CHUYÊN ĐỀ LUẬN ÁN TIẾN SĨỨNG DỤNG VI KHUẨN TÍCH LŨYPOLYPHOSPHAT TRONG QUI TRÌNH XỬ LÝNƯỚC - ĐẶC BIỆT NƯỚC AO NUÔI CÁ TRA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN ĐỀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ

ỨNG DỤNG VI KHUẨN TÍCH LŨY
POLYPHOSPHAT TRONG QUI TRÌNH XỬ LÝ
NƯỚC - ĐẶC BIỆT NƯỚC AO NUÔI CÁ TRA

Nghiên cứu sinh thực hiện

LÊ QUANG KHƠI
Khóa: 2011 – 2015

Cần Thơ, 9/2013


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN ĐỀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ

ỨNG DỤNG VI KHUẨN TÍCH LŨY
POLYPHOSPHAT TRONG QUI TRÌNH XỬ LÝ
NƯỚC – ĐẶC BIỆT NƯỚC AO NUÔI CÁ TRA

Người hướng dẫn khoa học
PGS.TS. HÀ THANH TỒN

Nghiên cứu sinh thực hiện

LÊ QUANG KHƠI
Khóa: 2011 – 2015


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Cần Thơ, 9/2013

ii


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

MỤC LỤC
MỤC LỤC..................................................................................................................... i
DANH SÁCH HÌNH...................................................................................................iii
DANH SÁCH BẢNG..................................................................................................iii
TĨM LƯỢC................................................................................................................iv
BẢNG CHÚ THÍCH.....................................................................................................v
CHƯƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ........................................................................................1
1. 1 Phospho và tác động của chúng đến chất lượng nước.........................................1
1. 2 Sự hấp thu và giải phóng phospho hịa tan..........................................................2
1. 3 Nguồn chất thải từ ao ni cá tra........................................................................3
1. 4 Mục đích của chun đề......................................................................................4
1. 5 Yêu cầu chuyên đề..............................................................................................4
CHƯƠNG 2: QUÁ TRÌNH LOẠI BỎ PHOSPHO HỊA TAN.....................................5

2. 1 Loại bỏ phospho bằng hóa chất...........................................................................5
2. 2 Cấu trúc quần thể vi khuẩn tích lũy polyphosphat..............................................7
2. 3 Loại bỏ phospho bằng con đường sinh học thông qua quá trình EBPR............11
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................14
3. 1 Phương tiện nghiên cứu....................................................................................14
3. 1. 1 Thiết bị, dụng cụ.....................................................................................................14
3. 1. 2 Nguyên vật liệu.......................................................................................................15

3. 2 Phương pháp nghiên cứu...................................................................................15
3. 2. 1 Phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P............................................................................15
3. 2. 2 Chụp kính hiển vi điện tử truyền quét (Transmission Electron Microscopy)............15
3. 2. 3 Nhận diện gen poly-phosphate kinase 1 (ppk 1).......................................................16
3. 2. 4 Định danh dòng TGT025L......................................................................................17
3. 2. 5 Thí nghiệm kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphat trong môi trường tổng hợp.............17

i


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

3. 2. 6 Thí nghiệm loại bỏ phosphat trong nước ao ni cá tra (qui mơ 10 lít).....................18
3. 2. 7 Thí nghiệm loại bỏ phosphat trong nước ao nuôi cá tra 100 lít.................................19
3. 2. 8 Phương pháp phân tích............................................................................................19

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...............................................................20
4. 1 Kết quả tuyển chọn các dòng vi khuẩn phân lập...............................................20
4. 1. 1 Kết quả kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphat của 20 dòng vi khuẩn...........................20
4. 1. 2 Kết quả chụp TEM..................................................................................................20

4. 1. 3 Kết quả PCR...........................................................................................................21
4. 1. 4 Kết quả định danh...................................................................................................22

4. 2 Kết quả kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphat trong môi trường tổng hợp...........23
4. 2. 1 Sự biến đổi chỉ số pH theo thời gian........................................................................23
4. 2. 2 Sự biến đổi chỉ số OD.600 nm và hàm lượng PO43- theo thời gian...........................23

4. 3 Kết quả loại bỏ phosphat trong nước ao nuôi cá tra..........................................25
4. 3. 1 Sự biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian trong thí nghiệm qui mơ 10 lít..............25
4. 3. 1 Sự biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian trong thí nghiệm qui mơ 100 lít............27

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...................................................................28
5. 1 Kết luận............................................................................................................. 28
5. 2 Đề nghị.............................................................................................................28
Tài liệu tham khảo.......................................................................................................29

ii


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Hệ thống tăng cường loại bỏ phospho sinh học (van Loosdrecht et al., 1997). .11
Hình 2: Các đặc điểm sinh hóa chính trong q trình EBPR.......................................12
Hình 3: Ảnh chụp TEM dịng TGT025L......................................................................21
Hình 4: Sản phẩm PCR của 5 dịng vi khuẩn trên gel agarose 1,2 %.............................21
Hình 5: Cây phả hệ 5 dòng vi khuẩn được xây dựng dựa trên trình tự 16S rRNA.......22

Hình 6: Biến đổi pH theo thời gian của 5 dịng vi khuẩn.............................................23
Hình 7: Sự biến đổi hàm lượng PO43- và chỉ số OD.600 nm theo thời gian.................24
Hình 8: Hiệu suất loại bỏ phosphat của 5 dịng vi khuẩn.............................................25
Hình 9: Biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian.........................................................26
Hình 10: Biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian giữa 2 nghiệm thức.......................27

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Hóa chất thường dùng để trầm hiện orthophosphat và sản phẩm của chúng....5
Bảng 2: Chỉ số sinh học và hóa học để đánh giá khả năng loại bỏ phospho..................6
Bảng 3: Acid béo hịa tan được hình thành trong bể kỵ khí.........................................11
Bảng 4: Cấu trúc phân tử các đơn vị cấu tạo nên poly-β-hydroxyalkanoates...............12
Bảng 5: Cặp mồi đặc hiệu nhận diện gen ppk 1.............................................................16
Bảng 6: Kết quả kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphat trong môi trường.......................20
Bảng 7: Kết quả định tên các dịng vi khuẩn dựa trên trình tự gen 16S rRNA.................22

iii


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

TÓM LƯỢC
Loại bỏ hay chuyển hoá phospho bằng con đường sinh học là một phương pháp phổ
biến được áp dụng. Một số lồi vi sinh vật dị dưỡng có khả năng hấp thu phosphat và dự
trử chúng dạng polyphosphat nội bào và chúng được gọi là vi sinh vật tích lũy
polyphosphat (polyphosphate accumulating organisms-PAOs). Trong đó, vi khuẩn tích
lũy polyphosphat là nhóm vi khuẩn có vai trị quan trọng trong xử lý nước thải bằng
con đường sinh học. Chúng tích lũy lượng lớn polyphosphat nội bào, góp phần vào

q trình loại bỏ phospho hịa tan trong nước.
Mục đích của chun đề này là tìm hiểu về quá trình loại bỏ phosphat hòa tan bởi vi
sinh vật và tuyển chọn các dòng vi khuẩn phân lập có hiệu suất loại bỏ phosphat cao
để ứng dụng xử lý phospho hòa tan trong nước ở phạm vi phịng thí nghiệm. Trong số
20 dịng vi khuẩn phân lập được tuyển chọn ban đầu, có 5 dịng có khả năng làm giảm
nhanh hàm lượng phosphat với hiệu suất loại bỏ từ 55,3 tới 76,6% sau 36 giờ chủng vi
khuẩn vào môi trường nước thải tổng hợp. Kết quả thí nghiệm ứng dụng 5 dịng vi
khuẩn này để loại bỏ phosphat cho thấy rằng, 2 dòng TGT013L và TGT025L có khả
năng làm giảm hàm lượng phosphat trong nước thải tổng hợp từ 17,7 mg/l xuống còn
4,1 và 2,6 mg/l sau 25 giờ thí nghiệm, với hiệu suất loại bỏ phosphat trong môi trường
tương ứng là 76,5% và 85,3% (ở pH khoảng pH 8,1; chỉ số OD.600 nm khoảng 0,6).
Kết quả chụp TEM và PCR cho thấy rằng 2 dịng vi khuẩn này có gen đồng hóa
phosphat thành dạng hạt poly-phosphat nội bào. Chúng được xác định có mối quan hệ
gần gũi với Acinetobacter radioresistens và Kurthia sp. (cùng tỉ lệ tương đồng với
trình tự 16S rRNA trên Genbank, 99%). Ứng dụng 2 dòng vi khuẩn này loại bỏ
phosphat hịa tan trong nước ao ni cá tra. Kết quả loại bỏ phosphat trong mơi trường
ở mơ hình 10 lít có hiệu suất từ 75,6 đến 88,7% sau 36 giờ; mơ hình 100 lít từ 60,35
đến 80,90% sau 48 giờ cấy bổ sung vi khuẩn với hàm lượng PO 43- cịn lại trong mơi
trường thấp. Hai dịng vi khuẩn này có nhiều tiềm năng ứng dụng để xử lý phospho
hịa tan trong nước.
Từ khóa: Vi khuẩn tích lũy poly-P, polyphosphat, loại bỏ phosphat, nước ao cá tra

iv


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

BẢNG CHÚ THÍCH

ĐBSCL: Đồng Bằng Sơng Cửu Long
DPABs: Denitrifying polyphosphate accumulating bacteria (vi khuẩn tích lũy poly-P khử nitơ)
EBPR: Enhanced biological phosphorus removal (Tăng cường sự loại bỏ P bằng sinh học)
N: Nitơ
P: Phospho
PAB: Polyphosphate accumulating bacteria (vi khuẩn tích lũy poly-P)
PHAs: Polyhydroxyalkanoates
PHB: Polyhydroxybutyrate
Poly-P: Polyphosphate
TEM: Transmission electron microscopy (kính hiển vi điện tử truyền quét)
SCFAs: Short chain fatty acids (axid béo mạch ngắn)

v


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

CHƯƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Nghề nuôi cá tồn tại đã hơn 4000 năm nhưng chỉ vài thế kỷ nay mới mở rộng thành
nghề nuôi trồng thủy hải sản nước ngọt và nước mặn (Trần Bá Cừ et al., 2003). Cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus) là mặt hàng xuất khẩu và tiêu thụ nội địa quan trọng
của ngành thủy sản Đồng bằng sông Cửu Long (Dương Tấn Lộc, 2006). Trong những
năm qua, nghề nuôi cá tra nói riêng và ni thủy sản nói chung đang phát triển ngày
càng mạnh mẽ, ngành thủy sản An Giang đạt mức tăng trưởng cao với kết quả vượt kế
hoạch nhiều chỉ tiêu như: diện tích ni đạt 2.384 ha, tăng 24,3% so với cùng kỳ, sản
lượng 263.592 tấn, giá trị xuất khẩu 125.000 tấn, tương đương 335 triệu USD (Tạp chí
Khoa học và Cơng nghệ An Giang, số 06/2007). Nuôi trồng thủy sản đặc biệt là cá tra,
là một trong những thế mạnh phát triển kinh tế của Đồng Bằng Sông Cửu Long và việc

thải nước trực tiếp từ các ao ni thủy sản ra ngồi mơi trường tự nhiên là khơng thể
kiểm sốt. Do đó nguy cơ ô nhiễm nguồn nước mặt là điều không tránh khỏi. Các nguồn
gây ô nhiễm nước chủ yếu là thức ăn tồn đọng, chất thải bài tiết của cá, bùn đáy ao…
Thành phần các chất gây ô nhiễm chủ yếu là protein, lipid, acid béo, photpholipid,
carbohydrate, hàm lượng nitơ, chất khoáng…(Nguyễn Văn Châu, 2008). Đây cũng
chính là vấn đề mà các ngành chức năng đang quan tâm tìm ra những giải pháp hợp lý
cho việc phát triển nghề nuôi thủy sản bền vững. Q trình ni thủy sản sẽ dẫn đến sự
tích tụ nhiều chất hữu cơ trong ao ni và đây là nguyên nhân gây ô nhiễm cho các thủy
vực. Sự phân giải các chất hữu cơ dư thừa này sẽ làm cho nồng độ nitơ (N) và phospho
(P) hòa tan vượt quá mức chịu đựng của thủy sản.
1. 1 Phospho và tác động của chúng đến chất lượng nước
Phospho được xác định như là yếu tố dinh dưỡng thiết yếu cho sự sống. P là thành
phần cấu tạo nên các hợp chất quan trọng của sự sống như: các phân tử di truyền
DNA, RNA; các phân tử cấu trúc như protein, lipid; các phân tử dự trữ năng lượng cho
tế bào như ATP, poly-P…Tuy nhiên, mặc dù P vừa là một yếu tố kiểm soát sự tăng
trưởng và phát triển của sinh vật nhưng chúng cũng là nhân tố chủ yếu gây ra hiện
tượng phú dưỡng hóa. Ở hàm lượng vượt mức cho phép, P kích thích mạnh mẽ khả năng
tăng sinh khối của thủy sinh vật như tảo, tảo lam…Bowman et al., (2007), chỉ ra rằng,
một lượng nhỏ P trong nước 0.1 mg/l và duy trì thời gian dài sẽ gây sự phát triển mạnh
mẽ của tảo. Sự biểu hiện có thể nhận biết rõ của hiện tượng này là sự bùng nổ của tảo, sự
1


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

giảm hàm lượng oxy hịa tan kéo theo nước ơ nhiễm nặng, cá chết, các thực vật – động vật
thủy sinh dần dần bị tiêu diệt. Trong một vài trường hợp, có sự xuất hiện của tảo độc như
Microsystis. Sự quá dư thừa lượng dinh dưỡng trong nước làm gia tăng sự hoạt động các

vi sinh vật có hại như Pfisteria. Điều này sẽ tác động đến nền kinh tế thông qua ảnh
hưởng của chúng đến nghề nuôi cá thương mại, du lịch sinh thái và có thể ảnh hưởng đến
sức khỏe con người.
1. 2 Sự hấp thu và giải phóng phospho hịa tan
Sự hấp thu và giải phóng P hịa tan dạng phosphat phụ thuộc vào các yếu tố nhạy cảm
trong các phản ứng oxy hóa khử dưới điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Trong điều kiện
hiếu khí P sẽ được hấp thu và giải phóng trở lại trong điều kiện kỵ khí dưới sự hiện
diện của Fe3+/Fe2+ (Zhou et al., 2005). Trước đây, quá trình hấp thu P hịa tan được xem
như là q trình loại bỏ bằng con đường hóa học (Peng et al., 2007). Tuy nhiên, nhiều
bằng chứng cho thấy q trình sinh học đóng vai trò quan trọng (Gächter et al. 1988).
Bên cạnh xử lý P hịa tan bằng con đường hóa học, nhiều vi sinh vật có khả năng hấp
thu lượng lớn phosphat và tồn trữ chúng dạng poly-P nội bào. Nhiều nghiên cứu cũng
cho rằng cả hai q trình hóa học và sinh học đều có vai trị quan trọng trong q trình
hấp thu và giải phóng phosphat (Khoshmanesh et al., 1999). Tác động của vi khuẩn
trong quá trình hấp thu và giải phóng phosphat có thể thơng qua con đường trực tiếp
như: sự phân hủy các hợp chất hữu cơ, tích tụ và phóng thích phosphat hoặc gián tiếp
thơng qua q trình khống hóa (Davelaar 1993). Chính vì vậy, vi khuẩn tích lũy polyP được xem xét và sử dụng trong quá trình loại bỏ các thành phần dinh dưỡng trong
các hệ thống xử lý nước thải (Mino et al., 1998), bên cạnh đó, chúng cũng hiện diện
trong các ao hồ trong tự nhiên (Davelaar 1993).
Loại bỏ PO43- thông qua hoạt động vi khuẩn ngày càng được ứng dụng bởi vì các đặc
tính hữu dụng của chúng là: dễ ứng dụng, hiệu quả về mặt kinh tế và thân thiện với
môi trường sống. Một số vi khuẩn có khả năng hấp thu và tồn trữ P như nguồn
phospho nội bào, nguồn P cần thiết cho tế bào khi môi trường sống thiếu hụt về
phospho, và chúng được xem như là vi khuẩn tích lũy poly-phosphat. Vi khuẩn tích
lũy poly-phosphat được biết đến như là vi sinh vật có khả năng hấp thu phosphat tự do
trong mơi trường và đồng hóa chúng dưới dạng hạt poly-phosphat (poly-P) nội bào.
Quá trình này đã được xem như là quá trình làm tăng cường loại bỏ P sinh học
2

Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

(Enhanced biological phosphorus removal - EBPR) trong các hệ thống xử lý nước thải
theo chuỗi [Sequencing batch reactors – SBRs, (Mino et al., 1998; Bond et al., 1999)].
Dưới điều kiện thiếu oxy, PAOs phân giải poly-P lấy năng lượng cho quá trình đồng
hóa các hợp chất hữu cơ mạch ngắn như acetat thành poly-hydroxyalkanoates (PHAs),
đồng thời phóng thích PO43-, kết quả là làm gia tăng tạm thời hàm lượng PO 43- trong
mơi trường. Khi điều kiện mơi trường có oxy, chúng phân hủy PHAs tạo nguồn carbon
cho quá trình tăng trưởng và nguồn năng lượng để tái tạo lại poly-P. Kết quả là làm
giảm tổng lượng phosphat thông qua lượng sinh khối tăng thêm chứa lượng poly-P
mới tái tạo (Mino et al., 1998).
1. 3 Nguồn chất thải từ ao nuôi cá tra
Nguồn chất thải chủ yếu chứa lượng lớn P là phân động vật. Chúng tồn tại 3 dạng: P hữu
cơ (P liên kết trong các hợp chất hữu cơ), orthophosphat (PO 43-) và poly-P. Hầu hết các P
hữu cơ và poly-P có thể chuyển hóa thành PO43- thơng qua q trình sinh học.
Theo Lê Bảo Ngọc (2004), bình quân sản xuất 1kg cá Tra sẽ thải ra môi trường 23,2g
N và 8,6g P. Khi cho ăn, cá chỉ hấp thu được chỉ khoảng 17% năng lượng trong thức
ăn và phần còn lại (83%) sẽ thải ra và hòa lẫn trong môi trường nước trở thành các
chất hữu cơ phân hủy.
Theo Huỳnh Trường Giang et al., (2008) nước ao nuôi cá Tra thâm canh ở An Giang
vào mùa khơ có TSS từ 3,5-122,7mg/l, TAN từ 0,053-2,513mg/l, PO 43- từ 0,0041,973mg/l, NO2- từ 0,001-1,359mg/l, NO3- từ 0,122-18mg/l; trong mùa mưa TSS từ
18,5-188mg/l, TAN từ 0,11-4,062mg/l, PO43- từ 0,003-2,28mg/l, NO2- từ 0,0341,359mg/l, NO3- từ 0,194-8,743mg/l.
Thay nước ao nuôi là việc làm rất cần thiết trong q trình ni cá Tra. Số lần thay
nước trong sáu tháng bình qn là 30-40 lần và có thể lên đến 90 lần (Lê Anh Tuấn,
2008). Lượng nước nầy hầu như 100% được thải trực tiếp ra sông, rạch mà không qua
xử lý. Đây là mối đe dọa lớn đến chất lượng nước mặt cho sinh hoạt và tăng nguy cơ
lây lan bệnh trong nuôi trồng thủy sản.
Để có 100 tấn cá phi lê phải có 300 tấn cá nguyên liệu, tức phải cần 480 tấn thức ăn

thủy sản (tính theo hệ số chuyển hóa thức ăn bình quân 1,6). Như vậy, nếu vùng
ĐBSCL đạt chỉ tiêu 1 triệu tấn cá phi lê xuất khẩu thì phải đưa vào nguồn nước 4,8
3


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

triệu tấn thức ăn - tức cùng lúc phải làm sao có đến 26 triệu ha mặt nước để tự xử lý ô
nhiễm do 2,1 triệu tấn chất thải hữu cơ phát sinh.
Đối với các ao nuôi công nghiệp, chất thải trong ao có thể chứa đến 45% Nitrogen và
22% là các chất hữu cơ khác...Nguồn chất thải này lan truyền nhanh ra bên ngồi gây
nguy cơ ơ nhiễm cịn khiến dịch bệnh thủy sản phát sinh trong môi trường nước.
Ở các nơi có nguồn thải N và P cao như khu vực nuôi cá tra công nghiệp tập trung ở
ĐBSCL. Tổng N và P thải ra từ các ao nuôi cá tra khoảng 31,6 tấn N và 9,8 tấn P năm
2007 và 50,4 tấn N và 15,7 P tấn năm 2008 (De Silva et al., 2010). Nếu tất cả chúng
thải trực tiếp ra các con sơng ở ĐBSCL thì gây cơ gây ô nhiễm nặng. Tuy nhiên,
không phải tất cả chúng đều thải ra các con sông ở ĐBSCL, một phần chất thải sử
dụng cho nông nghiệp và một phần chúng tích tụ trong bùn đáy ao hoặc được hấp thu
bởi các vi sinh vật trong ao. Phan et al., (2009) quan sát sự tích lũy thành phần dinh
dưỡng trong ao cho thấy rằng, khoảng 51% P được tích lũy trong bùn đáy ao. Điều này
cho thấy rằng vai trò quan trọng của các vi sinh vật trong quá trình tích tụ P hịa tan
trong nước ni cá tra. Chính vì vậy, việc tuyển chọn vi khuẩn tích lũy poly-P có hiệu
suất loại bỏ phosphat cao để ứng dụng vào trong xử lý P hịa tan trong nước ao ni cá
tra là điều cần thiết hiện nay.
1. 4 Mục đích của chuyên đề
Tìm hiểu cơ chế của quá trình loại bỏ phospho hịa tan bằng phương pháp hóa học và
sinh học. So sánh và đánh giá các thuận lợi và khó khăn của từng phương pháp.
Tuyển chọn các dịng vi khuẩn tích lũy polyphosphat từng các chuyên đề 1 và 2 có

hiệu quả loại bỏ phospho hịa tan cao để ứng dụng xử lý phosphat trong nước ao nuôi
cá tra.
1. 5 Yêu cầu chuyên đề
Tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn tích lũy polyphosphat để ứng dụng xử lý
phosphat hịa tan trong nước ao ni cá tra.
Viết 01 bài báo khoa học.

4


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

CHƯƠNG 2: Q TRÌNH LOẠI BỎ PHOSPHO HỊA TAN
Loại bỏ P hịa tan có ý nghĩa vơ cùng quan trọng. Hiện nay, một số biện pháp có thể
loại bỏ P được sử dụng là biện pháp hóa học và sinh học. Ba biện pháp được áp dụng
như lắng tụ P bằng quá trình bổ sung các kim loại như muối natri hoặc kẽm, loại bỏ P
bằng màng thấm lọc, tích tụ P trong tế bào vi sinh vật.
Quá trình loại bỏ P hịa tan bằng biện pháp hóa học phụ thuộc vào sự cân bằng giữa hàm
lượng P hòa tan - chất tạo lắng và hiệu quả loại bỏ các chất lắng tụ. Thường thì loại bỏ các
chất bùn lắng tốn kém và vì thế chi phí xử lý P bằng phương pháp hóa học thường cao.
Q trình loại bỏ P hòa tan bằng con đường sinh học tùy thuộc vào hàm lượng P hịa tan
và hiệu quả của q trình tách bùn. Trong quá trình làm tăng cường sự loại bỏ P hịa tan,
thì sinh khối có thể chứa 6 đến 8%, một lượng P vượt quá mức nhu cầu thiết yếu của tế
bào và P tích lũy trong tế bào sẽ được loại bỏ bằng quá trình lắng tụ sinh học.
2. 1 Loại bỏ phospho bằng hóa chất
Hóa chất làm trầm hiện orthophosphat thường sử dụng trong các nhà máy xử lý nước
thải và mặc dù polyphosphat và hợp chất phospho hữu cơ có thể được loại bỏ bằng hóa
chất, nhưng chúng phải được thủy giải và khống hóa (phân hủy) để phóng thích

orthophosphat rồi sau đó làm trầm hiện trở lại.
Khoáng kim loại thường sử dụng để trầm hiện orthophosphat là Al 3+, Ca2+, Fe3+, và
Mg2+ (Bảng 1). Hóa chất làm trầm hiện orthophosphat được kiểm sốt bởi pH ví dụ:
pH>8,5 cho Ca2+ và pH 5,5 đến 7,0 cho Al3+ và Fe2+. Hóa chất làm trầm hiện
orthophosphat có thể bổ sung ở đầu vào hay đầu ra của bễ hiếu khí. Tuy nhiên, trầm
hiện đầu vào của bễ hiếu khí có thể dẫn kết quả làm giảm dinh dưỡng (orthophosphat)
trong bễ hiếu khí.
Bảng 1: Hóa chất thường dùng để trầm hiện orthophosphat và sản phẩm của chúng

Hóa chất
Sulphate nhơm
Chlorua Sắt
Vơi
Sulphate ma-nhê

Cơng thức hóa học

Sản phẩm

Al2(SO4)3

AlPO4

FeCl3

FePO4

Ca(OH)2

Ca5OH(PO4)3

MgSO4

MgNH4PO4

5


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Trong bể hiếu khí, orthophosphat có thể được liên kết trong các phân tử keo tụ như là
dạng hydroxyapatit khó tan (CaOH(PO4)3), điều này xảy ra tự nhiên mà không cần có sự
tác động của các phản ứng hóa học. Nếu hàm lượng oxi hịa tan trong bể hiếu khí kém và
nhiều khí CO2 thải ra từ sự phân hủy BOD kéo dài trong dung dịch, pH của bể hiếu khí
giảm. Sự giảm sút này là do nồng độ CO 2 hòa tan cao và acid carbonic (H2CO3) được tạo
ra, dưới điều kiện này orthophosphat vẫn còn trong dung dịch ở dạng ion H2PO4-. Tuy
nhiên, nếu nồng độ oxi hòa tan trong bể hiếu khí cao và nồng độ khí CO2 giảm dần, ít acid
carbonic và pH trong bể hiếu khí gia tăng, dưới điều kiện này orthophosphat sẽ hiện diện
ở dạng ion HPO42-; Nếu nước chứa nhiều canxi (nước cứng), orthophosphat sẽ trầm hiện
từ dung dịch thành hydroxyapatite và liên kết trong các phân tử keo tụ.
Orthophosphat có thể duy trì trong dung dịch của bể hiếu khí trong hai dạng: dạng ion
được xác định bởi pH hay dạng liên kết để tạo ra dạng kim loại kiềm.
Phospho hữu dụng từ q trình tạo bùn hoạt tính xấp xỉ 90% orthophosphat, dạng
orthophosphat này có thể ở dạng ion hịa tan hay dạng liên kết, để khử hàm lượng
phospho hữu dụng từ q trình tạo bùn hoạt tính, một hệ thống xử lý nước thải tiên
tiến cần có những dụng cụ hay thiết bị để đo: Chất rắn lơ lửng vô cơ và hữu cơ, hỗn
hợp chứa phospho và nitơ đóng góp vào trong hiện tượng nở hoa, hỗn hợp hữu cơ
phân hủy nhanh hay phân hủy chậm chạp.

Bảng 2: Chỉ số sinh học và hóa học để đánh giá khả năng loại bỏ phospho
Chỉ số
Đồng hóa

Chỉ dẫn
Liên kết phospho như là nguồn dưỡng chất trong sự tổng hợp
màng tế bào và chuyển hóa năng lượng. Phospho đóng góp 13% trọng lượng vi khuẩn trong chất thải

Tăng cường loại bỏ Liên kết phospho như là nguồn dưỡng chất trong sự tổng hợp
phospho sinh học
màng tế bào, chuyển hóa năng lượng và hạt poly-P. Phospho
đóng góp 1-3% trọng lượng vi khuẩn trong chất thải
Hình thành
hydroxyapatit

Hydroxyapatit được hình thành trong suốt giai đoạn nồng độ
oxi hòa tan thấp và pH tăng trong bể hiếu khí

Trầm hiện hóa học

Sử dụng nhơm, clorric sắt, sulphat sắt hay vôi để trầm hiện
orthophosphat như là muối kim loại

Trầm hiện chất trung Trầm hiện hóa học orthophosphat phóng thích từ vi khuẩn qua
gian sinh-hóa
chỉ số tăng cường loại bỏ phospho sinh học
6


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Phospho có thể được loại bỏ khỏi hệ thống xử lý nước thải thông qua các thông số đo
lường hệ số xử lý sinh học và hóa học (Bảng 2). Một vài hệ số được đánh giá hay xem
xét để biết hệ thống xử lý nước thải tiên tiến bao gồm các hệ số trầm hiện hóa học của
phospho hay hệ số tăng cường loại bỏ phospho sinh học-EBPR và hệ số trầm hiện
phospho sinh học và hóa học.
2. 2 Cấu trúc quần thể vi khuẩn tích lũy polyphosphat
Q trình loại bỏ phospho bằng con đường sinh học tùy thuộc vào sự tăng cường khả
năng của vi sinh vật hấp thu lượng phosphat tự do trong môi trường vào tế bào. Do đó,
q trình này thường cho là q trình làm tăng cường sự loại bỏ phospho sinh học
(EBPR). Quá trình EBPR được ứng dụng trong hầu hết các hệ thống xử lý nước thải.
Mặc dù quá trình EBPR cho thấy loại bỏ phospho hiệu quả, nhưng đôi lúc hoạt động
này bị gián đoạn; nhiều nghiên cứu trong 50 năm qua đã góp phần giải thích hiện
tượng này. Tuy cịn vài khía cạnh chưa được làm sáng tỏ, nhưng các nghiên cứu cũng
đã mang lại nhiều sự hiểu biết quan trọng về con đường trao đổi chất và được áp dụng
vào thực tiển. Về mặt cơ bản, con đường trao đổi chất kỵ khí - hiếu khí và xác định vi
sinh vật có vai trị cho q trình EBPR là rất quan trọng. Về mặt thực tiển, sự áp dụng
đồng thời 2 quá trình: loại bỏ nitơ và phospho với nồng độ oxy hịa tan thấp thì rất có ý
nghĩa, sẽ làm giảm đáng kể chi phí xử lý. Phương pháp xử lý bằng sinh học có thể làm
giảm nồng độ phospho trong nước xuống dưới 0,5 mg/l.
Trải qua nhiều thập niên ứng dụng quá trình EBPR để xử lý nước thải, mặc dù chúng
thể hiện tính hiệu quả về mặt kinh tế và thân thiện với môi trường, nhưng đôi lúc q
trình này biểu lộ tính khơng ổn định và q trình loại bỏ P khỏi nước thải đơi khi thất
bại (Neethling et al., 2005). Chính vì thế tìm hiểu rõ poly-P được tích lũy bởi nhóm vi
sinh vật nào, chúng tích lũy để làm gì và tích lũy như thế nào có vai trị quan trọng để
cung cấp cơ sở cho thiết kế, vận hành và khắc phục các sự cố không mong muốn xảy
ra trong các hệ thống xử lý nước thải.
Từ nghiên cứu phân lập đầu tiên của Fuhs và Chen (1975) cho rằng các loài vi khuẩn

thuộc giống Acinetobacter được xác định như là PAOs. Vào những năm 1980, nhiều
báo cáo cũng cho rằng sự đa dạng lồi trong giống Acinetobacter trong bùn hoạt tính
của các hệ thống xử lý (Stephenson, 1987). Sau đó, Acinetobacter được xem là nhóm
7


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

vi khuẩn có vai trị chính trong q trình EBPR (Auling et al., 1991; Carr et al., 2001;
Ohtake et al., 1985; Tandoi et al., 1998; Bark et al., 1992; Boswell et al., 2001; Sidat et
al., 1999), nhiều nghiên cứu về các kiểu trao đổi chất phản ánh các đặc tính trao đổi
chất của PAOs tập trung vào nhóm vi khuẩn này (Wentzel et al., 1986; Wentzel, 1991).
Trong các loài thuộc giống Acinetobacter, A. Johnsonii cho thấy có khả năng tích lũy
lượng lớn poly-P và được xem là loài vi khuẩn kiểu mẫu cho nghiên cứu về quá trình
trao đổi năng lượng, các enzyme chuyển hóa poly-P và q trình vận chuyển các hoạt
chất qua màng tế bào (van Veen et al., 1994). Những năm gần đây, các kỹ thuật sinh
học phân tử được sử dụng để mô tả cấu trúc quần thể của PAOs dựa trên mối quan hệ
phát sinh loài. Áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong việc xác định quần thể của
PAOs cho thấy vi khuẩn trong bùn hoạt tính của các hệ thống xử lý nước thải rất đa
dạng bao gồm các lớp Proteobacteria (α, β và ɣ), Gram positive với hàm lượng G+C
cao (Actinobacteria), Planctomycetes và Bacteroides (Crocetti et al., 2000; Ahn et al.,
2007; Bond et al., 1995; Bond et al., 1999; Kong et al., 2005; Liu et al., 2001; Gloess
et al., 2008; Tamaki et al., 2005). Bên cạnh đó, thường có sự khác nhau về thành phần
các nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong các hệ thống xử lý khác nhau. Sự thể hiện thành
phần và tính chất của từng loại nước thải mà có sự khác biệt trong thành phần của
PAOs (Beer et al., 2006; Wong et al., 2005; Crocetti et al., 2000). Trong lớp
Actinobacteria các vi khuẩn được xem là PAOs như Arthrobacter sp. (Shoda et al.,
1980), Mycobacterium sp. (McMahon et al., 2002), Gordonia sp. (Beer et al., 2006).

Nguyen et al., (2011) sử dụng kỹ thuật dò mẫu gen kết hợp khuếch đại và giải trình tự
đoạn 16S rRNA bằng cặp mồi (27F và 1492R) của nhóm vi khuẩn Actinobacteria
trong các hệ thống EBPR phát hiện giống Tetrasphaera thuộc họ Intrasporangiaceae
chiếm khoảng 30% trên tổng số vi khuẩn quan sát và có các kiểu hình khác nhau. Khả
năng hấp thu orthophosphate và hình thành poly-P xảy ra ở hầu hết các dòng
Tetrasphaera. Khả năng hấp thu orthophosphate dưới điều kiện hiếu khí chỉ xảy ra khi
chúng hấp thu nguồn carbon dưới điều kiện kỵ khí. Nguồn carbon rất đa dạng như acid
amin, glucose và acetate. Chúng có hình dạng rất khác nhau như hình que ngắn, que
chia nhánh, hình cầu, hình sợi.
Ivanov et al., (2005) phân tích vi khuẩn loại bỏ phosphate dựa trên khuếch đại và giải
trình tự 16S rRNA bằng cặp mồi 27F và 1492R cho thấy Stenotrophomonas
8


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

maltophilia LMG 10989 có khả năng loại bỏ phosphate cao vừa là giảm hàm lượng Fe
với tỉ lệ 0,17 g P/g Fe2+.
Hesselmann et al., (1999) đặt tên nhóm vi sinh vật tích lũy Poly-P là Candidatus
accumulibacter phosphatis hay accumulibacter. Chúng được xem là nhóm có liên quan
trực tiếp đến Rhodocyclus. Các nghiên cứu sau đó cũng chứng tỏ Accumulibacter rất
phổ biến (Oehmen et al., 2007). Trong một số nơi Accumulibacter chiếm khoảng 90%
trong bùn hoạt tính có khả năng loại bỏ phosphat cao. Sau đó, một số nghiên cứu cũng
cho biết, khơng chỉ có Accumulibacter chứa hạt Poly-P (poly-P) và một vài nhóm vi
khuẩn khác cũng có như Actinobacter (Wong et al., 2005).
Nakamura et al. (1991, 1995) phân lập Micrococcus NM-1. Chúng tích lũy Poly-P
trong điều kiện hiếu khí và sử dụng chúng như là năng lượng để hấp thu nguồn carbon
trong điều kiện kỵ khí như glucose và casamino acid, không phải là acetate. Ubukata

và Takii (1994) cũng phân lập dòng vi khuẩn tương tự và chứng minh rằng các vi
khuẩn này chỉ thể hiện sự đồng hóa nguồn carbon (PHAs) và tích lũy poly-P vào trong
tế bào khi có sự ln phiên q trình kỵ khí –hiếu khí. Tuy nhiên, chúng không phải là
một trong các vi khuẩn nổi trội trong tiến trình EBPR vì chúng khơng chuyển hóa
acetate tới PHAs dưới điều kiện kỵ khí. Gần đây, việc áp dụng các kỹ thuật sinh học
phân tử như FISH (Fluorescence in situ hydridization) (Wagner et al., 1994 ; Kampfer et
al., 1996 ; Liu, 1995) cho thấy có ít nhất ba nhóm vi khuẩn có vai trị quan trọng trong
q trình EBPR với hình dạng khác nhau.
Auling et al., (1991) sử dụng phương pháp DAP để phân tích quần thể vi sinh vật tích
lũy poly-P trong hệ thống xử lý nước thải. Bên cạnh Acinetobacter cịn có Pseudomonas
sp. và Xanthobacter sp. cũng góp phần quan trọng trong q trình EBPR.
Sidat et al., (1999) phân lập các vi khuẩn tích lũy Poly-P trong bùn hoạt tính cho thấy
có sự đa dạng trong thành phần các chủng vi khuẩn phân lập có khả năng tích lũy
Poly-P. Bên cạnh hai giống Pseudomonas spp. (chiếm 58% trên tổng số vi khuẩn phân
lập được) và Staphylococcus spp. (chiếm 40%), cịn có một số giống cũng có khả năng
tích lũy lượng lớn Poly-P như Acinetobacter calcoaceticus, Enterobacter spp.,
Aeromonas spp., Moraxella spp., Bacillus cereus. Trong đó, Enterobacter spp. và
Pseudomonas spp. tích lũy Poly-P nhiều nhất (> 5,3 x 10-12 mg/tế bào).

9


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Crocetti et al. (2000) đã sử dụng phương pháp FISH để phân tích các vi sinh vật tích lũy
P trong bùn nước thải. Các nhóm vi sinh vật tích lũy P ở mức cao chiếm khoảng 15,1%
trong lượng sinh khối có chứa vi khuẩn coccobacilli. Có hơn 80% vi khuẩn là β -2
Proteobacteria thuộc nhóm coccobacilli là nhóm vi sinh vật PAOs. Nhóm vi khuẩn trội

thứ hai là Actinobacteria. Bên cạnh đó, phương pháp PCR để khuếch đại gen 16S rRNA
của vi khuẩn, những dịng thuộc nhóm β-2 Proteobacteria được giải trình tự. Trong các
dịng này có mức độ tương đồng của Rhodocyclus spp. (94 ÷ 97%) và Propionibacter
pelophilus (95 ÷96%) được nhận diện là các vi khuẩn có khả năng tích lũy Poly-P nhiều
nhất. Ba mẫu dị PAO462, PAO651 và PAO846 cũng được thiết lập để nhận diện PAOs.
Cả ba mẫu dị nhận diện vi khuẩn thuộc nhóm β -proteobacteria.
McMahon et al.(2002) đã phát hiện ra poly-P kinase gense (ppk) từ các vi khuẩn trong
bùn hoạt động quá trình loại bỏ P bằng phương pháp sinh học. Bốn gen mới được tìm
ra, trong đó có hai kiểu gen (kiểu I và II) có mức độ tương đồng về trình tự acid amin
với gen của vi khuẩn Rhydocyclus tenuis (86 ÷ 87%). Hoạt tính của gen ppk này sau
tinh sạch có hoạt tính đặc hiệu có thể so sánh với các gen ppk khác của vi khuẩn tích
lũy Poly-P.
He et al. (2007) sử dụng poly-P kinase 1 gene (ppk1) như là marker di truyền để phân
tích cấu trúc quần thể “Candidatus Accumulibacteria” trong hệ thống EBPR. Sự phát
sinh lồi thơng qua phân tích 16S rRNA và ppk1 có sự tương đồng lớn, sử dụng ppk1
gene như là marker di truyền để phân tích sự phát sinh lồi phát hiện cho thấy có sự đa
dạng như khi phân tích bằng 16S rRNA trong quần thể “Candidatus
Accumulibacteria”.
Bên cạnh sự loại bỏ P hòa tan trong nước bằng con đường hóa học, thì biện pháp sinh
học trở nên phổ biến. Q trình tích tụ và hòa tan P bằng con đường sinh học, đặc biệt là
thơng qua vi khuẩn, có vai trị quan trọng trong sự điều chỉnh hàm lượng P hòa tan trong
nước. Chúng giải phóng P từ bùn đáy ao vào các tầng nước thơng qua q trình phân rã
các hợp chất hữu cơ hoặc các hợp chất vô cơ chứa P (poly-P), bên cạnh đó, P cũng có
thể tích tụ trở lại bùn thơng qua q trình lắng tụ sinh học, kết quả là có thể loại bỏ P hịa
tan trong nước.

10


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

2. 3 Loại bỏ phospho bằng con đường sinh học thông qua quá trình EBPR
Quá trình EBPR liên kết với hai nhóm vi khuẩn: vi khuẩn lên men và vi khuẩn poly-P.
Trong các hệ thống xử lý nươc thải ít nhất phải thiết kế có sự hiện diện của hai bể xử lý,
một bể kỵ khí (vi khuẩn lên men) và một bể hiếu khí, được dùng cho EBPR (Hình 1).
Bể lên men
kỵ khí

Bể hiếu khí

Bể lắng
Nước thải
đầu ra

Nước thải
ở đầu vào

Bùn hoại tính
thải bỏ

Bùn hoại tính
hồn lưu

Hình 1: Hệ thống tăng cường loại bỏ phospho sinh học (van Loosdrecht et al., 1997)
Lên men là quá trình phân hủy vi sinh của hợp chất hữu cơ hịa tan (BOD) mà khơng
cần sử dụng oxi tự do hay nitrat. Hợp chất hữu cơ lên men hay cơ chất tạo ra trong bể
kỵ khí sẽ là các hợp chất hữu cơ mạch ngắn và một loạt các acid béo (Bảng 3).
Bảng 3: Acid béo hịa tan được hình thành trong bể kỵ khí

Acid béo

Thành phần hóa học

Formate

HCOOH

Acetate

CH3COOH

Propionate

CH3CH2COOH

Butyrate

CH3CH2CH2COOH

Acid Valeric

CH3CH2CH2CH2COOH

Acid Caproic

CH3CH2CH2CH2CH2CH2COOH

Trong bể kỵ khí, vi khuẩn poly-P hấp thu acid béo và tích trữ chúng dạng như là một
loại tinh bột khó tan (poly-β-hydroxyalkanoates hay PHAs) (Bảng 4). PHAs trong vi

khuẩn poly-P giữ hai chức năng. Đầu tiên, nó giúp vi khuẩn phát triển và tái cấu trúc
polyphosphat bằng cách hấp thu nhiều phosphat hòa tan. Thứ hai, PHAs cùng với

11


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

polyphosphat giúp vi khuẩn poly-P sống sót trong điều kiện mơi trường thiếu nguồn
carbon.
Bảng 4: Cấu trúc phân tử các đơn vị cấu tạo nên poly-β-hydroxyalkanoates

Đa phân-tử hóa các acid béo địi hỏi phải có một nguồn năng lượng tổng hợp. Năng
lượng này được hình thành từ sự phân hủy poly-P nội bào tạo ATP và orthophosphat.
Kết quả của quá trình phân hủy là làm phóng thích orthophosphat nội bào ra trong bể
kỵ khí làm gia tăng tạm thời hàm lượng orthophosphat trong nước thải đầu vào.
Chú thích
Pha kỵ khí

- HAc: Hydroxy-acetate
- Gly: glycogen
- PP: poly-P
- PHB: poly-hydroxybutyrate

Pha hiếu khí

- ATP: Adenosine triphosphate
- NADH: Nicotinamide adenine

dinucleotide

Tế tào tăng trưởng

- Pi: phosphate

Hình 2: Các đặc điểm sinh hóa chính trong q trình EBPR. Sự chuyển đổi kiểu
trao đổi chất xảy ra dưới điều kiện kỵ khí và hiếu khí (van Loosdrecht et al., 1997)
Trong bể hiếu khí vi khuẩn poly-P sử dụng oxi tự do để phân hủy PHAs nội bào như là
một nguồn carbon và nguồn năng lượng cho tế bào tăng trưởng và phát triển. Vi khuẩn
12


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

poly-P hấp thu orthophosphat để tích trữ năng lượng phóng thích từ sự phân hủy
PHAs. Bên cạnh đó, vi khuẩn poly-P nhận khá nhiều năng lượng để hấp thu không chỉ
phospho vừa phóng thích mà cịn sử dụng hấp thu một lượng lớn phospho trong môi
trường. Phospho vừa được hấp thu được đồng hóa thành các đại phân tử và tích trữ
như các hạt poly-P hay volutin. Sự loại bỏ phospho được thực hiện khi bùn hoạt tính
chứa vi khuẩn đi vào bể lắng. Một phần chất thải được hồi lưu trở lại bể kỵ khí ở đó
q trình EBPR được lặp lại. Với sự hiện diện luân phiên giữa điều kiện kỵ khí và hiếu
khí, vi khuẩn tích lũy poly-P được ưu tiên hấp thu phospho dư thừa cho nhu cầu sinh
tổng hợp tế bào.
Quá trình EBPR được biết đến như sự biến đổi theo chu trình của các chất tích lũy nội
bào như poly-P, poly-β-hydroxyalkanoates (PHAs) và glycogen. Trong điều kiện kỵ khí,
poly-P nội bào bị thủy phân tạo năng lượng ATP cho quá trình hấp thu các chất hữu cơ
như các axid béo mạch ngắn (short chain fatty acids - SCFAs) và thơng qua q trình đó

phosphate phóng thích ra mơi trường. SCFAs được chuyển hóa thành PHAs. Ngược lại,
dưới điều kiện hiếu khí, PHAs bị oxy hóa và phosphat được hấp thu vào trong tế bào trở
lại và đồng hóa thành poly-P. Song song với q trình này thì glycogen được tái tổng
hợp và tế bào sẽ tăng trưởng và phát triển (Hình 2).

13


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3. 1 Phương tiện nghiên cứu
3. 1. 1 Thiết bị, dụng cụ
Đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, que gạt thủy tinh, bình tam giác, lam, lamen, ống tuýp
thực hiện phản ứng PCR, bọc nylon, ống eppendoft.
Tủ cấy vi sinh vật (Pháp), Tủ ủ vi sinh vật (Đức).
Tủ ủ vi sinh vật.
pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ).
Nồi khử trùng.
Cân điện tử Sartorius (Đức).
Tủ lạnh trữ mẫu.
Tủ sấy.
Bình hút ẩm.
Bộ micropipette Gibson P10, P20, P50, P200, P1000 (Đức).
Nồi khử trùng nhiệt ướt.
Lị vi sóng Panasonic (Thái Lan).
Kính hiển vi Olympus CHT (Nhật).
Máy li tâm Eppendorf (Đức).

Máy sấy chân không Concentrator (Đức).
Bộ điện di một chiều BioRad.
Máy đọc và chụp hình gel Bio-Rad Universal Hood II (Hoa Kỳ)
Máy PCR Perkin Elmer 9700 (Hoa Kỳ).
Máy JEOL-1400 TEM (Nhật).

Máy vortex IKA (Hoa Kỳ).
Dụng cụ đổ gel.
14


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Máy đo OD Beckman Coulter DU 640B (Đức).
3. 1. 2 Nguyên vật liệu
Môi trường nhân sinh khối (Lin-lin et al., 2007): Acetate (5 g/l), MgSO 4.7H2O (90
mg/l), NH4Cl (100,8 mg/l), KH2PO4 (17,55 mg/l), KCl (72 mg/l), CaCl 2 (14 mg/l),
pepton (0,5 g/l), yeast extract (0,5 g/l); dung dịch khoáng vi lượng (1 ml/l) (Smolders
et al., 1994) bao gồm: FeCl3. 6H2O (1,5 g/l), H3BO3 (0,15 g/l), CuSO4. 5H2O (0,03 g/l),
KI (0,18 g/l), MnCl2. 4H2O (0,12 g/l), Na2MoO4. 2H2O (0,06 g/l), ZnSO4. 7H2O (0,12
g/l), CoCl2. 6H2O (0,15 g/l), EDTA (10 g/l); pH 7.0.
Môi trường tổng hợp kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphat (Filipe et al., 2001): Acetate
(211,42 g/l), MgSO4.7H2O (90 mg/l), NH4Cl (100,8 mg/l), KH2PO4 (54,8 mg/l), KCl
(72 mg/l), CaCl2 (14 mg/l), pepton (0,5 g/l), yeast extract (0,5 g/l); dung dịch khoáng
vi lượng (1 ml/l) (Smolders et al., 1994); pH 7.0.
Nguồn vi khuẩn: Các dịng vi khuẩn tích lũy poly-P sử dụng trong thí nghiệm được
tuyển chọn từ 20 dịng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra (Khoi và Diep, 2013)
và chất thải trại chăn nuôi heo (Lê Quang Khôi và Cao Ngọc Điệp, 2013) ở các tỉnh

Đồng Bằng Sông Cửu Long. Sau khi kiểm tra khả năng xử lý phosphat trong mơi
trường tổng hợp, 5 dịng vi khuẩn tích lũy poly-P được tuyển chọn để bố trí thí
nghiệm. Trong 5 dịng; có 4 dịng (TGT013L, BTT006L, TGH006L và VLH013L) đã
được định danh có quan hệ gần gũi với các dòng vi khuẩn trên ngân hàng gen tương
ứng

với

Acinetobacter

radioresistens

(99%),

Bacillus

aryabhattai

(98%),

Corynebacterium sp. (98%) và Bacillus subtilis (98%); 01 dòng được phân lập từ ao
nuôi cá tra ở Tiền Giang chưa định danh có ký hiệu là TGT025L. Năm dịng vi khuẩn
này được sử dụng trong thí nghiệm.
3. 2 Phương pháp nghiên cứu
3. 2. 1 Phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P
Dịng TGT025L được phân lập theo phương pháp phân lập vi khuẩn tích lũy
polyphosphat (Khoi và Diep, 2013).
3. 2. 2 Chụp kính hiển vi điện tử truyền quét (Transmission Electron Microscopy)
Quan sát sự hiện diện của các hạt poly-P nội bào thông qua chụp TEM. Chụp TEM được
thực hiện theo Boswell et al., (2001). Dịch huyền phù tế bào ly tâm ở 10000 rpm, 5 phút

15


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

ở 15oC. Cặn tế bào rửa với nước cất vô trùng, ly tâm với chế độ như trên thu lấy tế
bào. Sinh khối tế bào được cố định bằng dung dịch glutaraldehyde (v/v) 1.5% (SigmaAlorich) ở 10oC trong 2 giờ, sau đó ly tâm thu tế bào. Tế bào tiếp tục được cố định
bằng dung dịch osmium tetroxide (v/v) 1% (Sigma-Alorich) trong 4 giờ ở 10 oC, sau đó
ly tâm thu tế bào. Sinh khối tế bào được loại bỏ nước bằng ethanol (v/v) theo trình tự
nồng độ 70%, 90%, 100% trong 10 phút cho mỗi nồng độ khác nhau. Sinh khối tế bào
sau khi loại bỏ nước được bọc trong nhựa epoxy (Epon 812 epoxy resin). Hỗn hợp
nhựa bọc tế bào được polymer hóa ở 60oC trong 16 giờ. Khối nhựa chứa tế bào được
cắt lớp mỏng 70 nm bằng dao cắt kim cương dưới máy Ultramicrotone (Powertome XRMC, Boeckeler). Lớp cắt 70 nm chuyển lên bề mặt lưới đồng và nhuộm với 1%
(w/v) Methyl Blue solution (pH 3,0) trong 70 % ethanol (Bond et al., 1999) trong 20
giây. Sau đó rửa nhẹ nhàng bằng nước và sấy khơ 60 oC trong 3 giờ. Mẫu được xem
dưới kính hiển vi điện tử JEOL-1400 TEM (điện thế gia tốc 100 kV) tại trường Đại
học Bách Khoa TP. Hồ Chí Minh.
3. 2. 3 Nhận diện gen poly-phosphate kinase 1 (ppk 1): Cặp mồi đặc hiệu nhận
diện gen ppk 1 theo He và McMahon, (2011)
Bảng 5: Cặp mồi đặc hiệu nhận diện gen ppk 1
Gen

Ký hiệu

Chiều dài Vị trí bắt
gen (bp)
cặp

Trình tự
cặp mồi (5’-3’)

Chiều dài đoạn DNA
khuếch đại (bp)

GACGAAGAAGCGG
Poly-phosphate
kinase 1, dạng IA

ppk 1IA

79-96

TCAAG

469-486

AACGGTCATCTTGA

1437

408
TGGC
AGTTCAATCTCACC

Poly-phosphate
kinase 1, dạng IIA

ppk 1IIA

893-912

GAGAGC

980-997

GGAACTTCAGGTC

2121

105
GTTGC

Cặp mồi [(5’-GACGAAGAAGCGGTCAAG-3’; 5’-AACGGTCATCTTGATGGC-3’)
và 5’-AGTTCAATCTCACCGAGAGC-3’; 5’-GGAACTTCAGGTCGTTGC-3’) (He
và McMahon, 2011)] được sử dụng khuếch đại gen ppk 1. Phản ứng PCR thực hiện
trong 25 μl bao gồm: 100 ng DNA, 1X dung dịch đệm PCR, 2 mM MgCl 2, 0,2 mM
DNTP mỗi loại, 0,2 μm mỗi cặp mồi xuôi và ngược và 1U Taq polymerase. Sau giai
16


Chuyên đề nghiên cứu sinh

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

đoạn biến tính ban đầu 95oC trong 1 phút, PCR thực hiện trong 40 chu kỳ với chu kỳ
nhiệt (biến tính 95oC trong 0,45 phút, bắt cặp 61oC trong 1 phút, kéo dài 72oC trong 2
phút), 10 phút 72oC sau cùng để hoàn thiện sản phẩm PCR. Sản phẩm PCR được điện
di trên gel agarose 1,2% trong 1X đệm TAE có bổ sung ethidium bromide ở 90V, 1,5

giờ. Gel được quan sát và chụp hình dưới máy Bio-Rad Universal HoodII.
3. 2. 4 Định danh dịng TGT025L
Ly trích DNA thực hiện theo Carr et al., (2001). Cặp mồi 27F và 1492R (Lane et al.,
1991) được sử dụng khuếch đại 16S rRNA. Phản ứng PCR thực hiện theo Ivanov et al.,
(2005) trong 25 μl bao gồm: 100 ng DNA, 1X dung dịch đệm PCR, 2 mM MgCl 2, 0,2
mM DNTP mỗi loại, 0,2 μm mỗi cặp mồi xuôi và ngược và 1U Taq polymerase. Sau
giai đoạn biến tính ban đầu 95oC trong 1 phút, PCR thực hiện trong 30 chu kỳ với chu
kỳ nhiệt (biến tính 95oC trong 1 phút, bắt cặp 57 oC trong 0,45 phút, kéo dài 72 oC trong
1,5 phút), 7 phút 72oC sau cùng để hoàn thiện sản phẩm PCR. Sản phẩm PCR được
điện di trên gel agarose 1.2% trong 1X đệm TAE có bổ sung ethidium bromide ở 90V,
1,5 giờ. Gel được quan sát và chụp hình dưới máy Bio-Rad Universal HoodII. Sản
phẩm PCR được tinh sạch với bộ kít Qiagen PCR. Trình tự 16S rRNA được xác định
thông qua phản ứng dideoxy chain termination chemistry dưới máy giải trình tự tự
động ABI 310A (Applied Biosystems, USA). Sử dụng BLASTN để tìm sự tương đồng
giữa trình 16S rRNA của dịng vi khuẩn phân lập với trình tự 16S rRNA trên GenBank.
Các trình tự 16S rRNA của dịng vi khuẩn phân lập cũng như các trình tự 16S rRNA thu
nhận từ GenBank được so sánh cặp với nhau (multi-aligned) bằng CLUSTALW 1.6. Cây
phát sinh loài được xây dựng dựa trên sự khoảng cách tiến hóa bằng phần mềm phân tích
MEGA5 (Molecular Evolutionary Gentics Analysis, Tamura et al., 2011). Định danh loài
vi khuẩn phân lập dựa trên loài gần nhất trên cây phát sinh lồi.
3. 2. 5 Thí nghiệm kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphat trong môi trường tổng hợp
Các dòng vi khuẩn TGT013L, BTT006L, TGH006L, VLH013L và TGT025L được nhân
sinh khối trong mơi trường có hàm lượng thấp phosphat và hàm lượng acetat cao (môi
trường nhân sinh khối có hàm lượng KH2PO4 17,55 mg/l, tương đương lượng phospho
khoảng 4 mg/l). Mục đích là để vi khuẩn phân giải poly-P nội bào cung cấp nguồn
phospho cần thiết cho chúng phát triển trong quá trình tăng sinh (Lin-lin et al., 2007).
Thơng qua q trình này sẽ làm cho vi khuẩn cạn kiệt về hàm lượng poly-P nội bào và
17