NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LOẠI MÀU THUỐC NHUỘM HOẠT TÍNH VÀ PHÂN HỦY CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN CỦA VI SINH VẬT SINH ENZYME LACCASE LUẬN ÁN TIẾN SỸ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

PHÙNG KHẮC HUY CHÚ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LOẠI MÀU THUỐC NHUỘM
HOẠT TÍNH VÀ PHÂN HỦY CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN
CỦA VI SINH VẬT SINH ENZYME LACCASE

LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

Hà Nội, 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

PHÙNG KHẮC HUY CHÚ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LOẠI MÀU THUỐC NHUỘM
HOẠT TÍNH VÀ PHÂN HỦY CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN

CỦA VI SINH VẬT SINH ENZYME LACCASE
Chuyên ngành: Kỹ thuật môi trường
Mã số: 9.52.03.20

LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS Đặng Thị Cẩm Hà

Hà Nội, 2018


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:
Luận án tiến sỹ “Nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính
và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin của vi sinh vật sinh enzyme laccase” là cơng
trình nghiên cứu do chính tơi tự thực hiện. Các kết quả nghiên cứu trong luận án là
hoàn tồn trung thực và chưa được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nghiên cứu
nào khác. Các trích dẫn sử dụng trong luận án đã được ghi rõ tên tác giả tài liệu
tham khảo.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2018

TÁC GIẢ LUẬN ÁN

NCS Phùng Khắc Huy Chú

Lời cảm ơn
Để hồn thành được luận án, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành
nhất đến PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà, Phịng Cơng nghệ sinh học tái tạo môi trường,
Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là
người thầy đã tận tâm, tận tình và nhiệt thành đã hướng dẫn, chỉ bảo, tạo mọi điều
kiện thuận lợi và kịp thời trong những lúc khó khăn, vất vả để giúp tơi thực hiện và
hồn thành luận án này.
Tơi chân thành cảm ơn các đồng chí lãnh đạo, chỉ huy Binh chủng Hóa học; các
đồng chí lãnh đạo, chỉ huy, các đồng chí, đồng nghiệp cơng tác tại Phịng Khoa học
qn sự và Viện Hóa học - Mơi trường qn sự, Bộ Tư lệnh Hóa học đã hết sức giúp
đỡ, tạo điều kiện thuận lợi và tối đa về mặt tinh thần và một phần vật chất cho tôi khi
tôi tham gia học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình.
Bên cạnh đó, để có thể hồn thành được luận án này, tôi chân thành cảm ơn
ThS Đào Thị Ngọc Ánh, ThS Lê Việt Hưng, ThS Nguyễn Hải Vân cùng tồn thể các
đồng nghiệp trong phịng Cơng nghệ sinh học tái tạo môi trường,Viện Công nghệ sinh
học đã giúp đỡ, làm việc nhóm một cách có hiệu quả để thực hiện một số nội dung liên
quan đến luận án.
Để hồn thành chương trình nghiên cứu sinh đến được đích cuối cùng, tơi
chân thành cảm ơn lãnh đạo, các thầy, các cô và các anh chị phụ trách đào tạo của
Học viện Khoa học và Công nghệ, đặc biệt là lãnh đạo, các thầy, cô của Viện Công
nghệ môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình
truyền đạt, chỉ dạy những kiến thức, kinh nghiệm và chia sẽ những khó khăn của
bản thân tơi trong những năm tháng đã qua.
Hồn thành được luận án nghiên cứu này, tôi đã liên tục nhận được sự động
viên to lớn của gia đình, dịng họ và đặc biệt là của “đồng chí vợ” đã ln ở bên,
chủ động khắc phục mọi khó khăn của gia đình nhỏ bé của tôi để động viên và tạo
điểu kiện thuận lợi nhất để tơi n tâm hồn thành chương trình đào tạo tiến sỹ này.
Tơi rất cảm ơn sự động viên, khích lệ của các đồng nghiệp, bạn bè trong và ngồi

đơn vị đã dành cho tơi.
Luận án được thực hiện với sự tài trợ về kinh phí của Đề tài độc lập cấp Nhà
nước: "Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật vùng đất ô nhiễm chất diệt
cỏ/dioxin nhằm tìm kiếm các gene, các enzyme mới có khả năng phân hủy dioxin",
Mã số DTDLCN.13/14 do PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà làm chủ nhiệm Đề tài.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2018

NGHIÊN CỨU SINH

Phùng Khắc Huy Chú


MỤC LỤC
Mục lục
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ và đồ thị
MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Laccase, laccase-like và vi sinh vật sinh tổng hợp laccase, laccase-like
1.1.1. Giới thiệu chung về laccase
1.1.1.1. Cấu trúc phân tử của laccase
1.1.1.2. Cơ chế xúc tác của laccase
1.1.1.3. Một số đặc tính sinh hóa của laccase
1.1.1.4. Vi sinh vật sinh tổng hợp laccase

1.1.1.5. Khả năng của laccase trong phân hủy các hợp chất hữu cơ
1.1.1.6. Khả năng của laccase trong phân hủy các hợp chất hữu cơ có clo
1.1.2. Giới thiệu về laccase-like
1.2. Đặc điểm ô nhiễm nước thải dệt nhuộm và công nghệ xử lý
1.2.1. Đặc điểm chung của thuốc nhuộm và nước thải dệt nhuộm
1.2.1.1. Đặc điểm chung của thuốc nhuộm
1.2.1.2. Đặc điểm chủng của nước thải dệt nhuộm
1.2.2. Các phương pháp xử lý màu thuốc nhuộm
1.2.2.1. Phương pháp hóa lý
1.2.2.2. Phương pháp oxy hóa nâng cao
1.2.2.3. Phương pháp sinh học
1.3. Hiện trạng ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam và các công nghệ xử lý
1.3.1. Hiện trạng ô nhiễm
1.3.2. Công nghệ xử lý dioxin và các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm
1.3.3. Phương pháp phân hủy sinh học xử lý dioxin và các hợp chất hữu cơ
1.3.3.1. Phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T, dioxin và các hợp chất tương tự bởi laccase
1.3.3.2. Phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T, dioxin và các hợp chất tương tự bởi nấm sinh
tổng hợp enzym ngoại bào
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu để phân lập vi sinh vật và các chủng nấm kế thừa
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu xử lý
2.1.3. Mơi trường sử dụng trong nghiên cứu
2.1.4. Thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân lập, nuôi cấy vi sinh vật
2.2.1.1. Phân lập chủng nấm
2.2.1.2. Phân lập xạ khuẩn
2.2.1.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy để chủng nấm sinh tổng hợp laccase cao

1
4
4
4
4
5
6
7
8
12
13
17
17
17
18
19
19
20
21
26
26
28
30
31
33
40
40
40
40

41
41
42
43
43
43
43


2.2.1.4. Nuôi cấy xạ khuẩn sinh tổng hợp laccase-like trên các nguồn chất hữu cơ
vòng thơm khác nhau
2.2.2. Phân loại vi sinh vật
2.2.2.1. Phân loại VSV theo hình thái khuẩn lạc
2.2.2.2. Phân loại VSV theo phương pháp sinh học phân tử
2.2.3. Phương pháp hóa - sinh
2.2.3.1. Xác định hoạt tính laccase, laccase-like sử dụng ABTS
2.2.3.2. Tinh sạch, nhận diện protein của laccase, laccase-like
2.2.3.3. Xác định đặc tính protein của laccase, laccase-like tinh sạch
2.2.4. Xác định khả năng loại màu thuốc nhuộm
2.2.4.1. Xác định khả năng loại màu thuốc nhuộm bởi laccase, laccase-like
2.2.4.2. Xác định khả năng loại màu thuốc nhuộm bởi chủng nấm
2.2.5. Xác định khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin
2.2.5.1. Thực nghiệm phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bằng laccase thô
2.2.5.2. Thực nghiệm phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bằng chủng nấm sinh tổng hợp
laccase
2.2.5.3. Phương pháp phân tích để xác định khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin
2.3. Phương pháp xử lý số liệu
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Phân lập, tuyển chọn và định tên chủng nấm và xạ khuẩn có khả năng

sinh tổng hợp laccase, laccase-like
3.1.1. Phân lập và lựa chọn để phân loại nấm đảm có hoạt tính laccase cao
3.1.2. Phân lập và phân loại xạ khuẩn có khả năng sinh trưởng trên mơi trường
chứa chất diệt cỏ/dioxin và sinh tổng hợp laccase-like
3.1.2.1. Phân lập xạ khuẩn
3.1.2.2. Phân loại chủng xạ khuẩn XKBHN1 và XKBiR929

3.1.3. Môi trường để chủng nấm, chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp laccase, laccase-like
3.1.3.1. Mơi trường thích hợp để chủng nấm FBV40 sinh tổng hợp laccase
3.1.3.2. Khả năng sinh tổng hợp laccase-like của XKBHN1 và XKBiR929 trên môi
trường chứa các chất hữu cơ clo khác nhau
3.2. Đặc điểm hóa-lý của laccase, laccase-like tinh sạch
3.2.1. Tinh sạch laccase của nấm đảm Rigidoporus sp. FBV40
3.2.2. Tinh sạch laccase-like của xạ khuẩn Streptomycese sp. XKBiR929
3.2.3. Đặc tính hóa-lý của laccase và laccase-like tinh sạch
3.2.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến laccase tinh sạch
3.2.3.2. Đặc điểm động học của laccase tinh sạch
3.2.3.3. Đặc tính hóa-lý của laccase thơ
3.2.3.4. Đặc tính hóa - lý của laccase-like tinh sạch
3.3. Loại màu thuốc nhuộm và phân hủy chất diệt cỏ chứa dioxin
3.3.1. Loại màu thuốc nhuộm bởi laccase, laccase-like
3.3.1.1. Loại màu thuốc nhuộm tổng hợp bởi laccase thơ của chủng nấm FBV40
3.3.1.2. Loại màu hoạt tính sử dụng trong quân đội bởi laccase thô
3.3.1.3. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính MN.FBN bởi Lac1 tinh sạch
3.3.1.4. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính MN.FBN bởi laccase-like tinh sạch của
chủng xạ khuẩn XKBiR929
3.3.2. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bởi Rigidoporus sp.FBV40

43
44

44
44
45
45
46
48
49
49
51
52
52
54
55
55
57
57
57
60
60
61
64
64
65
68
68
70
71
71
78
79

81
84
84
84
89
96
97
98


3.3.2.1. Khả năng loại màu một số thuốc nhuộm hoạt tính sử dụng để nhuộm vải
may quân trang
3.3.2.2. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN ở các nồng độ khác nhau
3.3.2.3. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt D-glucose
3.3.2.4. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt các loại đường khác nhau
3.3.2.5. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt các nguồn nitơ khác nhau
3.3.3. Phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bởi laccase và nấm sinh tổng hợp laccase
3.3.3.1. Phân huỷ chất diệt cỏ/dioxin bởi laccase thô
3.3.3.2. Phân huỷ chất diệt cỏ/dioxin bởi nấm sinh tổng hợp laccase
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

98
101
102
103
106

108
108
112
121
123
124


Danh mục các chữ viết tắt
2,3,7,8-TCDD
2,4,5-T
2,4,5-TCP
2,4-D
2,4-DCP
ABTS
BH
CDD
CGK
DBF
DCĐ
DD
DBP
đtg
HBT
HCHC
LiP
LMCO
MN.FBN
MnP
MR.EBR

MT.BES
MY.BES
MY.EG
MCDD
NN.SG
NY.FN2R
NY.S3R
NY1
NY5
NY7
PAH
PCB
PCDDs
PCDFs
POPs
ppm
ppt
RBBR
TBP
VA
ViO
VK
VSV

2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin
2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid
2,4,5-trichlorophenol
2,4-dichlorophenoxyacetic acid
2,4-dichlorophenol
2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)

Sân bay Biên Hòa
Chất diệt cỏ chứa dioxin
Chất gắn kết
Dibenzofuran
Dịch chiết đất
Dibenzo-p-dioxin
Dibromophenol
Đồng tác giả
1-Hydroxybenzotriazole
Hợp chất hữu cơ
Lignin peroxidase
Laccase multicopper oxidase
Megafix navy FBN
Mangan peroxidase
Megafix red EBR
Megafix turquoise BES
Megafix yellow BES
Megafix yellow EG
Mono chlorodibenzo-p-dioxin
Nova navy SG
Nova yellow RN2R
Nova yellow S3R
acid red 299
acid blue 281
acid red 266
Polycyclic Aromatic Hydrocacbon = hydrocacbon đa nhân
Polychlorinatedbiphenyl
Polychlorinated dibenzo-p-dioxin
Polychlorinated dibenzofuran
Các hợp chất hữu cơ khó phân hủy

Parts per million (mg/kg)
Parts per trillion (ng/kg)
Remazol Brilliant Blue R
Tribromophenol
Valli anilin
Violuric acid
Vi khuẩn
Vi sinh vật


Danh mục bảng
Bảng
Bảng 1.1
Bảng 1.2
Bảng 1.3
Bảng 1.4
Bảng 1.5
Bảng 1.6
Bảng 1.7
Bảng 1.8
Bảng 2.1
Bảng 2.2
Bảng 3.1
Bảng 3.2
Bảng 3.3
Bảng 3.4
Bảng 3.5
Bảng 3.6
Bảng 3.7
Bảng 3.8

Bảng 3.9
Bảng 3.10
Bảng 3.11
Bảng 3.12
Bảng 3.13
Bảng 3.14
Bảng 3.15

Tên bảng
Trang
Ứng dụng của laccase trong phân hủy các hợp chất hữu cơ
9
vòng thơm
Khả năng sinh laccase và hiệu suất phân hủy PAH, thuốc
10
bảo vệ thực vật ở Việt Nam
Ứng dụng của laccase trong phân hủy các chất hữu cơ có clo
12
Phân loại màu và tính chất các màu thuốc nhuộm
17
Các phương pháp xử lý nước thải dệt nhuộm
20
Ứng dụng của laccase trong phân hủy sinh học thuốc
23
nhuộm
Các cơng nghệ có thể xử lý đất, trầm tích ơ nhiễm dioxin
30
Phân hủy các đồng loại dioxin bởi nấm đảm
36
Tổng hợp các thực nghiệm nghiên cứu loại màu thuốc

49
nhuộm bởi laccase, laccase-like
Đánh giá khả năng loại màu thuốc nhuộm bởi nấm đảm
52
sinh tổng hợp laccase
Đặc điểm mẫu nấm đã phân lập được
58
Hoạt tính laccase-like của các chủng xạ khuẩn
61
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc hai chủng xạ khuẩn XKBHN1
61
và XKBiR929
Ảnh hưởng của chất ức chế lên hoạt tính Lac1, Lac2 của
75
FBV40
Ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính Lac1 và Lac2
76
Quan hệ giữa nồng độ ABTS với hoạt tính laccase tinh sạch
78
Các yếu tố mơi trường ảnh hưởng tới hoạt tính laccase thơ
79
của FBV40
So sánh hiệu suất loại màu thuốc nhuộm sử dụng laccase từ
87
FBV40 và các chủng nấm đảm khác
Hiệu suất loại màu thuốc nhuộm và biến động hoạt tính
89
laccase theo thời gian (%)
Biến động hoạt tính laccase trong q trình loại màu thuốc
nhuộm MN.FBN bởi FBV40 trong môi trường chứa các

104
loại đường khác nhau
Khả năng phân hủy 2,4,5-T tinh khiết bằng laccase thô chủng
109
FBV40
Khả năng phân hủy chất diệt cỏ và các chất ô nhiễm khác
110
bằng laccase thô
Khả năng phân hủy 2,4,5-T trong đất ô nhiễm bởi chủng
112
FBV40
Khả năng phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T trong đất bởi đơn chủng
113
FBV40 và hỗn hợp chủng FBV40, FBD154 và FNBLa1
Khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD bởi đơn chủng và hỗn hợp
117
chủng


Danh mục hình
Hình
Hình 1.1
Hình 1.2
Hình 2.1
Hình 3.1
Hình 3.2
Hình 3.3.
Hình 3.4
Hình 3.5
Hình 3.6

Hình 3.7
Hình 3.8
Hình 3.9
Hình 3.10
Hình 3.11
Hình 3.12
Hình 3.13
Hình 3.14
Hình 3.15
Hình 3.16

Hình 3.17

Hình 3.18
Hình 3.19
Hình 3.20
Hình 3.21
Hình 3.22
Hình 3.23
Hình 3.24
Hình 3.25

Tên hình
Trang
Hình ảnh cấu trúc khơng gian ba chiều của laccase
5
Cơ chế giả định sự phân hủy 3-(2-hydroxy-1-naphthylazo)
22
benzenesulfonic Acid bởi laccase
Sơ đồ thực hiện nghiên cứu

42
Hỉnh ảnh sợi, bào tử dưới kính hiển vị điện tử và ảnh phân lập
58
mặt trước, mặt sau của chủng FBV40
Cây phát sinh chủng loài chủng nấm FBV40
60
Hình thái khuẩn lạc và cuống sinh bào tử chủng XKBHN1
62
(A, C) và chủng XKBiR929 (B, D)
Cây phát sinh chủng lồi 2 chủng XKBHN1 và XKBiR929
63
Hoạt tính laccase thô chủng FBV40 ở các môi trường nuôi cấy
65
Khả năng sinh tổng hợp laccase-like theo thời gian
67
Hoạt tính laccase tinh sạch của chủng FBV40
69
Diện di protein chủng FBV40
69
Hoạt tính laccase-like tinh sạch của chủng XKBiR929
70
Phản ứng oxy hóa của laccase-like tinh sạch với ABTS
71
Ảnh hưởng của pH lên Lac 1, Lac 2/FBV40
72
Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ bền nhiệt lên hoạt tính
73
Cơ chất đặc hiệu đối với Lac1 (A) và Lac 2 (B)
74
Ảnh hưởng của chất ức chế lên Lac 1 (A), Lac 2 (B) của

76
chủng FBV40
Ảnh hưởng của ion kim loại lên Lac 1, Lac 2/FBV40
77
Mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất với hoạt tính Lac1 (A) và
78
Lac2 (B)
Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính (A) và độ bền pH (B); ảnh
hưởng của nhiệt độ (C, D); động học xúc tác (E, G) và ảnh
81
hưởng của chất ức chế và ion kim loại (H, K) lên hoạt tính
laccase thơ của chủng FBV40
Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính (A) và độ bền (B); động học
xúc tác (C, D) và ảnh hưởng của chất ức chế (E) và ion kim
82
loại (G) lên laccase-like tinh sạch của XKBiR929
Khả năng loại màu NY1 (A) và sự thay đổi hoạt tính laccase
85
theo thời gian (B)
Khả năng loại màu NY5 (A) và sự thay đổi hoạt tính laccase
85
theo thời gian (B)
Khả năng loại màu NY7 (A) và sự thay đổi hoạt tính laccase
86
theo thời gian (B)
Phổ UV-Vis và hình ảnh loại màu một số thuốc nhuộm hoạt
91
tính thương mại của Nhà máy X20/TCHC
Khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt ViO ở
93

các nồng độ khác nhau
Khả năng loại màu và hoạt tính laccase theo thời gian đối với
95
thuốc nhuộm MN.FBN
Khả năng loại màu và hoạt tính laccase theo thời gian đối với 95


Hình
Hình 3.26
Hình 3.27
Hình 3.28
Hình 3.29
Hình 3.30
Hình 3.31
Hình 3.32
Hình 3.33
Hình 3.34
Hình 3.35

Hình 3.36

Hình 3.37

Hình 3.38
Hình 3.39
Hình 3.40
Hình 3.41
Hình 3.42
Hình 3.43
Hình 3.44

Tên hình
Trang
thuốc nhuộm NN.SG
Khả năng loại màu và thay đổi hoạt tính laccase theo thời gian
96
loại màu MN.FBN khi có mặt D-glucose
Loại màu MN.FBN bởi Lac1
97
Khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bằng laccase-like
97
của chủng XKBiR929
Khả năng loại màu và sự biến động hoạt tính laccase theo thời
gian trong loại màu thuốc nhuộm MY.EG, MY. BES,
99
MN.FBN
Phổ UV-Vis của thuốc nhuộm MN.FBN sau khi nuôi cấy
100
bằng FBV40 sau 1 ngày (A) và sau 4 ngày (B)
Khả năng loại màu MN.FBN bằng chủng FBV40 sau 1 ngày
100
(A) và sau 4 ngày nuôi cấy (B)
Khả năng loại màu MN.FBN và hoạt tính laccase của chủng
101
FBV40
Sự thay đổi màu MN.FBN bằng chủng FBV40 ở các nồng độ
thuốc nhuộm 50, 100 và 200 mg/L sau 1 ngày (A), 2 ngày (B)
102
và sau 3 ngày (C)
Khả năng loại màu bằng chủng FBV40 với nồng độ D-glucose

102
khác nhau
Khả năng loại màu thuốc nhuộm bằng chủng FBV 40 (A) và
hoạt tính laccase (B) theo thời gian trong mơi trường nuôi
104
cấy chứa các loại đường khác nhau
Phổ UV-Vis của màu thuốc nhuộm MN.FBN được loại bằng
chủng FBV40 trong môi trường chứa các loại đường sau 4
104
ngày nuôi cấy
Khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bằng chủng FBV40
trong môi trường chứa các loại đường khác nhau sau 2 ngày
105
(A), 3 ngày (B) và sau 7 ngày (C)
Khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bằng chủng FBV
40 (A) và hoạt tính laccase (B) theo thời gian khi sử dụng các
106
hợp chất chứa nitơ
Hoạt tính laccase theo thời gian xử lý DCĐ
109
Hàm lượng và hiệu suất phân hủy 2,4,5-T (A), hoạt tính laccase
110
thơ theo thời gian (B)
Hiệu suất phân hủy 2,4,5-T trong đất (A) và sự biến động hoạt
111
tính laccase thơ theo thời gian (B)
Khả năng phân hủy 2,4,5-T trong đất (A) và sự thay đổi hoạt
113
tính laccase thơ theo thời gian (B)
Khả năng phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T trong đất (A) và sự biến

114
động hoạt tính laccase thơ theo thời gian (B)
Khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD (A) và quá trinh sinh tổng
116
hợp laccase theo thời gian (B)


1
MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, ô nhiễm bởi các loại hóa chất trong đó có các chất
hữu cơ khó phân hủy (POPs) do con người tạo ra ngày càng được phát hiện nhiều, mức
độ ngày càng nghiêm trọng và hậu quả gây nên rất nhiều hệ lụy cho sức khỏe con
người, môi trường và hệ sinh thái. Các chất gây ô nhiễm môi trường phổ biến trong
nước thải công nghiệp hiện nay ở Việt Nam gồm các hợp chất của phenol, các hợp chất
đa vòng thơm chứa halogen và thuốc nhuộm, v.v. Ở các nước đang phát triển như Việt
Nam, việc sử dụng và xả thải hóa chất trong nông nghiệp, công nghiệp, y dược và các
ngành sản xuất khác khơng có khả năng kiểm sốt đã gây nên những hậu quả nghiêm
trọng với môi trường và con người. Nhiều chất ơ nhiễm được thải ra mơi trường có độc
tính cao, thời gian bán hủy dài, khả năng tích lũy cao ở các dạng khác nhau trong hệ
sinh thái dẫn đến giảm đa dạng sinh học và xuất hiện nhiều loại bệnh hiểm nghèo.
Ngồi ra, ơ nhiễm thuốc bảo vệ thực vật, các chất diệt cỏ chứa dioxin có nguồn gốc từ
chiến tranh hoặc nước thải ngành dệt nhuộm vẫn hàng ngày âm thầm gây tác động lớn
tới môi trường và sức khỏe con người. Những chất ô nhiễm này đều là những chất rất
bền vững và khó bị phân hủy bằng các công nghệ, giải pháp đơn giản nên để tiến tới xử
lý triệt để ô nhiễm cần tính tới các giải pháp tích hợp các cơng nghệ, giải pháp để xử lý
và quản lý bền vững. Với các thành tựu khoa học công nghệ ngày càng được nâng cao
và hướng tiếp cận sử dụng tổ hợp các chuỗi cơng nghệ, giải pháp thì khả năng xử lý
triệt để hồn tồn các chất ơ nhiễm trên ngày càng có tính khả thi cao hơn.
Đến nay, di chứng của dioxin tới nạn nhân chất độc màu da cam đã đến thế hệ
thứ 4. Trong hai thập kỷ qua các nghiên cứu ở quy mơ khác nhau đều nhằm tìm kiếm

các công nghệ khả thi để xử lý khử độc ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin trong môi trường
phù hợp với điều kiện Việt Nam. Nhiều nghiên cứu từ năm 1999 trong phịng thí
nghiệm, quy mơ pilot và hiện trường sử dụng công nghệ phân hủy sinh học
(bioremediation) đã chứng minh là một trong các giải pháp có hiệu quả cao về công
nghệ, kinh tế và môi trường. Ở quy mô hiện trường, sử dụng công nghệ phân hủy sinh
học đã xử lý hoàn toàn 3.384m3 đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin, kết quả đã được Hội
đồng khoa học độc lập cấp Nhà nước của Bộ Khoa học và Công nghệ đánh giá, sau 40
tháng xử lý tổng độ độc trung bình trong các lô xử lý sinh học tại sân bay Biên Hịa chỉ
cịn 14,12 ngTEQ/kg đất khơ (99,6% độ độc đã bị loại bỏ), thấp dưới ngưỡng quy định
cho đất sử dụng trồng cây hàng năm theo QCVN45:2012 (40 ng TEQ/kg) [29].


2
Cho đến thời điểm này, chưa có thơng báo nào liên quan đến xử lý chất diệt
cỏ/dioxin ở các quy mô khác nhau bằng các vi sinh vật sinh enzyme ngoại bào,
enzyme thơ do chúng sinh ra nói chung và laccase nói riêng. Trong khi đó, Việt Nam
là một nước nhiệt đới có đa dạng sinh học cao nằm trong top 10 của thế giới, đặc biệt
là đa dạng vi sinh vật. Có nhiều lồi vi sinh vật sinh tổng hợp các loại enzyme khác
nhau, trong đó có hai họ oxidoreductase và peroxidase với nhiều ứng dụng mang hiệu
quả cao trong các lĩnh vực kinh tế, bảo vệ sức khỏe con người và mơi trường.
Laccase thuộc nhóm oxidoreductase có khả năng hoạt động mạnh chỉ cần oxy tự do
để oxy hóa nhiều loại hợp chất hữu cơ vịng thơm trong thời gian ngắn. Chúng đã trở
thành tâm điểm của nhiều nghiên cứu sàng lọc, sản xuất công nghiệp của hàng trăm
phịng thí nghiệm và cơng ty trên tồn thế giới.
Chính vì vậy, đề tài nghiên cứu của nghiên cứu sinh với tên “Nghiên cứu khả
năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin của vi sinh
vật sinh enzyme laccase” đã được tiến hành với mục đích tìm kiếm các chủng vi sinh
vật có khả năng sinh tổng hợp laccase, laccase-like để có thể sử dụng trong phân hủy
các chất ơ nhiễm đa vịng thơm chứa và không chứa clo, cụ thể là hỗn hợp chất diệt
cỏ/dioxin và thuốc nhuộm hoạt tính. Kết quả thu được sẽ giúp chúng ta hiểu sâu sắc

thêm về tiềm năng của laccase, laccase-like và bản thân chủng vi sinh vật sinh tổng
hợp chúng nhằm hướng tới nghiên cứu tạo công nghệ khả thi để xử lý các chất ô
nhiễm hữu cơ tồn tại trong môi trường.
Mục tiêu:
- Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh laccase, laccase-like từ khu vực
rừng Quốc gia Ba Vì, trong đất ơ nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa;
- Đánh giá khả năng phân hủy các chất diệt cỏ chứa dioxin và loại màu thuốc
nhuộm hoạt tính bởi laccase, laccase-like và chủng VSV được lựa chọn nhằm định
hướng áp dụng trong hoạt động quốc phịng.
Nội dung chính của luận án cần thực hiện:
 Phân lập, phân loại nấm, xạ khuẩn có khả năng sinh laccase và laccase-like có tiềm
năng cao từ khu vực rừng Quốc gia Ba Vì và đất ơ nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin
khu vực Z1 và khu vực mới Tây Nam (Pacer Ivy) sân bay Biên Hòa, Đồng Nai;
 Lựa chọn môi trường nuôi cấy để chủng nấm, xạ khuẩn có khả năng sinh tổng
hợp laccase, laccase-like cao;


3
 Chiết tách và tinh sạch laccase, laccase-like từ đại diện nấm, xạ khuẩn có hoạt
tính enzyme cao đã được phân lập;
 Nghiên cứu đặc tính hóa-lý, hóa-sinh cơ bản của laccase, laccase-like tinh sạch;
 Đánh giá hiệu suất loại màu thuốc nhuộm tổng hợp, thuốc nhuộm hoạt tính bởi
laccase, laccase-like và bản thân chủng VSV sinh tổng hợp laccase, laccase-like;
 Đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ 2,4-D, 2,4,5-T tinh khiết và có
trong đất ơ nhiễm (dịch chiết đất -DCĐ) tại sân bay Biên Hòa bởi laccase,
đơn chủng và hỗn hợp chủng nấm sinh tổng hợp laccase;
 Đánh giá hiệu suất phân hủy đồng loại 2,3,7,8-TCDD bằng đơn chủng và hỗn
hợp chủng nấm sinh tổng hợp laccase;
NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1. Cơng trình đầu tiên nghiên cứu tinh sạch và đặc tính laccase-like được sinh
tổng hợp bởi chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. XKBiR929 và khả năng của laccase-like
trong loại màu thuốc nhuộm hoạt tính thương mại MN.FBN;
2. Chứng minh được nấm đảm Rigidoporus sp. FBV40 có hoạt tính laccase
thơ lên tới 107.708 U/L và tiềm năng cao trong loại màu thuốc nhuộm tổng hợp gốc
azo, anthraquinone và đặc biệt là màu thuốc nhuộm thương mại được sử dụng trong
quân đội;
3. Khẳng định nấm đảm Rigidoporus sp. FBV40 đồng thời có khả năng phân
hủy được các chất diệt cỏ 2,4-D, 2,4,5-T và đồng loại độc nhất của dioxin là
2,3,7,8-TCDD. Bên cạnh đó, đã làm sáng tỏ hỗn hợp các loài nấm khác nhau (nấm
đảm và nấm sợi) có khả năng sinh tổng hợp laccase phân lập từ thiên nhiên Việt Nam
không chỉ phân hủy được 2,4-D, 2,4,5-T mà còn phân hủy được cả đồng loại 2,3,7,8TCDD đạt hiệu suất cao hơn gấp 2 lần khi chỉ sử dụng đơn chủng với tổng độ độc ban
đầu tới 2000 ng TEQ/L;
Hy vọng với kết quả ban đầu của cơng trình nghiên cứu này sẽ góp phần định
hướng tiếp cận trong triển khai các nghiên cứu tiếp theo, để sáng tạo nên các chuỗi
cơng nghệ mang tính đột phá trong sử dụng hỗn hợp vi sinh vật và các chất có hoạt tính
sinh học do chúng sinh tổng hợp như laccase, laccase-like đều có tiềm năng cao để giải
quyết vấn đề ô nhiễm màu thuốc nhuộm trong hoạt động quốc phịng và xử lý các chất
ơ nhiễm hữu cơ khó phân hủy (POPs) trong đó có chất diệt cỏ chứa dioxin.


4
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Laccase, laccase-like và vi sinh vật sinh tổng hợp laccase, laccase-like
1.1.1. Giới thiệu chung về laccase
Laccase ngày càng được quan tâm nhiều hơn trong những năm gần đây do
tiềm năng của chúng trong việc phân hủy, khử độc các chất ô nhiễm là các hợp chất
của phenol và các chất đa vòng thơm [142]. Laccase thuộc nhóm oxidoreductase là
một trong số ít các enzyme đã được nghiên cứu từ thế kỷ thứ 19. Năm 1883,

Yoshida là người đầu tiên mô tả laccase từ dịch chiết thân cây Rhus vernicifera ở
Nhật Bản [52]. Laccase có hiệu quả oxy hóa với phổ cơ chất rộng và do chỉ sử dụng
oxy là tác nhân nhận điện tử cuối cùng nên nó được áp dụng trong nhiều ngành
cơng nghiệp với những mục đích khác nhau như dệt nhuộm, chế biến thức ăn, nhiên
liệu sinh học, tổng hợp hữu cơ, xử lý môi trường, giấy và nước thải, dược phẩm và
cơng nghiệp mỹ phẩm. Thực tế, đã có một số sản phẩm laccase thương mại để ứng
dụng trong các lĩnh vực chế biến thức ăn, giấy, dệt nhuộm và các ngành công
nghiệp khác [89, 155].
1.1.1.1. Cấu trúc phân tử của laccase
Một lồi sinh vật có thể sinh tổng hợp có nhiều loại laccase khác nhau (các
isozyme) và các isozyme thường khác nhau về trình tự axit amin và tính chất động
học xúc tác. Isozyme laccase khác nhau ở mức độ glycosyl hóa và thành phần các
gốc carbonhydrat. Lồi nấm đảm Trametes versicolor có 5 loại isozyme chỉ khác
nhau về thành phần carbonhydrate, thành phần carbonhydrat của chúng thay đổi từ
10-45% so với khối lượng của protein. Phân tử laccase có khối lượng phân tử dao
động trong khoảng 60-100 kDa. Phần lớn laccase của nấm có bản chất là
glycoprotein với hàm lượng carbonhydrate chiếm khoảng 10-25% [72].
Tuy vậy, tất cả laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4
nguyên tử đồng. Những nguyên tử đồng này được chia thành ba nhóm: loại 1 (T1),
loại 2 (T2) và loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế
điện tử. Các nguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp thụ điện tử và tạo thành phổ
điện tử mạnh, trong khi cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ điện tử hấp thụ điện
tử và có thể được hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh.


5

Hình 1.1. Hình ảnh cấu trúc 3 chiều của laccase (A) của chủng Bacillus subtilis 168.
Ion màu xanh là 4 nguyên tử đồng. (B) số lượng nghiên cứu công bố về các loại
enzyme trong giai đoạn 1940 - 2013 [9]

Cấu trúc 3 chiều của laccase bao gồm 3 tiểu phần (vùng A: màu đỏ, vùng B:
màu vàng và vùng C: màu xanh lá cây) có khối lượng tương đối bằng nhau, cả ba phần
đều đóng vai trị trong q trình xúc tác. Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng
B và vùng C, trung tâm một nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử
đồng nằm ở bề mặt chung của vùng A và vùng C [147]. Trung tâm đồng một chỉ chứa
một nguyên tử đồng T1, liên kết với một đoạn peptit có hai gốc histidin và một gốc
cystein. Liên kết giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên tử S của cystein là liên kết đồng
hóa trị bền và hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600 nm, tạo cho laccase có màu xanh
nước biển đặc trưng. Trung tâm đồng ba nguyên tử có nguyên tử đồng T2 và cặp
nguyên tử đồng T3. Nguyên tử đồng T2 liên kết với hai gốc histidin bảo thủ trong khi
các nguyên tử đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidin bảo thủ (Hình 1.1) [99].
1.1.1.2. Cơ chế xúc tác của laccase
Cơ chất khi bị oxy hóa bởi laccase sẽ nhường một electron cho nguyên tử
đồng T1, biến nguyên tử đồng T1 trở thành dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có
cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái khử (Cu+). Phân tử oxy sau đó oxy hóa laccase
dạng khử, thơng qua hợp chất trung gian peroxy và peroxy bị khử thành nước. Một số
nhà nghiên cứu cho rằng, sự oxy hóa hợp chất peroxy trung gian hình thành laccase ở
trạng thái bị oxy hoạt hóa, trong đó cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái oxy hóa.
Sau đó, enzyme nhanh chóng tham gia vào chu trình xúc tác mới [99].
Ngồi ra, cơ chế xúc tác có thể diễn ra theo cách khác đó là khi các cơ chất bị
oxy hóa trực tiếp bởi trung tâm hoạt động do 4 nguyên tử đồng đảm nhiệm. Các phân


6
tử cơ chất thường có cấu tạo cồng kềnh hoặc có thế oxi hóa khử q lớn, vì vậy
chúng khơng thể tiếp cận được trung tâm xúc tác của laccase. Trong trường hợp này
cần một chất gắn kết (mediator) hoặc hệ chất gắn kết để tiếp xúc với trung tâm phản
ứng của laccase để bị laccase oxy hóa, sau đó mediator ở dạng oxy hóa nhận một điện
tử của cơ chất và trở thành khử, tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác [117]. Ngược
lại, laccase sau khi cho mediator một điện tử thì trở thành dạng khử, sau đó bị oxy

hóa thành dạng oxy hóa và tiếp tục tham gia vào chu trình xúc tác tiếp theo. Các
mediator thường phù hợp cho laccase là 3-hydroxyanthranillic acid (HAA), 2,2’azino-bis

(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic

axit)

(ABTS),

N-hydroxybenzo-

trialzone (HOBT), N-hydroxyphtaimide (HPI), violuric acid (ViO) v.v. Sự có mặt của
mediator đã góp phần làm tăng phổ cơ chất xúc tác và tính khơng đặc hiệu cơ chất
của laccase.
1.1.1.3. Một số đặc tính sinh hóa của laccase
Đến nay, đã có khoảng 100 loại laccase khác nhau đã được tinh sạch và xác
định đặc điểm sinh hóa với các cơ chất là ABTS, 2,6-DMP và SGZ. Gene laccase
đặc biệt mã hoá cho một protein khoảng 500 - 600 amino acid và trọng lượng phân
tử trong khoảng 60 đến 90 kDa khi được xác định bằng SDS-PAGE [156]. Đến
tháng 9 năm 2017, có khoảng 112.000 kết quả tra cứu các tiêu đề bài báo khoa học
có từ khóa laccase ().
Đã có một vài hệ gene của các chủng nấm có chứa hơn một gene laccase [36].
Mức độ biểu hiện của các gene điển hình khác nhau phụ thuộc vào điều kiện ni cấy
[145]. Với hàm lượng nitơ cao trong môi trường đã giảm sự dịch mã của gene laccase
trong chủng Basidiomycete sp. I-62 (CECT 20197) và lồi Pleurotus sajorcaju [18].
Có nhiều bước được sử dụng trong quá trình tinh sạch protein laccase như siêu lọc
(lọc thẩm thấu màng), kết tủa với amoni sulfat hoặc với dung môi hữu cơ và trao đổi ion
cũng như sắc ký khối lượng. Laccase đại diện của nấm là các protein có khối lượng trong
khoảng 50 đến 90 kDa, điểm đẳng điện xung quanh giá trị 4.0. Một số loài nấm sinh tổng
hợp laccase đã được nghiên cứu bao gồm Coprinus plicatilis, Fomes fomentarius,

Heterobasidion annosum, Hypholoma fasciculare, Kuehneromyces mutabilis, Leptoporus
litschaueri, Panus stipticus, Phellinus igniarius, Pleurotus corticatus, P. ostreatus,
Polyporus brumalis, Stereum hirsutum, Trametes gibbosa, T. hirsuta, và T. versicolor có
hơn một isozyme và điểm đẳng điện (pI) trong khoảng từ 3 đến 5 [4].


7
Khả năng xúc tác của enzyme đã được mô tả thông qua định lượng bằng hằng
số Michaelics Km và hằng số hiệu quả xúc tác Kcat. Những hằng số này đã được cơng
bố với một lượng lớn laccase và có sự khác biệt trong số chúng. Hằng số Km của
laccase nhìn chung dao động xung quanh giá trị 2,5 𝜇M phụ thuộc vào nguồn gốc
enzyme và cơ chất. Giá trị Km của laccase được xác định với cơ chất là 2,6dimethoxyphenol nhìn chung là cao hơn khi xác định với syringadazine (sự trùng hợp
của hai phân tử là 2,6-dimethoxyphenol được liên kết với nhau bằng cầu azide) [117].
Nghiên cứu ảnh hưởng của pH và các điều kiện nhiệt độ lên hoạt tính
laccase đã được thực hiện. Theo đó, sự biến động hoạt tính của laccase theo pH
thường có hình chng và khoảng tối ưu xung quanh giá trị 4,6 khi sử dụng cơ
chất có nguồn gốc phenol [139]. Hoạt tính laccase giảm trong điều kiện pH trung
tính hoặc kiềm là do tăng anion - OH, anion này có kích thước nhỏ nên là tác
nhân gây ức chế hoạt tính của laccase. Khi pH tăng thế khử của cơ chất có bản
chất phenol giảm dẫn đến cơ chất này nhạy cảm hơn với q trình oxy hố bởi
laccase [47, 48]. Sự ổn định hoạt tính laccase đối với pH nhìn chung trong
khoảng từ 8-9 [175] và sự ổn định hoạt tính của laccase theo nhiệt độ thay đổi
phụ thuộc lớn vào nguồn gốc vi sinh vật, nhìn chung nằm trong khoảng từ 30 đến
50oC và hoạt tính giảm nhanh chóng ở nhiệt độ trên 60oC [114, 94].
1.1.1.4. Vi sinh vật sinh tổng hợp laccase
Laccase từ thực vật được tìm thấy trong xylem nơi chúng có thể oxy hóa các
monoligno ở trạng thái ban đầu của q trình lignin hóa và cũng tham gia trong các
cơ chế gốc cơ bản của sự hình thành lignin cao phân tử [79]. Thêm vào đó laccase
đã được nghiên cứu về khả năng tham gia vào bước đầu tiên của quá trình hàn gắn
vết thương trên lá [133]. Hiện tại, nghiên cứu về laccase thực vật bậc cao còn rất

hạn chế so với laccase từ các chủng nấm [113, 147].
Thực tế, một số nghiên cứu về hoạt tính laccase ở vi khuẩn khơng giống
laccase ở các nhóm nhân sơ [24]. Protein laccase của vi khuẩn là protein nội bào
hoặc ở khoang chu chất [4]. Chủng Bacillus subtilis đã sinh ra loại laccase CotA ổn
định nhiệt tham gia vào sự hình thành màu ở màng nội bào [88].
Laccase cũng đã được tìm thấy từ lồi Streptomyces cyaneus [3] và S.
lavendulae. Laccase đã được nghiên cứu khá chi tiết ở nhiều chủng nấm thuộc nấm sợi
(Ascomycetes) và nấm đảm (Basidiomycetes) và chúng đã được tinh sạch từ nhiều


8
chủng khác nhau. Có nhiều nghiên cứu về sản phẩm laccase tinh sạch của các loài nấm
Ascomycetes như loài Melanocarpus albomyces [69], Cerrena unicolor [70],
Magnaporthe grisea [19], Trametes versicolor, Trichoderma reesei [81] và Xylaria
polymorpha [102].
Nấm men là nhóm riêng biệt có thể thuộc cả Ascomycetes và Basidiomycetes.
Hiện nay, laccase được tinh sạch từ chủng Cryptococcus (Filobasidiella)
neoformans gây bệnh cho người, chủng nấm men này sinh ra laccase thật có khả
năng oxy hóa phenol và aminophenol và cũng có thể oxy hóa tyrosine [34]. Ngồi
ra, laccase cịn có thể tìm thấy trong một số côn trùng nơi mà chúng được cho là thể
kích hoạt q trình hình thành biểu bì [35].
Ngày này, các nhà khoa học vẫn đang nỗ lực nghiên cứu sàng lọc từ tự
nhiên các chủng nấm sinh tổng hợp laccase với mong muốn tìm được chủng có
hoạt tính cao và có đặc tính mới. Hoạt tính laccase thay đổi phụ thuộc vào các
loài, các chủng vi sinh vật, vì ở điều kiện tự nhiên hoạt tính laccase rất thấp.
Việc lựa chọn, sàng lọc các chủng có khả năng sinh tổng hợp laccase từ tự nhiên
là bước rất quan trọng sau đó là tối ưu các điều kiện mơi trường nuôi cấy để
chúng sinh tổng hợp laccase cao hơn với các đặc tính vượt trội hơn [112].
1.1.1.5. Khả năng của laccase trong phân hủy các hợp chất hữu cơ vòng thơm
Ứng dụng của chủng nấm và enzyme trong xử lý các chất ô nhiễm môi trường

đã được nghiên cứu. Trong đó, laccase có khả năng phân hủy và khử độc có hiệu quả
các hợp chất hữu cơ khó phân hủy đã nhận được nhiều sự quan tâm trong lĩnh vực công
nghệ sinh học [16] và chúng cũng đã được sử dụng như các sensor sinh học trong quan
trắc, xử lý ô nhiễm môi trường trong các lĩnh vực công nghiệp dệt, thức ăn, xử lý gỗ,
dược và hoá chất [125].
Laccase có khoảng cơ chất đặc hiệu rộng nên có thể oxy hoá với phạm vi lớn
các chất độc sinh học ngoại lai bao gồm các hợp chất phenol có clo [151], thuốc trừ
sâu [120], các hợp chất hữu cơ đơn và đa vòng thơm được khai thác từ các nhiên
liệu hố thạch [10].
Laccase tinh sạch từ lồi Coriolopsis gallica oxy hố carbozole, Nethylcarbozole, fluorine và dibenzothiophene khi có mặt 1-hydroxybenzotriazole và
2.2-azinobis (3-ethylbenzthiazoline)-6-sulfonic acid như là một chất gắn kết [8].


9
Các nghiên cứu trong phịng thí nghiệm đã chứng minh rằng phenol và các
amin thơm có thể bị loại bỏ khỏi nước khi sử dụng laccase. Cơ chế của quá trình
này là sự oxy hố của enzyme với các chất ô nhiễm thành các cấu tử tự do hoặc
quinone và sau đó là q trình kết tủa từng phần [164].
Bảng 1.1. Ứng dụng của laccase trong phân hủy các hợp chất hữu cơ vòng thơm
Hợp chất
Phenols

Nguồn gốc laccase

Laccase tái tổ hợp
Chlorophenols,
Trametes sanguineus biểu
cresols, nitrophenols
hiện trong
Trichoderma atroviride

Technical nonylphenol Phoma sp. UHH 5-1-03
Oxybenzone,
pentachlorophenol

P. ostreatus

Laccase tái tổ hợp
Myceliophthora biểu hiện
trong Aspergillus oryzae
Pycnoporus sanguineus
2,4-dichlorophenol
CS43
Các chất làm hỏng hệ miễn dịch
Coriolopsis gallica,
Bisphenol A (BPA)
Bjerkandera
adusta, T. versicolor
Laccase tái tổ hợp T.
BPA
sanguineus biểu hiện
trong T.atroviride
Laccase tái tổ hợp T.
BPA
versicolor biểu hiện trong
S.cerevisiae
Các hợp chất hydrocarbon (PAHs)
Laccase tái tổ hợp B.
15 loại PAHs (theo US
subtilis CotA biểu hiện
EPA)

trong E. coli
4-tert-butylphenol, 4tert-octylphenol

Naphthalene,
phenanthrene

T. versicolor (SigmaAldrich)

Cơ chất

Hình thức

-

Ni cấy

SA
ABTS, HBT,
HPI,
TEMPO, SA,

Tự do

SA

Nuôi cấy

-

Tự do

HBT

Tự do

-

Nuôi cấy

ABTS

Nuôi cấy

ABTS

Tự do

-

Cố định lên
đất sét hoạt
tính

Tự do

Laccase tái tổ hợp T.
sanguineus biểu hiện
Tự do
trong T.atroviride
Laccase được tinh sạch từ chủng nấm đảm trắng Basidiomycete, Trametes

Benzo[a]pyrene,
phenanthrene

villosa có khả năng phân huỷ bisphenol A, đây là một chất gây biến đổi hệ nội tiết
[123]. Các chất phenol đang thu hút nhiều sự quan tâm vì khả năng gây tác động tới


10
các hormon tự nhiên ở các động vật có xương sống. Chúng là sản phẩm từ sự phân
huỷ sinh học không triệt để của các nonylphenol polyethoxylates (NPEOs) được sử
dụng rộng rãi trong các chất hoạt động bề mặt không ion trong các q trình cơng
nghiệp. Cả nonyphenol và NPEOs được thải vào mơi trường chủ yếu từ q trình xử
lý nước thải không triệt để [85]. Laccase từ các thực vật thuỷ sinh Clavariopsis
aquatica đã được chứng minh là có khả năng phân huỷ các chất nonylphenol gây
các triệu trứng thay đổi nội tiết tố [12]. Một số ứng dụng của laccase trong phân hủy
các hợp chất hữu cơ trên thế giới được trình bày ở Bảng 1.1 [173].
Như vậy có thể thấy có rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh về khả năng của
laccase được sinh tổng hợp từ nhiều loài vi sinh vật hay tái tổ hợp trong phân hủy
các hợp chất hữu cơ khác nhau với sự có mặt hay khơng có mặt của các chất gắn kết
và ở các dạng tồn tại tự do hoặc được cố định lên các loại vật liệu khác nhau. Qua
đó cho thấy sự đa dạng của chủng loại, cách thức sử dụng của laccase trong xử lý
các hợp chất hữu cơ.
Ở Việt Nam, đã có một số cơng trình nghiên cứu về laccase và ứng dụng của nó
trong loại màu thuốc nhuộm và xử lý các hợp chất hữu cơ, các hợp chất của phenols.
Khả năng sinh laccase và hiệu suất phân hủy dịch chiết đất (DCĐ) ô nhiễm chất diệt
cỏ chứa chủ yếu đồng loại dioxin 2,3,7,8-TCDD, PAH, thuốc bảo vệ thực vật thuộc
POPs từ một số công trình có liên quan được trình bày ở Bảng 1.2. Loại laccase được
sinh bởi các chủng liệt kê ở Bảng 1.2 đã thể hiện sự khác biệt so với laccase thật bởi
khi đun vài giờ chúng vẫn phân hủy được các chất hữu cơ đa vòng thơm. Những kết

quả nghiên cứu cho thấy tiềm năng và khả năng rất cao của chủng vi sinh vật sinh tổng
hợp laccase từ thiên nhiên của Việt Nam trong việc xử lý các chất ơ nhiễm có vịng
thơm.
Bảng 1.2. Khả năng sinh laccase và hiệu suất phân hủy PAH, thuốc bảo
vệ thực vật ở Việt Nam
STT
Nghiên cứu
Tham khảo
Vi khuẩn Achromobacter sp. BQNT2 được phân lập từ
Đặng Thị Cẩm
nước thải chứa 1600 mg/L TNT. Chủng BQNT2 sinh
1
Hà et al., 2009
laccase với hoạt tính 15 U/L trên mơi trường muối khống
[30]
chứa 100 mg/L TNT
Nấm sợi Aspergillus sp. FNA33 phân lập từ đất đang xử Đặng Thị Cẩm
2
lý khử độc ô nhiễm hỗn hợp các thuốc trừ sâu trong Hà et al., 2009
bioreactor hiếu khí. Chủng nấm sợi này có khả năng sinh
[31]


11
STT

3

4

5

6

7

8

Nghiên cứu
Tham khảo
tổng hợp mangan peroxidase với hoạt tính 434,5 U/L và
laccase với hoạt tính 4,3 U/L trên mơi trường muối
khoáng bổ sung 0,5% glucose và chứa 300 ppm HCH.
Nấm sợi Aspergillus sp. FNA1 được phân lập từ đất ô
nhiễm hỗn hợp thuốc trừ sâu. Ngoài khả năng phân hủy Đào Thị Ngọc
DDT, FNA1 còn sinh enzyme laccase với hoạt tính cao
Ánh et al.,
nhất sau 1 ngày ni cấy là 1.608 U/L trên môi trường
2011
Czapek nghèo bổ sung 0,2% Tween 80, ở pH 5, nhiệt độ
[32]
30°C, 0,1% NaCl và trên nguồn chất độc là DDT.
Xạ khuẩn Streptomyces sp. XKDNP22 được phân lập
Nguyễn Thị
trong lô xử lý đất diệt cỏ/dioxyn tại sân bay Đà Nẵng.
Lan Anh et al.,
Chủng XKDNP22 được nuôi trên môi trường GauseM 1/5
2011
bổ sung 4g dịch chiết malt, DCĐ và 6 g/L KNO3 cho hoạt
[109]

tính laccase là 4.688 U/L
Nấm sợi Myrothecium sp. FNBLa1 phân lập từ rơm mục ở
Ninh Bình. Chủng FNBLa1 có khả năng sinh laccase cao Trần Thị Thu
với hoạt tính là 30.016 U/L sau 96h ở pH 6,5, chất cảm ứng
Hiền et al.,
là 0,1 mM CuSO4, 12 g/L glucose, hỗn hợp1 g/L casein và 3
2013
g/L NaNO3. Hoạt tính laccase cao nhất khi ni cấy bằng
[152]
bioreactor có dung tích 15 lít là 10.410 U/L sau 57 giờ.
Nấm sợi Trichoderma sp. FCP3 phân lập từ rừng Quốc
gia Cúc Phương, sinh laccase hoạt tính là 2.000 U/L ở pH
Hoàng Thị
5,5; chất cảm ứng là CuSO4, glucose, nguồn nitơ là hỗn
Nhung et al.,
hợp KNO3 và NaNO3. Tế bào sống và dịch enzyme thô
2012
của chủng FCP3 loại bỏ pyrene với hiệu suất 33% và
[58]
41%; anthracene với hiệu suất 41% và 54% (nồng độ ban
đầu mỗi chất là 100 mg/L).
Xạ khuẩn Streptomyces sp. XKBH1 đã được phân lập từ đất
nhiễm chất diệt cỏ tại sân bay Biên Hòa. Sau 7 ngày ni
lắc, chủng này có khả năng phân hủy 72 % pyren; 48,3 % Nguyễn Quang
anthracen trên môi trường KG và 63,3 % pyren; 55,8 %
Huy et al.,
anthracen trên môi trường SH1 với nồng độ ban đầu của
2012
mỗi chất là 100 mg/L. Chủng này cũng sinh tổng hợp
[108]

laccase hoạt tính laccase cao nhất (1.073 U/L) trong môi
trường KG chứa veratryl alcohol nồng độ ban đầu 0,5 mM.
Xạ khuẩn Streptomyces sp. XKBH13 phân lập từ đất nhiễm
chất diệt cỏ/dioxyn tại sân bay Biên Hịa. Trong mơi trường
Đàm Thúy
ni cấy chứa dịch chiết malt, 1 mM catechol và sử dụng
Hằng et al.,
DCĐ ô nhiễm chứa dioxyn và các chất chứa clo khác làm
2012
nguồn cacbon, XKBH13 sinh laccase cao nhất sau 24 giờ
[28]
với hoạt tính 3.747 U/L. Sau 7 ngày ni cấy, chủng
XKBH913 loại bỏ được 67,07% pyrene với nồng độ ban


12
Nghiên cứu

STT

Tham khảo

đầu lớn hơn 76 mg/L.
1.1.1.6. Khả năng của laccase phân hủy các hợp chất hữu cơ vòng thơm có clo
Độc tính, độ bền và khả năng bị phân hủy sinh học của các hợp chất clophenol
phụ thuộc vào số lượng và vị trí của nguyên tố clo trên vịng thơm. Các hợp chất clo
vịng thơm khó bị phân hủy hơn các hợp chất clo mạch thẳng và khả năng phân hủy
sinh học giảm khi số lượng nhóm clo tăng. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng loại
clo của enzyme là pH, nồng độ cơ chất ban đầu, lượng enzyme, thời gian phản ứng và
nhiệt độ. Laccase đã loại được 79,74% clo của 2,4,5-TCP ở các điều kiện tối ưu như

pH 5, nồng độ cơ chất là 400 µM, thời gian phản ứng là 30 phút, với lượng enzyme là
4ml và nhiệt độ phản ứng là 50ºC. Laccase của loài nấm Rhizoctonia praticola đã
được sử dụng để phân hủy các chất ô nhiễm phenolic như o-chlorophenol, pchlorophenol, 2,4-DCP, 2,4,5-TCP, 4-chloro-2-methylphenol. Tuy nhiên, độc tính
của p-chlorophenol và 2,4,5-TCP khơng giảm. Xử lý chất đa vòng thơm chứa clo
bằng laccase có thể khơng phải lúc nào cũng đạt hiệu quả triệt để, có thể laccase nên
được sử dụng để xử lý sau quá trình loại clo các hợp chất trên [73]. Khả năng phân
hủy các hợp chất vòng thơm chứa clo bởi laccase được trình bày ở Bảng 1.3 [173].
Bảng 1.3. Ứng dụng của laccase trong phân hủy các chất hữu cơ có clo
Hợp chất
Thuốc trừ sâu

Nguồn gốc laccase

Cơ chất

Ở dạng

Atrazine

P. ostreatus

ABTS, HBT,
HPI, TEMPO,
SA,VA, VAN

Tự do

Chlorpyrifos

Laccase tái tổ hợp từ

chủng vi khuẩn WD
biểu hiện trong
Pseudomonas putida

-

Nuôi cấy

T. versicolor

ABTS, AS,
guaiacol,
HBT, SA,
VA, VAN

Tự do

-

Trong q
trình ni
cấy

SA

Cố định
lên màng

Atrazine, chlorothalonil,
chlorpyrifos,

isoproturon, pyrimethani
Atrazine, isoproturon
Ametryn, atrazine,
clofibric acid, fenoprop,
pentachlorophenol,
propoxur

Laccase tái tổ hợp từ
chủng O. sativa biểu
hiện trong P.pastoris
Laccase tái tổ hợp từ
chủng M. thermophila
biểu hiện trong
Aspergillus oryzae


13
Chú thích: (Tự do) - Là hình thức enzyme được sử dụng ở trạng thái dung dịch;
(Cố định) - Là hình thức enzyme được cố định lên các loại vật liệu; (Trong q trình ni
cấy) - Enzyme được hình thành trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật.

Kết quả từ các nghiên cứu trong và ngoài nước được trình bày ở trên cho
thấy khả năng phân hủy các chất vịng thơm có clo (các thuốc trừ sâu) bởi laccase
tái tổ hợp, laccase tự nhiên từ chủng nấm, vi khuẩn và ở các dạng tồn tại khác nhau,
bên cạnh đó là vai trị của chất gắn kết phù hợp với từng loại laccase.
Nhận xét:
Tổng quan tài liệu liên quan đến laccase và các ứng dụng cho thấy, laccase là
đối tượng đã được nghiên cứu khá chi tiết trên các phương diện: vi sinh vật sinh
tổng hợp laccase, cấu tạo phân tử, cơ chế hoạt động xúc tác, nghiên cứu phân tử về
gene, protein và đặc điểm hóa - lý của laccase.

Đến thời điểm hiện nay, có ít cơng trình sử dụng tổ hợp của nhiều chủng vi
sinh vật sinh tổng hợp laccase trong xử lý các chất ơ nhiễm hữu cơ khó phân hủy vì
việc lựa chọn được tổ hợp của nhiều vi sinh vật sinh tổng hợp laccase có khả năng
cao khơng đơn giản và nghiên cứu địi hỏi nhiều cơng sức. Đây là cơ hội cho các
nghiên cứu nhằm tìm kiếm cơng nghệ xử lý ô nhiễm môi trường do nước thải dệt
nhuộm và chất diệt cỏ/dioxin gây ra. Các nghiên cứu về khả năng của laccase cần tiếp
tục thực hiện để bổ sung cơ sở khoa học, cơ sở dữ liệu về mức độ đa dạng của chủng
vi sinh vật sinh tổng hợp laccase và tiềm năng ứng dụng theo phân bố của Việt Nam.
1.1.2. Giới thiệu về laccase-like
Laccase là các enzyme oxy hóa 3 thành phần có chứa đồng, enzyme này có
thể lấy một điện tử của 4 phân tử cơ chất và khử oxy nguyên tử thành nước. Ngày
nay, có nhiều enzyme đã được xác định có cấu tạo và cơ chế hoạt động sử dụng oxy
giống laccase nhưng nó khơng thể hiện cơ chất đặc hiệu hướng tới quá trình
benzendiol (quá trình gắn gốc OH vào vịng benzen). Những enzyme này thường có
hoạt tính khơng ổn định và khơng dễ để phân loại vì việc phân loại laccase thường
dựa trên loại phản ứng hóa học và tính chất vật lý của cơ chất, nên thuật ngữ oxy
hóa laccase-like đa nhân chứa đồng đã được đề xuất (laccase multicopper oxidaseLMCO) [128].
Cấu trúc phân tử của laccase-like (LMCO) đã được nghiên cứu bởi
Messerschmidt và cộng sự trong rất nhiều công bố từ năm 1989 đến 1993 [91]. Tới
tháng 7 năm 2014 đã có khoảng 30 cấu trúc tinh thể laccase-like khác nhau đã được


14
đăng ký trong ngân hàng protein trong đó có cấu trúc laccase của loài B. subtills CotA.
Tuy nhiên, cấu trúc phân tử laccase-like này vẫn có bản chất là protein. Laccase-like
thường ổn định nhiệt độ với nhiệt độ phản ứng tối ưu trên 450C, có thể kể đến laccaselike được sinh tổng hợp từ Pycnoporus cinnabarinus khi ủ ở 2h ở nhiệt độ 800C thì
hoạt tính giảm đi một nửa và khi ủ ở 370C sau 245 ngày vẫn còn hoạt tính [9].
Gần đây việc nghiên cứu ứng dụng các hoạt chất sinh học được sinh tổng
hợp bởi chủng nấm trên tồn thế giới để ứng dụng trong cơng nghiệp chế biến thức
ăn và dược phẩm ngày càng được tăng lên, các sản phẩm này đã trở thành lĩnh vực

quan trọng của công nghệ sinh học hiện nay. Các hoạt chất này là các protein,
polysacharide hoặc hỗn hợp polysacharide và protein có nguồn gốc nội và ngoại
bào có khối lượng phân tử thấp (LMS Low Molecular Weight). Khi phân tích thành
phần hóa học của các chất này thì thấy có sự xuất hiện của các loại đường và các
hợp chất phenolic. Trong q trình ni cấy chủng Cerena unicolor trên mơi trường
lỏng phát hiện thấy hoạt chất có khối lượng phân tử thấp khoảng 10kDa, chất này có
tính oxy hóa mạnh, bằng hoặc cao hơn khi so sánh với trolox và ascorbic acid.
Một số nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả q trình phân hủy sinh học
lignin khơng cao nếu chỉ có vai trị enzyme thuộc họ lignin, mà ở đó có sự tham gia
của một số hoạt chất có kích thước nhỏ có khả năng thể khuếch và đóng vai trị khởi
động q trình phân hủy lignin. Glycopeptides có khối lượng 1 đến 5 kDa được sinh
tổng hợp từ chủng Phanerochaete chrysosporium, gọi là tác nhân Pc, chất này có
thể xúc tác phản ứng khử để tạo thành gốc OH* và khử Fe3+ thành Fe2+. Hiện nay,
những nghiên cứu về mối quan hệ giữa tác nhân Pc với các enzyme ligninolytic và
vai trị trong q trình phân hủy lignin đang được tiếp tục nghiên cứu [93]. Quá
trình tinh sạch tác nhân Pc được thực hiện như sau: dịch enzyme ngoại bào thô của
chủng P. Chrysosporium ME-446 ATCC 34541 được siêu lọc qua màng 5 kDa, các
thành phần sau quá trình lọc được tinh sạch qua cột Sephadex G-10, sau đó được
tinh sạch tiếp theo qua thiết bị HPLC TSK với cột GEL G2500PW. Sau đó tác nhân
Pc tinh sạch được xác định cấu trúc với hàng loạt peptides bằng phương pháp
MALDI-TOF cũng như phân tích acid amin. Qua đó khối lượng phân tử của tác
nhân Pc được xác định trong khoảng 0,5 đến 1,0 kDa [93].
Tác nhân Pc của lồi P. Chrysosporium có thể oxy hóa chất 2,6-DMP mà
khơng có sự tham gia của Mn2+ và H2O2 trong khi MnP được sinh tổng hợp bởi