẽ giảm theo. Sự tăng nhiệt độ làm cho động năng
của enzyme và cơ chất tăng, chúng chuyển động nhanh hơn, va chạm nhiều
hơn. Các phức chất emzyme - cơ chất hình thành nhiều hơn, phản ứng xảy ra
nhanh hơn. Tuy nhiên nếu nhiệt độ q cao enzyme bị biến tính. Khi cấu hình
vị trí xúc tác khơng cịn phù hợp với cơ chất enzyme mất hoạt tính xúc tác.
Khi nhiệt độ hạ thấp hơn nhiệt độ tối ưu, cơ chất và phân tử enzyme chuyển
động chậm. Tần số va chạm giữa chúng thấp dẫn đến ít phức hợp enzyme - cơ
chất hình thành và tốc độ phản ứng giảm. Nhiệt độ tối ưu là 40 - 500 C, cao
hơn 500 C enzyme bắt đầu biến tính, vận tốc xúc tác giảm. Đến 60 - 800 C,
enzyme mất khả năng hoạt động. Ở 100 0 C enzyme hoàn toàn mất tác dụng
(Phạm Thị Ánh Hồng, 2003).
2.1.2.2. Nồng độ cơ chất
Tốc độ phản ứng của phần lớn các phản ứng biến đổi theo nồng độ của

cơ chất và nồng độ enzyme. Khi tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng tăng
chỉ khi nồng độ cơ chất tương đối thấp. Khi nồng độ cơ chất lớn tốc độ phản
ứng ít phụ thuộc vào nồng độ cơ chất và có khuynh hướng đạt cực đại do nồng
độ enzyme có mặt quyết định. Ở nồng độ cơ chất thấp, nhiều phân tử enzyme

Đại học An Giang – 2013

4


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa

có trung tâm hoạt động chưa liên kết với cơ chất. Nên việc tăng hạn chế cơ
chất là tăng tốc độ phản ứng. Tuy nhiên, ở nồng độ cơ chất cao, hầu hết các
trung tâm phản ứng đã liên kết với cơ chất làm cho số phân tử enzyme trở
thành yếu tố giới hạn. Khi số phân tử enzyme tăng tốc độ phản ứng cực đại
tăng lên tương ứng.
2.1.2.3. Độ pH
Mỗi một enzyme hoạt động tối ưu tại một giới hạn pH thích hợp chẳng
hạn pepsin hoạt động tối ưu ở pH = 2, trypsin hoạt động tối ưu ở pH = 8,5,
cellulase bền pH = 5,5 và hoạt tính cao ở pH = 6 (Zhuang và ctv, 2007). Khi
pH lệch sang hai bên phía pH tối thích, hoạt tính của enzyme giảm xuống.
2.1.2.4. Các chất ức chế enzyme
Hoạt tính của enzyme bị thay đổi khi có mặt của chất ức chế.
Chất ức chế cạnh tranh: các chất kìm hãm có cấu trúc tương tự như cơ
chất. Chất ức chế gắn thuận nghịch vào trung tâm phản ứng của enzyme cạnh
tranh với cơ chất, khiến cho hoạt động xúc tác của enzyme chậm lại. Khi chất
ức chế được giải phóng hoạt động xúc tác của enzyme trở lại mình thường.
Chất ức chế khơng cạnh tranh: chất ức chế không cạnh tranh không gắn
vào vị trí xúc tác mà gắn thuận nghịch vào vị trí khác trên enzyme. Điều này

sẽ làm thay đổi cấu hình của vị trí hoạt động khơng cịn phù hợp với cơ chất.
Vùng mà chất ức chế cạnh tranh gắn vào enzyme gọi là vị trí di lập thể
(allosteric site) và gây ra hiệu ứng dị lập thể (allosteric effect). Khi chất ức chế
giải phóng, hoạt động xúc tác của enzyme trở lại bình thường.
2.2. Tổng quan về enzyme cellulase
2.2.1. Sơ lược về enzyme cellulase
Tên gọi cellulase dùng để chỉ chung cho các enzym tham gia phân cắt
hợp chất cellulose. Tất cả các enzym cellulase đều có tác dụng phân cắt liên
kết -1,4 giữa 2 đơn vị glucose và được các nhà khoa học phân ra làm 3 nhóm
chủ yếu sau đây:
 1,4 -D-glucan cellobiohydrolase (EC.3.2.1.91) (CBH). Enzym cắt
đầu cuối của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose. Enzym này
cịn có một loạt các tên khác như: cellobiohydrolase, cellobiosidase
và avicellase.
 1,4 -D-glucan –4- glucanohydrolase (EC.3.2.1.4) (EG). Enzym này
tham gia phân giải liên kết -1,4 glucoside trong cellulose và -Dglucanase. Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin,
cellobiose, và glucose. Enzym này cịn có một loạt tên khác như:
endoglucanase, endo 1,4 -D-glucanase, C-cellulase.

Đại học An Giang – 2013

5


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa

 -D-glucoside glucohydrolase (EC.3.2.1.21). Enzym này tham gia
phân hủy cellobiose tạo thành glucose. Chúng khơng có khả năng
phân hủy cellulose ngun thủy. Trong các tài liệu khoa học, chúng
có tên là cellobiase và -glucosidase.

Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng các enzym EG có tác dụng phân cắt tốt
trên cellulose vơ định hình và đặc biệt có tác dụng trên cellulose biến tính như
CMC, HEC. Vì vậy, để xác định hoạt tính enzym này người ta thường sử dụng
cơ chất là CMC. Còn các enzym CBH thì có tác dụng trên cellulose kết tinh, ít
trên cellulose vơ định hình và hầu như khơng có tác dụng phân cắt cellulose
biến tính. Trong hệ thống enzym CBH thì enzym CBH I tấn cơng từ đầu khử,
trong khi CBH II tấn công vào đầu không khử của chuỗi cellulose.
Sự thủy phân cellulose là sự kết hợp của 3 loại enzym trên. Đầu tiên
enzym EG tấn công vào giữa mạch cellulose và giải phóng các đầu cuối của
chuỗi. Tiếp sau đó các enzym CBH tiếp tục phân cắt để tạo sản phẩm cuối là
cellobiose. Việc phân cắt cuối cùng tạo thành glucose là nhờ vào enzym thứ ba
-glucosidase. Vì vậy tuy rằng enzym -glucosidase khơng có tác dụng trên
chuỗi cellulose nhưng nó vẫn được xếp vào hệ thống enzym cellulase.
2.2.2. Cơ chất cellulose
Cellulose là polysaccharide chủ yếu của thành tế bào thực vật. Trong
bơng nó chiếm trên 90 %, cịn trong gỗ hơn 50 %. Ngồi ra, người ta cịn thấy
chúng có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật. Ơ tế bào thực vật và ở tế bào
một số loài vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi. Khi đun sôi với acid sulfuric
đặc, cellulose sẽ chuyển thành glucose còn khi thủy phân trong điều kiện nhẹ
nhàng sẽ tạo thành disacarit cellobiose.
Cellulose khơng có trong tế bào động vật. Chúng là một homopolimer
mạch thẳng, được cấu tạo bởi các -D-glucose-pyranose. Các thành phần này
liên kết với nhau bởi liên kết -1,4 glucoside. Tinh bột cũng được cấu tạo bởi
các glucose này và bằng liên kết -1,4 glucoside. Điểm khác biệt là tinh bột
chứa các gốc glucose phân nhánh cịn cellulose chứa các glucose khơng phân
nhánh. Các gốc glucose trong cellulose thường lệch một góc 1800 C và có
dạng như một chiếc ghế bành. Cellulose thường chứa 10.000 - 14.000 gốc
đường và được cấu tạo như sau:

Đại học An Giang – 2013

6


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa

Đầu không khử

Đầu khử

Hình 1: Cấu tạo phân tử cellulose
Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng từ 50000 - 2500000 Dalton.
Các phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Vander Waals và liên kết
hydro.
Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3nm.
Các sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi. Trong điều kiện tự nhiên, các
vi sợi thường không đồng nhất, chúng thường tồn tại 2 vùng:
- Vùng kết tinh: các mạch cellulose kết với nhau theo một trật tự đều
đặn nhờ liên kết hydro nối nhóm hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm
hydroxyl ở mạch cacbon của mạch khác. Ở vùng này cellulose rất bền vững
dưới tác động của điều kiện bên ngồi. Enzym cellulase chỉ có tác dụng ở bề
mặt hệ sợi ở vùng này.
- Vùng vơ định hình: các mạch liên kết với nhau nhờ lực Vander Waals.
Ở vùng này cellulose có cấu trúc khơng chặt và dễ bị tác động bởi các yếu tố
bên ngoài. Khi gặp nước, chúng dễ bị trương phồng lên, enzym cellulase rất dễ
tác động, làm thay đổi tồn bộ cấu trúc của chúng.

Hình 2: Cấu trúc của ligno-cellulose

Đại học An Giang – 2013

7


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa

Chiều dài phân tử cellulose trong vùng vơ định hình thường lớn gấp
hàng chục lần so với chiều dài của phân tử cellulose kết tinh. Các cây gỗ lâu
năm thường chứa lượng cellulose kết tinh nhiều, các cây thảo mộc ngược lại,
chứa nhiều cellulose vơ định hình.
Trong phân tử cellulose có nhiều liên kết hydroxyl tồn tại dưới dạng tự
do, hydrogen của chúng dễ bị thay thế bởi một số gốc hoá học như metyl hoặc
gốc acetyl tạo nên các dẫn xuất ete hoặc este của cellulose. Một trong những
dẫn xuất được ứng dụng rất nhiều là CMC, trong đó một số nhóm hydroxyl
của cellulose được thay thế bằng gốc –OCH2COOH.

Hình 3: Cấu trúc của CMC
Trong thiên nhiên, khi thực vật và vi sinh vật có chứa cellulose bị chết,
cellulose của chúng chỉ bị phân hủy bởi cả một tập đoàn vi sinh vật. Các loài
vi sinh vật sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo ra mùn và từ đó các
thành phần cấu tạo của cellulose lại được đi vào các con đường chuyển hóa
trong chu trình chuyển hóa vơ tận của thiên nhiên.
Trong thực vật, cellulose thường tồn tại một lượng rất lớn. Số lượng
cellulose thường không đều ở các cơ quan khác nhau trong thực vật. Người ta
thấy rằng, lượng cellulose ít nhất ở lá và nhiều nhất ở thân cây, đặc biệt ở sợi
bơng, cellulose có thể chiếm đến 80 – 90 %.
Ở vi sinh vật cấu trúc của cellulose không bền và không theo một trật tự
như ở thực vật. Ở đó, cellulose thường thuộc loại vơ định hình. Chính vì thế
việc phân hủy chúng thường rất dễ thực hiện.
2.2.3. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase

Cơ chế 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (cellobiohydrolase)
(EC.3.2.1.91): Enzyme này thủy phân liên kết 1,4-β-D-glucoside từ đầu không
khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose.

Đại học An Giang – 2013

8


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa

Hình 4: Cơ chế hoạt động của 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase
(Nguyễn Hoàng Phúc và ctv, 2012)
Cơ chế 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase (giống như cello
dextrinase) (EC 3.2.1.74): enzyme này thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4 -βD-glucoside giữa mạch của chuỗi cellulose, linchenin và các β-D-glucan của
ngũ cốc.

Hình 5: Cơ chế hoạt động của 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase
(Nguyễn Hoàng Phúc và ctv, 2012)
Cơ chế β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21): enzyme này thủy
phân gốc β-D-gluoside khơng khử ở đầu tận cùng để phóng thích ra β –
glucose

Hình 6: Cơ chế hoạt động của β-D-glucoside glucohydrolase
(Nguyễn Hoàng Phúc và ctv, 2012)
2.2.4. Hoạt lực của enzyme cellulase (cơ chế thủy phân cellulose )
Trong thiên nhiên, thủy phân cellulose có sự tham gia của tất cả ba loại
enzyme cellulase như: endoglucanase, exoglucanase và β –glucoside. Một
trong ba loại enzyme trên không tự thủy phân cellulose đến cùng.
Từ những nghiên cứu riêng lẽ đối với từng loại enzyme đến nghiên cứu

tác động tổng hợp của cả ba loại enzyme cellulose, nhiều nhà khoa học đều
đưa ra kết luận chung là các loại enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau phân
hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Có nhiều cách giải

Đại học An Giang – 2013

9


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa

thích khác nhau về cơ chế tác động của cellulose, trong đó cách giải thích do
Erikson đưa ra được nhiều người cơng nhận.
Theo Erikson và ctv (1980), cơ chế tác động hiệp đồng của ba loại
cellulase như đầu tiên endoglucanase tác động vào vùng vơ định hình trên bề
mặt cellulose, cắt liên kết β-1,4- glucosid và tạo ra các đầu mạch được tạo
thành. Kết quả tác động của endoglucanase và exoglucanase tạo ra các
celloligosaccherit mạch ngắn cellobiose, β –glucosidase thủy phân tiếp và tạo
thành glucose.
Các lồi vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulose trong điều kiện
tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại
cảnh nên có lồi phát triển rất mạnh, có lồi lại phát triển yếu. Chính vì thế,
việc phân hủy cellulose trong tự nhiên được tiến hành đồng bộ, xảy ra rất
chậm. Mỗi loại vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp hợp ưu việc một lồi
enzyme. Chính vì thế cần phải khai thác enzyme cellulose từ nhiều nguồn vi
sinh vật.
Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực của enzyme như: nhiệt độ, pH, nồng
độ cơ chất, ion kim loại…(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.3. Nấm sợi Aspergillus niger
2.3.1. Phân loại nấm Aspergillus niger

Domian:
Eukaryota
Kingdom: Fungi
Phylum:
Ascomycota
Subphylum: Pezizomycotina
Class:
Eurotiomycetes
Order:
Eurotiales
Family:
Trichocomaceae
Genus:
Aspergillus
Species:
Aspergillus niger

Đại học An Giang – 2013

10


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa

Hình 7: Nấm Aspergillus niger

(Nguồn: />2.3.2. Đặc điểm cấu tạo
Aspergillus thuộc nhóm nấm bất tồn (Deuteromycetes hay Fungi
Imperfecti) sinh sản vơ tính bằng bào tử bụi mang bởi những giá bào tử có
hình dạng khác nhau xếp thành chuỗi (đính bào tử) ở đầu ngọn có cuống bào

tử.
Aspergillus niger gây bệnh mốc đen trên trái cây và rau củ như: nho, củ
hành, đậu phộng và làm hư hỏng thực phẩm... Một số nòi của Aspergillus
niger có khả năng tạo ra độc tố mycotocxin.
Aspergillus niger là vi sinh vật hiếu khí nên có thể tìm thấy ở các mơi
trường giàu oxy, chúng sinh trưởng tốt trên bề mặt các cơ chất giàu cacbon,
cũng có thể sống ở mơi trường khơng có chất dinh dưỡng như tường nhà ẩm.
Ba môi trường thường dùng để nuôi cấy nấm Aspergillus niger là: môi
trường Czapek dox agar, môi trường Sabouraud agar, môi trường Potato
dextro agar (Nguyễn Thị Thanh Tuyền, 2009).
Nấm Aspergillus niger có màu đen nâu thường được gọi là nấm sợi
màu đen. Khi mới phát triển sợi nấm có màu trắng, sau đó sẫm lại nhưng
khơng hồn tồn đen. Chỉ có bào tử của chúng là có màu đen huyền. Từ một
sợi đầu tiên chúng phân nhánh tạo ra 2 - 4 nhánh sợi nhỏ. Từ các nhánh này sẽ
phát triển thành đỉnh bào tử và từ đó phát triển thành những bào tử màu đen.
Aspergillus niger có khả năng tạo nhiều enzyme khác nhau như amylase,
maltase, protease, pectinase, glucoamylase và cả cellulase.
Nấm Aspergillus niger trên môi trường Czapek nhiệt độ nuôi cấy 270 C
ở 10 ngày tuổi có đường kính 2,5 - 3,0 cm, màu đen. Khối bào tử trần đỉnh
bọng hình cầu, sau hình tia tỏa tròn hoặc tách thành các cột 700 - 800 m
đường kính, đơi khi các khối bào tử trần nhỏ màu nâu đen. Giá bào tử trần
nhẵn, dài 1,5 - 3,0 cm. Bọng đỉnh giá hình cầu đường kính 45 - 75 m. Cuống
thể hình thành phần lớn 5 - 6 x 20 - 30 m, đôi khi 6 – 10 x 60 - 70 m. Bào

Đại học An Giang – 2013

11


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa

tử trần hình cầu, phần lớn 4 - 5 m đường kính, ráp hoặc có gai khơng đều,
thành chuỗi gốc non (Bùi Xn Đồng và Nguyễn Huy Văn, 2000).
Nấm Aspergillus niger khi mọc trên môi trường Sabouraud agar phủ
đầy lông tơ và đầy bột, ban đầu có màu trắng chuyển dần sang màu nâu và trở
thành màu đen đến đen huyền. Bào tử đính có vách nhẵn, xung quanh vách
bào tử đính màu nâu, xù xì hình thành những chuỗi hạt.
Loại nấm mốc này thích hợp phát triển ở độ ẩm 60 % do đó mơi trường
ni cấy phải đạt được độ ẩm này, nếu cao quá sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn
phát triển, nếu thấp hơn nấm mốc sẽ sinh bào tử gây giảm hoạt tính enzyme.
Q trình phát triển của nấm mốc trong môi trường rắn khi nuôi cấy
bằng phương pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:
- Giai đoạn 1: giai đoạn này kéo dài 10 - 14 giờ từ thời gian bắt đầu
nuôi cấy, lúc này bào tử bắt đầu trương nở và hô hấp. Ở giai đoạn này có xảy
ra nhiều biến đổi: nhiệt độ tăng rất chậm, sợi nấm bắt đầu hình thành và có
màu trắng hoặc sữa, thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi, khối mơi
trường cịn rời rạc, enzyme mới bắt đầu được hình thành.
- Giai đoạn 2: giai đoạn này kéo dài khoảng 14 - 18 giờ. Trong giai
đoạn này có những thay đổi cơ bản như tồn bộ bào tử đã phát triển thành sợi
nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh có thể nhìn rõ được sợi nấm, môi
trường được kết lại khá chặt, độ ẩm môi trường giảm dần, nhiệt độ môi trường
sẽ tăng nhanh do sự đồng hóa mạnh của nấm sợi, các enzyme được hình thành
và enzyme nào có cơ chất cảm ứng trội hơn sẽ được tạo ra nhiều hơn. Lượng
oxy trong khơng khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần
phải được thơng khí mạnh là tốt nhất.
- Giai đoạn 3: giai đoạn này kéo dài khoảng 10 - 12 giờ. Lúc này nhiệt
độ khối môi trường sẽ giảm dần, cường độ hô hấp giảm dần một cách rõ rệt.
Màu sắc của sợi nấm bắt đầu thay đổi và thể hiện màu đặc trưng (Nguyễn Đức
Lượng, 2004).
2.3.3. Các đặc tính và cấu trúc của hệ cellulase từ Aspergillus niger

Theo Hurst (1977), endoglucanase từ Aspergillus niger có trọng lượng
phân tử 26.000 Dalton, hoạt động ở pH và nhiệt độ tối ưu là 4,0 và 450 C.
Galas và Romanowska (1997), cho biết -glucosidase (EC.3.2.1.21) từ
Aspergillus niger IBT - 90 có trọng lượng phân tử khoảng 200 kDa, điểm
đẳng điện là 4,05 và chứa 33 % carbohydrate. Enzyme này thủy phân
cellobiose ở pH và nhiệt độ tối ưu là 4,8 và 650 C.
Theo báo cáo gần đây của Gokhan CORAL (2002), dịch nuôi cấy
Aspergillus niger Z10 trong môi trường Czapek Dox chứa CMC 1 %, sau khi

Đại học An Giang – 2013

12


Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa

cho chạy điện di trên gel SDS-PAGE (chứa 0,2 % CMC) phát hiện có 2 vạch
protein có hoạt tính thủy phân CMC với trọng lượng phân tử lần lượt là 83.000
và 50.000 Dalton.

Hình 8: Cấu trúc tinh thể endoglucanase (EC.3.2.1.4)
từ Aspergillus niger
( Trần Thạnh Phong, 2004)
Ở Aspergillus niger có hai gene mã hóa cho endoglucanase là eglA,
eglB và hai gene mã hóa cho exoglucanase là chbA và chbB. Cả eglA và eglB
thiếu domain CBD và vùng liên kết. ChbB có một domaain xúc tác và một
đuôi CBD tách biệt với domain xúc tác bởi một liên kết peptid giàu
Ser/Pto/Thr; trong khi chbA chỉ có domain xúc tác thiếu đi CBD và liên kết
peptid. Gần đây, một gene mới được cô lập là eglC, mã hóa cho
endoglucanase là eglC, emzyme này tham gia thủy phân xyloglucan và được

điều hào bởi protein XlnR (protein hoạt hóa phiên mã), protein này khơng chỉ
điều hịa sự biểu hiện của các gene mã hóa hệ enzyme thủy phân xylan mà cịn
kiểm sốt sự phiên mã của các gene mã hoá hệ enzyme thủy phân cellulose
như eglA, eglB, chbA và chbB.
2.3.4 Nguồn phân lập
Vùng phân bố của Aspergillus niger rất rộng do có thể sinh trưởng trên
nhiều cơ chất khác nhau như: các loại ngũ cốc, quả chín, da động vật, phân
hữu cơ và trên một số loại nhựa (Nguyễn Thị Thanh Tú, 2010).
2.4. Giới thiệu thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn Aspergillus niger
2.4.1. Cám
Cám là phụ phẩm được tạo ra trong quá trình xay xát và chế biến lúa
gạo. Cám gạo được sử dụng nhiều trong ni cấy vi sinh vật do chúng có đầy
đủ chất dinh dưỡng phù hợp cho sự phát triển của vi sinh vật, trong đó nấm sợi
phát triển rất mạnh trong môi trường cám.

Đại học An Giang – 2013

13