Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu sản xuất vaccine than Bacillus anthracis

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN NGỌC BẢO

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACCINE
THAN Bacillus anthracis

Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã số: 62420107

DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2015
1


Cơng trình đƣợc hồn thành tại
Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên- ĐHQGHN

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. TS. Đoàn Trọng Tuyên
2. TS. Lê Thu Hà

Phản biện 1: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
..............................
Phản biện 2: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
..............................
Phản biện 3: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
..............................

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án
tiến sĩ họp tại . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
vào hồi

giờ

ngày

tháng

năm 20...

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

2


MỞ ĐẦU

Bệnh than là bệnh truyền nhiễm cấp tính, nguyên nhân do nhiễm trực khuẩn
than B.anthracis. B. anthracis thường gây bệnh cho các loại động vật móng guốc,
ăn cỏ như: trâu, bò, ngựa, dê, cừu…người mắc bệnh là do ngẫu nhiên tiếp xúc trực
tiếp với động vật mắc bệnh hoặc các sản phẩm từ động vật như: thịt, sữa, da,
lông[1]. Vi khuẩn than được xếp vào nhóm tác nhân nguy hiểm nhóm 3 bởi vì bệnh
cảnh lâm sàng và đường lây phong phú, gây tử vong cao, tồn tại bền vững ngồi
mơi trường. Chính vì, dễ sản xuất và tàng trữ nên B.anthracis thường được các
nước sử dụng như một loại vũ khí sinh học trong phịng chống và đánh trả, ln có
nguy cơ sử dụng khi chiến tranh [4].

Phịng chống bệnh than ln là vấn đề mang tính cấp thiết, sử dụng kháng
chỉ là biện pháp ngắn hạn, tại chỗ. Biện pháp bảo vệ lâu dài và chủ động trên diện
rộng là tiêm phịng vắc-xin cho các nhóm nguy cơ cao: người dân trong vùng dịch,
nhân viên y tế trực tiếp điều trị bệnh nhân than, nhân viên xét nghiệm tại các
phịng thí nghiệm... Bên cạnh đó, dự phịng bệnh than cho quân nhân thực hiện
nhiệm vụ trong điều kiện tác chiến có nguy cơ sử dụng trực khuẩn than cũng là vấn
đề nhiều quốc gia trên thế giới đặt ra.
Hiện nay, quan điểm sử dụng vaccine phòng bệnh than cho người có hai xu
hướng khác nhau. Đối với các nước như: Anh, Mỹ, vaccine phòng bệnh than đã
đưa vào sử dụng là loại vaccine phòng bệnh than hấp phụ, sử dụng một phần cấu
trúc tế bào với kỳ vọng gây miễn dịch đặc hiệu, an tồn, ít phản ứng phụ hơn so
với vaccine toàn tế bào. Trường phái của các nước như: Nga; Trung quốc, Ấn độ,,
thì sản xuất vaccine bào tử than, toàn tế bào với mục đích gây đáp ứng miễn dịch
nhanh và sản xuất đơn giản đầu tư ít. Do vậy cần có những nghiên cứu cụ thể về
hai phương pháp này để có được phương án phù hợp nhất với Việt Nam.
Tại Việt Nam, hàng năm dịch than vẫn xảy ra trên gia súc và lây sang người
nhưng vẫn chưa có vaccine dự phịng cho người. Đến nay, chưa có nghiên cứu về
sự phù hợp giữa các chủng gây bệnh tại Việt Nam và chủng dùng sản xuất vaccine.
Việc nhập vaccine phòng bệnh than cho người có nhiều khó khăn và khơng đáp
ứng được u cầu chủ động phịng bệnh. Chính vì vậy để đáp ứng yêu cầu của
cộng đồng, nhất là yêu cầu của Quân đội chúng tôi triển khai nghiên cứu đề tài
“Nghiên cứu sản xuất vaccine than Bacillus anthracis” nhằm mục đích:
1. Tuyển chọn được chủng sản xuất vaccine và các chủng than gây bệnh đầy đủ
độc lực tại Việt Nam để đánh giá thử thách.
2. Sản xuất được hai loại vaccine phòng bệnh than với hai nguyên lý khác nhau ở
quy mơ phịng thí nghiệm.
3. Đánh giá được tính an tồn, tính sinh miễn dịch và hiệu lực bảo vệ của hai loại
vaccine than trên động vật.
1

Những đóng góp mới của luận án:
1. Phân lập được các chủng than (B.anthracis) từ các ổ dịch mới và cũ, từ mẫu
lâm sàng có tính đại diện cho các vùng dịch (Lai Châu, Hà Giang). Các chủng phân lập từ
môi trường là bằng chứng khẳng định ổ dịch lưu hành trong tự nhiên tại các địa phương.
Đóng góp xây dựng ngân hàng chủng nhóm B. cereus, các chủng than độc lực và không
độc lực.
2. Tuyển chọn được chủng sản xuất vaccine phù hợp có tính tương đồng cao, có
hiệu lực bảo vệ với các chủng gây bệnh phân lập tại Việt Nam. Giải trình tự và đăng ký
vùng gene Pacủa chủng độc lực của Việt Nam trên ngân hàng gene NCBI.
3. Xây dựng quy trình và sản xuất hai loại vaccine phịng bệnh than, đánh giá tính
an tồn, tính sinh miễn dịch và hiệu lực bảo vệ trên mô hình động vật.
4. Nghiên cứu và sản xuất vaccine phịng bệnh than hấp phụ có thể sử dụng cho
người lần đầu áp dụng tại Việt Nam ở quy mơ phịng thí nghiệm.
Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm dịch tễ học bệnh than - anthrax
1.1.1 Đặc điểm lưu hành bệnh than trên thế giới
1.1.2. Đặc điểm lưu hành bệnh than trong nước
1.1.3. Đặc điểm lâm sàng bệnh than
1.1.4. Dự phòng và điều trị dự phòng bệnh than
1.2. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn than B. anthracis
1.2.1. Phân loại
1.2.2. Hình thể
1.2.3. Tính chất phát triển
1.2.4. Khả năng đề kháng và phương thức tồn tại của vi khuẩn than
1.2.4.1. Sức đề kháng.
1.2.4.2. Phương thức tồn tại
1.2.5. Cấu trúc kháng nguyên
1.2.6. Độc tố của trực khuẩn than
1.2.7. Cấu trúc hệ thống gene của B. anthracis

1.2.8. Đặc điểm của các chủng B. anthracis dự tuyển sản xuất vaccine.
1.3. Qui trình sản xuất vaccine phịng bệnh than
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu:
 Chủng B.anthracis
+ 02 chủng độc lực (ký hiệu: Toxin) và không độc lực (Non Toxin) do Học viện
Quân y cung cấp.
+ 03 chủng vi khuẩn Bacillus anthracis VCM1167 và chủng B. anthracis
VCM1166 và BaVCM1168; Hai chủng BaVCM1167 và BaVCM1166 có nguồn gốc từ
chủng 34F2 do FAO cung cấp.
+ 01 chủng ký hiệu Vaccine lưu giữ tại Khoa vi sinh vật- Viện Y học dự phòng
Quân đội
2


+ Chủng phân lập các từ mẫu môi trường và mẫu bệnh phẩm lâm sàng.
+ Trình tự các chủng trên ngân hàng gene:
/> dm=result&pk=-466528958
 Vaccine phòng bệnh than
- Vaccine bào tử than sống giảm độc lực, toàn tế bào (TTB) từ chủng dự tuyển.
- Vaccine hấp phụ phòng bệnh than (AVA) từ chủng dự tuyển.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Sinh phẩm, hố chất nghiên cứu
a. Mơi trường ni cấy, phân lập tuyển chọn chủng B. anthracis
b. Sinh phẩm PCR:
c. Sinh phẩm giải trình tự gene do hãng ABI cung cấp
d. Kháng huyết thanh và kháng nguyên:
e. Định lượng kháng thể:
f. Thanh định danh trực khuẩn bacillus API 50CHB/E và API 20E ( Pháp).
2.2.2. Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu.

2.2.2.1. Máy móc dụng cụ
- Tủ ấm 370C, Memmert, kính hiển vi Olympus, tủ lạnh âm (-200C).
- Máy đông khô Edward 3400 – Anh quốc.
- Buồng cấy vô trùng Class II Nuaire – USA.
- Máy Khuếch đại gene Parking Elmer 2400 ( Mĩ).
- Máy điện di Power pac 300 ( Bio - rad).
- Máy ly tâm, máy đo MacFanland, máy ủ (370C).
- Máy sequencer 3130 genetic Analyzer –ABI (Mỹ).
- Cân điện tử, hộp Roux, đĩa Petri và các dụng cụ chuyên dùng.
2.2.2.2. Dụng cụ tiêu hao
2.2.2.3. Động vật thí nghiệm
- Chuột nhắt trắng khỏe mạnh: 18 – 22g/con.
- Chuột lang khỏe mạnh: 250 – 350 g/con.
- Thỏ khỏe mạnh trọng lượng 2,5 – 3,5 kg/con (thỏ newzeland do Trung tâm
nghiên cứu dê, thỏ Xuân Canh Ba Vì cung cấp).
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu:
2.3.1. Phƣơng pháp nghiên cứu tuyển chọn chủng sản xuất vaccine và các chủng vi
khuẩn than gây bệnh làm chủng thử thách:
 Kỹ thuật phân lập và định danh vi khuẩn:
 Phƣơng pháp xác định khả năng gây bệnh thực nghiệm:
- Phương pháp xác định độc tính cấp LD50 của chủng than độc lực.
 Phƣơng pháp phát hiện B. anthracis và các yếu tố độc lực bằng kỹ thuật sinh
học phân tử.
- Kỹ thuật PCR và semi-Nested PCR xác định các gene độc lực B.anthracis
- Kỹ thuật giải trình tự gene và so sánh trình tự các vùng gene:
3


2.3.2. Quy trình kỹ thuật sản xuất vaccine
2.3.2.1. Quy trình kỹ thuật sản xuất vaccine bào tử sống giảm độc lực

- Kiểm tra chủng giống

Chủng Bacillus anthracis
BaVCN1167 đơng khơ

Hồn ngun chủng với canh
thang TSB (370C/6h)
(370C/hhggggiờ)giờ)

- Kiểm tra thuần khiết

Thạch dinh dưỡng (NA)
370C/24 giờ
Nhân chủng trong canh thang TSB
370C/15 giờ

- Chọn khuẩn lạc

3
Nuôi cấy thu sinh khối VK trên
Thạch NA trong hộp Roux 37oC/48
giờ
0
Gặt vi 37
khuẩn
bằng
C/48
giờtá dược
(12ml/hộp Roux)

Bất hoạt vi khuẩn (650C/1giờ)

- Kiểm tra thuần khiết
Phân 0,5 ml dịch vi khuẩn vào lọ
đông khô

- Kiểm tra độ sống
- Kiểm tra vật lý, độ ẩm
- Kiểm tra an tồn chung

Đơng khơ vaccine trên máy đông khô

- Kiểm tra đáp ứng miễn dịch
và cơng hiệu

Vắc xin thành phẩm

Hình 2. 1: Quy trình sản xuất vaccine phòng bệnh than sống giảm độc lực.
.
Dsfdfgd
Fgfgh
Ghj
4


2.3.2.2. Phƣơng pháp sản xuất vaccine hấp phụ phòng bệnh than (AVA)
Môi trường
nhân giống
(1)

Nhân giống
24 h

Môi trường
lên men
Tiếp giống
10%

Tối ưu điều kiện
môi trường

(2)
Lên men

(2)
(3)

Kiểm tra tốc
độ sinh
trưởng

(4a)

(4b)

Xác định
lượng protein
tạo thành

Thu mẫu

sau 36h lên
men
(5)
Loại bỏ tế bào

Bổ sung
amluminum
hydroxide 0.1%

Kiểm tra protein
bằng phản ứng
Western, ELISA

(7)

(6)
Tủa bằng cồn 50 %
(9)

(8)

Chia nhỏ và
đơng khơ

(10)

Hình 2. 2. Quy trình sản xuất vaccine hấp phụ phịng bệnh than (AVA)
2.2.2.2.1. Các bƣớc thực hiện quy trình lên men:
2.3.2.2.2. Các phƣơng pháp áp dụng trong sản xuất và đánh giá độ tinh sạch
của protein PA của vaccine hấp phụ


Lựa chọn mơi trường thích hợp lên men chủng dự tuyển sản xuất vaccine

Điều kiện môi trường sinh tổng hợp protein PA của B.anthracis
 Kỹ thuật thu nhận protein PA [119]
 Xác định độ tinh sạch bằng kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide 12,6 %
 Tinh sạch protein bằng phương pháp tủa Ethanol
 phương pháp sắc ký trao đổi ion
 Sắc ký lọc gel Biogel P100.
 Phương pháp Western Blot [3, 25]

5


2.3.3. Phƣơng pháp đánh giá tính an tồn và sinh miễn dịch của vaccine
phòng bệnh than.
2.3.3.1. Kỹ thuật xác định độc tính cấp của vaccine trên động vật thực nghiệm
(LD50) .
- Cách xác định LD50 theo phương pháp Kaerker và behrens
- Cách tính LD50 theo cơng thức Spearman-Karber
2.3.3.2. Đánh giá tính an tồn của vaccine:
2.3.3.3. Kỹ thuật gây miễn dịch trên thỏ
Máu 1

Máu 2

0 tuần

Máu 3

Máu 4

4 tuần

2 tuần
Tiêm mũi 1

6 tuần

8 tuần

10 tuần

Tiêm mũi 2

Hình 2. 3: Lịch tiêm và thời gian lấy máu đánh giá đáp ứng miễn dịch của thỏ
tiêm vaccine
2.3.3.4. Định lƣợng kháng thể (anti-PA) kháng kháng nguyên bảo vệ Pa-83
Kda từ huyết thanh thỏ.
2.3.3.5. Phƣơng pháp đánh giá vaccine phòng bệnh than và các tiêu chuẩn
kiểm định vaccine phòng bệnh than
Bảng 2. 1 Tiêu chuẩn chất lƣợng vaccine bào tử than, sống giảm độc lực
TT

Chỉ tiêu

1

Kiểm tra vật lý

2

pH

4

Thuần khiết (*)

5
6

Độ sống (*)
Độ ẩm tồn dư

7

Độ ổn định

8

Chí nhiệt tố

9

Tính sinh miễn
dịch trên thỏ

Tiêu chuẩn
- Bánh xốp, màu trắng, vàng nhạt, bong, không teo, không chảy
nước.

- Hoàn nguyên với nước muối sinh lý tạo thành huyền dịch đồng
nhất, khơng vẩn cặn.
6,8-7,5
- Hình thái đặc trưng của trực khuẩn Than, Gram (+).
- Khơng có tạp nhiễm.
1 x 108 – 5 x 108 CFU/ml
 3%
Độ sống đạt 1x108 - 5x108 CFU/ml đến 2 năm, bảo quản ở nhiệt độ
2oC - 8oC.
- Đánh giá các yếu tố gây sốt gây viêm trong vaccine, tiêm trên
thỏ. Vết tiêm không có phản ứng viêm, Thỏ khơng tăng nhiệt sau
khi tiêm
- Liều tiêm:
+ TTB 0,5ml x 108tbvk/thỏ
- Hiệu giá, hàm lượng kháng thể trong thỏ tiêm vaccine (u/ml =
ng/ml)

6


10

Công hiệu, đánh
giá thử thách

- Sau 10 ngày thử thách (ngày 21-30), với phác đồ tiêm vaccine
0,14 ngày:
+ Chuột chứng: Chết 100%.
+ Chuột được tiêm vaccine liều:
+ 107btvk/ml/con: sống 90%

+ 108btvk/ml /con: sống 100%.

Bảng 2. 2. Tiêu chuẩn vaccine hấp phụ phịng bệnh than AVA
TT

Chỉ tiêu

1

Kiểm tra vật lý

2
3
5

7
8
9

pH
Vơ trùng
Độ sống
Aluminum hydrorid hoặc
aluminum potassium
sulfate
formaldehyde
Benzethorium chlorid
Độ ẩm tồn dư

10

Chí nhiệt tố

11

Tính sinh miễn dịch trên
thỏ

12

Công hiệu, đánh giá thử
thách.

6

Tiêu chuẩn
- Bánh xốp, màu trắng, vàng nhạt, bong, không teo, không
chảy nước.
- Hoàn nguyên với nước muối sinh lý tạo thành huyền dịch
đồng nhất, không vẩn cặn.
6,8 - 7,5
- Không nhiễm vi khuẩn, nấm, vi sinh vật khác.
Không
0,65mg / liều (AVA-Mỹ)
0,52 mg / liều (Merck)
0,01% (AVA-Mỹ)
0,0025% - 0,01%
 3%
- Đánh giá các yếu tố gây sốt, gây viêm trong vaccine trên
thỏ. Vết tiêm khơng có phản ứng viêm, thỏ khơng tăng nhiệt

sau khi tiêm.
- Liều tiêm:
+ AVA 0,1ml x 50µg/thỏ
- Hiệu giá, hàm lượng kháng thể trong thỏ tiêm vaccine
(u/ml = ng/ml)
- Hiệu lực bảo vệ của vaccine tăng theo liều tiêm và nồng độ
kháng nguyên PA83.

2.3.3.6. Quy trình kỹ thuật đánh giá cơng hiệu của vaccine AVA.
2.3.3.7. Quy trình kỹ thuật đánh giá cơng hiệu của vaccine TTB:
2.4. Quy trình, kỹ thuật đông khô vaccine.
2.5. Xử lý số liệu: Thống kê xử lý số liệu theo các thuật toán trong y học và các
phần mềm trong nghiên cứu.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN CHỦNG SẢN XUẤT VẮC XIN VÀ CHỦNG
THỬ THÁCH.
3.1.1. Kết quả phân lập định danh vi khuẩn than từ các loại mẫu khác nhau.
Các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và mẫu môi trường được thu thập và phân lập
tại Khoa Vi sinh vật viện Y học dự phòng Quân đội. Mẫu được phân lập chọn lọc
trên mơi trường thạch máu, sau đó lựa chọn khuẩn lạc, nhuộm soi hình thể cấu
trúc, tính chất bắt màu và trình tự sắp xếp.

7


Các chủng nghi ngờ được định danh trên thanh API 50CHB/E và API 20E,
để xác định tính chất sinh vật hóa học và định danh trên phần mềm của hãng
BioMerieux.
Bảng 3. 1: Kết quả định danh các chủng nghi ngờ từ mẫu bệnh phẩm và
chủng đƣợc cung cấp bằng bộ kit API 50CHB/E

TT

Ký hiệu
mẫu

Nguồn mẫu

Số mẫu/
chủng

Nguồn gốc

1

Toxin

Bệnh nhân HVQY

01

Chủng

2

Non Toxin

Bệnh nhân HVQY

01

Chủng

3

Vaccine

Viện VSPDQD

01

Chủng

4

BaVCM1167

01

Chủng

5

Ba VCM
1168

01

Chủng

6

1NS

01

Thể da

7

4NS

01

Thể dạ dàyruột

8

3KV (3B)

Khâu Vai - HG

01

Thể da

9

18C

Tuần Giáo - Điện

Biên

01

Thể da

Viện CNSH cung
cấp
Viện CNSH cung
cấp
Niêm Sơn-Mèo
Mạc-Hà Giang
Niêm Sơn-Mèo
Vạc-HG

Kết quả định danh
Bacillus anthracis
(99,7%)
Bacillus cereus II
(99,9%)
Bacillus cereus II
(99,9%)
Bacillus anthracis
(99,9%)
Bacillus anthracis
(99,6%)
Bacillus cereus 1
(99,9%)
Bacillus anthracis
(99,8%)

Bacillus anthracis
(99,1%)
VK không mọc

Kết quả bảng 2 cho thấy: Kết quả định danh xác định 05 chủng là trực
khuẩn than (B. anthracis) từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng và mẫu chủng cung cấp với
độ tin cậy trên 99%: Toxin, BaVCM1167, BaVCM1168, 4NS, 3KV.
Bảng 3.2. Kết quả định danh các chủng nghi ngờ từ mẫu môi trƣờng bằng bộ
kit API 50CHB/E
T
T
1

Điểm thu thập mẫu

2

Khâu Vai- Hà Giang

3

Quỳnh Nhai- Sơn La

4

Trung Thu- Tủa chùaĐiện Biên

Niêm Sơn- Niêm Tòng –
Mèo Vạc – Hà Giang

Số
mẫu
Đất (nơi bò chết)
03
Đất (nơi chơn)
02
Phân bị mắc bệnh
01
Đất nơi bị chết
02
Lơng bị
01
Phân bị
01
Đất nơi xung quanh nơi 05
trâu mắc bệnh
Phân trâu
01
Đất nơi ổ dịch cũ
03
Nước sinh hoạt
01
Lông, sừng trâu
06
Loại mẫu

8

Kết quả định danh
2/3 chủng B.anthracis

2 chủng B.anthracis
B.cereus
B.cereus
B.anthracis
B.anthracis
2/5 chủng B.anthracis
B.cereus
B.anthracis
B.cereus
Âm tính
3/6 chủng B.cereus


Tuần Giáo Điện Biên

5

Đất chôn gia súc
Phân gia súc mắc bệnh

Tổng số

06
01
33

B.cereus
B.cereus

- Tống số chủng B. anthracis phân lập định danh từ mẫu môi trường là 9/33

chủng.
3.1.2. Kết quả phát hiện B.anthracis và các yếu tố độc lực bằng kỹ thuật PCR
 Kết quả phát hiện vùng gene đặc hiệu Ba813 trên các chủng vi khuẩn than
 Kết quả phát hiện vùng pagA thuộc pXO1 của các chủng vi khuẩn than
 Kết quả phát hiện các vùng gene capA, capB, capC thuộc pXO2
Bảng 3.3. Kết quả PCR phát hiện B. anthracis và các yếu tố độc lực từ các
chủng đƣợc cung cấp và chủng phân lập
Chromosome
Ba813
Toxin
(+)
Non Toxin
(-)
Vaccine
(-)
BaVCM1167
(+)
Ba VCM 1168
(+)
1NS
(-)
4NS
(+)
3KV (3B)
(+)
A3
(+)
B1
(+)
B2

(+)
6B
(+)
7C
(-)
2C
(+)
6C
(-)
8C
(-)
12C
(-)
21C
(-)
13C
(-)
23C
(-)
24C
(-)
1C3
(+)
5C
(-)
4C
(+)
20C
(-)

TT Ký hiệu mẫu
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25

Các vùng gene thuộc plasmide (pXO1 và pXO2)
pagA
CapA

Cap B
Cap C
(+)
(+)
(+)
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(+)
(+)
(+)
(+)

(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)

(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(+)
(+)
(+)
(+)

(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)

Kết quả bảng trên cho thấy:
Chủng BaVCM1167 chỉ có gene pagA nằm trên plasmide pXO1, khơng có
các gene trên plasmide pXO2. phù hợp tiêu chí của chủng sản xuất vaccine. [25] [80].
Phát hiện 4 chủng độc lực ký hiệu Toxin, BaVCM1168, 4NS và 1C3 đầy đủ
độc lực sử dụng làm các chủng thử thách.
9


3.1.3. Kết quả thử nghiệm gây bệnh thực nghiệm trên chuột nhắt trắng
Bảng 3.4: Thử nghiệm độc tính các chủng than trên chuột nhắt trắng
TT

Tên chủng

Nguồn gốc chủng

Thời gian chuột chết

1
2
3
4
5

Toxin
4NS
1C3
Ba1167
Ba1168

HVQY (BN thể da)
BN thể dạ dầy-ruột
Môi trường
Chủng được cung cấp
Chủng được cung cấp

24 giờ - 48 giờ
24 giờ - 48 giờ
24 giờ - 48 giờ
không
24 giờ - 48 giờ

3.1.4. Kết quả đánh giá chủng dự tuyển vaccine BaVCM1167
3.1.4.1. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa đặc trƣng của chủng sản xuất
vaccine - BaVCM1167
Bảng 3.4. Đặc tính sinh lý sinh hóa của chủng BaVCM1167
Chủng

BaVCM1167

Đặc điểm
A

B

C

D

E

F

G

H

I

+
+
+
+
+
+
+
. h ển đ ng . inh le cithina e . T o acid trong môi trường ch a manitol . inh
catala e . h nitrat . hản ng

. n men gl co e kị kh
. hát triển trong môi
trường
a l . háng
1% lysozyme

3.1.4.2. Kiểm tra khẳng định sự có mặt của gene pagA và protein PA của
chủng dự tuyển BaVCM1167
 Khuếch đại đoạn gen pagA bằng phản ứng PCR
 Đọc trình tự nucleotide của gene pagA của chủng VCM 1167.
3.1.4.3. Kết quả so sánh pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA của chủng
BaVCM1167 với các chủng gây bệnh trong nƣớc.
Kết quả so sánh trình tự của chủng BaVCM1167 và các chủng than phân lập
được tại Việt Nam cho thấy độ tương đồng rất cao, phát hiện hai đột biến điểm
dẫn đến thay đổi 2 aa ở chủng Toxin và chủng 4NS của Việt Nam.

Hình 3.1: So sánh trình tự nucleotide vùng pagA của 3 chủng B.anthracis phân
lập tại Việt Nam và chủng dự tuyển sản xuất vaccine BaVCM1167 (Ba1167)
bằng phần mềm Mega5
10


3.1.5. Kết quả đánh giá chủng than độc lực sử dụng làm chủng thử thách.
Bảng 3.5. Kết quả xác định LD50 của chủng 4NS trên chuột lang
Liều tiêm chủng 4NS
(tbvk/ml)
10 tbvk/ml
100 tbvk/ml
1000 tbvk/ml
10.000 tbvk/ml

(n)
5
5
5
5

Số chuột sống Số chuột chết (%)
(%)
4 (80,0%)
2 (40,0%)
0 (0,0%)
0 (0,0%)

1 (20,0%)
3 (60,0%)
5 (100,0%)
5 (100,0%)

Tƣơng quan
sống/chết
0.2
0.6
1
1
∑Li =2.8

LD50 được tính theo phương pháp Kep∂epa
LD50 = lgDN - ∂ (∑Li – 0,5)
- lgDN: logarit của liều tiêm lớn nhất 10.000 = 4

- ∂ : log của hệ số pha lỗng 10 = 1
Ta có : LgLD50 = 4 – 1(2,8 – 0,5) = 1.7  LD50 = 50 bào tử
3.2. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN THAN
3.2.1. Nghiên cứu sản xuất vaccine hấp phụ phòng bệnh than (AVA)
3.2.1.1. Chọn mơi trƣờng ni cấy thích hợp và khả năng sinh tổng hợp
protein PA của chủng BaVCM1167 phục vụ sản xuất vaccine hấp phụ.
Nghiên cứu sinh trưởng chủng BaVCM1166 và BaVCM1167 trên môi
trường 1, 2 dạng đặc và dạng lỏng, ở 37 oC trong điều kiện kỵ khí hồn tồn. Khả
năng sinh trưởng phát triển và sinh tổng hợp protein PA của các chủng khi nuôi
cấy trên cả hai môi trường 1, 2 dạng rắn rất tốt mật độ tế bào đạt 108 CFU/ml sau
36 h ni cấy. Trong khi đó, ở môi trường 1 (mt C) dạng lỏng các chủng vi khuẩn
phát triển yếu hơn môi trường 2 (mt R). Kết quả điện di kiểm tra protein trên gel
polyacrylamide 12,6%.

11


kDa

1, 6: Protein chủng Ba VCM 1166 trên môi
trường 1 rắn và lỏng

100

2, 7: Protein chủng Ba VCM 1167 trên môi

83

70

trường 1 rắn và lỏng
3, 8: Protein chủng Ba VCM 1166 trên môi
trường 2 rắn và lỏng
4, 9: Protein chủng Ba VCM 1167 trên môi
trường 2 rắn và lỏng
5: Thang protein chuẩn

Hình 3.2: Điện di phát hiện sản phẩm protein Pa của chủng B.anthracis nuôi
cấy trên môi trường 1 và 2 sau 42 giờ.
3.2.1.2. Nghiên cứu thời gian thích hợp cho sự sinh tổng hợp protein PA trên
môi trƣờng 1 và 2 dạng lỏng và rắn.
1 – 5: Protein chủng Ba VCM 1166
sau 24, 36, 48, 60, 72 giờ nuôi cấy
6: Thang protein chuẩn
7 – 11: Protein chủng Ba VCM
1167 sau 24, 36, 48, 60, 72 giờ ni
cấy

Hình 3.3: Điện di phát hiện sản phẩm protein PA của các chủng B.anthracis ở
các thời điểm 24h, 36h, 48h, 60h, 72h trên môi trường 2 dạng rắn.
1 – 5: Protein chủng Ba VCM
1166 sau 24, 36, 48, 60, 72 giờ
nuôi cấy
6: Thang protein chuẩn
7 – 11: Protein chủng Ba VCM
1167 sau 24, 36, 48, 60, 72 giờ
ni cấy

Hình 3.4: Điện di phát hiện protein PA của các chủng B.anthracis sinh tổng
hợp ở các thời điểm 24h, 36h, 48h, 60h, 72h nuôi cấy trong môi trường 1 dạng

lỏng
12


1 – 5: Protein chủng Ba VCM
1166 sau 24, 36, 48, 60, 72 giờ
nuôi cấy
6: Thang protein chuẩn
7 – 11: Protein chủng Ba VCM
1167 sau 24, 36, 48, 60, 72 giờ
ni cấy

Hình 3.5: Điện di phát hiện protein PA của các chủng B.anthracis sinh tổng
hợp ở các thời điểm 24h, 36h, 48h, 60h, 72h nuôi cấy trong môi trường 2dạng
lỏng
Môi trường 2 d ng lỏng, chủng BaVCM1166 tổng hợp protein PA và nhiều nhất sau 48 giờ
(giếng 3 hình 3.10); thời gian thích hợp để chủng BaVCM1167 tổng hợp PA l i là ở 36 giờ
(giếng 8 hình 3.10). Ở mơi trường 2, chủng BaVCM1167 có thời gian tổng hợp PA dải hơn ở
môi trường 1 (từ 36 giờ đến 72 giờ so với 36 giờ – 48 giờ ).

Các kết quả trên cho thấy khoảng thời gian thích hợp cho sự sinh tổng hợp
protein PA của các chủng BaVCM1167 là 36 – 48 giờ, và sinh tổng hợp protein
PA tốt hơn khi được nuôi trong môi trường 2 dạng lỏng
3.2.1.3. Sản xuất protein kháng nguyên bảo vệ PA của chủng
BaVCM1167

9
8
7
6

5
4
3
2
1
0

0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0

4

6

10

14

18

22

26

30

34

pH
OD

pH

Biểu đồ động thái quá trình lên men

sinh khối
protein

36

Thời gian

Hình 3.6: Động thái quá trình lên men chủng BaVCM1167 ở nhiệt độ 37 oC
trong điều kiện kỵ khí hồn tồn sản xuất vaccine AVA

13


0.4

OD

Đường chuẩn protein PA
y = 0.0163x + 0.0246
R2 = 0.9828

0.35

OD
1

0.3
0.25

0.8

Series1

0.2

y = 0.4299x + 0.0648
R2 = 0.9833

Linear (Series1)

0.6

0.15

0.4

0.1
0.2

0.05
0

0

0

5

10

15

20

25
BSA (mg/ml)

0

0.5

1

1.5

2

2.5 PA

Hình 3.7: Đường chuẩn Bradford cho xác định hàm lượng protein tổng số của
dịch lên men và phương trình đường chuẩn protein PA cho xác định hàm lượng
protein PA trong dung dịch sau ly tâm
.
1

2

3

Hình 3.8: Điện di protein tổng
số của chủng BaVCM 1167

85 kDa
83
kDa

Giếng 1: Protein PA tinh s ch sau khi
tủa băng thanol 5
Giếng 2: protein

trước tinh s ch

Giếng 3: Thang protein chuẩn

3.2.1.4. Nghiên cứu quá trình tinh sạch protein PA từ chủng BaVCM1167
 Kết quả tinh sạch protein PA bằng phƣơng pháp tủa ethanol

Kết quả cho thấy ở nồng độ Ethanol 50 % các protein khác đã bị loại bỏ
đồng thời băng protein kích thước 83 kDa đã tăng lên rõ nét. Từ đó, chúng tơi tiến
hành tinh sạch hàm lượng lớn protein PA ở nồng độ này.
1

kDa

1

2 3 4

5

6 7

2
83
kD
a

85 kDa
83 kDa

100

85

70

Hình 3.9: Tinh sạch protein

PA bằng phương pháp tủa
ethanol ở các nồng độ khác
nhau
1-6: sản phẩm điện di tủa
protein ở các nồng đ cồn lần
lượt là 10 %, 20 %, 30 %, 40
%, 50 %, 60 %.
7: thang chuẩn protein.

14


Kết quả tinh sạch protein qua cột sắc ký trao đổi ion


0.12

P1

0.1

P2

0.08

P3

P4

20

25

0.06
0.04
0.02
0
0

5

10

15

30

35

Hình 3.35. sắc ký đồ DEAE của các phân đoạn được đẩy ra khỏi cột

1

Hình .

: kết quản

2

3

4

5

A xác đinh sự có mặt của protein PA trong các đỉnh

1-4: các đỉnh thu được tu sắc ký đồ P1 – P4
5: ĐC ( saline buffer)

 Kết quả tinh sạch protein qua cột sắc ký biogel P100
KDa

1 2 3

4

5 6 7 8 9

85
83

Hình 3.10: Hình ảnh
điện di các phân đoạn
tinh sạch protein bằng
sắc ký biogel P100.
1: Marker
2: protein trước tinh s ch
3 - 9: các phân đo n tinh sạch

 Khẳng định sự biểu hiện của protein PA bằng phản ứng Western blot

15


Hình 3.25a. Phản ứng của protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin
với kháng thể kháng Thioredoxin trên màng lai PVDF
Giếng 4. Thang chuẩn protein

Hình 3.25b. Phản ứng của protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với
kháng thể kháng PA trên màng lai PVDF
Giếng 7: Thang protein chuẩn (Fermentas)
Giếng 8: Đối chứng (Huyết thanh thỏ trước khi gây miễn dịch)

3..2.2. Sản xuất vaccine phòng bệnh than sống giảm độc lực tại Công ty
Vaccine và Sinh phẩm Pasteur Đà Lạt: Phụ lục 4
3.3. ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TỒN, VÀ SINH MIỄN DỊCH CỦA VẮC XIN
AVA VÀ VẮC XIN TTB TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM.
3.3.1. Kiểm tra tiêu chuẩn an tồn vaccine
3.3.1.1. Yếu tố vật lý:
- Vaccine hấp phụ:
+ Bóc nhãn lọ đựng vaccine, nhìn và đánh giá bằng mắt thường: vaccine
được đóng trong lọ thủy tinh trắng, vaccine đông khô tạo thành bánh xốp, màu
trắng, bong, không teo, không chảy nước.
+ Cho 6ml nước muối sinh lý tạo thành huyền dịch màu trong đồng nhất,
khơng vẩn cặn.
- Vaccine tồn tế bào: Lọ Vaccine phịng bệnh than đơng khơ có màu trắng, xốp,
bong ra, không bị chảy nước.

16

3.3.1.2. Kiểm tra pH vaccine:
- Vaccine hấp phụ: Hút dung dịch nhỏ lên giấy quỳ so màu với thang màu kết
quả cho thấy ở khoảng màu pH=7,0
- Vaccine toàn tế bào: Các lơ vaccine phịng bệnh than đơng khơ có giá trị pH
đạt 6,8 – 7,5
3.3.1.3. Kết quả kiểm tra vô trùng.
 Vaccine hấp phụ: Cho 6ml nước muối sinh lý vô trùng vào lọ vaccine, lắc
đều. Tiến hành lấy 0,5 ml cho vào môi trường thạch máu, thạch dinh dưỡng
và thạch sabouraud. Lấy que cấy ria đều huyền dịch trên đĩa thạch, ủ đĩa cấy
trong nhiệt độ 370C/ 24 giờ.
+ Kết quả vi khuẩn hiếu khí: âm tính
+ Kết quả vi khuẩn tan huyết: âm tính
+ Kết quả nấm men, nấm mốc: âm tính
 Vaccine tồn tế bào: thuần nhất
3.3.2. Kết quả đánh giá tính an tồn và sinh miễn dịch của vaccine:
3.3.2.1. Đánh giá phản ứng toàn thân và tại chỗ sau tiêm vaccine trên thỏ:

Bảng 3.6. Kết quả theo dõi nhiệt độ và phản ứng tại chỗ của thỏ sau tiêm 02
loại vaccine, so sánh với nhóm chứng và nhóm plascebo.
Mã số thỏ
Thỏ 1
Thỏ 2

Vaccine AVA

Thỏ 3
Thỏ 4
Thỏ 5

Thỏ 6
Thỏ 7

Vaccine toàn tế bào
(TTB)

Thỏ 8
Thỏ 9
Thỏ 10
Thỏ 11
Thỏ 12
Thỏ 13

Sáng
chiều
Sáng
chiều
Sáng
chiều
Sáng
chiều
Sáng
chiều
Sáng
chiều
Sáng
chiều
Sáng
chiều
Sáng

chiều
Sáng
chiều
Sáng
chiều
Sáng
chiều
Sáng

Trƣớc tiêm
-2
-1
37,8
38,2
39
39,1
38,8
38
38,2
38,1
39,1
38,9
38,9
39
39,5
38,9
38,9
39
38,9
39

39,1
39
37,5
38,2
38,9
38,5
38
39
39
39
38
38.5
38.2
38
39,1
39
39,2
39,3
38,2
38,5
39,1
39,2
39,2
38,9
39,2
39
37,6
38,1
38
38,2

38,9
38,9

0
39,1
38,4
39,4
38,5
38,9
38,9
39
39
39,1
38,5
39,1
38,5
17

Sau tiêm
1
39
39,4
38,2
38,3
39
39,2
38,1
38,4
39,5
39

39
39
38,9
39
39
39
39,2
39
38,8
38,5
39,1
39
39,3
39
38,5

2
39,4
38,2
39
38,1
39,5
39
38,9
39
39
38,5
39,1
39,3
38,5

T0 dao
động
0,7
0,0
0,2
-0,8
0,2
0,7
0,2
0,8
-0,1
-0,2
0,0
1,1
-0,4

Vết tiêm
Bình
thường
Bình
thường
Bình
thường
Bình
thường
Bình
thường
Bình
thường

Bình
thường
Bình
thường
Bình
thường
Bình
thường
Bình
thường
Bình
thường
Bình


chiều
Sáng
chiều
Sáng
chiều
Sáng
chiều
Sáng
chiều
Sáng
chiều
Sáng
chiều
Sáng

Thỏ 14
Thỏ 15

chứng

plascebo

Thỏ 16
Thỏ 17
Thỏ 18
Thỏ 19
Thỏ 20

39
38,7
39
39
38,9
38,2
38,1
39
38,8
38,8
38,2
38,1
38,4
39

chiều

39
39
39
39
39,2
39
38,1
38,5
39
38,5
38
38,5
38,8
39

38,2

38,5

38,6
39,2
39,2
39
38,9
39,5
38,8
38,8
38,6
39,6
39,2

39
38,9
38,9

39,2
39
38,5
38,7
38,2
38,9

38,5

39

39.2
39

thường
Bình
thường
Bình
thường
Bình
thường
Bình
thường
Bình
thường
Bình

thường

0,3
-0,1

39,5
38,8
39,6
38,6
39

0,7
-0,1
0,8
0,4

Bình
thường

0,2

38,7

3.3.2.2. Đánh giá độc cấp tính của vaccine (LD50) trên chuột nhắt trắng.
 Độc tính cấp của vaccine AVA.
Bảng 3.7. Xác định liều chết 50% (LD50) vaccine AVA trên chuột nhắt trắng
Lô chuột thử

Nồng độ AVA (

nghiệm

µg/chuột)

Số lƣợng chuột
Chết

Sống

Tổng số

Tỉ lệ chết (%)

Lơ sô 1 (n=8)

1800.00

2

6

8

25,00

Lô sô 2 (n=8)

1440.00

2

6

8

25,00

Lô sô 3 (n=8)

1152.00

0

8

8

0,00

Lô sô 4 (n=8)

921.60

0

8

8

0,00

Lô sô 5 (n=8)

737.28

0

8

8

0,00

Áp dụng công th c:
logLD50 = Log X100 – Log Fd (∑t – n/2)
n
LD50 = 90.000 µg/kg
Kết qủa cho thấy độc tính của vaccine AVA rất thấp, ở hàm lượng PA cao nhất
mà chúng tơi có thể tạo ra không thể gây chết 50 % động vật thí nghiệm.
 Độc tính cấp của vaccine TTB.
Bảng 3.8. Xác định liều chết 50% (LD50) vaccine TTB trên chuột nhắt trắng
Số lô
chuột
Lô sô 1

n

Số lƣợng tế
bào/ liều

Kết quả theo dõi số lƣợng chuột
Chết
Sống
Tương quan

8

1,25 x108

7

1
18

7/8

Tỉ lệ chết
(%)
87,50


Lô sô 2
Lô sô 3
Lô sô 4
Lô sô 5

8
8

1,00 x108

0,75 x108

6
4

2
4

6/8
4/8

75,00
50,00

8

0,50 x108

1

7

1/8

12,5

8

0,25 x108

0

8

8

0,00

Áp dụng công th c:

Từ công thức trên có thể áp dụng cụ thể trong trường hợp này là:
LD50 = 2,27 x 109 tbvk/kg
Kết qủa trên cho thấy độc tính của vaccine TTB tương đối cao. Liều an toàn
trên chuột là 0.25 x 108 tương đương 1,25 x 109 tbvk/kg.
3.3.2.3. Kết quả đánh giá tính sinh miễn dịch của vaccine AVA và TTB trên
thỏ
 Kết quả đánh giá kháng thể nền trên thỏ và xác định ngƣỡng dƣơng
tính.
Bảng 3.9. Nồng độ kháng thể nền trong huyết thanh thỏ trƣớc khi tiêm
vaccine
Vaccine
thử
nghiệm dự
kiến
Vaccine
hấp phụ
(AVA)

Vaccine
toàn tế bào

(TTB)

Số
thỏ

Ký hiệu thỏ

Thỏ 1
Thỏ 2
Thỏ 4
Thỏ 5
7 Thỏ 6
Thỏ 7
Thỏ 8
Thỏ 9
Thỏ 10
Thỏ 11
Thỏ 12
8 Thỏ 13
Thỏ 14
Thỏ 15
Thỏ 16
Tổng (16 thỏ)

Định lƣợng nồng độ anti-PA83 trên thỏ trƣớc
tiêm vaccine
P
OD
GMT
Xm ± SD

(α=0,05)

0,576
0,365
0,533
0,584
0,365
0,334
0,305
0,416
0,305
0,495
0,504
0,365
0,347
0,640
0,495

0,423

0,437 ± 0,121

0,889

0,435

0,45 ± 0,108

0,429

0,442 ± 0,111

Ghi chú: n: số lượng thỏ th nghiệm;
: đ lệch chuẩn. Xm giá trị trung bình c ng của kháng
thể. GMT: giá trị trung bình nhân của hiệu giá kháng thể

19


 Kết quả định lƣợng kháng thể trên thỏ tuần thứ 6 sau tiêm 2 mũi
vaccine.
Bảng 3. 10. Nồng độ anti-PA83 của các lô thỏ vào tuần thứ 6 sau tiêm
vaccine.
Định lƣợng nồng độ anti-Pa 83 trên thỏ
Lô thỏ

n

Lô 1
(tiêm
vaccine
AVA)

8

Lô 2
(tiêm
vaccine
tồn tế bào)

8

Lơ 3
(chứng
placebo)

3

Ký hiệu
Thỏ 1
Thỏ 2
Thỏ 3
Thỏ 4
Thỏ 5
Thỏ 6
Thỏ 7
Thỏ 8
Thỏ 9
Thỏ 10
Thỏ 11
Thỏ 12
Thỏ 13
Thỏ 14
Thỏ 15
Thỏ 16
Thỏ 17
Thỏ 18
Thỏ 19

anti-PA
(µg/ml)
59,926
6,240
8,713
6,862
49,752
6,272
11,848
10,280
36,004
51,740
36,702
33,224
45,634
24,478
50,544
46,380
7,732
3,460
6,738

Ghi chú: Mẫ dương t nh O >= 0,885;
µg/ml

Ln(PA)

GMT
(µg/ml)

11,000
8,738
9,072
8,833
13,065
10,814
8,743
9,379
9,237
10,491
10,854
10,510
10,411
39,518
10,728
10,105
10,830
10,744
8,953
8,149 5,648
8,815

P
(α=0,05)

P(1,2) =
0,0052
P(1;3) =
0,170

P(2;3) =
0,000547

1000 U/ml= 1000 nanogram/ml= 1

Kết qủa sau 6 tuần gây miễn dịch nồng độ kháng thể trung bình của thỏ tiêm
vaccine TTB tăng cao, cao gấp 3 lần so với thỏ tiêm vaccine AVA
 Kết quả định lƣợng kháng thể trên thỏ tuần thứ 8 sau tiêm hai mũi vaccine.
Bảng 3. 11. Nồng độ anti-PA83 của các lô thỏ tiếp nhận vaccine ở tuần
thứ 8
Lô thỏ
Lô 1
(tiêm
vaccine
AVA)

n

8

Ký hiệu
Thỏ 1
Thỏ 2
Thỏ 3
Thỏ 4

anti-Pa 83 trong huyết thanh thỏ
Anti-PA
GMT
Ln(PA)

(µg/ml)
(µg/ml)
50,512
10,830
33,984
10,434
15,179
7,126
8,872
5,154
8,548
20

P (1;2)
(α=0,05)

0.636


Lô 2
(tiêm
vaccine
TTB)

8

Thỏ 5
Thỏ 6
Thỏ 7
Thỏ 8

Thỏ 9
Thỏ 10
Thỏ 11
Thỏ 12
Thỏ 13
Thỏ 14
Thỏ 15
Thỏ 16

59,926
9,782
12,564
6,070
12,174
19,554
15,158
9,550
15,670
14,458
42,776
39,064

11,001
9,188
9,439
8,711
9,407
9,881
9,626
9,164

9,660
9,579
10,664
10,573

18,383

Ghi chú: 1000 U/ml= 1000 nanogram/ml= 1 µg/ml, n: số lượng
chuẩn, P: xác suất có điều kiện

: đ lệch

Nồng độ kháng thể trung bình của nhóm thỏ tiêm vaccine AVA tăng cao hơn
thời điểm 6 tuần, nhưng thỏ tiêm vaccine toàn tế bào lại giảm.
 Kết quả định lƣợng kháng thể trên thỏ tuần thứ 10 sau hai mũi vaccine.
Bảng 3.12. Định lƣợng anti-PA83 trong huyết thanh thỏ tiếp nhận vaccine
tuần thứ 10 (lấy máu lần 4)
anti-PA 83 trên thỏ
Lơ thỏ n Ký hiệu anti-Pa
GMT
P (1;2)
Ln(PA)
(µg/ml)
(µg/ml)
(α=0,05)
Thỏ 1
47,142
10,761
Thỏ 2
39,872

10,593
Thỏ 3
14,412
9,576
Lô 1
Thỏ 4
12,874
9,463
(tiêm
15,321
8
vaccin
Thỏ 5
59,926
11,001
e AVA)
Thỏ 6
11,476
9,348
0,861
Thỏ 7
14,252
8,355
Thỏ 8
2,978
7,999
Thỏ 9
8,182
9,010
Thỏ 10

11,056
9,311
Lô 2
Thỏ 11
16,244
9,695
(tiêm
16,599
7 Thỏ 13
16,820
9,730
vaccin
Thỏ 14
15,172
9,627
e TTB)
Thỏ 15
31,172
10,347
Thỏ 16
29,712
10,299
Nồng độ kháng thể trung bình của nhóm thỏ tiêm vaccine AVA tăng cao hơn
thời điểm 8 tuần, nhưng thỏ tiêm vaccine toàn tế bào lại giảm.

21


Hình 3.21. Đáp ứng miễn dịch của
cá thể thỏ tiếp nhận vắc xin ava

Tính sinh miễn dịch khơng đều ở các cá thể thỏ

Hình 3.11: Đáp ứng miễn dịch của
cá thể thỏ tiếp nhận vaccine TTB
Tất cẩ các cá thể thỏ đề có đáp ng MD tốt

Đáp ứng miễn dịch của của thỏ đối với hai loại vaccine AVA và TTB khác
nhau: Lô thỏ tiêm vaccine AVA đáp ứng miễn dịch khơng đều, đáp ứng mang tính
cá thể 3/8 thỏ có đáp ứng rất tốt. Lơ thỏ tiêm Vaccine TTB đáp ứng miễn dịch sinh
ra đồng đều ở tất cả các thỏ.

Ngưỡng (+)

Hình 3.12: Đáp ứng kháng thể thỏ anti-PA trung bình GMT theo thời gian.
Nồng độ kháng thể kháng PA83 trên thỏ đáp ứng với hai loại vaccine có xu
hướng khác nhau. Thỏ tiêm vaccine AVA nồng độ kháng thể có xu hướng tăng
dần, thỏ tiêm vaccine TTB nồng độ kháng thể tăng cao lúc đầu và giảm dần theo
thời gian.

22


3.3.3. Đánh giá công hiệu của vaccine trên chuột lang.

3.3.3.1. Đánh giá hiệu lực bảo vệ của vaccine TTB. (bảng 3.31)
3.3.3.1. Hiệu lực bảo vệ của vaccine TTB

Hình 3. 13: Đánh giá hiệu lực bảo vệ của vaccine TTB trên chuột lang
Biến đ ng số lượng chu t sống sót của các nhóm chu t lang, mỗi nhóm 10 con, 4 nhóm được
tiêm vaccine (từ nồng đ 105, 106, 107, 108 tbvk/ml, phác đồ 2 lần tiêm vào ngày 0 và ngày 14),

nhóm ch ng khơng tiêm vaccine. Chủng th thách đầ đủ đ c lực 4 được gây nhiễm ngày th
21 đường ổ bụng. Liều th thách nhóm thí nghiệm 100 x LD50, liều th thách nhóm ch ng 10x
LD50. Theo dõi trong 10 ngày.

3.3.3.2. Đánh giá hiệu lực bảo vệ của vaccine AVA (Bảng 3.27)

Hình 3. 14:Đánh giá hiệu lực bảo vệ của vaccine AVA trên chuột lang
Biến đ ng số lượng chu t sống sót của các nhóm chu t lang, mỗi nhóm 10 con, 4 nhóm được
tiêm vaccine (từ nồng đ 50 µg, 100 µg và 200 µg, phác đồ 2 lần tiêm vào ngày 0 và ngày 14),
nhóm ch ng khơng tiêm vaccine. Chủng th thách đầ đủ đ c lực 4 được gây nhiễm ngày th
21 đường ổ bụng. Liều th thách nhóm thí nghiệm 100 x LD50, liều th thách nhóm ch ng 10x
LD50. Theo dõi trong 10 ngày.
23