Đồ án công nghệ cố định enzym và ứng dụng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC
Bộ MƠN CƠNG NGHỆ THựC PHẨM
C5S CQ ỈO

ĐỒ ÁN MÔN HỌC

CÔNG NGHỆ CỐ ĐỊNH ENZYM
YÀ ỨNG DỤNG
SVTH

:

NGUYỄN BẢO Dư

MSSV

:

60700443

GYHD

:

TS. TRẦN BÍCH LAM


Đồ án mơn học
TP Hồ Chí Minh, 6/2011

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2011
Chữ ký của giáo viên

/V

1~


Đồ án môn học

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Trần Bích Lam đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian thực hiện đồ án.
Cảm ơn quý thầy cô bộ môn Công nghệ Thực phẩm, khoa Kỹ thuật Hóa Học, trường Đại
học Bách Khoa TpHCM đã giảng dạy nhiệt tình và truyền đạt những kiến thức q báu của mình
giúp tơi hồn thành đồ án.
Xin cảm ơn tất cả bạn bè, những người đã quan tâm, giúp đỡ tơi hồn thành đồ án
này.
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 6/2011
Nguyễn Bảo Dư


Đồ án mơn học
iii ~MỤC LỤC

/V

TRANG BÌA......................................................................................................................................i
NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN...........................................................................ii
LỜI CẢM ƠN..................................................................................................................................iii
MỤC LỤC........................................................................................................................................iv
DANH MỤC HÌNH.........................................................................................................................vi
DANH MỤC BẢNG.......................................................................................................................vi
Chương 1:

TỒNG QUAN............................................................................................................1

1.1. Lịch sử phát triển của enzym cố định.................................................................................1
1.2. Sơ lược về enzym cố định...................................................................................................2
1.2.1.

Định nghĩa .................................................................................................................2

1.2.2.

Đặc điểm của enzym cố định.....................................................................................2

1.2.3.

Ưu nhược điểm của enzym cố định ..........................................................................3

1.2.4.

Các phương pháp cố định enzym..............................................................................3

1.2.5.

Vật liệu cố định........................................................................................................ 5

1.2.6.

Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định enzyme ...................................................7

Chương 2:

ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH...................................................................9

2.1. ứng dụng trong công nghệ thực phẩm.................................................................................9
2.1.1.

Enzym ß-galactosidase..............................................................................................9

2.1.1.1.

Giới thiệu về enzym ß-galactosidase .............................................................9

2.1.1.2.

Nguồn thu nhận enzym ß-galactosidase............................................................9

2.1.1.3.

Các phương pháp cố định enzym ß-galactosidase..........................................10

2.1.1.4.

ứng dụng của enzym ß-galactosidase cố định.................................................13

2.1.1.4.1.

Thủy phân lactose trong sữa và lactoserum..............................................13

2.1.1.4.2.

Tổng họp Galacto-Ohgosaccharides (GOSs)............................................16

2.1.2.

Enzym lipase............................................................................................................17

2.L2.1. Giới thiệu về enzym hpase....................................................................................17
2.L2.2. Nguồn thu nhận enzym lipase...............................................................................17
2.1.2.3.

Các phương pháp cố định enzym lipase..........................................................18

2.1.2.4.

ứng dụng enzym lipase cố định trong công nghệ thực phẩm.........................20

2.1.2.4.1.

ứng dụng lipase cố định tổng họp các ester có hương trái cây.................20

2.1.2.4.2. ứng dụng enzyme lipase cố định để sản xuất Mên tục monoacylglycerol
từ olein dầu cọ ............................................................................................................ 21
2.1.3.

Enzym a-galactosidase (raffinase)...........................................................................23
/V

~


Đồ án mơn học
2.1.3.1.

Giói thiệu về enzym a-galactosidase ...............................................................23

2.L3.2.

Nguồn thu nhận enzym a-galactosidase...........................................................23

2.L3.3.

Cách phương pháp cố định enzym a-galactosidase.........................................23

2.L3.4.

ứng dụng của enzym riffinase cố định.............................................................26

2.2. ứng dụng trong phân tích................................................................................................27
2.2.1.

Tổng quan về cảm biến sinh học (biosensor)........................................................27

2.2.1.1.

Giới thiệu về cảm biến sinh học ......................................................................27

2.2.1.2.

Lịch sử phát triển cảm biến sinh học ...............................................................27

2.2.1.3.

Phân loại............................................................................................................28

2.2.1.4.

Các yếu tố sinh học...........................................................................................29

2.2.1.4.

L.........................................................................................................Enzym
29

2.2.1.4.2.

Kháng thể ..................................................................................................29

2.2.1.4.3.

Vi sinh vật .................................................................................................30

2.2.1.5.

Bộ chuyển đổi (transducer)...............................................................................30

2.2.1.5.1.

Chuyển đổi điện hóa..................................................................................30

2.2.1.5.2.

Chuyển đổi quang......................................................................................30

2.2.1.5.3.

Chuyển đổi nhiệt........................................................................................30

2.2.1.5.4.

Chuyển đổi bằng tinh thể áp điện (piezoelectric) ....................................30

2.2.2.

Cảm biến sinh học sử dụng L-glutamate oxidase và L-glutamate dehydrogenase

cố định dùng để phân tích monosodium glutamate trong thực phẩm...................................31
2.2.2.1.

Giới thiệu..........................................................................................................31

2.2.2.2.

Phương pháp thí nghiệm...................................................................................31

2.2.2.2.1.

Các hóa chất sử dụng ................................................................................31

2.2.2.2.2.

Sự cố định enzym .....................................................................................31

2.2.2.23.

Điện cực ....................................................................................................32

2.2.2.2A

Thử nghiệm ...............................................................................................32

2.2.2.2.5.

Quá trinh phản ứng ...................................................................................33

2.2.2.2.

Ĩ.............................................................................Cấu hình nhiệt độ và pH
33

2.2.2.23.

Xác định giá trị Km và Vmax.....................................................................34

2.2.2.2.8.

Sự ổn định của màng cố định....................................................................35

/V

~


Đồ án mơn học
TÀI LIỆU THAM KHẢO

36DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Mơ hình biosensor........................................................................................................27
Hình 2.2: Mơ hình cảm biến sinh học phân tích MSG dùng L-GLOD-L-GLDH cố định..........32
Hình 2.3: Đường hiệu chỉnh vận tốc tiêu thụ Oxy theo nồng độ MSG của cặp L-GLOD-LGLDH cố định trong cảm biến sinh học.......................................................................................33
Hình 2.4: pH ở nhiệt độ 25 ± 2 °c có mặt 2mM NADPH và lOmM ammonium với nồng độ
MSG 1.2mg/L..............’............................’..................................................................................34
Hình 2.5: Nhiệt độ ở pH 7.0 với nồng độ MSG 12mg/dL...........................................................34
Hình 2.6: Hoạt túứi của enzym cố định trên cảm biến sinh học trong thời gian 60 ngày:
LGLOD 25U-L-GLDH 143.2U; L-GLOD 25U-L-GLDH 35U; L-GLOD 25U...........................35

DANH MỤC BẢNG
•

Bảng 1.1: Ưu - Nhược điểm của các phưorng pháp cố định enzyme.............................................4
Bảng 2.1: Tóm tắt các phưcmg pháp cố định enzym P-galactosidase..........................................13
Bảng 2.2: Thủy phân lactose sử dụng các kỹ thuật cố định khác nhau.........................................15

Chương 1: Tổng quan

Đồ án môn học

Bảng 2.3: Nguồn vsv thu nhận enzym lipase và tứứi chất enzyme lipase 18
Chương 1:

TỔNG QUAN

1.1. Lịch sử phát triển của enzym cố định [1]
- Năm 1916, Nelson và Griffin quan sát và cho thấy rằng enzym invertase của nấm men

.2.6) khi hấp thụ vào than có khả năng thủy phân đường saccharose. Sau đó ữên thế giới xuất hiện nhiều báo cáo về khả năng cố định
enzym bằng liên kết đồng hóa trị trên chất mang. Trước năm 1953 chưa có một nghiên cửu nào về enzym khơng hịa tan được ứng dụng
vào thực tế.
- Năm 1953, Grubhofer và Schleith đã cố định được một số enzym như carboxy peptidase, diastase, pepsin và ribonuclease trên
polyaminostyrene bằng liên kết đồng hóa trị và các nghiên cửu trên mới bắt đầu thử nghiệm ứng dụng qui mô pilot.
- Năm 1954, Chang đã tạo ra được các vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzym để chống lại dị ứng khi đưa enzym vào cơ thể.
- Năm 1963, Bemfeld và Wan đã thí nghiệm thành cơng việc nhốt các enzym như amylase, trypsin, papain, ribonuclease vào gel
polyacrylamide.
- Năm 1964, Quiociio và Richards đã mô tả phương pháp liên kết chéo cố định carboxy peptidase A với glutaraldehyde. Cũng trong
năm này Chang đã triển khai phương pháp tạo vi nang để nhốt enzym carbonic anhydrase.
- Năm 1969, Wilson đã xây dựng thành công xưởng thực nghiệm để sản xuất glucose bằng glucoamylase cố định.
- Năm 1969, Chibata và những người cộng tác ở công ty Tanabe Seiyaku - Nhật đã là những người đầu tiên thực hiện thành công
việc áp dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp. Theo phương pháp cố định enzym của các tác giả người Nhật, enzym aminoacylase
của nấm sợi đã được gắn vào DEAE-sephadex thông qua liên kết ion và sử dụng chúng cho các quá trình thủy phân.
- Năm 1970, Mosbach đã tiến hành cố định ba loại enzym: P-galactosidase, hexokinase, glucophosphatase bằng hên kết cộng hóa trị
với các hạt sephadex.
- Năm 1971, Gregoriadis đã triển khai liposome có chứa amyloglucosidase.

- Năm 1973, Chibata và các cộng tác viên cũng là những người đầu tiên thành công trong việc cố định tế bào vi sinh vật để sản xuất
L-aspartate từ ammonium fumarate bằng gel acrylamid. Tế bào E.coli chứa trong gel có hoạt tính aspartate rất cao.
- Đến năm 1987, bằng công nghệ ứng dụng enzym glucoisomerase cố định, đã tiến hành sản xuất sữo fructose từ glucose theo qui
mô công nghiệp. Cho đến nay cổ khoảng 4,5 triệu tấn sừo fructose được sản xuất theo phưong pháp enzym cố định.

- Ngồi sàn phẩm trên, enzym cố định cịn được ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men, chống ô nhiễm môi trường và cả trong y
học.
1.2. Sơ luợc về enzym cố định
1.2.1.

Định nghĩa [1]
Enzym cố định có thể hiểu theo 2 nghĩa:

- Nghĩa hẹp: enzym khơng hịa tan là enzym được đưa vào những pha riêng rẽ, pha này có thể tách riêng vói mơi trường dung dịch
phàn ứng. Pha enzym khơng hịa tan trong nước và được gắn với các polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn.

/V

1


Chương 1: Tổng quan

Đồ án môn học

- Nghĩa rộng: cắc chất xúc tác cố định là các enzym, tế bào, cơ thể sống ờ trạng thái cho phép sử dụng lại. Như vậy, theo nghĩa rộng,
enzym khơng hịa tan bao gồm cả enzym được cố định vào một chất mang, cả enzym có trong tế bào sống, chúng được cố định trong các
bình phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần.
- Enzym khơng hịa tan hay enzym cố định thường là những enzym hòa tan được gắn vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác
nhau. Nhờ quấ trình gắn này mà enzym từ trạng thái hòa tan chuyển sang khơng hịa tan.

1.2.2.

Đặc điểm của enzym cố định [1]
Enzym cố định có đặc điểm như sau:

- Hoạt tính của enzym cố định thường nhỏ hơn hoạt tính của enzym tự do cùng loại. Sở dĩ có sự thay đổi hoạt tính riêng của enzym
cố định là do những nguyên nhân sau:
•

Do ảnh hưởng điện tích của chất mang: khi điện tích của chất mang có sự khác biệt với điện tích của enzym thì khi gắn enzym

vào chất mang, cấu trúc khơng gian của enzym có sự thay đổi ở mức độ nhất định. Chính vì sự thay đổi cấu trúc này mà sự kết họp giữa
enzym và cơ chất sẽ kém đi, dẫn đến hoạt tính của chứng cùng giảm.
•

Do enzym bị nhốt vào mạng lưới hoặc bị liên kết bởi chất mang khiến cho sự tiếp xúc giữa enzym và cơ chất bị kém đi.

- Enzym cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis - Menten nhưng có một số sai khác nhất định:
• Có thể xảy ra sự cạnh tranh cơ chất với enzym và chất mang.
• Xảy ra hiện tượng cản trở khuếch tán của cơ chất và sản phẩm làm giảm tốc độ phản ứng.
- Enzym cố định thường có tính bền nhiệt hơn enzym tự do nhờ có tác dụng che chở của chất mang.
- Enzym cố định thường có pH tối ưu không trùng với enzym tự do cùng loại.
- Enzym cố định do có chất mang che chắn nên được bảo vệ tốt hơn enzym tự do.

- Enzym cố định có thể tái sử dụng nhiều lần và dễ dàng tách ra khỏi cơ chất một cách dễ dàng sau phản ứng và độ bền của enzym
cố định cao hơn enzym tự do.
1.2.3.
Ưu nhược điểm của enzym cố định [1]
Ưu điểm:
- Enzym cố định có thể tái sử dụng nhiều lần trong thời gian dài.

- Enzym cố định không lẫn vào trong sàn phẩm cuối của phản ứng enzym, do đó nó khơng gây ảnh hường xấu đến chất lượng sản
phẩm, hay nói cách khác chúng ta khơng tốn chi phí cho việc tách enzym ra khỏi sản phẩm
- Có thể ngừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách hệ chất mang - enzym ra khỏi dung dịch cơ chất.
- Enzym cố định tương đối bền với các tác nhân vật lý và hóa học hơn enzym tự do.
- Dễ dàng tiến hành quá trình sản xuất theo phương pháp liên tục.
Nhươc điểm:
- Sự có mặt của chất mang có thể làm giảm hoạt tính của enzym.
- Trong đa số trường họp, enzym có thể bị giảm hoạt mất hoạt tính sau quấ trình cố định.

/V

2~


Chương 1: Tổng quan

Đồ án môn học

- Tuy nhiên, những hạn chế trên là không đáng kể so với những lợi ích mà enzym cố định mang lại. Do vậy, ngày càng có nhiều
nghiên cứu về cố định enzym cũng như ứng dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp.
1.2.4.

Các phương pháp cố định enzym [1]

Các phương pháp cố định enzym được chia thành 2 nhóm: hóa học và vật lý
.Bảng 1.1: Ưu - Nhược điểm của các phương pháp cổ định enzyme [1]
Phương pháp hóa học
Phương pháp

Ưu điểm

Nhược điểm

Phương pháp gắn enzym lên chất
Liên kết giữa enzym và chất mang làHoạt
Mêntính
kết enzym có thể bị giảm do những
mang bằng liên kết cộng hóa
bền, do đó hạn chế tối đa sự mất mát biến đổi về cấu trúc của enzym
trị
enzym trong quá trình phản ứng.
trong quá trình cố định.
Phương pháp gắn các phân Tạo
tử enzym
được Mên kết rất bền trước các tấc nhân
Chi phí cao, thao tác thực hiên tương đối
lại với nhau bằng liên kết pH, nhiệt độ...
cộng hóa trị

phức tạp.
Thường được dùng phối họp với các phương
Hoạt tính enzym có thể bị giảm do những
pháp khác.
biến đổi về cấu trúc của enzym
trong quấ trình cố định.
Phương pháp vật lý

Phương pháp

Ưu điểm

Nhược điểm

Phương pháp gắn enzym lên chất
tấc thực hiện đơn giản.
mang bằng tác nhânThao
vật lý

Do lực tương tác giữa enzym và chất

Điều kiện tiến hành cố định enzym ơn hịa nên
khơng làm mất hoạt tính của enzym
trong q trình cố định.
Có khả năng tái sử dụng chất mang.

/V

3

mang yếu nên dễ xảy ra hiện
tượng nhả hấp phụ trong quá
trình sử dụng enzym cố định do
khuấy trộn hay do thay đổi nhiệt
độ, pH của môi trường.


Chương 1: Tổng quan

Đồ án môn học

Phương pháp nhốt enzym

Chỉ thích họp cho phản ứng với cơ chất có
Thao tác đơn giản.

khối lượng phân tử nhỏ.

Khơng địi hỏi phải có các nhóm tạo Mên kết
nên phù họp với nhiều loại enzym.
Hiệu quả cố định enzym cao.
Có thể cố định đồng thịi nhiều enzym.

Phương pháp hóa hoc:
- Gắn enzym lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trị.
- Gắn các phân tử enzym lại với nhau bằng liên kết cộng hóa trị.
Phương pháp vât lý:
- Hấp phụ enzym lên chất mang bằng liên kết vật lý như sau: lực mao quản, liên kết ion, lực Van der Walls....
- Phương pháp nhốt enzym trong khuôn gel hoặc màng bao vi thể.

liệu cố định [1]
Vật liệu và phương pháp cố định là hai yếu tố có tính chất quyết định đến hiệu quả của q trình cố định enzym Trong đó, khơng có
đặc điểm, tính chất của vật liệu cố định nào thích họp cho tất cả các loại enzym và cũng không có enzym nào thích họp với tất cả các loại
vật liệu cố định.
Vật liệu cố định enzym và tế bào có thể chia làm hai loại: vật liệu vơ cơ và vật liệu hữu cơ.
Vât liêu vô cơ:

- Đặc điểm: chất mang vô cơ bền với các tác động bên ngồi, khơng bị vi sinh vật ăn mịn, phân hủy, nhưng việc gắn với enzym
thường khó khăn hơn.
- Một số chất mang vô cơ thông dụng như: thủy tinh xốp, cấc oxid kim loại như oxid nhôm, oxid mangan, oxid magie, Silicagel...

Vât liêu hữu cơ:
- Đặc điểm: chất mang hữu cơ thường có các nhóm hoạt động hóa học như: -NH 2, - COOH, -OH, -SH,... nên dễ kết gắn với enzym
nhưng độ bền với tác động của môi trường không cao, đặc biệt các polymer sinh học rất dễ bị vi sinh vật xâm nhập và tấn cơng.
• Các polymer tư nhiên:
- Tinh bột là vật liệu phong phú rẻ tiền. Tinh bột dùng để đóng mạch, diethanolamin tinh bột đã được dùng làm chất mang cố định
enzym như lipase, glucoisomerase, trypsin, amylase. Nhược điểm của tinh bột là độ trương kém, thiếu các nhóm chức năng nên khả năng
cố định và hoạt tính enzym cịn thấp. Tinh bột thường được ghép copolymer với các vinyl monomer ưa nước như acrylamide, acrylic acid
để cải thiện tính chất cơ lý, độ trương nở và tạo các nhóm chức năng trên bề mặt.

/V

4~


Chương 1: Tổng quan

Đồ án môn học

- Cellulose và dẫn xuất của Cellulose là CM-cellulose, DEAE-cellulose, nitrocellulose... là những vật liệu rẻ hơn so với agarose
nhưng lại không đồng nhất, thường chỉ sử dụng ở dạng sợi, và dạng tinh thể (microcrystalline). Cellulose là vật liệu được nghiên cứu cố
định enzym đầu tiên, các quy trình cố định trên vật liệu này được nghiên cứu khá hoàn chỉnh. Cellulose thường được dùng để hấp thụ, hên
kết ion, Mên kết cộng hóa trị với enzym hoặc nhốt trong gel.
- Chitin là họp chất được Braconnot phân lập từ năm 1811 và Odier đặt tên là chitin từ năm 1823. Chitin là một polymer sinh học có
nhiều triển vọng trong nghiên cứu và ứng dụng làm vật liệu cố định enzym và tế bào. Chitin là một polymer sinh học rất phổ biến trong tự
nhiên, chỉ đứng sau cellulose.
- Chitin có cấu trúc tương tự cellulose, là một polymer của các gốc 2-acetoamide-2- deoxy-ß-D-glucoza, Mên kết với nhau bởi Mên
kết ß-l,4-glycoside. Chitin có trong thành phần cấu trúc vỏ của cơn trùng, vỏ tơm cua, sị, vách tế bào sinh vật,...Chitin là một vật Mệu có
chứa nhóm chức -OH và cho Mên kết với enzym, có cấu trúc siêu lỗ, có khả năng hấp thụ tốt, dễ tạo màng. Chitin có cấu trúc mạng tinh

thể chặt chẽ, khơng chỉ có các Mên kết hydro hình thành trong chuỗi mà cịn có giữa cấc lóp với nhau trong mạng tinh thể. Chitin là một

polymer kỵ nước, độ trương thấp, diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ và bền về mặt hóa học. Gần đây có rất nhiều nghiên cứu cố định enzym
trên chitin, chủ yếu bằng phương pháp hấp thụ và Mên kết cơng hóa trị qua cầu nối glutaraldehyde. Chitin được tìm thấy trong thành tế
bào của nấm sợi. Nó là chất hữu cơ chiếm lượng lớn để hình thành nên lóp vỏ ngồi của động vật khơng xương sống (cơn trùng, giáp
xác...). về mặt cấu trúc, chitin có cấu trúc tương tự như cellulose, điểm khác biệt hóa học duy nhất là nhóm acetamido ở vị trí số 2 trên
khung carbon của chitin được thay thế cho nhóm hydroxyl (-OH) ờ ceUulose.
- Chitosan là dẫn xuất của chitin khi được deacetyl hóa trong kiềm mạnh. Chitosan dễ tạo màng, tạo hạt, có cấu trúc siêu lỗ, có
nhóm - NH2. Chitosan có thể cố định enzym bằng phương pháp hấp phụ, phương pháp cộng hóa trị, hoặc nhốt enzym trong gel chitosan.
Chitosan không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ như acid formic, acid dipic, acid acetic. Chitosan là một polymer sinh học có
trọng lượng phân tử cao, có các nhóm amin hoạt động, cấc nhóm hydroxyl có thể tham gia phàn ứng hóa học.
- Anginate, carrageenan, cả hai vật Mệu này tạo gel trong dung dịch CaCỈ2 dùng để nhốt tế bào, enzym.

/V

5


Chương 1: Tổng quan

Đồ án môn học

Chất mang protein thường là gelatin, keratin, albumin,... thường có khả năng dễ tạo
màng, tạo hạt, nhốt enzym trong khuôn gel với tác nhân đóng mạch là glutaraldehyde; nhược
điểm của nhóm này là thường kém bền, dễ bị nhiễm khuẩn.• Các polymer tone hơp:
- Cấc polymer tổng họp được sử dụng làm chất mang cố định enzym như polyacrylamide,
polyester,

polyvinylalcohol,

polyvinylacetate,

polyacrylic,

polyhydroxyethylacrylate,

polystyrene,...
- Ưu điểm chung của các polymer tổng họp này là bền, tính chất cơ lý tốt, hồn tồn trơ
với sự tấn cơng của vi khuẩn, độ trương tốt, một số polymer có thể điều chỉnh kích thước siêu lỗ.
- Nhược điểm là một số polymer có giá thành cao, khả năng tương họp sinh học kém,
không thể phân hủy trong môi trường tự nhiên nên gây ô nhiễm môi trường.
1.2.6. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định enzyme [1]
Ảnh hưởne của chất mans
- Cấc tính chất lý học của chất mang như tính hịa tan, tính bền cơ hóa, diện tích, tính háo
nước và kỵ nước,.. .đều có ảnh hưởng nhất định đến lượng enzym được liên kết, đến tính bền và
hoạt tính sinh học của các chất dẫn xuất enzym khơng tan.
- Bản chất hóa học của chất mang cũng ảnh hưởng đến khả năng tạo thành dẫn xuất enzym
và tới khả năng chất mang hấp phụ không đặc trưng các chất từ môi trường phản ứng.
- Sự định vị enzym giúp cho dẫn xuất enzym khơng tan có tính bền nhiệt cao hơn enzym
tan.
- Chất mang có tác dụng hạn chế sự biến tính của enzym trong các dung mơi, làm đứt nối
liên kết hydro và liên kết kỵ nước
Ảnh hưởns của vH
- Khi lực ion thấp thì nồng độ H + gần chất mang tích điện âm cao hơn, cịn gần chất mang
tích điện dương cao hơn trong dung dịch. Kết quả là pH tối ưu của enzym liên kết đồng hóa trị
với chất mang tích điện âm sẽ chuyển dịch sang pH kiềm so với enzym hòa tan, trái lại nếu
enzym liên kết đồng hóa trị với chất mang tích điện dương thì pH tối ưu sẽ chuyển dịch sang
phía pH acid.
- Khi lực ion lớn thì điện tích của chất mang được trung hịa bởi các ion trái dấu và pH tối
ưu của enzym cố định gần giống enzym hòa tan.
Ảnh hưởne của enzyme

Chương 1: Tổng quan

Đồ án môn học

Theo Poltorak, một trong những nguyên nhân làm giảm hoạt độ của enzym cố định là sự
tương tác protein-protein giữa các phân tử enzym đã được liên kết.
Trong mọi trường họp đều thấy hoạt độ riêng của chế phẩm bị giảm đi cùng với sự tăng
lượng enzym được kết họp trên một đơn vị diện tích chất mang.


Chương 1: Tổng quan

/N/

Đồ án môn học

'J Ảnh hưởne của phươns pháp cố đinh
/%/

- Khi cố định bằng phương pháp hấp phụ vật lí, các enzym ít bị thay đổi cấu trúc khơng gian
do đó ft ảnh hường đến hoạt tính. Nhưng do phương pháp này sử dụng các liên kết yếu như liên kết
kị nước, liên kết hydro,... nên enzym dễ bị giải hấp phụ.
- Khi cố định bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị sẽ có độ ổn định cao khi sử dụng dưói
các điều kiện như nhiệt độ, pH, có khả năng chống chịu cao đối với sự ảnh hường của các dung môi
hữu cơ và các tác nhân vật lí khác. Tuy nhiên, liên kết cộng hổa trị sẽ làm thay đổi mạnh mẽ cấu trúc
khơng gian của enzym nên hoạt tính của enzym cố định thường bị giảm đi đáng kể.
- Khi cố định bằng phương pháp bao gói, q trình hoạt động của enzym phụ thuộc vào hai
yếu tố chính là kích thước chất mang polyme và trọng lượng của phân tử cơ chất. Hai yếu tố này sẽ

làm giảm tốc độ khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất khác. Hơn nữa, cùng với hoạt tính xúc
tác cao của enzym sẽ làm xuất hiện gradient nồng độ của cơ chất và sản phẩm của dung dịch và chất
mang chứa enzym cố định. Điều này làm cho các thông số công nghệ thay đổi, đó là điều cần để ý
khi thiết lập quy mơ của q trình.
Chương 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH
2.1. ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
2.1.1.

Enzym p-galactosidase

2.1.1.1.

Giói thiệu về enzym Ịỉ-galactosỉdase [2]

Enzym P-galactosidase (EC.3.2.1.23) là một lactase thủy phân đường lactose thành
các monomer là glucose và galactose. Việc sử dụng P-galactosidase để thủy phân lactose trong sữa và whey là
một trong những ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và các sàn phẩm từ sữa.
Enzym này có thể được sử dụng dưới dạng hòa tan hoặc dạng cố định nhưng dạng hòa tan chỉ có thể
sử dụng trong qui trình sản xuất gián đoạn, cịn dạng cố định có lợi thế hon là có thể sử dụng tốt cho
cả hai qui trình sản xuất gián đoạn và liên tục.
Mặc dù hầu hết các ngành công nghiệp vẫn thủy phân lactose với enzym tự do, nhưng việc
sử dụng enzym P-galactosidase cố định là một lĩnh vực đáng quan tâm vì những tiềm năng của nó.
2.1.1.2.

Nguồn thu nhận enzym p-galactosỉdase [2]

Enzym P-galactosidase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như vi sinh
vật, thực vật, và động vật. Tuy nhiên, tính chất của enzym được thu nhận từ các nguồn khấc nhau có sự khác
nhau rõ rệt. Enzym thu nhận từ nguồn thực vật và động vật có giá trị kinh tế thấp, nhưng thu nhận từ
nguồn vi sinh vật lại có nhiều ưu thế như dễ dàng xử lí thu nhận, tốc độ nhân giống vi sinh vật cao,

/V

1


Chương 2: ửngdụng

Đồ án môn học

năng suất thu nhận sản phẩm cao. Một số vi sinh vật được xem là nguồn thu nhận tiềm năng của loại
enzym này.
Bacteria: Alicyclobacỉllus acidocaldarìus subsp, Rittmannii Arthrobacter sp,_Bacittus
acidocaldarỉus, B. circulans, B. coagulans, B. subtilis, B. megaterum, B. stearothermophỉlus,
Bacteriodes polypragmatus, Bifidobacterium bifidum, B. infantis, Clostridium acetobutylicum,
c.thermosulfurogens, Corynebacterium murisepticum, Enterobacter agglomerans,E. cloaceae,
Escherichia coll, Klebsiella pneumonia, Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus,L. helviticus, L.
kefiranofaciens, L. lactis, L. sporogenes, L. themophilus, L. delbrueckii, Leuconostoc citrovorum,
Pediococcus acidilactỉ, p. pento, Propioionibacterium shermanii, Pseudomonas fluorescens,
Pseudoalteromonas haloplanktis
Streptococcus cremoris,

s.

lactis,

s.

thermophius, Sulfolobus solfatarius, Thermoanaerobacter

sp.,Thermus rubus, T. aquaticus, Trichoderma reesei, Vibrio cholera, Xanthomonas campestris.
Fungí: Alternaría alternate, A. palmi, Aspergillus foelidis, A. fonsecaeus, A. fonsecaeus, A.
Carbonarius, A. Oryzae, Auerobasidium pullulans, Curvularia inaequalis, Fusarium monilliforme, F.
oxysporum, Mucor meihei, M. pusillus, Neurospora crassa, Penicillum canescens, p. chrysogenum,
p. expansum, Saccharopolyspora rectivergula, Scopulariapsis sp, Streptomyces violaceus.
Yeast: Bullera singularis, Candida pseudotropicalis, Saccharomyces anamensis, s. lactis,
S.fragilis, Kluyveromyces bulgaricus, K.fragüis, K. lactis, K.marxianus.
2.1.1.3.

Các phương pháp cố định enzym ß-galactosidase [2]

Phươns pháp hấữ phu vât lý
Cấc chất vô cơ như nhôm, silic, thủy tinh xốp, đất sét, bentonite,... chất hữu cơ như
cellulose, tinh bột, than hoạt tính, nhựa trao đổi ion,... được sử dụng làm chất mang hấp phụ trong cố
định enzym. Hơn nữa có thể xử lí thêm với glutaraldehyde để tăng sự ổn định.
Enzym ß-galactosidase từ K. fragilis và K. lactis được cố định trên chitosan có hoạt độ riêng
0.9-2.2 u/mg trọng lượng khơ của tế bào. Hoạt tính của enzym được cố định từ K. fragilis thì cao hơn
nhưng độ ổn định của enzym cố định từ A. oryzae thì cao hơn 5-14 lần tùy thuộc vào phương pháp
cố định. Khi dùng phương pháp hấp phụ người ta nhận thấy hoạt tính cao nhất thu được khi dùng
enzym từ nấm men với chất mang là Ostsorb-DEAE. Hơn nữa, sự cố định tối đa đạt được ở pH 5.5
và kết quả tối ưu thu được khi có mặt dung dịch đệm citrate/phosphate trong suốt quá trình cố
định /?-galactosidase từ E. coli bằng phương pháp hấp phụ vật lí trên chromosorb-W. Một thiết bị
phản ứng mới chứa /?-galactosidase từ B. circulans được cố định trên màng có gờ làm từ PVC và

/V

2~


Chương 2: ửng dụng

Đồ án môn học

silica được sử dụng để thủy phân lactose trong sữa gầy. Việc cố định yổ-galactosidase từ Bullera
singularis trên hạt Chitopearl BCW 3510 (970 GƯ/g nhựa) bằng phương pháp hấp phụ đơn giản
cũng được thực hiện.
Các nghiên cứu về động học của enzym ß-galactosidase từ Kluyveromces marxianus
(Saccharomyces) lactis được cố định trên những chất mang khác nhau như nhôm và silica đã cho
thấy rằng hoạt tính của enzym cố định phụ vào bản chất hóa học tự nhiên và cấu trúc vật lí của chất
mang. Khi kích thước lỗ của các hạt chất mang tăng thì hoạt tính của enzym giảm mạnh. Sự cố định
ß- galactosidase từ Thermus sp. diễn ra rất nhanh trên PEI-Sepabeads và DEAE-Agarose. Tuy nhiên,
độ mạnh hấp phụ thì cao hơn trong trường họp của PEI- Sepabeads.

/V

3~


Chương 2: ửng dụng

Đồ án mơn học

Enzym ß-galactosidase từ B. stearothermophilus chịu nhiệt được cố định trên chitosan sử
dụng Tris (hydroxymethyl) phosphine (THP) và glutaraldehyde dùng để thủy phân đường lactose
trong sữa. Khả năng chịu nhiệt và hoạt tính của enzym ß-galactosidase được cố định trên THP thì
vượt trội hơn so với enzym tự do và enzym được cố định bằng glutaraldehyde. Enzym ßgalactosidase được cố định trên THP cho thấy hoạt tính cao hơn enzym tự do khi có mặt ion Ca2+ và
ổn định trong suốt thời gian bảo quản ờ 4°c trong 6 tuần, trong khi enzym tự do bị mất 31% hoạt tính
trong cùng điều kiện. Hai phương pháp quy hoạch thực nghiệm là phương pháp “Response
surfacemethodology” (RSM) và “Centre composite design” (CCD) được dùng để tối ưu sự cố định
enzym ß-galactosidase từ Pisum sativum trên hai vật liệu khung mạng: Sephadex G-75 và hạt

chitosan. Hiệu suất cố định đạt được 75.66% và 75.19% tương ứng với Sephadex G-75 và chitosan.
Enzym ß-galactosidase từ A. oryzae được cố định trên một chất mang rẻ tiền concanavalin Acellulose. Chế phẩm ß-galactosidase được hấp phụ và hên kết chéo bằng Concanavalin A-cellulose,
giúp giữ lại 78% hoạt tính ban đầu. Nhiệt độ tối ưu của enzym cố định tăng từ 50°c lên 60°c. Enzym
cố định bằng phương pháp hấp phụ và liên kết chéo giữ được 93% hoạt tính sau 1 tháng bảo quản
trong khi enzym tự nhiên chỉ giữ được 63% hoạt tính.
Phươns pháp bao i
Khung mạng sử dựng để cố định thường được làm từ các nguyên liệu như Ca-alginate, agar,
k-carragenin, polyacrylamide và collagen. Tuy nhiên, một vài khung mạng rắn như than hoạt tính,
ceramic,... cũng có thể dùng để cố định. Các loại màng dùng để nhốt enzym được sử dụng phổ biến
là nylon, cellulose, polysulfone, và polyacrylmide.
Enzym ß-galactosidase từ nấm sợi được cố định trong gel polyvinyl alcohol có tính chịu
nhiệt cao hơn enzym tự do, giữ được 70% hoạt tính sau 24h ở 50°c. Các tế bào K. bulgarìcus có chứa
enzym ß-galactosidase được xử lí với glutaraldehyde được nhốt trong alginate sử dụng dung dịch
BaCỈ2. Cấc hạt alginate thu được sau khi xử lí tiếp theo với polyethyleneimine thì đạt được độ ổn
định cao. Enzym ß-galactosidase của E. coli cũng được cố định trong gel polyacrylamide thông qua
việc chuẩn bị các dẫn xuất hên kết chéo của enzym với bisimidoesters.
Tế bào K. marxianus có chứa lactase hoạt động được nhốt toong gel calcium pectate (CPG)
và toong gel calcium alginate (CAG) được làm cứng bằng polyethyleneimine và glutaraldehyde. Các
tế bào được cố định trong CPG đã thủy phân hơn 80% lactose trong quá trình liên tục và bán hên tục.
So sánh các phương pháp cố định enzym ß-galactosidase từ Thermus aquaticus cho thấy rằng
việc cố định bằng hên kết chéo sau đó nhốt enzym toong hạt agarose có thể cho hiệu suất hoạt động
tốt hơn. Việc nhốt enzym ß-galactosidase từ A. oryzae trong gel polyvinyl alcohol lạnh xốp sẽ tăng
cường độ ổn định với nhiệt độ, pH, lực ion hơn so với enzym tự do. Khung dạng sợi được làm từ
~4


Chương 2: ửng dụng

Đồ án môn học

alginate và gelatin được bổ sung chất làm cứng là glutaraldehyde cổ thể giữ được 56% hoạt tính của
enzym trong 35 ngày mà khơng có bất kì sự giảm hoạt tính.
Người ta nhận thấy rằng chế phẩm ß-galactosidase được liên kết chéo bằng canavalin A có
thể thủy phân lactose vượt trội trong hàng loạt quá trình so với các chế phẩm khác vì chúng vẫn giữ
được hoạt tính cao, cụ thể là giữ được 95% hoạt tính sau 7 lần sử dụng, và giữ được 93% hoạt tính
sau 2 ngày bảo quản ở 4°c.
Phương pháp liên kấ cone hóa tri
Các phân tử enzym liên kết với chất mang thơng qua cấc nhóm chức năng không nằm trong
trung tâm hoạt động của enzym như amino, carboxyl, hydroxyl, và sulfydryl. Các nhóm chức năng
trên chất mang thường được hoạt hóa bằng cách sử dụng các chất hóa học như cyanogen bromide,
carbodimide, và glutaraldehyde.
Enzym từ A. oryzae được cố định trên bột nylon-6 và zeolite. Zeolite thì khơng lý tưởng vì
lượng liên kết tạo thành ft trong khi đó nylon-6 tạo ra được khung mạng ổn định. Các dẫn xuất thu
được hoạt hóa bằng diazo hoặc bằng carbodiimide cho thấy hoạt tính cao nhất trong suốt quá trình cố
định enzym trên thủy tinh xốp có phủ lóp glycophase.
Enzym ß-galactosidase từ E. coli được cố định trên gelatin sử dụng chất hoạt hóa là
chromium (III) acetate và glutaraldehyde vẫn giữ được tương ứng 25% và 22% hoạt tính. Enzym
được cố định trên silica-alumina ổn định hơn enzym tự do ở pH acid.
Các dẫn xuất ß-galactosidase cố định cho thấy nhiều sự cải thiện nhưng hoạt tính khấc nhau
sau khi được tạo điều kiện cho liên kết cộng hóa trị đa điểm bằng cách ủ trong dung dịch kiềm một
thời gian dài, enzym được cố định trên Sepabeads-epoxy-boronic được xem là ổn định nhất. Dan
xuất tốt nhất rất hoạt động trong việc thủy phân lactose thậm chí ờ 70°c.
Gần đây sự liên kết ngang của ß-galactosidase trên các hạt từ tính có nguồn gốc khác nhau
được thực hiện với sự có mặt của glutaraldehyde. Ket quả là hoạt tính của enzym cố định được tăng
lên.
Khi cố định ß-galactosidase chịu nhiệt trên Sepabeads
Nguồn P-galactosidase
để thủy phân lactose người taTác
nhận
nhân

thấy
cốsự
định
ức
chế enzym do sản phẩm tạo ra giảm, điều này hữu dụng trong việc cải thiện hiệu suất hoạt động của
K. fragilis
lactis
Chitosan
enzym trong cơng nghiệp.Bàng 2.1: Tóm tắt các
phươngand
phápK.cố
định enzym ịỉ-galactosỉdase
A. oryzae
E. coli
Hấp phụ vật lý

Phenol-formaldehyde resin
Chromosorb-W

B. circulans

Polyvinyl chloride, Silica gel

B. stearothermophilus

Chitosan

A. niger

Porous ceramic monolith

K. fragilis

Chitosan beads

/V

5~


Chương 2: ửng dụng

Đồ án môn học
K. lactỉs

CPC-silica, agarose

K. bulgaricus

Bao gói

Alginate using BaCỈ3

E. coli

Polyacrylamide gel

A. oryzae

Nylon-6 and zeolite

Thermus aquaticus YT-1

Agarose bead

Pénicillium expansum F3
Calcium alginate
K. lactis
Poly(vinylalcohol) hydrogel

Liên kết cộng hóa trị

L. bulgarìcus

Egg shells

s. anamensỉs

Calcium alginate

E. coli
K. latỉs

Hen egg white
Cotton fabric

A. nỉger
Magnetic polysiloxane- polyvinyl alcohol
Silica

A. oryzjae

2.1.1.4.

ứng dụng của enzym p-galactosidase cố định

2.1.1.4.1.

Thủy phân lactose trong sữa và lactoserum [2]
Sữa được thủy phân lactose được sử dụng cho việc chế biến hưcrag liệu sữa, phô

mai, và sữa chua. Sự thủy phân lactose trong sữa và dùng sữa chế biến thực phẩm cũng ngăn
ngừa sự kết tinh lactose khi đông lạnh sữa và sàn phẩm sữa cô đặc. Hơn nữa việc sử dụng sữa đã
thủy phân trong sản xuất sữa chua và pho mát sẽ làm tăng q trình acid hóa, bởi vì thủy phân
lactose thường là bước làm chậm tốc độ của quá trình, làm giảm thịi gian đơng đặc của sữa chua
và tăng tốc độ phất triển cấu trúc và hương vị cho phó mat. Chất lượng của sữa đơng lạnh và kem
làm từ sữa cũng được cải thiện đáng kể khi thêm enzym lactase. Nó chống
lại sự kết tinh đường lactose bằng cách thủy phân thành glucose và galactose và làm giảm cấu trúc cát sạn.
Thủy phân lactose trong whey là một ứng dụng quan trọng khác của ß-galactosidase
trong ngành cơng nghiệp chế biến sữa. Whey thủy phân và cô đặc hay whey thu được qua lọc
màng có thể được sử dụng như chất tạo ngọt trong sản xuất sữo rau quả đóng họp và nước giải
khất.
yổ-galactosidase từ nấm (Miles Chemie) được cố định trong gel polyvinyl alcohol
được nhận thấy là bền nhiệt hon so với enzym tự do, giữ được 70% hoạt tính sau 24h ở 50°c và
5% hoạt tính ở 60 °c. Thủy phân được 75% lactose trong 5-6h và mức độ chuyển đổi giảm 50%
sau 30 lần sử dụng. Các nghiên cứu về thủy phân lactose sử dụng enzym cố định ß- galactosidase

/V

6~

Chương 2: ửng dụng

Đồ án môn học

(Aspergillus niger) trên nhựa phenol formaldehyde cho thấy nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào thời
gian thực hiện q trình nhưng khơng phụ thuộc vào nồng độ và sự chuyển đổi lactose. Enzym
/?-galactosidase từ A. niger thủy phân được 70% lactose trong sữa gầy ở 40°c trong 10 phút.
Enzym ^-galactosidase có nguồn gốc từ nấm cố định trên hydrogel được dùng để thủy phân
whey, sau 7h thủy phân được 70-75% whey. Sự cố định enzym yổ-galactosidase từ A. niger trên
silica gel đã được kích hoạt, kết quả là hầu hết các chế phẩm enzym cố định sử dụng silica gel
được kích hoạt bằng TÌCI 3 và FeCỈ3 sẽ thủy phân được 81% đến 84% trong dung dịch chứa 4%
lactose.
Enzym ß-galactosidase từ K. lactis được cố định trên CPC-silica (đã được silan hóa và
kích hoạt với glutaraldehyde) và agarose (được kích hoạt bằng tác nhân cyanua) chuyển đổi được
90% lactose trong thiết bị phản ứng “packed bed minireactor”. yể-galactosidase được nhốt trong
gel đồng polymer hóa N-isopropylacrylamide và acrylamide có hiệu quả trong quấ trình thủy
phân lactose ờ 5°c cho quấ trình sản xuất sửa nghèo lactose. Mơ hình động học sử dụng cho
enzym yổ-galactosidase từ K. lactis cũng được khảo sất. Enzym cố định có thể hoạt động ở nhiệt
độ thấp và áp dựng được cho sản xuất các sản phẩm sữa đông lạnh, ngăn chặn sự kết tinh của
lactose, tăng khả năng tiêu hóa và tạo hưcmg vi cho sản phẩm sữa. Enzym ß- galactosidase từ K.
lactỉs cố định trên vải cotton sử dụng glutaraldehyde làm tác nhân liên kết chéo được dùng để
thủy phân lactose toong sữa nguyên kem và chuyển đổi được 95% lactose trong 2h toong thiết bị
phản ứng gián đoạn, và khi được cố định bằng hên kết cộng hóa trị với polysiloxane-polyvinyl
alcohol, sử dụng glutaraldehyde như là tác nhân liên kết chéo cho thấy độ hoạt động cao hon và
độ ổn định nhiệt cao hon so với enzym hòa tan. Vì thế enzym này được sử dụng có hiệu quả trong
thủy phân lactose từ sữa. yổ-galactosidases từ K. lactìs cũng được cố định trên viên nang
LentiKats polyvinylalcohol hydrogel dạng thấu kính được
dụng để sản xuất D-galactose từ lactose (200 g. L_1) trong một quá trình gián đoạn vừa đường hóa vừa lên men

đồng thời.
yổ-galactosidase từ A. oryzae cố định trên chất mang concanavalin A-cellulose được sử
dụng để thủy phân liên tục lactose từ whey và sữa. Người ta nhận thấy rằng pH tối ưu của enzym hòa
tan và enzym cố định là 4.8 nhưng nhiệt độ tối ưu tăng từ 50°c lên 60°c đối với enzym cố định.
Enzym cố định có sự ổn định nhiệt cao hơn ở 60°c. Gần đây thiết bị phản ứng packed bed cùng với
tế bào có tính thấm được nhốt ừong alginate được sử dụng để thủy phân lactose trong sữa trong hệ
thống liên tục, đạt hiệu suất 87.2%. ß- galactosidase từ A. oryzae được cố định bằng 3 kĩ thuật khấc
nhau: hấp phụ trên celite, hên kết cộng hóa trị với chitosan, hoặc kết họp lại với nhau bằng liên kết
chéo. Các chế phẩm enzym cũng được so sánh với nhau về hiệu suất cố định, đặc tính của enzym, độ
ổn định, và hiệu quả tổng hợp oligosaccharide. Các enzym ß-galactosidase được kết họp lại với nhau
/V

7~


Chương 2: ửng dụng

Đồ án môn học

bằng hên kết chéo được cho là có hiệu quả trong việc thủy phân lactose, đạt hiệu suất 78% trong 12h.
ß- galactosidase từ A. oryzae được cố định trên silica, hoạt tính cũng như độ ổn định của enzym đã
được thẩm định, và kết quả cố định tốt nhất thu được bằng cấch sử dụng glutaraldehyde như chất hỗ
trợ hoạt hóa và ổn định cho enzym. Trong các phương pháp xử lí whey khác nhau (vi lọc, siêu lọc,
xử lí nhiệt), siêu lọc được xem là phương pháp tốt nhất đối với dung dịch cơ chất để cho vào thiết bị
phản ứng.
Bảng 2.2: Thủy phân lactose sử dụng các kỹ thuậtTác
cổ định
nhânkhác
cố định
nhau

Nguồn vsv

Hiệu suất
Thòi gian thủy phân
thủy phân
75%

Fungal galactosỉdase Polyvinyl-alcohol
E. coli
K. lactis
K. fragilis
K. lactis

Polyacrylamide gel

47%

Thiosulfinate/thiosulfonae
Cellulose beads
Cotton fabric

>90%
95%

Fungal ß-galactosidase Hydrogels
K. marxianus
Calcium alginate

70%-75%
84.8%

A. oryzae
Concanavalin

85%-90%

A

layered

5-6 h
6h
2.5 h
5h
2h
7h
2.5 h

89%

3h

>80%

2h

calcium

alginate-starch hybrid
Bacillus stearothermophilus

Chitosan
2.I.I.4.2.

Tổng hợp Galacto-Oligosaccharides (GOSs) [2]

Bên cạnh hoạt động thủy phân, enzym yổ-galactosidase cịn có tác dụng chuyển nhóm
bằng cách thủy phân và sản xuất ra nhiều oligosaccharide, các oligosaccharide tác dụng có lợi cho các vi sinh
vật có ít trong đường ruột. Hơn nữa, phản ứng chuyển nhóm có thể được dùng để gắn galactose vào
họp chất hóa học khác, kết quả tạo thành galacto-oligosaccharide. Do đó cho thấy tiềm năng trong
việc sản xuất các thành phần thực phẩm, dược phẩm, và các họp chất có hoạt tính sinh học khác. Các
điều kiện của phản ứng chuyển nhóm galactose nên có nồng độ lactose cao, nâng nhiệt độ và giảm
hoạt độ nước trong môi trường phản ứng. Nhiệt độ, nồng độ cơ chất và nguồn gốc enzym đóng vai
ữị quan ừọng trong việc tổng họp oligosaccharide. Tuy nhiên ảnh hưởng của nồng độ lactose ban
đầu thì lớn hơn. Nói chung với nồng độ lactose ban đầu càng cao thì càng nhiều galactooligosaccharide được tổng họp. Nhiệt độ cao cũng có thể làm tăng hiệu suất tổng họp
oligosaccharide. Hiệu suất cao hơn ở nhiệt độ cao hơn là một lợi thế bổ sung khi tiến hành phản ứng
ở nồng độ lactose ban đầu cao. Do đó, enzym p-galactosidase nên được ổn định ờ nhiệt độ cao hàm
lượng nước thấp để làm cho hoạt động chuyển nhóm galactose tăng lên.

/V

8~


Chương 2: ửng dụng

Đồ án môn học

Việc tổng họp galacto-oligosaccharide bằng yổ-galactosidase từ A. oryzae được tối ưu hóa
bởi nồng độ lactose, enzym, ti lệ cơ chất. Trong quá trình sản xuất gián đoạn liên tiếp galactooligosaccharide, hiệu quả xúc tác tăng lên 190% đối với enzym tự do trong dung dịch, và 8500g
galacto-oligosaccharide trên lg enzym được sản xuất trong 10 đợt. Enzym P- galactosidase từ A.

oryzae được cố định trên Fe304-chitosan cho kết quà hiệu suất tổng họp galacto-oligosaccharide cao
nhất là 15,5%. Việc tổng họp galacto-oligosaccharide sử dụng ịì- galactosidase từ A. oryzae cố định
trên polysiloxane-polyvinyl alcohol (mPOS-PVA) đã được thực hiện. Lượng galacto-oligosaccharide
đạt được khoảng 26% (w/v) so với lượng đường tổng, có khoảng 55% lactose được chuyển đổi từ
dung dịch có nồng độ lactose là 50% (w/v) ờpH 4,5 và nhiệt độ 40°c. Trisaccharides chiếm hơn 81%
tổng lượng GOS được sản xuất. Việc hình thành GOS không bị ảnh hưởng đáng kể bởi nhiệt độ và
pH.
Hệ thống enzym cố định dùng polyethyleneimine, ghỉtaraldehyde, và cotton được nghiên
cứu và so sánh sự sản xuất galacto-oligosaccharide trong hệ thống siêu lọc enzym tự do và hệ thống
sử dụng enzym cố định. Trong quá trinh cố định sử dụng kết họp PEI và GA, người ta nhận thấy
khoảng 50% đến 90% enzym bị hoạt hóa. Hệ thống enzym tự do và enzym cố định tương đương cho
thấy quá trình sản xuất GOS rất giống nhau, xấp xỉ 22% (w/v) và 20% (w/v) trong thời gian khoảng
15 - 17 phút, và chuyển đổi được 50% lactose.

/V

9~


Chương 2: ửng dụng

Đồ án môn học

P-galactosidase tinh khiết từ Buttera singularis ATCC 24193 được cố định trên hạt
Chitopearl BCW 3510 được sử dụng cho phản ứng tổng họp galacto-oligosaccharide (GOSs) từ
lactose trong thiết bị phản ứng packed bed, kết quả tổng họp được 55% GOS với năng suất 4.4 g/(Lh) hoạt động trong 15 ngày. Năng suất GOS đạt cao nhất khi nồng độ lactose ban đầu là 27% (w/w),
50% lactose được chuyển đổi với nồng độ ban đầu là 500 g/L. Trisaccharides là một sản phẩm được
tạo ra nhiều nhất, chiếm hơn 70% tổng lượng GOS được tạo ra. yổ-galactosidase từ A. oryzae được
cố định trên hạt chitosan tạo ra lượng trisaccharides cao nhất (17,3% trong tổng lượng đường), sử
dụng 20% (w/v) lactose trong vong 2h so với đối với enzym tự do và 4,6 % đối với tập họp enzym có

liên kết chéo.
2.1.2.

Enzym lipase

2.1.2.1.

Giói thiệu về enzym lipase

Lipase (EC 3.1.1.3) là một họ các enzym mà trong môi trường tự nhiên chúng xúc tác cho
các phản ứng thủy phân chất béo. Tuy nhiên, trong các điều kiện phản ứng phù họp lipase còn cho
thấy khả năng xúc tác các phản ứng ester hóa, chuyển ester và phản ứng alcoholysis [4].
Sự phát triển nhanh chóng của cơng nghệ enzym đã mang lại sự quan tâm đáng kể đến việc
ứng dụng enzym lipase trong ngành công nghiệp dầu béo. Cấc phản ứng sử dụng enzym lipase mang
lại nhiều lợi thế hơn các phản ứng hóa học thơng thường. Lipase có thể sử dụng một cách có hiệu
quả và kinh tế trong điều kiện ơn hịa. Đây là đặc điểm quan trọng bởi vì điều kiện khắc nghiệt sẽ
gây ra cấc phản ứng trùng họp chất béo và sinh ra nhiều sản phẩm phụ. Do đó, việc sử dụng lipase sẽ
làm giảm nhu cầu loại bỏ cấc họp chất màu và các sản phẩm phụ bằng cách phương pháp tốn kém
năng lượng [3].
Tuy nhiên, việc ứng dụng enzym lipase vẫn cịn nhiều trở ngại do chi phí cao. vấn đề này có
thể được khắc phục bằng cách sử dụng enzym cố định, khi đó enzym lipase có thể được tái sử dụng
dễ dàng và qui trình sản xuất có thể được vận hành liên tục [3].
2.1.2.2.

Nguồn thu nhận enzym lipase

Enzym lipase thương mại thường được thu nhận từ động vật (tuyến tụy hoặc dạ dày của động
vật nhai lại) hoặc từ nấm sợi như (Pénicillium spp., Aspergillus spp., Rhizopus spp., Rhizomucor
spp., Mucor spp. or Candida spp...). Enzym lipase từ động vật có tính đặc hiệu cao trong việc giải
phóng các acid béo ở vị trí số 1 và số 3 trong phân tử triglyceride, trong khi đó các lipase từ nguồn vi

sinh vật có khả năng hoạt động và tính đặc hiệu rộng hơn [5].
Tính chất
Bảng 2.3: Nguồn vsv thu nhận enzym lipase và tính chất enzyme lipase
[6] enzym
Nguồn vsv
Nhiệt độ tối ưu
Bacillus acidocaldarỉus

70

/V

pH tối ưu
-

10


Chương 2: ửng dụng

Đồ án mơn học

Bacillus sp.

50

8.0-9.0

Bacillus strìn

60

8.0
-

Bacillus stearothermophìlus
Bacillus thermocatenletus

68
60-70

8.0-9.0

Bacillus thermoleovorans

70-75

7.5

Geobacillus sp.

70

9.0

Pseudomonas sp.

65

9.6

Pseudomonas sp.

90

11.0
-

Pyrobaculum calidifontis
Pyrococcus ỷurìosus

90

-

Pyrococcus horikoshii

100
97

5.6

Pyrococcus horikoshii

95

7.0

2.I.2.3.

Các phương pháp cố định enzym lipase

Phươns pháp hấp ữhu vât lí
Đây là phương pháp đơn giản nhất liên quan đến sự tương tác bề mặt thuận nghịch giữa
enzym và chất mang. Lực liên kết chủ yếu là các tương tác kỵ nước. Phương pháp này có ưu điểm là
chi phí thấp, quấ trình thực hiện đơn giản và nhanh chóng; khơng có sự biến đổi về mặt hóa học
enzym cũng như chất mang, đây là sự cố đinh thuận nghịch. Nhược điểm của phương pháp này là sự
giải hấp enzym ra khỏi chất mang, sự cản trờ về mặt không gian của chất mang và sự hình thành các
liên kết khơng đặc hiệu. Các vật liệu vô cơ như than hoạt tính, silica,... và vật liệu hữu cơ như các
polymer tự nhiên hoạt tổng họp có thể được dùng làm chất mang cố định enzym upase [7].

/V

11


Chương 2: ửngdụng

Đồ án môn học

Lipase được hấp phụ trên chất mang kỵ nước rất ổn định đối với nhiệt độ và sự vô hoạt của
dung môi hữu cơ. Dan xuất enzym lipase từ

c.

antárctica B cố định trên Octadecyl- Sepabead giữ

được 100% hoạt tính sau khi ủ trong 200h ở 50°c và pH 7.0. Ngoài ra, dẫn xuất này cồn giữ được
hoạt tính đầy đủ trong thời gian dài (200h) trong dung dịch 50% dioxane ở nhiệt độ 25°c ở pH 7.0.
Mặc dù được cố định bằng phương pháp hấp phụ vật lí đơn giản nhưng các dẫn xuất enzym lipase

này có tính ổn định nhiệt hơn các dẫn xuất được cố định bằng Mên kết cộng hóa trị và các enzym tự
do trong dung dịch [8].
Phưome pháp liên kết cơne hóa tri
Phương pháp này dựa trên liên kết cơng hóa trị giữa chất mang và một vài nhóm chức năng
của amino acid trên bề mặt của enzym. Chất mang thường được hoạt hóa trước bằng cấc họp chất
đặc biệt làm cho các nhóm chức năng ừờ nên ái điện tử mạnh, các nhóm này sau đó phản ứng với các
nhóm ái nhân mạnh của enzym. Ưu điểm của phương pháp này là tạo được các Mên kết bền vững và
sự cố định đạt được sự ổn định cao. Nhược điểm của phương pháp này là chi phí cao và hiệu suất cố
định thấp. Bên cạnh đó, cấu trúc và hoạt tính của enzym bị ảnh hưởng mạnh bởi các Mên kết cộng
hóa trị [7].
Lipase đã được cố định thành công trên nhiều chất mang khác nhau như chitosan, agarose, và
các polypeptide kỵ nước sử dụng carbodũmide làm tấc nhân hoạt hóa nhóm carboxyl của chất mang
khi cố định enzym lipase từ

c.

rugosa. Ưu điểm của carbodũmide là có khả năng hoạt hóa cao và

độc tíhh thấp đối với enzym [9].
Nhóm carboxyl của y-PGA (Poly(y-glutamic acid)) được hoạt hóa bằng cách phản ứng với
carbodũmide (N-(3- dimethy lamino propyl) -N ethylcarbo diimide hydrochloride, EDC). y- PGA sau
khi được hoạt hóa sẽ được cho vào dung dịch đệm có chứa lipase tự do. Việc cố định enzym lipase từ
c. rugosa được thực hiện ở các thời gian và nhiệt độ khác nhau. Sau giai đoạn này enzym lipase cố
định được làm lạnh khô trong mấy sấy thăng hoa sau đó rửa lại vài lần bằng n-hexan. Điều kiện cố
định tối ưu đạt được ở nhiệt độ 13,3°c trong thời gian 2,3h và hoạt tính cao nhất đạt được là 1196
u/g-chất mang [9].
Lipase từ Candida Antarctica cũng được cố định trên agarose và chitosan, sử dụng các chất
hoạt hóa glycidol, glutaraldehyde và epichlorohydrin. Khi dùng chất mang là agarose với chất hoạt
hóa glycidol đạt được hoạt tính cao nhất là 845U/g gel trong sau 72h cố định. Khi sử dung chất mang
là agarose và chitosan với chất hoạt hóa là glutaraldehyde thì hoạt tính cao nhất đạt được tương ứng

là 1209U/g gel và 2716U/g gel sau 5h cố định. Sự ổn định nhiệt tăng đáng kể khi so sánh với enzym
hòa tan, gấp 20 lần khi sử dụng agarose- glyoxyl và gấp 18 lần khi sử dụng chitosan-glutaraldehyde
và gấp 21 lần khi sử dụng agarose-glutaraldehyde. Dần xuất tốt nhất có độ ổn định gấp 58 lần so vói
/V

12 ~