Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn xuất của quercetin, xác định hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của chúng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

HỒNG THỊ KIM DUNG

ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN XUẤT
CỦA QUERCETIN, XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH
KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN CỦA CHÚNG

LUẬN VĂN CAO HỌC
CHUN NGÀNH: CƠNG NGHỆ HĨA HỌC

NĂM 2003


Luận văn Thạc só
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

----------------

Độc Lập- Tự Do- Hạnh Phúc
----------------

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: HOÀNG THỊ KIM DUNG

Phái: Nữ

Ngày, tháng, năm sinh: 27/03/1976

Nơi sinh: Thanh Hóa

Chuyên ngành: Công Nghệ Hóa Học – Hóa hữu cơ Mã số : 02.10.04
I-TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn xuất của Quercetin, xác định
hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của chúng.
II-NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
-

Tiến hành tách chiết Rutin và tổng hợp Quercetin

-

Nghiên cứu tổng hợp Pentaacetyl Quercetin

-

Nghiên cứu tổng hợp Zn-Quercetin

-

Xác định các hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của Quercetin và các dẫn
xuất của nó.

III-NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:

20 / 05 / 2002

IV-NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:

/ 02 /2003

V-HỌ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:

TS. Nguyễn Cửu Khoa

VI- HỌ TÊN CÁN BỘ CHẤM NHẬN XÉT 1:

PGS.TS. Trần Thị Việt Hoa

VII- HỌ TÊN CÁN BỘ CHẤM NHẬN XÉT 2:

PGS.TS. Nguyễn Ngọc Sương

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CÁN BỘ NHẬN XÉT 1

CÁN BỘ NHẬN XÉT 2

Nội dung và Đề Cương Luận án cao học đã được thông qua Hội Đồng Chuyên
Ngành.
Ngày
PHÒNG QLKH-SĐH

Học viên Hoàng Thị Kim Dung

tháng năm

CHỦ NHIỆM NGÀNH


Luận văn Thạc só

CÔNG TRÌNH ĐƯC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học:
TS. NGUYỄN CỬU KHOA
Cán bộ chấm nhận xét 1:
PGS.TS. TRẦN THỊ VIỆT HOA
Cán bộ chấm nhận xét 2:
PGS.TS. NGUYỄN NGỌC SƯƠNG

Luận án được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN ÁN CAO HỌC
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ngày 22 tháng 3 năm 2003

Học viên Hoàng Thị Kim Dung


Luận văn Thạc só

LỜI CẢM ƠN
Con xin cảm ơn bố mẹ, anh chị – những người thân yêu nhất.
Xin chân thành cảm ơn:

-

Thầy Nguyễn Cửu Khoa đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho em
trong suốt thời gian thực hiện luận án này,

-

Cô Trần Thị Việt Hoa, thầy Phạm Thành Quân và các thầy cô trong Khoa Công
Nghệ Hóa Học & Dầu Khí, trường Đại Học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh,

-

Phòng Quản Lý Khoa Học- Sau Đại Học,

-

Các thầy cô trong Hội đồng Bảo vệ Luận án ,

-

Tập thể Phòng Công nghệ Hữu cơ cao phân tử và các cô chú, anh chị, các bạn
đồng nghiệp trong Viện Công nghệ Hóa học,

-

Phòng Hóa sinh, Phòng Công nghệ các hợp chất có hoạt tính sinh học – Viện Sinh
học Nhiệt đới,

-

Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích & Thí Nghiệm và Trung tâm đo lường tiêu chuẩn
chất lượng khu vực 3, Viện Pasteur Tp.HCM,

và tất cả các bạn đã nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo và động viên cho tôi trong suốt thời
gian qua.
Xin chân thành cảm ơn.

Học viên Hoàng Thị Kim Dung


Luận văn Thạc só

MỤC LỤC
NHIỆM VỤ LUẬN ÁN
LỜI CẢM ƠN
TÓM TẮT
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, HÌNH
DANH MỤC PHỤ LỤC
MỞ ĐẦU ………………….………………….………………….………………….………………….………………….….

Trang

1

PHẦN 1: TỔNG QUAN:
I- RUTIN:
I.1.Các loại cây có chứa Rutin:……………….………………………………………….…………………..

I.1.1.Cây Hòe: ………………….………………….………………….………………….……………………………….
I.1.2.Cây Mạch ba góc: ………………….………………….…………………….………………….…………….
I.1.3.Cây Nghễ: ………………….………………….………………….………………….……………………………..
I.1.4.Cây Cửu lý hương: ………………….………………….………………….………………….……………..
I.1.5. Một số loại cây khác:……………………………………………………………………………………….
I.2.Cấu tạo của Rutin: …………………………………………………………………………………………………
I.3.Tính chất Vật lý: ………………….…………………………….………………….………………….………….
I.4.Ứng dụng của Rutin hiện nay tại Việt Nam: ………………….………………….……….
II- QUERCETIN: ………………….………………….………………….………………….………………………….
II.1.Cấu tạo: ………………….………………….………………….………………….…………………………………….
II.2.Tính chất Vật lý: …………………………………………………………………………………………………..
II.3.Phản ứng điều chế từ Rutin: ………………….………………….……………….…………………..
II.4.Hoạt tính và ứng dụng của Quercetin: ………………….………………….………………….
II.4.1.Trong dược phẩm và y tế:………………………………………………………………………………
II.4.2. Sử dụng làm thuốc thử phân tích:………………………………………………………………
II.4.3.Sử dụng trong bảo quản thực phẩm:…………………………………………………………..
II.4.4.Sử dụng làm phụ gia mỹ phẩm:…………………………………………………………………..
II.4.5.Sử dụng làm chất màu:…………………………………………………………………………………..
III- PENTAACETYL QUERCETIN:…………………………………………………………………….
III.1.Cấu tạo: ………………….………………….………………….………………….………………………………….
III.2.Tính chất Vật lý: ………………………………………………………………………………………………..
III.3.Điều chế : ………………….………………….……………….…………………………………………………….
III.4.Ứng dụng: ………………….………………….……………………………………………………………………..
Học viên Hoàng Thị Kim Dung

3
3
4
5
5

6
7
7
8
9
10
10
10
11
11
15
15
15
15
18
18
18
18
18


Luận văn Thạc só

IV- Zn-QUERCETIN:………………………………………………………………………………………………….
IV.1.Cấu tạo: ………………….………………….………………….………………….…………………………………
IV.2.Tính chất Vật lý: ………………………………………………………………………………………………..
IV.3.Điều chế : ………………….………………….……………….…………………………………………………….
IV.4.Ứng dụng: ………………….………………….…………………………………………………………………….
V- XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN:…………..
V.1. Các phương pháp định tính xác định hoạt tính:……………………………………….

V.1.1. Phương pháp trộn thuốc vào môi trường thạch:………………………………….
V.1.2. Phương pháp đục lỗ trong môi trường thạch:………………………………………
V.1.3. Phương pháp thấm giấy:……………………………………………………………………………….
V.1.4. Phương pháp ống trụ của “Heatley”:………………………………………………………
V.1.5. Phương pháp đào rãnh của Fleming:……………………………………………………...
V.1.6. Phương pháp viên nén Đặng Văn Ngữ:…………………………………………………
V.1.7. Phương pháp thử những chất kháng khuẩn bay hơi:………………………….
V.1.8. Phương pháp sắc ký kháng khuẩn:…………………………………………………………..
V.2. Các loại vi khuẩn, nấm sử dụng để xác định hoạt tính:……….. ……………
V.2.1.Vi khuẩn:……………………………………………………………………………………………………………..
V.2.2.Nấm:………………………………………………………………………………………………………………………

22
22
22
22
22
26
26
26
26
26
27
27
27
28
28
29
29
30

PHẦN 2:PHƯƠNG PHÁP & KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU:
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: ………………….………………….………………….………………….……..
I- LỰA CHỌN, XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU: ……………………………………………………………
II- CHIẾT TÁCH RUTIN: ………………………………………………………………………………………….
II.1.Phương pháp và điều kiện chiết Rutin: ………………….………………….…………………
II.2.Tinh chế và định lượng Rutin: ………………….………………….…………………………………..
II.2.1.Tinh chế Rutin: ………………….………………….………………….……………………………………….
II.2.2.Định lượng Rutin: ………………….………………….……………………………………………………….
III- TỔNG HP QUERCETIN: ………………………………………………………………………………..
III.1.Điều kiện và quy trình tổng hợp: ………………….………………….……………………………
III.2.Tinh chế và định lượng Quercetin: ………………….………………….………………………..
III.2.1.Tinh chế Quercetin: ………………….………………….………………….……………………………..
III.2.2.Định lượng Quercetin: ………………….………………….…………………………………………….
IV- NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỔNG HP
PENTAACETYL QUERCETIN: ……………………………………………………………………………..
IV.1.Khảo sát quá trình tổng hợp Quercetin
thành Pentaacetyl Quercetin: ………………….……………………………………………………………….
IV.1.1.Khảo sát về thời gian phản ứng: ………………….………………….…………………………
IV.1.2.Khảo sát về lượng dung môi tham gia phản ứng: ………………….……………..
IV.1.3.Khảo sát nhiệt độ phản ứng: ………………….…………………………….……………………..
IV.2.Tinh chế và định lượng Pentaacetyl Quercetin: ………………….…………….…..
IV.2.1.Tinh chế Pentaacetyl Quercetin:…… ………………….………………………………….….
IV.2.2.Định lượng Pentaacetyl Quercetin: ………………….………………………………….…..
Học viên Hoàng Thị Kim Dung

32
34
35
35

37
37
38
40
40
41
41
42
44
44
45
46
47
49
49
49


Luận văn Thạc só

V- NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỔNG HP Zn-QUERCETIN: ………………
V.1.Khảo sát quá trình tổng hợp Quercetin thành Zn-Quercetin:……………
V.1.1.Khảo sát về thời gian phản ứng: ………………….………………….……………………………
V.1.2.Khảo sát về lượng dung môi tham gia phản ứng: ………………….……………...
V.1.3.Khảo sát nhiệt độ phản ứng: ………………….…………………………….………………………..
V.2.Tinh chế Zn-Quercetin: ………………….…………….……………………………………………………
VI- NHẬN DANH SẢN PHẨM: …………………………………………………………………………….
V.1.Nhận danh Rutin: ………………….………………….………………….………………….………………….
VI.2.Nhận danh Quercetin: ………………….………………….………………….………………….……….
VI.2.1. Sắc ký lớp mỏng, Tonc và UV-Vis: ………………….………………………………………….

VI.2.2. Phổ IR: ………………….………………….………………….………………….………………….…………….
VI.2.3. Phân tích nguyên tố:………………………………………………………………………
VI.2.4. MS Trap………………………………………………………………………………………….
VI.2.5.Phổ NMR: ………………….………………….………………….………………….………………….……….
VI.3.Nhận danh Pentaacetyl Quercetin: ………………….………………….………….………….
VI.3.1. Sắc ký lớp mỏng, Tonc và UV-Vis: ………………….………………………………………….
VI.3.2. Phổ IR: ………………….………………….………………….………………….………………….…………….
VI.3.3. Phân tích nguyên tố:………………………………………………………………………
VI.3.4. MS Trap…………………………………………………………………………………………..
VI.3.5.Phổ NMR: ………………….………………….………………….………………….………………….…………
VI.4.Nhận danh Zn-Quercetin: ………………….………………………….………………….……………
VI.4.1. Sắc ký lớp mỏng, Tonc và UV-Vis: ………………….………………………………………….
VI.4.2. Phổ IR: ………………….………………….………………….………………….………………….……………
VI.4.3. Phân tích nguyên tố:………………………………………………………………………
VI.4.4. MS Trap…………………………………………………………………………………………
VII-XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN: ………..

52
52
53
54
55
56
57
57
58
58
58
58
59

59
61
61
62
62
62
63
65
65
66
66
66
68

PHẦN 3: THỰC NGHIỆM:
I- NGUYÊN LIỆU: ………………………………………………………………………………………………………
I.1.Xử lý nguyên liệu: ………………….………………….………………….………………….…………………
I.2.Xác định độ ẩm: ………………….………………….………………….………………….……………………..
II- TÁCH CHIẾT RUTIN: …………………………………………………………………………………………
II.1.Phương pháp và điều kiện chiết tách Rutin: ……………………….……………………
II.2.Tinh chế và định lượng Rutin: ………………….………………….………………….……………
II.2.1.Kết tinh lại trong ethanol:………………………………………………………………………………
II.2.2.Định lượng Rutin:……………………………………………………………………………………………….
III- TỔNG HP QUERCETIN: :…………………………………………………………………………….
III.1.Điều kiện để thủy phân Rutin thành Quercetin: …………………………………..
III.2.Tinh chế và định lượng Quercetin: ………………….………………….…………………….
III.2.1.Kết tinh lại trong ethanol: ………………………………………………………………………….
III.2.2.Định lượng Quercetin: ………………………………………………………………………………….
Học viên Hoàng Thị Kim Dung

71
71
71
72
72
73
73
73
74
74
74
74
75


Luận văn Thạc só

IV- NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỔNG HP PENTAACETYL
QUERCETIN: :………………………………………………………………………………………………………………
IV.1.Khảo sát quá trình tổng hợp Pentaacetyl Quercetin: ………………….……….
IV.2.Tinh chế và định lượng Pentaacetyl Quercetin: ………………….…………….…
IV.2.1.Kết tinh lại trong acetone+ethanol:…… ………………….………………………….…
IV.2.2.Định lượng Pentaacetyl Quercetin: ………………….………………………………….…
V- NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TỔNG HP Zn-QUERCETIN: …………….
VI- NHẬN DANH SẢN PHẨM: ………………………………………………………………………….
VI.1.Nhận danh Rutin: ………………….………………….………………….………………….…………….
VI.2.Nhaän danh Quercetin: ………………….………………….………………….………………….…….
VI.3.Nhaän danh Pentaacetyl Quercetin: ………………….………………….…….……………..
VI.4.Nhaän danh Zn-Quercetin: ………………….………….………………….………………….……..
VII- XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN:………

VII.1. Các loại vi khuẩn, nấm thử nghiệm:………………………………………………………
VII.2. Môi trường thử nghiệm:………………………………………………………………………………..
VII.2. Chất thử nghiệm: :………………………………………………………………………………………….
VII.4. Dụng cu:ï:…………………………………………………………………………………………………………..
VII.5.Tiến hành khảo sát: :……………………………………………………………………………………..

PHẦN 4 : KẾT LUẬN ………………….………………….………………….…………………….
TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………….………………….………………….………………….……….
PHỤ LỤC
TÓM TẮT LÝ LỊCH TRÍCH NGANG

Học viên Hoàng Thị Kim Dung

76
76
76
76
77
78
79
79
79
80
81
82
82
82
83
83
83

84
87


Luận văn Thạc só

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1: Lượng kẽm cần cung cấp theo lứa tuổi …………………………………………

24

Bảng 2: Nguồn cung cấp trong tự nhiên của kẽm……. ………………………………..
Bảng 3: Kết quả độ hấp thu A của dung dịch Rutin chuẩn tại λ = 258nm
……………………………………………………………………………………………………………
Bảng 4: Kết quả độ tinh của sản phẩm Rutin…..…………………………………………
Bảng 5: Kết quả độ hấp thu A của dung dịch Quercetin chuẩn tại
λ = 255nm…………………………………………………………………………………………..
Bảng 6: Kết quả độ tinh của sản phẩm Quercetin…..………………………………….
Bảng 7: Kết quả khảo sát biến đổi Quercetin thành Pentaacetyl Quercetin
theo thời gian phản ứng………………………… …..………………………………….
Bảng 8: Kết quả khảo sát biến đổi Quercetin thành Pentaacetyl Quercetin
theo lượng dung môi tham gia phản ứng…… …..………………………………….
Bảng 9: Kết quả khảo sát biến đổi Quercetin thành Pentaacetyl Quercetin
theo nhiệt độ phản ứng…………………………… …..………………………………….
Bảng 10: Kết quả độ hấp thu A của dung dịch Pentaacetyl Quercetin chuẩn
tại λ= 254nm……………………………………………………………………………………
Bảng 11: Kết quả độ tinh của sản phẩm Pentaacetyl Quercetin…………………
Bảng 12: Kết quả khảo sát biến đổi Quercetin thành Zn-Quercetin theo thời
gian phản ứng…………………………………… …..………………………………….

Bảng 13: Kết quả khảo sát biến đổi Quercetin thành Zn-Quercetin theo
lượng dung môi tham gia phản ứng…… …..………………………………………..
Bảng 14: Kết quả khảo sát biến đổi Quercetin thành Zn-Quercetin theo
nhiệt độ phản ứng…………………………………… …..………………………………….
Bảng 15: Kết quả phân tích nguyên tố của Quercetin
…………………………….…………………………………… …..………………………………….
Bảng 16: 1H-NMR của Quercetin ………………………………………………………………
Bảng 17: 13C-NMR của Quercetin ……………………………………………………………
Bảng 18: Kết quả phân tích nguyên tố của Pentaacetyl Quercetin
…………………………….…………………………………… …..………………………………….
Bảng 19: 1H-NMR của Pentaacetyl Quercetin …………………………………………
Bảng 20: 13C-NMR của Pentaacetyl Quercetin …………………………………………
Bảng 21: Kết quả phân tích nguyên tố của Zn-Quercetin
…………………………….…………………………………… …..………………………………….
Bảng 22: Kết quả xác định tính kháng nấm, kháng khuẩn…………………………

24

Học viên Hoàng Thị Kim Dung

38
39
42
43
45
46
48
49
50
53

54
55
58
59
60
62
63
64
66
68


Luận văn Thạc só

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, HÌNH
Sơ đồ 1: Sơ đồ nghiên cứu ……………………………………………………………………………
Sơ đồ 2: Xử lý nguyên liệu …………………………………………………………………………..
Sơ đồ 3: Quy trình chiết Rutin …………………………………………………………………....
Sơ đồ 4: Quy trình tinh chế Rutin ………………………………………………………………..
Sơ đồ 5: Quy trình thủy phân Rutin thành Quercetin ………………………………….
Sơ đồ 6: Quy trình tinh chế Quercetin ………………………………………………………..
Sơ đồ 7: Quy trình tổng hợp Pentaacetyl Quercetin ………………………………….
Sơ đồ 8: Quy trình tổng hợp Zn-Quercetin ……………………..………………………….

Trang
33
34
36
37
40

41
44
52

Hình 1: Công thức cấu tạo của Rutin ………………………………………………………
Hình 2: Công thức cấu tạo của Quercetin ………………………………………………..
Hình 3: Ví dụ về trạng thái oxy hóa khử của Quercetin……………………………
Hình 4: Công thức cấu tạo của Pentaacetyl Quercetin …………..………………..
Hình 5: Công thức cấu tạo của Zn-Quercetin ……………………………………………
Hình 6: Hệ thống đun hồi lưu……………………………………………………………………..

7
10
14
18
22
72

Học viên Hoàng Thị Kim Dung


Luận văn Thạc só

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

Đồ thị 1: Đường chuẩn độ hấp thu A theo nồng độ của dung dịch Rutin
chuẩn tại 258 nm ………………………………………………………………………………
Đồ thị 2: Đường chuẩn độ hấp thu A của dung dịch Quercetin theo nồng độ
tại 255 nm…………………………………………………………………………………………...
Đồ thị 3: Biểu diễn khối lượng sản phẩm Pentaacetyl Quercetin theo thời

gian phản ứng ………………………………………………………………………………….
Đồ thị 4: Biểu diễn khối lượng sản phẩm Pentaacetyl Quercetin theo lượng
dung môi tham gia phản ứng ………………………………………………………….
Đồ thị 5: Biểu diễn khối lượng sản phẩm Pentaacetyl Quercetin theo nhiệt
độ phản ứng …………….……………………………………………………………………….
Đồ thị 6: Đường chuẩn độ hấp thu A của dung dịch Pentaacetyl Quercetin
theo nồng độ tại 254 nm…………………………………………………………………….
Đồ thị 7: Biểu diễn khối lượng sản phẩm Zn-Quercetin theo thời gian phản
ứng …………………………………………………………………………………………………….
Đồ thị 8: Biểu diễn khối lượng sản phẩm Zn-Quercetin theo lượng dung
môi tham gia phản ứng …………………………………………………………………….
Đồ thị 9: Biểu diễn khối lượng sản phẩm Zn-Quercetin theo nhiệt độ phản
ứng ………………………………………………………………………………………………….

Học viên Hoàng Thị Kim Dung

Trang
38
42
45
47
48
50
53
54
45


Luận văn Thạc só

DANH MỤC PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Phổ UV của Rutin
Phụ lục 2: Phổ UV của Quercetin
Phụ lục 3: Phổ UV của Pentaacetyl Quercetin
Phụ lục 4: Phổ UV của Zn-Quercetin
Phụ lục 5: Phổ IR của Rutin
Phụ lục 6: Phổ IR của Quercetin
Phụ lục 7: Phổ IR của Pentaacetyl Quercetin
Phụ lục 8: Phổ IR của Zn-Quercetin
Phụ lục 9: Đồ thị biểu diễn kết quả phân tích nguyên tố của Quercetin
Phụ lục 10: Kết quả phân tích nguyên tố của Quercetin
Phụ lục 11: Đồ thị biểu diễn kết quả phân tích nguyên tố của Pentaacetyl Quercetin
Phụ lục 12: Kết quả phân tích nguyên tố của Pentaacetyl Quercetin
Phụ lục 13: Đồ thị biểu diễn kết quả phân tích nguyên tố của Zn-Quercetin
Phụ lục 14: Kết quả phân tích nguyên tố của Zn-Quercetin
Phụ lục 15: Khối phổ MS của Quercetin
Phụ lục 16: Khối phổ MS2 của Quercetin
Phụ lục 17: Khối phổ MS của Pentaacetyl Quercetin
Phụ lục 18: Khối phổ MS2 của Pentaacetyl Quercetin
Phụ lục 19: Khối phổ MS của Zn-Quercetin
Phụ lục 20: Khối phổ MS2 của Zn-Quercetin
Phụ lục 21: Kết quả đo AAS của Zn-Quercetin
Phụ lục 22: Phổ 1H-NMR của Quercetin
Phụ lục 23: Phổ 13C-NMR của Quercetin
Phụ lục 24: Phổ DEPT của Quercetin
Phụ lục 25: Phổ 1H-NMR của Pentaacetyl Quercetin
Phụ lục 26: Phổ 13C-NMR của Pentaacetyl Quercetin
Phụ lục 27: Phổ DEPT của Pentaacetyl Quercetin
Phụ lục 28: Zn-Quercetin thử trên chủng Pseudomonas aeruginosa.
Phụ lục 29: Zn-Quercetin thử trên chủng E.coli.

Phụ lục 30: Zn-Quercetin thử trên chủng Bacillus subtilis.
Phụ lục 31: Zn-Quercetin thử trên chủng Staphylococcus aureus.
Phụ lục 32: Zn-Quercetin thử trên chủng Enterococcus faecalis.
Phụ lục 33: Quercetin thử trên chủng Staphylococcus aureus.
Phụ lục 34: Pentaacetyl-Quercetin thử trên chủng Staphylococcus aureus.
Phụ lục 35: Rutin thử trên chủng Bacillus subtilis.
Phụ lục 36: Rutin thử trên chủng Staphylococcus aureus.
Phụ lục 37: Zn-Quercetin thử trên chủng Trichoderma sp.
Phụ lục 38: Rutin thử trên chủng Aspergillus oryzae.
Phụ lục 39: Zn-Quercetin thử trên chủng Aspergillus oryzae.
Học viên Hoàng Thị Kim Dung


Luận văn Thạc só

TÓM TẮT
Trên cơ sở rutin, một loại flavonoid có trong nhiều loại cây, đặc biệt với hàm
lượng rất lớn trong cây hòe, một loại cây có sẵn và trồng nhiều ở Việt Nam, chúng tôi
thủy phân ra quercetin.
Quercetin cũng là một loại flavonoid đang được nghiên
cứu khá nhiều trên thế giới vì tác dụng của nó lên nhiều loại bệnh khác nhau. Để
nâng cao hiệu quả sử dụng các hợp chất thiên nhiên của Việt Nam trong ngành y tế,
chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài này để tổng hợp một vài dẫn xuất của quercetin,
xét nghiệm tính kháng nấm,kháng khuẩn của chúng.
Kết quả thực hiện đề tài:
1. Lần đầu tiên tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu về phức của
Quercetin với kim loại (Zn), tổng hợp và xác định cấu trúc cũng như hoạt tính
kháng nấm, kháng khuẩn của phức này một cách có hệ thống và khoa học.
2. Tách chiết và tổng hợp được Rutin và Quercetin với hiệu suất cao, tương đối tinh
khiết.

3. Xác định được điều kiện tối ưu để tổng hợp Pentaacetyl Quercetin.
4. Xác định được điều kiện tối ưu để tổng hợp Zn-Quercetin.
5. Bằng các phương pháp phân tích hóa lý hiện đại nhiệt độ nóng chảy, UV, IR,
phân tích nguyên tố, MS, 1H-NMR, 13C-NMR chúng tôi đã xác định được cấu trúc
của các sản phẩm tổng hợp.
6. Kết quả xác định hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn cho thấy: Zn-Quercetin có
hoạt tính mạnh cao hơn rất nhiều so với Quercetin và Rutin cũng như Pentaacetyl
Quercetin.
Kết quả nghiên cứu cho thấy ta thu được các sản phẩm có hiệu suất lớn, độ
tinh khiết khá cao, có thể sử dụng các kết quả này trong các nghiên cứu tiếp theo.

Học viên Hoàng Thị Kim Dung


Luận văn Thạc só

ABSTRACT
On the basis of Rutin, a type of flavonoid existing in a majority of plants,
particularly in Sophora japonica L., with high content which is present and grows
in many locations in Vietnam, hydrolysis was realised to produce Quercetin.
Quercetin is also a type of flavonoid and is a substance on which many studies
have been conducted worldwide because of its effect on many different diseases.
In order to improve the effectiveness of Vietnamese natural compounds in the
health sector, this research has been conducted to synthesize Quercetin
derivatives, to test their antibacterial and antifungal characteristics.
Research results:
1. It’s the first time in Vietnam that a research on the complex of Quercetin
with metal (Zn) was conducted, its synthesis and structure determination
were carried out, its antibacterial and antifungal characteristics were
determined scientifically and systematically.

2. Rutin and Quercetin were extracted and synthesized with high yield and in
relatively high purity.
3. Optimized conditions for the synthesis of Pentaacetyl Quercetin were
found.
4. Optimized conditions for the synthesis of Zn-Quercetin were found.
5. Using physical chemistry analyses such as melting point, UV, IR, element
analysis, MS, 1H-NMR, 13C-NMR the synthesized products structure was
determined.
6. The results of antibacterial and antifungal characteristics testing
demonstrated that Zn-Quercetin has much stronger antibacterial and
antifungal activities than Quercetin, Rutin and Pentaacetyl Quercetin.
Research results indicate that products were obtained with high yield and
in very high purity and the results should be used for the following research steps.

Học viên Hoàng Thị Kim Dung

Trang 1


Luận văn Thạc só

MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, xu thế quay trở lại nghiên cứu các hợp chất
thiên nhiên đang phát triển mạnh mẽ, đặc biệt ở Việt Nam nơi có một hệ
động thực vật đa dạng, phong phú, có nhiều loại cây cỏ có tác dụng sinh
dược học mạnh. Các nhà nghiên cứu nước ta đã đạt được nhiều thành quả
trong việc nghiên cứu và ứng dụng các hợp chất chiết xuất được vào một số
lónh vực. Tuy nhiên, chúng ta chỉ mới dừng lại ở việc nghiên cứu thành phần,
tính chất của các hợp chất này mà chưa đi sâu vào nghiên cứu các dẫn xuất
của các hợp chất trong khi các nhà khoa học trên thế giới đã có nhiều nghiên

cứu đáng kể và chuyên sâu.
Trên cơ sở Rutin, một loại flavonoid có trong nhiều loại cây, đặc biệt
với hàm lượng rất lớn trong cây Hòe, một loại cây có sẵn và trồng nhiều ở
Việt Nam, chúng tôi tổng hợp ra Quercetin. Quercetin cũng là một loại
flavonoid đang được nghiên cứu khá nhiều trên thế giới vì tác dụng của nó
lên nhiều loại bệnh khác nhau. Tuy nhiên, hiện nay người ta đang quan tâm
nhiều đến việc tổng hợp ra các dẫn xuất của Quercetin vì một số dẫn xuất
tổng hợp được đã chứng tỏ hoạt tính mạnh so với Quercetin. Với mong muốn
góp phần vào việc nghiên cứu sâu hơn cho việc sử dụng tốt các hợp chất
thiên nhiên ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài này để tổng hợp
một vài dẫn xuất của Quercetin, xét nghiệm tính kháng nấm,kháng khuẩn của
chúng, từ đó có thể làm nền tảng để thực hiện những bước tổng hợp các dẫn
xuất khác tiếp theo trong những nghiên cứu sâu hơn sau này.

Học viên Hoàng Thò Kim Dung

Trang 1


Luận văn Thạc só

PHẦN 1:

TỔNG QUAN

Học viên Hoàng Thị Kim Dung

Trang 2

Luận văn Thạc só

I- RUTIN: [1], [2], [3], [4], [5], [6]
Rutin là một loại flavonoid chiếm thành phần khá lớn trong cây hoa Hòe,
hoặc từ nhiều cây khác thuộc các họ thực vật khác nhau. Rutin phải chứa từ
95,0% đến 101,5% C27H30O16 tính theo chế phẩm khan.

I.1: Các loại cây có chứa Rutin:
I.1.1: Cây Hòe:
Tên khoa học: Sophora japonica L. ï
Thuộc họ: Đậu, Fabaceae.
a) Mô tả cây:
Cây hoa hoè là dạng cây gỗ, cao khoảng 5-7m. Lá kép lông chim lẻ, mọc
so le, mỗi lá có từ 7-17 lá chét. Hoa mọc thành bông, cánh bướm, màu trắng. Quả
là một giáp dài hoặc hơi cong. Giữa các hạt quả hơi thắt lại. Mùa cây ra hoa: vào
tháng 7, 8, 9.
b) Phân bố, thu hái và chế biến:
Cây hoa Hòe mọc ở nhiều nước trên thế giới nhất là ở khu vực châu Á. Ở
nước ta hoa Hòe được trồng nhiều ở các tỉnh phía Bắc như Hà Nội, Sơn La, Thái
Bình,… với một lượng khá dồi dào có thể đáp ứng một nhu cầu lớn trong sản xuất
các sản phẩm dược. Người ta có thể trồng bằng hạt hoặc dâm cành. Sau 3-4 năm
bắt đầu thu hoạch. Cây sống lâu, càng những năm sau thu hoạch càng cao. Hoa
phải hái lúc còn nụ mới chứa nhiều hoạt chất. Phơi hay sấy khô.
Ở nước ta từ xưa, người ta đã sử dụng hoa hòe sống chữa huyết áp cao,
dùng hoa hòe sao chữa chảy máu cam, ho ra máu, băng huyết, tiện huyết, tró ra
máu, can nhiệt, nhức đầu xây xẩm… dùng dưới dạng thuốc hãm hoặc thuốc sắc.

Học viên Hoàng Thò Kim Dung

Trang 3

Luận văn Thạc só

c) Thành phần hóa học:
Trong thành phần của cây hoa Hòe, Rutin chiếm hàm lượng trung bình như
sau:
-

nụ hòe : 30 – 35%
vỏ quả : 0,5%
lá cây : 4,4%

I.1.2: Cây Mạch ba góc:
Còn gọi là Tam giác mạch, Lúa mạch đen, Kiều mạch, Sèo.
Tên khoa học: Pagopyrum esculentum moench.
Thuộc họ: Rau răm, Polygonaceae.
a) Mô tả:
Mạch ba góc là một cây thuộc thảo, có nhiều cành, cao từ 0,4-1,7m, thân
hình trụ, màu xanh hay đỏ. Lá nguyên đơn, mọc cách, mép nguyên, có bẹ chìa, lá
phía dưới hình tim, đầu hơi nhọn, có cuống, lá phía trên hình mũi tên, không có
cuống. Gân lá hình chân vịt. Hoa mọc thành chùm ở nách lá. Hoa lưỡng tính, chỉ
có một vòng bao hoa, màu trắng đỏ hoặc trắng hồng. Bao hoa có 5 bản tồn tại
trên quả. Nhị 8, nhụy có 3 vòi rời nhau. Bầu thượng có tuyến mật ở xung quanh.
Quả khô có ba góc gồm hai lần vỏ, lớp vỏ ngoài đen xám khi già, lớp vỏ hạt trong
mọng, màu trắng vàng, bao hoa tồn tại. Hạt có nội nhũ bột lớn, phôi thẳng, hình lá
xếp nếp.
b) Phân bố, thu hái và chế biến:
Cây Mạch ba góc được trồng nhiều ở các tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc
Cạn. Ngoài ra còn được trồng ở các nước Châu Á, Châu Âu khác.

Mạch ba góc có thể trồng vào hai vụ: vụ xuân hạ trồng vào tháng 11-12,
thu hoạch tháng 4-5; vụ thu đông trồng vào tháng 8-9 đến tháng 11-12 thì thu
hoạch. Trung bình từ khi trồng đến khi thu hoạch là 3 tháng.

Học viên Hoàng Thị Kim Dung

Trang 4


Luận văn Thạc só

c) Thành phần hóa học:
Tỉ lệ Rutin trong cây thay đổi tùy theo bộ phận, mùa thu hoạch và cách
phơi sấy. Lá có hàm lượng cao nhất: 7.92%; hoa: 4,15%; thân: 0,4% Rutin. Tỉ lệ
Rutin cao nhất khi hoa mới nở.
I.1.3: Cây Nghễ:
Còn gọi là Nghễ đỏ, Nghễ râm, Thủy liễu.
Tên khoa học: Polygonum hydropier L.
Thuộc họ : Rau răm, Polygonaceae.
a) Mô tả:
Nghễ là một loại cỏ mọc hoang, cao 70-80cm, có nhiều cành. Lá hình mác,
cuống ngắn, dài 4-6cm. Những lá trên nhỏ và hẹp hơn, bẹ chìa mỏng, hoa đỏ mọc
thành bông ở đầu cành hay kế lá. Bao hoa 4, nhị 6.
Toàn cây có vị cay nóng, thơm. Khi khô vị sẽ mất.
b) Phân bố, thu hái và chế biến:
Nghễ là một loại cây mọc hoang khắp nơi trong nước ở những vùng ẩm
thấp. Ngoài ra còn mọc ở các nước Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia và các nước
Châu Âu.
c) Thành phần hóa học:
Trong cây Nghễ có chứa các chất oximetylantraquinone và 2-2,5% dẫn

xuất flavon, ramnazin, isoramrutin và rutin, acid polygonic, hyperin, pecsicarin,
chất pecsicarin-metylester.
I.1.4: Cây Cửu lý hương:
Còn gọi là Ruefetid, Vân hương.
Tên khoa học: Ruta graveolens L.
Thuộc họ : Cam qt, Rutaceae.
Học viên Hoàng Thị Kim Dung

Trang 5


Luận văn Thạc só

a) Mô tả:
Cây nhỏ sống dai, nhiều cành, cao 80cm. Lá mọc so le, vò có mùi hắc,
phiến lá 2-3 lần xẻ lông chim, mọc ở dưới gốc, phía trên ít xẻ hơn. Hoa mọc thành
ngù, hoa màu vàng,lá dài 3 cạnh, 4 cánh hoa, 10 nhị, khi chín tự động áp vào đầu
nhụy. Quả khô gồm 4-5 đại đính ở phía gốc.
b) Phân bố, thu hái và chế biến:
Cây mọc hoang và được trồng ở nhiều vùng nước ta để làm thuốc, ngoài ra
còn mọc ở nhiều nước ôn đới như Pháp, Ý và các nước phía Bắc Châu Phi.
c) Thành phần hóa học:
Ngoài một số alcaloid có trong quả và rễ thì cây còn chứa 1-2% rutin, 1%
tinh dầu trong đó chủ yếu là metylnonylceton kèm theo một số chất khác như
metylheptyl, metylceton, hợp chất cumarin như beegapten, xamthotoxin.
I.1.5: Một số loại khác:
Bên cạnh các loại cây trên còn có một số cây khác mà trong thành phần có
chứa Rutin, tuy nhiên theo các tài liệu thì các loại cây này chưa tìm thấy ở Việt
Nam, gồm có:
-

Daphniphyllum macropodum
Cerasus erythrocarpa
Amsoniataber nacmentana
Hoa loài Sambucusnigra
Euphorbia jaxartica
Euphobia lamprocarpa
Eucalyptus macrorrhyncha F.
…..

Như vậy Rutin có hàm lượng khá lớn trong nụ hoa Hòe, do đó chúng tôi
tiến hành chiết Rutin trong nụ hoa Hòe để làm nguyên liệu cho cả quá trình
nghiên cứu sau này.
Học viên Hoàng Thị Kim Dung

Trang 6


Luận văn Thạc só

I.2: Cấu tạo của Rutin:
• Các tên goïi: Rutin; rutozit; tanrutin; 3,3’,4’,5,7-pentahydroxy flavone3-rutinozit; melin; phytomelin; eldrin; ilixanthin; sophorin;
globularicitrin; paliurozit; birutan; rutabion; rutozyd.
• Công thức phân tử : C27H30O16
• Khối lượng phân tử : M = 610,51
• Công thức cấu tạo:
OH
2'

OH

1

8
7

9

O

10

4

5

OH

O

4'

1'

2
3

6

3'

6'

OH
O

5'

O

O

OH

H 3C

O
HO

OH

OH

OH
OH

Hình 1: Công thức cấu tạo của Rutin

I.3: Tính chất Vật lý:
Rutin có dạng bột kết tinh màu vàng nhạt hay vàng hơi lục, không mùi hay

hơi có mùi đặc trưng. Để ra ánh sáng có thể màu hơi sẫm lại.
Rutin dễ tan trong pyridin, tan trong methanol và trong các dung dịch kiềm
loãng, hơi tan trong glycerin, khó tan trong ethanol và isopropanol, không tan
trong nước, aceton, ether, cloroform, ether dầu hỏa, benzen và carbon disulfid.
Bình thường Rutin ngậm 3 phân tử H2O, và bị loại nước khi sấy trong 12h
ở 10 mmHg và 110oC.
Tnc = 185 – 190oC , Thủy = 214 – 215oC

Học viên Hoàng Thị Kim Dung

Trang 7


Luận văn Thạc só

I.4: Ứng dụng của Rutin hiện nay tại Việt Nam:
Do màu vàng tươi của Rutin khi tan trong nước nóng và các dung dịch kiềm
mà người ta sử dụng Rutin chủ yếu để nhuộm giấy, vàng mã… Ngoài ra còn được
sử dụng trong nhuộm màu thực phẩm, trong dược phẩm thì dùng để bao màu
thuốc viên.
Rutin thường dùng cho bệnh nhân bị cao huyết áp mà mao mạch dễ vỡ, đứt
để đề phòng đứt mạch máu ở não, xuất huyết cấp tính do viêm thận, xuất huyết ở
phổi mà không rõ nguyên nhân, còn có tác dụng đối với bệnh cao huyết áp. Rutin
được chế thành thuốc viên, mỗi viên có 0,02g, ngày uống 3 lần, mỗi lần 1 hoặc 2
viên ( 0,06-0,12g/ngày ).
Rutin chưa được tổng hợp theo quy mô lớn thành các sản phẩm (ví dụ :
quercetin…) ở Việt Nam để có thể ứng dụng rộng rãi trên thị trường dược phẩm
cũng như lónh vực buôn bán hóa chất trên thế giới để cạnh tranh với Rutin,
Quercetin… của hãng Fluka hay một số hãng của Trung Quốc .

Học viên Hoàng Thị Kim Dung

Trang 8


Luận văn Thạc só

II- QUERCETIN:
Quercetin là một hợp chất phenol được tìm thấy trong nhiều loài cây thiên
nhiên, trong nhiều sản phẩm thực phẩm, các loại thuốc nhuộm tự nhiên….
Quercetin được xác định về mặt sinh học đầu tiên vào năm 1936.
Các nguồn chứa Quercetin: [23]
-

Hành
:
284 – 486 mg/kg
Cải
:
110 mg/kg
Đậu Pháp
:
32 – 45 mg/kg
Broccoli
:
30 mg/kg
Rau diếp
:
14 mg/kg
Cà chua

:
8 mg/kg
Các loại trái cây :
15 mg/kg
Táo
:
21 - 72 mg/kg
Các loại đồ uống (bia, chocolat sữa, vang trắng) : < 1 mg/l
Rượu vang đỏ
:
4 – 16 mg/l
Nước nho
:
7 - 9 mg/l
Nước chanh
:
7 mg/l
Nước cà chua
:
13 mg/l
Các loại nước trái cây khác : < 5 mg/l
Nước trà
:
10 - 15 mg/l

Trong những năm gần đây, Quercetin được nghiên cứu rộng rãi trên thế
giới do nó có hoạt tính mạnh so với các loại flavonoid khác. Tuy nhiên nguồn
Quercetin có sẵn trong thiên nhiên tương đối thấp, đòi hỏi quá trình trích chiết lâu
dài và kém hiệu quả do đó người ta đã tìm phương pháp để có thể tổng hợp
Quercetin cũng từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên, đó là phương pháp thủy phân

Rutin, một loại flavonoid có hàm lượng cao trong một số loại cây, để tạo ra
Quercetin. Phương pháp này đặc biệt phù hợp với điều kiện của Việt Nam, là nơi
trồng nhiều cây Hòe, loại cây có hàm lượng Rutin lên đến 30%. Vì vậy, trong
khuôn khổ đề tài nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp tổng hợp Quercetin
từ Rutin để tạo ra nguyên liệu ban đầu cho các phản ứng tổng hợp tiếp theo.

Học viên Hoàng Thị Kim Dung

Trang 9


Luận văn Thạc só

II.1: Cấu tạo:

• Các tên gọi: Quercetin; 3,3’,4’,5,7-pentahydroxy flavone; metetin;
Sophoretin.
• Công thức phân tử : C15H10O7
• Khối lượng phân tử : M = 302,23
• Công thức cấu tạo :
OH
2'
1

8

HO

O

9

3'

1'

4'

2

OH

7
6

4

10

5'

6'

3

OH

5

O

OH

Hình 2: Công thức cấu tạo của Quercetin

II.2: Tính chất Vật lý: [3], [14]
Quercetin có dạng tinh thể hình kim mịn, màu vàng chói, không vị.
Quercetin không tan trong nước lạnh, rất ít tan trong nước nóng, dễ tan
trong acid acetic, ethanol, dung dịch kiềm loãng.
Quercetin bình thường ngậm hai phân tử nước và bị mất nước khi sấy khô ở
95 – 97oC, Tnc = Thủy = 314oC.
Quercetin không bền dưới tác dụng lâu dài của ánh sáng, nhiệt độ.

II.3: Phản ứng điều chế từ Rutin:
acid:

Quercetin được điều chế bằng phản ứng thủy phân Rutin trong môi trường
OH

OH

HO

HO
O

OH

O
OH

O

O

OH

H2O/H2SO4
OH

C6H10O4 O

Học viên Hoàng Thị Kim Dung

C6H11O4

OH

O

+ C6H12O6 + C6H12O5
Glucose

Rhamnose

Trang 10


Luận văn Thạc só

II.4: Hoạt tính và ứng dụng của Quercetin:
II.4.1: Trong dược phẩm và y tế: [22], [23], [24], [25], [26], [27]

™ Quercetin làm giảm nguy cơ ung thư:
Quercetin giúp làm giảm nguy cơ phát triển của ung thư. Được nhận biết
như là một phytoestrogen, Quercetin có khả năng kháng estrogen đưa đến làm
giảm nguy cơ ung thư. Ở liều thấp, Quercetin là một tác nhân hiệu quả trong ngăn
ngừa ung thư da do khóa ( block ) các chất gây chuyển hóa tế bào. Hoạt tính ức
chế một số dòng tế bào ung thư và hoạt tính chống sự tăng sinh là do thông qua
tương tác liên kết với type II estrogen binding sites ( type II EBS ).
Ngoài ra còn do Quercetin ức chế protein kinase ( enzyme xúc tác cho
phản ứng phosphoryl hóa ): protein kinase điều chỉnh và điều khiển nhiều hoạt
động sinh lý vì thế có thể làm tăng sự phát triển u ác tính, do đó Quercetin còn ức
chế sự phát triển của tế bào ung thư qua việc ảnh hưởng ức chế lên phosphorylase
C và protein kinase. Quercetin còn làm giảm sự phóng thích lactate từ các tế bào
u và làm tăng tính axit trong khối u để hoạt hóa lysosomal, là chất ức chế
calmodulin ( protein canxi điều biến ): calmodulin đóng vai trò chính trong việc
điều chỉnh tế bào từ đó làm tăng hoạt tính kháng u của Quercetin.
Các thử nghiệm cho thấy Quercetin có khả năng ức chế tế bào ung thư vú.
Các thí nghiệm trên chuột cho thấy Quercetin làm giảm mức độ ung thư vú gây ra
bởi tác nhân 7,12-dimethylbenzanthracene (DMBA) hay N-nitroso-methyl urea.
Người ta còn quan sát thấy không có tình trạng nhiễm độc hay mất trọng lượng ở
chuột sau 20 tuần như ở một vài loại thuốc khác. Ở dòng tế bào gây ung thư vú
MDA-MB 468 ở người, Quercetin có khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào ( IC50 =
7 μg/ml ). Khi sử dụng chung với cis-platin, một loại thuốc chống ung thư hiệu
quả đang được nghiên cứu sử dụng, cho thấy làm tăng hiệu quả chống tăng sinh tế
bào ung thư khi thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư OVCA 433.
Nghiên cứu hơn 200 loại flavonoids cho thấy Quercetin làm tăng tuổi thọ
của chuột bị bệnh bạch cầu. Là chất ái điện tử, Quercetin kềm chế hoạt tính của
O• và làm mất hoạt tính của các chất gây ung thư hoặc làm giảm tối thiểu khả

Học viên Hoàng Thị Kim Dung

Trang 11