Thiết kế quy trình phân tích alpha lipoic acid trong một số thực phẩm chức năng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
---------------

BÙI MINH ĐỨC

THIẾT KẾ

QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ALPHA LIPOIC ACID
TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ
KỸ THUẬT HÓA HỌC

Đà Nẵng 2019


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
---------------

BÙI MINH ĐỨC

THIẾT KẾ

QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ALPHA LIPOIC ACID
TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

Chuyên ngành : Kỹ thuật hóa học

Mã số : 8520301

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Diệu Hằng

Đà Nẵng 2019


LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian học tập nghiên cứu và tổ chức thí nghiệm dưới sự hướng dẫn của
PGS.TS. Nguyễn Thị Diệu Hằng.
Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến:
PGS.TS. Nguyễn Thị Diệu Hằng, Phó trưởng phịng Đào tạo Trường Đại học
Bách Khoa Đà Nẵng đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý cho tơi những kiến thức
q báu và chỉ ra những thiếu xót để tơi có thể hồn thành luận văn này.
Các thầy cơ giảng viên khoa Hóa, phịng Đào tạo Trường Đại học Bách Khoa
Đà Nẵng đã tham gia giảng dạy, hổ trợ những kiến thức nền, góp ý phản biện bảo vệ
đề tài này.
Viện An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc gia đã tổ chức đánh giá so sánh liên
phòng giúp đề tài nghiên cứu có độ chính xác và tin cậy cao hơn.
Trung Tâm Kiểm Nghiệm Thuốc, Mỹ Phẩm, Thực Phẩm Quảng Ngãi và
các anh chị trong Khoa Mỹ Phẩm – Thực phẩm đã giúp đỡ, hỗ trợ chia sẻ những
khó khăn với tôi trong công việc.
Và cuối cùng tôi xin chúc các quý thầy cô và các tổ chức; cá nhân ở trên lời
chúc sức khỏe và thành công.


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn

của PGS.TS. Nguyễn Thị Diệu Hằng. Các số liệu, kết quả nên trong luận văn là trung
thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Tác giả luận văn

Bùi Minh Đức


TĨM TẮT LUẬN VĂN

THIẾT KẾ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ALPHA LIPOIC ACID TRONG
MỘT SỐ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
Học viên: Bùi Minh Đức

Chuyên Ngành: Kỹ thuật hóa học

Mã số: 8520301 Khóa: 2017-2019 Trường Đại học Bách khoa – ĐHĐN
Tóm tắt - Alpha Lipoic Acid (ALA) là một trong những chất chống oxy hóa hiện diện tự
nhiên trong tất cả các tế bào nhân sơ và sinh vật nhân thực. ALA có chức năng tổng hợp
nội sinh là một trong yếu tố tạo thành cho một số phức hợp enzyme quang trọng trong ty
thể. Do đặc tính chống oxy hóa độc đáo của nó, nó đã được sử dụng trong nhiều bệnh liên
quan đến mất cân bằng oxy hóa và thường có sẵn trên thị trường dưới dạng thực phẩm bổ
sung. Mục đích của cơng việc nghiên cứu hiện tại là xây dựng và tối ưu phương pháp
phân tích để xác định hàm lượng ALA trong thực phẩm bổ sung khác nhau bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Thiết kế quy trình phân tích bao gồm: Điều kiện
sắc ký HPLC; Điều kiện sử lý mẫu; Đánh giá xác nhận giá trị của phương pháp; Thử
nghiệm thành thạo hay so sánh liên phịng; Phân tích mẫu ở địa phương. Tác giả đã tóm
tắt các kết quả đạt được và đưa ra các hướng phát triển tiếp theo.

Từ khóa - Alpha Lipoic Acid (ALA); Đánh giá phương pháp; So sánh liên phòng; Tối ưu
phương pháp; Điều kiện sử lý mẫu.

DESIGN OF ALPHA LIPOIC ACID ANALYSIS PROCESS IN
SUPPLEMENTS FOOD
Abstract - Alpha Lipoic Acid (ALA) is a universal antioxidant present naturally in all
prokaryotic and eukaryotic cells. Endogenously synthesized ALA functions as a cofactor
for several important mitochondrial enzyme complexes. Due to its unique antioxidant
properties, it has been administered in many oxidative stress related diseases and is also
commercially available in the form of supplements food. The aim of the present research
work was to build and optimal analytical method to determine ALA content in various
supplement food using high performance liquid chromatography (HPLC). Analysis
process design includes: HPLC conditions; Sample handling conditions; Selection,
verification and validation of method; Proficiency testing inter-laboratory comparision;
Analyzing samples in the locality. The achieved results are summarized and perspective
of the work is provided.

Key words - Alpha lipoic acid (ALA); verification and validation of method; interlaboratory comparision; optimal analytical method; Sample handling conditions.


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................ 1
2. Mục tiêu nghiên cứu.............................................................................................. 2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu......................................................................... 2
4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................... 2

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................. 2
6. Cấu trúc của luận văn ............................................................................................ 2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 3
1.1. Khái quát về thực phẩm chức năng .......................................................................... 3
1.2. Tổng quan về Alpha Lipoic Acid ............................................................................. 4
1.3. Sản xuất ALA trong công nghiệp ............................................................................. 6
1.4. Tổng quan về sắc ký lỏng HPLC ............................................................................. 6
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ............................................................................................................. 12
2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................. 12
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 14
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN .................................................. 31
3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện đo sắc ký lỏng ...................................................... 31
3.2. Kết quả Khảo sát và tối ưu điều kiện Xử lý mẫu trên modde 5 ............................. 36
3.3. Đánh giá quy trình phân tích ala ............................................................................. 41
3.4. Đánh giá phương pháp bằng so sánh liên phịng .................................................... 54
3.5. Phân tích một số mẫu lấy trên địa bàn .................................................................... 55
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 58
PHỤ LỤC
QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN (Bản sao)


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
ALA

Tiếng Anh hoặc tên khoa học

Tiếng Việt

Alpha-Lipoic Acid

Alpha Lipoic Acid

AOAC

Association of Official Analytical

Hiệp hội những nhà hóa học
phân tích chính thức

HPLC

High Performance Liquid
Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

ISO

International Oranization for
Standardization

Ủy ban tiêu chuẩn thực phẩm

CODEX
BOA

AGL 03

Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế

quốc tế
Bureau of Accreditation
Supplementary requirements for
accreditation in the field of
chemical testing

Văn phịng cơng nhận chất
lượng
u cầu bổ sung để cơng nhận
các phịng thử nghiệm lĩnh vực
hóa.
Trung ương

TW
LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Quantitation

Giới hạn định lượng

ACN

Acetonitril

MeOH

Methanol

DAD
UV-Vis
RSD
SD

Diode Array Detector

Đầu dò Diode Array

Ultraviolet – Visible spectroscopy Quang phổ tử ngoại khả kiến
Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

EURACHEM Analytical Chemistry in Europe

Hiệp hội Phân tích Hóa học
Châu Âu

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

QCVN

Quy chuẩn Việt Nam

KNV
ISO
17025:2017

Kiểm nghiệm viên
Tiêu chuẩn quốc tế qui định các
yêu cầu nhằm đảm bảo năng lực
của phòng thử nghiệm và hiệu
chuẩn


DANH MỤC CÁC BẢNG
Số hiệu

Tên bảng

bảng
2.1.
2.2.

Danh mục các loại cột khảo sát trong quá trình nghiên cứu
Đặc điểm các dung môi làm pha động thường dùng trong sắc

ký pha đảo

Trang
16
17

2.3.

Giá trị α2 phụ thuộc vào k và no

20

3.4.

Kiểm tra lại q trình quy hoạch và tối ưu hóa thực nghiệm

40

3.5.

Bảng kết quả phân tích và độ chệch đường chuẩn

44

3.6.

Bảng kết quả xác định LOD, LOQ

45

3.7.

Kết quả độ lặp lại trên nền mẫu 1

46

3.8.

Kết quả độ lặp lại trên nền mẫu 2

46

3.9.

Kết quả độ lặp lại trên nền mẫu 3

47

3.10.

Kết quả đánh giá độ tái lặp nội bộ nền mẫu 1

48

3.11.

Kết quả đánh giá độ tái lặp nội bộ nền mẫu 2

48

3.12.

Kết quả đánh giá độ tái lặp nội bộ của nền mẫu 3

49

3.13.

Đánh giá độ thu hồi nền mẫu 1

50

3.14.

Đánh giá độ thu hồi trên nền mẫu 2

51

3.15.

Đánh giá độ thu hồi trên nền mẫu 3

51

3.16.

Kết quả đánh giá độ không đảm bảo đo nền mẫu 1

52

3.17.

Kết quả độ không đảm bảo đo nền mẫu 2

53

3.18.

Đánh giá độ không đảm bảo đo trên nền mẫu 3

53

3.19.

Kết quả đánh giá so sánh liên phịng Alpha Lipoic Acid

54

3.20.

Kết quả phân tích ALA trong các mẫu lấy trên địa bàn tỉnh
Quảng Ngãi

55


DANH MỤC CÁC HÌNH
Số hiệu
Tên hình
hình

1.1.
Cơng thức cấu tạo của ALA

Trang
4

1.2.

Một số thực phẩm chức năng có chứa ALA trên thị trường

5

1.3.

Nguyên lý hoạt động của hệ thống HPLC

6

1.4.

Pic của một chất

10

1.5.

Hệ số đối xứng trong sắc ký

10

2.1.

Hệ thống máy HPLC Ultimate 3000

15

2.2.

Giao diện phần mềm Chromeleon của máy HPLC Ultimate
3000

15

2.3.

Phổ UV-VIS của hoạt chất ALA

19

2.4.

Đường chuẩn và phuơng trình hồi quy của một chất

24

2.5.

Xác định LOD, LOQ bằng nhiễu đường nền

26

3.1.

Sắc kí đồ chuẩn ALA khi chạy khảo sát với H3PO4 0,001M

31

3.2.

Sắc kí đồ chuẩn ALA khi chạy khảo sát với H3PO4 0,005M

32

3.3.

Sắc kí đồ chuẩn ALA khi chạy khảo sát với H3PO4 0,01M

32

3.4.

Sắc kí đồ chuẩn ALA khi chạy khảo sát với H3PO4 0,05M

32

3.5.

Sắc kí đồ chuẩn ALA khi chạy khảo sát với H3PO4 0,025M

33

3.6.

Sắc ký đồ chuẩn ALA khi chạy tỉ lệ ACN:H3PO4 (50:50)

33

3.7.

Sắc ký đồ chuẩn ALA khi chạy tỉ lệ ACN:H3PO4 (30:70)

33

3.8.

Sắc kí đồ chuẩn với hệ pha động ACN: 0,025M H3PO4 (40:60)
(v/v)

34

3.9.

Thông số và sắc ký đồ chuẩn ALA 0,1mg/ml ở các bước sóng
khảo sát

34

3.10.

Thông số và sắc ký đồ chuẩn ALA 0,2mg/ml ở các bước sóng

khảo sát

35

3.11.

Thơng số và sắc ký đồ chuẩn ALA 0,3mg/ml ở các bước sóng
khảo sát

35

3.12.

Thơng số và sắc ký đồ chuẩn ALA 0,4mg/ml ở các bước sóng
khảo sát

35

3.13.

Thơng số và sắc ký đồ chuẩn ALA 0,5mg/ml ở các bước sóng
khảo sát

36

3.14.

Các mức yếu tố cần khảo sát trên Modde 5

37

Số hiệu
hình

Tên hình

Trang

3.15.

Mơ hình ma trận các yếu tố trên Modde 5

37

3.16.

Phương án thí nghiệm và kết quả phân tích mẫu Modde 5

38

3.17.

Tỷ lệ và tương quan của các hệ số hồi quy

38

3.18.

Hệ số và kết quả kiểm tra các hệ số phương trình hồi quy

39

3.19.

Mức độ ảnh hưởng của các yếu tố

39

3.20.

Tối ưu hóa thực nghiệm

40

3.21.

Sắc ký đồ nền mẫu trắng

41

3.22.

Sắc ký đồ nền mẫu chuẩn ALA nồng độ 0,1mg/ml

42

3.23.

Sắc ký đồ nền mẫu 1

42

3.24.

Sắc ký đồ nền mẫu 2

42

3.25.

Sắc ký đồ nền mẫu 3

43

3.26.

Phổ UV-Vis của dung dịch chuẩn và các nền mẫu thử

43

3.27.

Phương trình hồi quy tuyến tính ALA

44

3.28.

Sắc kí đồ ALA ở nồng độ 1,50mg/L

45


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Chất lượng thực phẩm chức năng là một vấn đề cần phải được quan tâm bởi vì
được sử dụng trực tiếp vào trong cơ thể con người. Nếu thực phẩm chức năng giả, kém
chất lượng, khơng đảm bảo nguồn gốc thì có khả năng ảnh hưởng nghiêm trọng đến
sức khỏe con người. Trong khi “Thuốc” có những quy định rất chặt chẽ như cần phải
ghi rõ nguyên liệu, công dụng và luật định, sự chuyển hóa trong cơ thể, đào thải ra sao,
tác dụng phụ, hàm lượng… thì thực phẩm chức năng lại khơng có những u cầu khắt
khe. Do vậy, việc sản xuất thực phẩm chức năng trở nên dễ dàng hơn, nhất là trong
khâu đăng ký sản xuất hay các khâu kiểm định chất lượng.
Trong thời gian qua, việc sản xuất, kinh doanh thực phẩm chức năng không đảm
bảo chất lượng, không rõ nguồn gốc xuất xứ, chưa đăng ký bản công bố với cơ quan
quản lý, đặc biệt kinh doanh qua mạng điện tử có chiều hướng diễn biến phức tạp, ảnh
hưởng đến quyền lợi và sức khỏe người tiêu dùng, gây bức xúc với xã hội.
Ngày 19/06/2018, Thử tướng Chính phủ đã ban hành Chỉ thị số 17/CT-TTg về
việc “Tăng cường đấu tranh chống buôn lậu, gian lận thương mại, sản xuất, kinh
doanh hàng giả, hàng kém chất lượng thuộc nhóm hàng dược phẩm, mỹ phẩm, thực
phẩm chức năng, dược liệu và vị thuốc y học cổ truyển”.
Hiện nay trong thị trường có nhiều loại thực phẩm chức năng có thành phần
chính là Alpha Lipoic Acid (ALA). Tuy nhiên chất lượng của các sản phẩm là vấn đề
cần quan tâm chính vì vậy cần có phương pháp tối ưu để phân tích định lượng hàm
lượng hoạt chất trên trong sản phẩm. Trong đó hầu như các quy trình phân tích chỉ
được tham khảo từ các tiêu chuẩn và các kênh nước ngoài. Các hệ thống TCVN;
QCVN; Dược Điển Việt Nam; Dược Điển Anh… hiện tại chưa thấy có quy trình chính

thức về phân tích chất lượng Alpha Lipoic Acid và chưa tìm ra các bài báo khoa học ở
Việt Nam nói về việc xây dựng quy trình và tối ưu điều kiện chiết xuất phân tích ALA
trong thực phẩm chức năng. Các quy trình phân tích ở Việt nam chỉ là các quy trình
nội bộ cho nên điều kiện phân tích thiết bị hóa chất khác nhau, và chưa được đánh giá
tối ưu theo điều kiện phân tích. Chính vì vậy cần xây dựng và áp dụng các phương
pháp đánh giá và tối ưu để hồn thiện quy trình phân tích này.
Ngồi ra thực trạng nhu cầu về quản lý trên địa bàn tỉnh Quảng Ngãi cần tìm hiểu
về chất lượng các sản phẩm thực phẩm chức năng, đặc biệt là những hoạt chất mới,
những hoạt chất đáng quan tâm và được sử dụng nhiều như ALA.
Với những lý do và các vấn đề thực tiễn trên tôi xin được lựa chọn đề tài “Thiết
kế quy trình phân tích Alpha Lipoic Acid trong một số thực phẩm chức năng”.


2
2. Mục tiêu nghiên cứu
1. Xây dựng và đánh giá được quy trình phân tích ALA trong một số thực phẩm
chức năng, quy trình này phải tối ưu và phân tích được hầu hết các mẫu thực phẩm
chức năng có chứa ALA trên thị trường.
2. Từ quy trình đã xây dựng lập hướng dẫn phương pháp ở cơ quan đơn vị để
phân tích các mẫu nghiên cứu có trên địa bàn.
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Thực phẩm chức năng có chứa ALA trên địa bàn tỉnh Quảng Ngãi.
- Sắc ký lỏng cao áp HPLC.
4. Phƣơng pháp nghiên cứu
- Nghiên cứu lý thuyết.
- Phân tích dữ liệu.
- Xây dựng quy trình.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- Xây dựng và lựa chọn quy trình phân tích, lựa chọn các thơng số và điều kiện
quy trình phân tích.

- Xây dựng và tối ưu được quy trình xử lý mẫu phân tích
- Xây đựng quy trình và đánh giá quy trình phân tích. Sau đó tiến hành thực hiện
phân tích đối chứng về quy trình với các phịng thí nghiệm khác nhau.
- Phân tích một số mẫu đối chứng trên địa bàn.
6. Cấu trúc của luận văn
Cấu trúc luận văn gồm các Chương sau:
- Chương 1: Tổng quan
- Chương 2: Đối tượng, hóa chất, thiết bị và phương pháp nghiên cứu
- Chương 3: Thực nghiệm và thảo luận
- Chương 4: Kết luận


3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Khái quát về thực phẩm chức năng
1.1.1. Định nghĩa về thực phẩm chức năng
Khái niệm thực phẩm chức năng được người Nhật sử dụng đầu tiên trong
những năm 1980 để chỉ những thực phẩm chế biến có chứa những thành phần giúp
nâng cao sức khoẻ cho người sử dụng.
Vào nửa cuối thập niên 1990, Ủy ban Châu Âu xây dựng và thảo luận về khái
niệm thực phẩm chức năng. Tại cuộc họp này góp mặt với nhiều chuyên gia về dinh
dưỡng và các ngành khoa học liên quan khác để đưa ra một khái niệm đồng thuận và
từ đó đã được sử dụng rộng rãi. Theo đó “Thực phẩm chức năng là các sản phẩm có
nguồn gốc tự nhiên hoặc là thực phẩm trong quá trình chế biến được bổ sung thêm các
chất chức năng. Cũng như thực phẩm thuốc, thực phẩm chức năng nằm giữa nơi giao
thoa thực phẩm và thuốc cho nên đôi khi người ta cũng gọi thực phẩm chức năng là
thực phẩm thuốc. Sở dĩ thực phẩm chức năng có khả năng hỗ trợ điều trị bệnh và
phịng ngừa bệnh vì nó có khả năng phục hồi tất cả các cấu trúc tế bào trong cơ thể
đang bị tổn thương”.
Bộ Y tế Việt Nam định nghĩa thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hỗ

trợ chức năng của các bộ phận trong cở thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ
thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ gây bệnh. Tùy theo
công thức, hàm lượng vi chất và hướng dẫn sử dụng, thực phẩm chức năng cịn có các
tên gọi sau: thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng, thực phẩm bổ sung, thực phẩm bảo
vệ sức khỏe, sản phẩm dinh dưỡng y học.
1.1.2. Phân loại thực phẩm chức năng
Thực phẩm chức năng được phân loại như sau [2]:

 Thực phẩm bổ sung (Supplemented Food) là thực phẩm thông thường được bổ
sung vi chất và các yếu tố có lợi cho sức khỏe như vitamin, khoáng chất, acid amin,
acid béo, enzym, probiotic, prebiotic và chất có hoạt tính sinh học khác.
 Thực phẩm bảo vệ sức khỏe (Health Supplement, Food Supplement, Dietary
Supplement) là sản phẩm được chế biến dưới dạng viên nang, viên hoàn, viên nén,
cao, cốm, bột, lỏng và các dạng chế biến khác có chứa một hoặc hỗn hợp của các chất
sau đây:
 Vitamin, khoáng chất, acid amin, acid béo, enzym, probiotic và chất có hoạt
tính sinh học khác.
 Hoạt chất sinh học có nguồn gốc tự nhiên từ động vật, chất khoáng và nguồn
gốc thực vật ở các dạng như chiết xuất, phân lập, cơ đặc và chuyển hóa.


4
 Thực phẩm dinh dưỡng y học còn gọi là thực phẩm dinh dưỡng dùng cho mục
đích y tế đặc biệt (Food for Special Medical Purposes, Medical Food) là loại thực
phẩm có thể ăn bằng đường miệng hoặc bằng ống xông, được chỉ định để điều chỉnh
chế độ ăn của người bệnh và chỉ được sử dụng dưới sự giám sát của nhân viên y tế.
 Thực phẩm dùng cho chế độ ăn đặc biệt (Food for Special Dietary Uses) dùng
cho người ăn kiêng, người già và các đối tượng đặc biệt khác theo quy định của Ủy
ban tiêu chuẩn thực phẩm quốc tế (CODEX) là những thực phẩm được chế biến hoặc
được phối trộn theo công thức đặc biệt nhằm đáp ứng các yêu cầu về chế độ ăn đặc thù

theo thể trạng hoặc theo tình trạng bệnh lý và các rối loạn cụ thể của người sử dụng.
Thành phần của thực phẩm này phải khác biệt rõ rệt với thành phần của những thực
phẩm thông thường cùng bản chất, nếu có.

1.1.3. Yêu cầu kiểm nghiệm của thực phẩm chức năng [2]
Việc lấy mẫu kiểm nghiệm định kỳ được thực hiện bởi tổ chức, cá nhân hoặc tổ
chức, cá nhân chủ động mời cơ quan có thẩm quyền thực hiện.
Các chỉ tiêu để kiểm nghiệm định kỳ là các chỉ tiêu chất lượng chủ yếu đã công
bố trong bản thông tin chi tiết về sản phẩm hoặc trên nhãn sản phẩm đang lưu hành;
một số chỉ tiêu hóa lý, vi sinh vật đã công bố trong bản thông tin chi tiết về sản phẩm
hoặc theo quy định của pháp luật.
Các hoạt chất có tác dụng chính tạo nên cơng dụng của sản phẩm, mà các đơn
vị kiểm nghiệm trong nước thực hiện kiểm nghiệm được thì phải định lượng hoạt chất
chính đó trong sản phẩm.
Hoạt chất chính mà các đơn vị kiểm nghiệm trong nước chưa có phương pháp
thử, mẫu chuẩn để kiểm nghiệm định lượng được thì yêu cầu cơng bố hàm lượng thành
phần có chứa hoạt chất chính trong hồ sơ cơng bố.
1.2. Tổng quan về Alpha Lipoic Acid
1.2.1. Cấu tạo và tính chất lý hóa
Alpha Lipoic Acid (ALA) có tên hóa học là 1,2-dithiolane-3-pentanoic acid.
Một số tên khác của ALA: 1,2-dithiolane-3-valeric acid; acetate-replacing
factor; iletan; 5-(1,2dithiolan-3-yl) valeric acid; 6,8-dithiooctanoic acid; Heparlipon;
lipoic acid; Liposan; Lipothion; protogenA; pyruvate oxidation factor; Thioctacid;
thioctic acid; 6,8-thioctic acid; 6-thioctic acid; thioctidase; thiooctanoic acid; Tioctan.
O

OH

S

S

Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của ALA


5
Một số tính chất vật lý của ALA [10]:
 Cơng thức phân tử: C8H14O2S2
 Khối lượng phân tử: 206,33g/mol
 Mô tả: là dạng bột màu vàng
 Điểm nóng chảy: 60-61oC
 Điểm sơi: 160-165 oC
 Độ hịa tan: Khơng tan trong nước, hịa tan trong dung mơi chất béo.
1.2.2. Cơng dụng đối với sức khỏe
ALA là một chất tự nhiên được tổng hợp trong ty thể của tế bào, đóng vai trò là
coenzyme cho hai loại enzyme:
 Pyruvate Dehydrogenase
 Ketoglutarate -Dehydrogenase.
ALA được sử dụng trong cơ thể để phá vỡ carbonhydrate và tạo năng lượng cho
các cơ quan khác trong cơ thể. ALA được tế bào cơ thể người sản xuất ra nhưng với
nồng độ thấp và lượng giảm dần theo tuổi. Khi được cung cấp đủ nhu cầu cần thiết cơ
thể sẽ khỏe mạnh và trẻ đẹp.
ALA là một chất chống oxy hóa mạnh đã được sử dụng rộng rãi trong các chế
phẩm thực phẩm chức năng:
 Kích thích tổng hợp glutathione
 Tăng cường tác dụng của các chất chống oxy hóa khác (ví dụ: Vitamin C và E)
 Tăng cường hoạt động insulin
 Giảm sơ hóa niêm mạc
 Ngăn ngừa và điều trị hóa trị gây ra tác dụng phụ, chẳng hạn như bệnh thần
kinh ngoại biên. Hơn nữa, có một số báo cáo về ALA đang được sử dụng như một tác

nhân có đặc tính chống ung thư.
Hiện nay trên thị trường có các loại thực phẩm chức năng có chứa ALA thường
được bào chế dưới dạng thuốc có hàm lượng dao động từ 50mg đến 600mg/viên và
dạng bào chế thường: Viên nén, viên bao phim, gói bột thuốc, viên nang cứng hay
mềm...

Hình 1.2. Một số thực phẩm chức năng có chứa ALA trên thị trường


6
1.3. Sản xuất ALA trong cơng nghiệp [13]
Acid lipoic có thể được điều chế bằng cách phản ứng:
Acid 6,8-dichlorooctanoic + Natri disulfide.
Trong sản xuất công nghiệp acid-lipoic người ta sử dụng phương pháp chuyển
đổi monomethyl hoặc monoethyl adipate thành acid clorua tương ứng bằng phản ứng
với thionyl clorua. Hỗn hợp này được xử lý bằng ethylene và nhôm clorua khan tạo ra
một hợp chất trung gian sau khi khử được xử lý bằng natri disulfide. Quá trình tạo ra
este dithionooctyl sau đó tạo ra acid-lipoic sau khi thủy phân.
1.4. Tổng quan về sắc ký lỏng HPLC [1]
Sắc ký lỏng là phương pháp tách sắc ký các chất dựa trên sự phân bố khác nhau
của chúng giữa hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là một chất lỏng chảy qua
pha tĩnh chứa trong cột.
Sắc ký lỏng được tiến hành chủ yếu dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố khối
lượng, trao đổi ion, loại trừ theo kích thước hoặc tương tác hóa học lập thể.
Thiết bị bao gồm một hệ thống bơm, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký (bộ phận
điều khiển nhiệt độ có thể được sử dụng nếu cần thiết), detector và một hệ thống thu
dữ liệu (hay một máy tích phân hoặc một máy ghi đồ thị). Pha động được cung cấp từ
một hoặc vài bình chứa và chảy qua cột, thông thường với tốc độ khơng đổi và sau đó
chạy qua detector.

Hình 1.3. Ngun lý hoạt động của hệ thống HPLC


7
1.4.2. Hệ thống bơm
Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng phải giữ cho pha động luôn chảy với một lưu
lượng không đổi. Những biến đổi áp suất sẽ được giảm thiểu, ví dụ cho dung mơi chạy
qua một thiết bị giảm xung. Ống dẫn và hệ thống nối phải là loại chịu được áp suất
sinh ra do hệ thống bơm. Các bơm có thể được lắp với thiết bị loại bỏ bọt khí.
Hệ thống điều khiển bằng bộ vi xử lý có khả năng cung cấp pha động hoặc hằng
định (rửa giải đẳng dòng) hoặc thay đổi tỷ lệ thành phần (rửa giải gradient) theo một
chương trình xác định. Trong trường hợp rửa giải gradient, hệ thống bơm lấy các dung
mơi từ một vài bình chứa và các dung mơi có thể được trộn lẫn ở áp suất thấp hoặc áp
suất cao.
1.4.3. Bộ phận tiêm mẫu
Dung dịch mẫu thử được đưa vào dịng pha động hoặc vào vị trí gần đầu hoặc
đầu cột nhờ một bộ phận tiêm mẫu có khả năng hoạt động ở áp suất cao. Có thể dùng
vịng chứa mẫu thử, có thể tích cố định hoặc thiết bị có thể tích thay đổi, có thể vận
hành bằng tay hoặc tự động. Khi tiêm mẫu bằng tay có thể gây ra sai số do thể tích
tiêm vào vịng chứa mẫu khơng đủ.
1.4.4. Pha tĩnh
Có nhiều loại pha tĩnh có thể được sử dụng trong sắc ký lỏng, bao gồm:
 Silica (silicon dioxide), nhôm oxide hoặc than graphit xốp thường được dùng
trong sắc ký pha thuận mà quá trình phân tách dựa trên sự khác nhau về khả năng hấp
phụ hoặc phân bố khối lượng;
 Nhựa hoặc polymer có chứa các nhóm chức acid hoặc base, sử dụng trong sắc
ký trao đổi ion mà trong đó sự chia tách được thực hiện dựa trên sự cạnh tranh giữa
các ion cần tách và các ion trong pha động;
 Silica xốp hoặc polymer, sử dụng trong sắc ký rây phân tử, ở đó sự chia tách
dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử, tương ứng với sự loại trừ khơng gian;

 Rất nhiều chất mang biến đổi hóa học được chế tạo từ polymer, silica gel hoặc
than graphit xốp được dùng trong sắc ký lỏng pha đảo mà ở đó sự chia tách về nguyên
tắc cơ bản dựa trên sự phân bố phân tử các chất giữa pha động và pha tĩnh;
 Pha tĩnh loại biến đổi hóa học đặc biệt, ví dụ dẫn xuất của celulose hoặc
amylose, protein hoặc peptid, cyclodextrin v.v... dùng để tách các đồng phân đối
quang (sắc ký đối quang).
Phần lớn sự chia tách dựa trên cơ chế phân bố, sử dụng silica biến đổi hóa học
làm pha tĩnh và các dung mơi phân cực làm pha động. Bề mặt của chất mang, ví dụ
như các nhóm silanol của silica được phản ứng với các thuốc thử silan khác nhau tạo
thành các dẫn xuất silyl có liên kết cộng hóa trị, che phủ một số lượng khác nhau các


8
vị trí hoạt động trên bề mặt chất mang. Bản chất của các pha liên kết là tham số quan
trọng để xác định các tính chất tách của hệ sắc ký.
Các pha liên kết dùng phổ biến là:
 Octyl

= Si–(CH2)7–CH3 C8

 Octadecyl

= Si–(CH2)17–CH3 C18

 Phenyl

= Si–(CH2)n–(C6H5) C6H5

 Cyanopropyl

= Si–(CH2)3–CN CN

 Aminopropyl

= Si–(CH2)3–NH2 NH2

 Diol
= Si-(CH2)3-OCH(OH)-CH2-OH
Đặc điểm và yêu cầu của pha tĩnh sắc ký:
 Trừ khi có tiêu chuẩn riêng của nhà sản xuất, thông thường các cột sắc ký pha
đảo dựa trên silica được coi là ổn định đối với pha động có pH từ 2,0 tới 8,0. Cột chứa
than graphit xốp hoặc các hạt vật liệu polymer như styren - divinylbenzen copolymer
ổn định ở một khoảng pH rộng hơn.
 Phân tích sử dụng sắc ký pha thuận với pha tĩnh là silica không bị biến đổi,
than graphit xốp hoặc silica biến đổi hóa học làm cho phân cực (ví dụ cyanopropyl
hoặc diol) và pha động khơng phân cực được sử dụng trong một số trường hợp.
 Đối với sự tách nhằm mục đích phân tích, kích thước hạt của pha tĩnh phổ biến
nhất từ 3 µm đến 10 µm. Các hạt có thể hình cầu hoặc khơng có hình dạng nhất định,
có độ xốp khác nhau và diện tích bề mặt đặc hiệu. Những tham số này cấu thành biểu
hiện sắc ký của từng pha tĩnh cụ thể. Trong trường hợp pha đảo, các yếu tố bổ sung
như bản chất của pha tĩnh, mức độ liên kết, ví dụ như độ dài mạch carbon liên kết,
hoặc các nhóm hoạt động bề mặt của pha tĩnh có được che phủ hết hay không. Sự kéo
đuôi pic, đặc biệt của các chất base, có thể xảy ra khi có mặt các nhóm silanol bề mặt
của silica.
 Cột được làm bằng thép khơng gỉ trừ khi có chỉ dẫn khác trong chun luận
riêng, có chiều dài và đường kính trong ( ) khác nhau được sử dụng cho phân tích sắc
ký. Cột với đường kính trong nhỏ hơn 2 mm thường được coi là vi cột. Nhiệt độ của
pha động và cột phải được giữ ổn định trong suốt thời gian phân tích. Phần lớn q
trình tách được thực hiện ở nhiệt độ phịng, nhưng cột có thể được làm nóng nhằm thu
được hiệu quả cao hơn. Tuy nhiên, nhiệt độ cột cũng khơng được phép vượt q 60°C

vì khả năng phân hủy của pha tĩnh hoặc sự thay đổi thành phần của pha động có thể
xảy ra.

1.4.5. Pha động
Đối với sắc ký pha thuận, thường sử dụng dung mơi ít phân cực. Sự có mặt của


9
nước trong pha động phải được hạn chế và kiểm tra chặt chẽ nhằm thu được kết quả tái
lặp lại. Đối với sắc ký lỏng pha đảo, sử dụng pha động chứa nước, có hoặc khơng có
dung mơi hữu cơ.
Các thành phần của pha động thường được lọc nhằm loại bỏ các tiểu phân lớn
hơn 0,45 m. Pha động chứa nhiều thành phần được chuẩn bị bằng cách đong các thể
tích qui định (trừ khi có chỉ định về khối lượng) của các thành phần riêng lẻ rồi sau đó
trộn lẫn với nhau. Ngồi ra, dung mơi cũng có thể được cấp qua các bơm riêng lẻ, điều
khiển bằng các van chia tỷ lệ, để có thể trộn lẫn theo các tỷ lệ mong muốn. Dung mơi
thường được loại khí trước khi bơm bằng cách sục khí Heli, lắc siêu âm hoặc sử dụng
hệ thống lọc màng lọc/chân không trực tuyến nhằm tránh sự tạo bọt khí trong cốc đo
của detector.
Dung môi dùng để chuẩn bị pha động thường không được chứa các chất làm ổn
định và phải trong suốt (khơng hấp thụ quang) ở vùng bước sóng phát hiện, nếu như sử
dụng detector tử ngoại. Dung môi và những thành phần khác được dùng phải có chất
lượng phù hợp. Khi cần điều chỉnh pH chỉ thực hiện với thành phần nước của pha
động mà không điều chỉnh với hỗn hợp. Nếu sử dụng dung dịch đệm, cần phải rửa hệ
thống bằng hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ (5 % v/v) nhằm ngăn chặn sự kết tinh
muối sau khi kết thúc q trình sắc ký.
Pha động có thể chứa những thành phần khác, ví dụ một ion trái dấu trong sắc
ký tạo cặp ion hoặc một chất chọn lọc đối quang trong trường hợp sắc ký sử dụng pha
tĩnh không chọn lọc đối quang.
1.4.6. Detector

Detector hấp thụ tử ngoại/khả kiến gồm cả detector chuỗi diod là được sử dụng
phổ biến nhất. Detector huỳnh quang, detector khúc xạ vi sai, detector điện hóa,
detector khối phổ, detector tán xạ ánh sáng bay hơi, detector phóng xạ hoặc các loại
detector đặc biệt khác cũng có thể được sử dụng
1.4.7. Các thơng số trong sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.4.7.1. Sắc đồ
Sắc đồ (hay sắc ký đồ) là một đồ thị hay một cách trình bày khác mơ tả sự thay
đổi của đáp ứng của detector (hay nồng độ của chất hay một đại lượng khác dùng làm
thước đo nồng độ của chất) theo thời gian, thể tích hay khoảng cách. Một sắc đồ lý
tưởng có dạng một chuỗi các pic kiểu Gauss trên một đường nền.
1.4.7.2. Thời gian lưu và thể tích lưu
Trong sắc ký rửa giải, sự lưu giữ của một chất có thể được biết dưới dạng thời
gian lưu tR. Thời gian lưu được xác định trực tiếp trên sắc đồ bởi vị trí của đỉnh pic. Từ
thời gian lưu có thể tính được thể tích lưu VR dựa trên công thức:


10
VR  υ  t R

Trong đó:
tR (thời gian lưu) là khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến đường
thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic của chất;
v (tốc độ dòng) là lưu lượng của dòng pha động.
1.4.7.3. Pic sắc ký
Pic của một chất có thể được xác định bởi diện tích pic (A), hay chiều cao pic
(h), và chiều rộng của pic ở nửa chiều cao (wh) hoặc chiều cao pic (h) và chiều rộng
pic ở điểm uốn (wi). Với các pic dạng Gauss ta có hệ thức:
wh = 1,18 wi

Hình 1.4. Pic của một chất

1.4.7.4. Hệ số đối xứng
Hệ số đối xứng (As) (hay hệ số kéo đi) của một pic được tính theo cơng thức:
AS 

w 0,05
2d

Trong đó:
w 0,05 là chiều rộng của pic ở 1/20 chiều cao của pic;
d là khoảng cách từ đường thẳng đứng đi qua đỉnh pic đến cạnh phía trước của
pic ở 1/20 chiều cao của pic.
Khi As = 1,0 thì pic hồn tồn đối xứng (lý tưởng).

Hình 1.5. Hệ số đối xứng trong sắc ký


11
1.4.7.5. Hiệu năng của cột và số đĩa lý thuyết biểu kiến
Tùy theo kỹ thuật được sử dụng, dựa trên các dữ liệu thu được trong điều kiện
đẳng nhiệt, đẳng dòng hay đẳng mật độ, hiệu năng của cột (hay hiệu lực biểu kiến của
cột), biểu thị dưới dạng số đĩa lý thuyết biểu kiến (N), có thể tính được theo cơng thức
dưới đây:
 t
N  5,54 R
 wh





2

Trong đó:
tR là thời gian lưu hay thể tích lưu hay khoảng cách trên đường nền từ điểm
tiêm mẫu đến đường thẳng góc kẻ qua đỉnh pic tương ứng với chất;
wh là chiều rộng của pic ở nửa chiều cao pic tính theo cùng đơn vị đo tR (thời gian,
thể tích hay khoảng cách).
Số đĩa lý thuyết biểu kiến thay đổi theo chất, theo cột cũng như theo thời gian
lưu.


12
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu và đặc điểm của đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là các mẫu thực phẩm chức năng bao gồm: các nền mẫu
tự tạo, các nền mẫu dùng để xây dựng quy trình thẩm định và các mẫu lưu hành trên
thị trường có thành phần và thể chất phức tạp, tiêu chí phân tích đa dạng.
Cụ thể là:
 Viên nén Webber naturals Alpha-Lipoic Acid 100mg
 Viên nén Alpha-Lipoic Acid 300mg

 Swanson Alpha Lipoic Acid 50mg
Ngồi ra cịn có 3 nền mẫu đặc trưng dùng để phân tích và nghiên cứu đánh giá
quy trình theo yêu cầu của ISO 17025-2017 mà trong đó cụ thể AGL 03 yêu cầu bổ
sung để cơng nhận các phong thử nghiệm lĩnh vực hóa (Văn phịng cơng nhận chất
lượng BOA) thì đối với các mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe bào chế dưới dạng thuốc
thì xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp trên các dạng bào chế: Bào chế dạng rắn,
lỏng, thân dầu/ưa dầu, cốm…. .Ở đây ta chọn 03 dạng bào chế thường gặp nhất đối với

hoạt chất Alpha Lipoic Acid bao gồm:
 Nền mẫu 1: Dung dịch tiêm truyền Thiotic acid 300mg/12ml (nền mẫu ALA
dạng lỏng).
 Nền mẫu 2: Viên nén Thực phẩm bảo vệ sức khoẻ Alpha Lipoic Acid 600mg
(nền mẫu ALA dạng rắn).
 Nền mẫu 3: Thực phẩm chức năng Omega 3-4-6, Alpha Lipoic Acid 780mg
(nền mẫu ALA ưa dầu).
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
Để thực hiện nghiên cứu phân tích ALA trong thực phẩm chức năng, quy trình
nghiên cứu được thực hiện như sau:
 Sử dụng hệ thống phân tích Sắc ký lỏng tiến hành nghiên cứu. Khảo sát các
thơng số HPLC, đưa ra quy trình và tiến hành xác định ALA bằng HPLC. Lựa chọn
quy trình phân tích, lựa chọn các thơng số và điều kiện quy trình phù hợp nhất. Mục
đích sao cho pic sắc ký lỏng tách tốt, có độ phân giải tốt nhất.
 Thực hiện mơ hình quy hoạch và tối ưu hóa thực nghiệm trên nền mẫu thêm
chuẩn, từ đó đưa ra các thơng số tối ưu cho q trình chiết tách ALA trên các nền mẫu
thực phẩm. Nhằm mục đích chiết tách sản phẩm được tối đa và mức độ chiết cao nhất.


13
 Xây đựng quy trình và đánh giá quy trình phân tích. Sau đó tiến hành thực hiện
phân tích đối chứng về quy trình với các phịng thí nghiệm khác nhau.
 Khảo sát một số mẫu thực phẩm chức năng theo quy trình đã tối ưu.
2.1.3. Mục tiêu nghiên cứu
 Xây dựng được quy trình phân tích ALA trong một số thực phẩm chức năng,
quy trình này phải tối ưu và phân tích được hầu hết các mẫu thực phẩm chức năng có
chứa ALA trên thị trường.
 Quy trình đã xây dựng được đánh giá theo ISO 17025:2017 từ đó được đưa vào
quy chuẩn trong phịng thí nghiệm.
2.1.4. Chất chuẩn, dung mơi, hóa chất

2.1.4.1. Chất chuẩn
Chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu gồm có:
 Alpha Lipoic Acid (Hàm lượng: 99,0 %; Nơi sản xuất: Trung Quốc; Hạn dùng:
03/2021; Đã kiểm tra và thực hiện nối chuẩn)
 Alpha Lipoic Acid (Hàm lượng: 99,9%; Viện An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm
Quốc Gia).
2.1.4.2. Dung mơi, hóa chất
Một số dung mơi, hóa chất khác được sử dụng trong nghiên cứu gồm có:
 Acetonitrile (Merck; Lô: K49707491; Hạn dùng: 30/11/2020).

 Acid phosphoric 85% (Trung Quốc).
 Acid sulfuric đậm đặc 95% (Prolabo; Lô: 17J44013; Hạn dùng: 20/11/2022).
 Methanol HPLC (Merck; Lô: I0916118; Hạn dùng: 30/9/2020).
 Ethanol Absolution (Prolabo; Lô: 17K074009; Hạn dùng: 03/11/2022).
 NaOH (Prolabo; Lô: 17E4110; Hạn dùng: 05/2020).
 Tetrahydrofuran (Prolabo; Lô: 14L090500; Hạn dùng: 12/2019).
 Acid Formic 98-100% (Merck; Lô: S5779554; Hạn dùng: 30/04/2021).
 Acid Acetic 100% (Prolabo; Lô: 17E034008; Hạn dùng: 03/2022).

 Ethylenglycol (Trung Quốc).
 Acetanilid (Merck; Lô: S6921344; Hạn dùng: 31/07/2019).
 Saccharose (Merck; Lô: K47396387; Hạn dung: 31/01/2020).

 Tinh bột (Trung Quốc).
 Dầu thực vật.
2.1.5. Thiết bị, dụng cụ
Các thiết bị dụng cụ theo quy định và yêu cầu của ISO 17025 – 2017 và được
Viện kiểm nghiệm thuốc TW và các cơng ty hiệu chuẩn và bảo trì gồm:

14
 Máy sắc ký lỏng hiệu nâng cao (Model: U-3000; Nơi sản xuất: Dionex)
 Máy sắc ký lỏng hiệu nâng cao (Model: D7000; Nơi sản xuất: Hitachi)
 Cân phân tích 4 số lẻ (Model: ML 204/01; Nơi sản xuất: Thụy sĩ)
 Bể điều hòa nhiệt độ (Model: 1,5HP; Nơi sản xuất: LG)
 Nồi cách thủy (Model: WNB145; Nơi sản xuất: Đức)

 Máy li tâm (Model: Z206A; Nơi sản xuất: Đức)
 Bể siêu âm (Model: Elma; Nơi sản xuất: Anh)
 Giấy lọc, màng lọc 0,45m
 Bếp điện, nhiệt kế thủy tinh
 Dụng cụ thủy tinh chính xác cấp A (Pipet; bình định mức)
 Dụng cụ thủy tinh (Bình gạn; cốc có mỏ)
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Xác định nồng độ ALA trong các mẫu bằng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao HPLC
Trong nghiên cứu này, việc xác định nồng độ ALA trong các mẫu được thực
hiện bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC trên máy Ultimate 3000,
Hãng Dionex – Mỹ:
 Bơm dung môi 4 kênh (Model: LPG-3400SD; tốc độ dòng 0,001 – 10,0
ml/phút; Độ đúng tốc độ dịng: ± 0,1%; Độ chính xác tốc độ dịng: < 0,05%...).
 Khoang chứa dung môi (Model: SR-3000).
 Buồng điều nhiệt cột (Model: TCC-3000SD; Dải nhiệt độ 5oC đến 70oC; Độ
chính xác ± 0,5oC; Độ đúng ± 0,1oC...)
 Diode Array Detector (Model DAD 3000; Cấu tạo dạng mảng quang diode
quang với 1024 mảng diode không cần motor quay. Độ phân giải hệ quang: < 1nm;
Khoảng bước sóng: 190 – 800nm; Nguồn sáng sử dụng đèn Deuterium cho khoảng
UV và Tungsten cho khoảng Vis…)

15

Hình 2.1. Hệ thống máy HPLC Ultimate 3000

 Phần mềm điều khiển Chromeleon

Hình 2.2. Giao diện phần mềm Chromeleon của máy HPLC Ultimate 3000
2.2.1.2. Khảo sát cột sắc ký lỏng
a) Bàn luận hướng nghiên cứu:
Khi nghiên cứu cấu tạo và tính chất của ALA, cho thấy ALA là hoạt chất có
khối lượng phân tử nhỏ (<5000g/mol), tan tốt trong các dung mơi hữu cơ. Vì vậy
nghiên cứu này lựa chọn phương pháp sắc ký pha đảo với 2 loại cột sau:
 C18–Octadecyl silane: Octadecyl silane liên kết với silicagel xốp kích thước từ