LUẬN văn THẠC sĩ CÔNG NGHỆ SINH học (FULL) nghiên cứu sử dụng nước thải chế biến tinh bột sắn để nuôi cấy bacillus thuringiensis

MỤC LỤC
MỤC LỤC.........................................................................................................1
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT....................................... 4
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................5
DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ...............................................................6
MỞ ĐẦU...........................................................................................................8
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................... 10
1.1. Tổng quan về Bacillus thuringiensis........................................................10
1.1.1 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus thuringiensis........................................10
1.1.2. Độc tố delta-endotoxin của Bacillus thuringiensis và cơ chế tác động
của chúng.........................................................................................................11
1.1.3. Khái quát về thuốc trừ sâu sinh học...................................................... 16
1.1.4. Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Bt ở Việt Nam................................20
1.2. Tổng quan về tình hình sản xuất và tiêu thụ tinh bột sắn.........................24
1.2.1. Thơng tin chung về tình hình canh tác và tiêu thụ sắn..........................24
1.2.3. Cơng nghệ sản xuất tinh bột sắn............................................................31
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP............................................ 36
2.1. Vật liệu..................................................................................................... 37
2.1.1. Chủng giống vi sinh vật sử dụng...........................................................37
2.1.2. Nước thải sản xuất tinh bột sắn............................................................. 37
2.1.3. Thiết Bị..................................................................................................37
2.1.4. Môi trường tổng hợp TSB.................................................................... 37
2.2. Phương pháp.............................................................................................38
2.2.1. Phương pháp xác định mật độ tế bào, mật độ bào tử............................38
2.2.2. Phương pháp xác định các thông số trong nước thải.............................38

1


2.2.3. Phương pháp khử xyanua (CN-) có trong nước thải sản xuất tinh bột
sắn

38

2.2.4. Phương pháp xác định nồng độ delta-endotoxin trong dịch nuôi cấy .. 38
2.2.5. Đánh giá khả năng phát triển của Bt trên môi trường nước thải chế biến
tinh bột đã qua tiền xử lý.................................................................................40
2.2.6. Nghiên cứu tiền xử lý nước thải chế biến tinh bột sắn..........................40
2.2.7. Đánh giá ảnh hưởng pH lên khả năng sinh trưởng của Bt.....................41
2.2.9. Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện cấp khí của quá trình lên men trong hệ
thống lên men quy mơ phịng thí nghiệm (thể tích 5L) trên nước thải tinh bột
lên sự sinh trưởng và phát triển của Bt............................................................42
2.2.10. Đánh giá biến động của pH trong quá trình lên men, so sánh q trình
lên men có khống chế ổn định pH và không ổn định pH................................42
2.2.11. Lên men Bt trong hệ lên men quy mơ phịng thí nghiệm, đánh giá hiệu
quả giệt sâu của sản phẩm lên men và so sánh với chế phẩm thương mại hiện
có trên thị trường.............................................................................................43
2.2.12. Phương pháp thử nghiệm sinh học......................................................43
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................44
3.1. Khảo sát tính chất của nước thải sản xuất tinh bột sắn.............................44
3.2. Thử nghiệm khả năng phát triển của Bt trên nước thải tinh bột sắn

47

3.3. Nghiên cứu tiền xử lý nước thải tinh bột sắn để sử dụng nuôi cấy vi sinh
vật. 48
3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường lên khả năng
sinh trưởng và tạo tinh thể độc của chủng Bacillus thuringiensis trên nước
thải tinh bột sắn...............................................................................................53
3.5.1. Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng và tạo tinh thể độc của
chủng Bacillus thuringiensis...........................................................................53

2


3.5.2. Ảnh hưởng của độ thống khí lên khả năng sinh trưởng và tạo tinh thể
độc của chủng Bacillus thuringiensis..............................................................58
3.6. Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện cấp khí của quá trình lên men trong hệ
thống lên men quy mơ phịng thí nghiệm (thể tích 5L) trên nước thải tinh bột
lên sự sinh trưởng và phát triển của Bt............................................................62
3.6.1. Ảnh hưởng tốc độ khuấy lên sự sinh trưởng và phát triển của Bt

62

3.6.2. Ảnh hưởng tốc độ thổi khí lên sự sinh trưởng và phát triển của Bt

66

3.7. Đánh giá biến động của pH trong quá trình lên men, so sánh q trình lên
men có khống chế ổn định pH và không khống chế ổn định pH.....................69
3.8. Nghiên cứu lên men thu nhận thuốc trừ sâu sinh học trong hệ lên men ở
quy mơ phịng thí nghiệm (5L)........................................................................74
3.9. Thử nghiệm so sánh khả năng diệt sâu của dịch lên men Bt từ nước thải
chế biến tinh bột với chế phẩm thương mại hiện có trên thị trường...............76
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.........................................................................79
A. KẾT LUẬN................................................................................................79
B. KIẾN NGHỊ................................................................................................80

3

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu, chữ viết tắt

Giải thích, ý nghĩa

WHO

Tổ chức Y tế Thế giới

FAO

Tổ chức Lương thực Thế giới

UNEP

Chương trình mơi trường Thế giới

BVTV

Bảo vệ thực vật

CNSH

Công nghệ sinh học

TCN

Trước Công nguyên

TSB

Trypton soya Broth

TSA

Trypton soya Agar

T-N

Tổng nitơ

T.P

Tổng photpho

COD

Nhu cầu oxy hóa hóa

BOD5

Nhu cầu oxy sinh học

vvm

Thể tích khí/thể tích mơi trường/phút

rpm

Vịng/phút

cfu

Đơn vị hình thành khuẩn lạc (colonyforming unit)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Tình hình sản xuất và sử dụng sắn ở năm 1993 và dự kiến đến năm
2020.................................................................................................................25
Bảng 1.2. Một số thành phần dinh dưỡng có trong củ sắn..............................26
Bảng 1.3. Tính chất hóa lý của nước thải sản xuất tinh bột sắn......................34
Bảng 3.1. Kết quả phân tích chất lượng nước thải sản xuất tinh bột tại xưởng
sản xuất tinh bột Tiên Sơn – Bắc Ninh............................................................44
Bảng 3.2. Thử nghiệm khả năng phát triển của Bt trên nước thải sản xuất tinh
bột sắn.............................................................................................................47
Bảng 3.3. Mật độ tổng số Bt sau 24 nuôi lắc...................................................48
Bảng 3.4. Khả năng phát triển của Bt trên môi trường nước thải chế biến tinh
bột sắn.............................................................................................................49
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của pH lên quá trình sinh trưởng Bt............................54
Bảng 3.6. ảnh hưởng của độ thống khí lên khả năng sinh trưởng của chủng vi
khuẩn Bacillus thuringiensis...........................................................................58
Bảng 3.7. Kết quả phân tích mật độ tổng số, bào tử và hàm lượng độc tố deltaendotoxin ở các tốc độ khuấy khác nhau.........................................................63
Bảng 3.8. Sinh trưởng và sinh độc tố của chủng Bt trong các điều kiện thổi
khí khác nhau khi lên men trên nước thải tinh bột sắn....................................66
Bảng 3.9. Các thông số môi trường được thống kê trong suốt quá trình lên men
69
Bảng 3.10. Ảnh hưởng độ biến động pH lên khả năng sinh trưởng và
sinh độc tố của Bt khi nuôi trên môi trường nước thải tinh bột săn đã
qua tiền xử lý.................................................................................................72

Bảng 3.11. Động thái của Bt khi nuôi cấy trong hệ lên men quy mơ phịng thí
nghiệm trên mơi trường nước thải tinh bột sắn...............................................74
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của lượng dịch nuôi cấy vi khuẩn Bt lên khả năng diệt
sâu so sánh với chế phẩm trừ sâu sinh học V-BT............................................77

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Hình dạng Vi khuẩn Bacillus thuringiensis.....................................10
Hình 1.2. Sâu bị chết khi ăn phải lá nhiễm Bt.................................................13
Hình 1.3. Tinh thể độc của Bt dưới kính hiển vi điện tử.................................14
Hình 1.4. Chuyển gen sinh độc tố của Bt vào ngơ..........................................15
Hình 1.5. Cây sắn và củ sắn sau khi thu hoạch...............................................24
Hình 1.6. Sản lượng tinh bột sắn của một số nước (x1000 tấn)......................30
Hình 1.7. Sơ đồ quy trình cơng nghệ sản xuất tinh bột sắn............................33
ở quy mơ cơng nghiệp (Thái Lan)...................................................................33
Hình 1.8. Quy trình cơng nghệ xử lý nước thải chế biến tinh bột sắn.............35
Hình 2. Đường chuẩn protein để xác định delta-endotoxcin...........................39
Hình 3.1. Sinh trưởng của Bt trên mơi trường cơ bản TSB............................51
Hình 3.3. Sinh trưởng của Bt trên môi trường 50% nước thải tinh bột sắn

52

Hình 3.4. Sinh trưởng của Bt trên mơi trường 100% nước thải tinh bột sắn..
53 Hình 3.5. Sinh trưởng và sinh độc tố của Bt trên nước thải tinh bột sắn có
pH 5 .. 55 Hình 3.6. Sinh trưởng và sinh độc tố của Bt trên nước thải tinh bột
sắn có pH6
.........................................................................................................................

55

Hình 3.7. Sinh trưởng và sinh độc tố của Bt trên nước thải tinh bột có pH7.....56
Hình 3.8. Sinh trưởng và sinh độc tố của Bt trên nước thải tinh bột có pH8......57
Hình 3.9. Biểu đồ mật độ tổng số trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của
độ thống khí...................................................................................................59



Hình 3.10. Biểu đồ mật độ bào tử thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của độ
thống khí........................................................................................................60
Hình 3.11. Biểu đồ hàm lượng độc tố delta-endotoxin thí nghiệm nghiên cứu
ảnh hưởng của độ thống khí..........................................................................61
Hình 3.12. DO trong hệ lên men ở các tốc độ khuấy khác nhau.....................62
Hình 3.13. Sinh trưởng và sinh độc tố delta-endotoxin của Bt trong hệ lên
men với tốc độ khuấy 350 rpm........................................................................64
Hình 3.14. Sinh trưởng và sinh độc tố delta-endotoxin của Bt trong hệ lên
men với tốc độ khuấy 450 rpm........................................................................65
Hình 3.15. Sinh trưởng và sinh độc tố delta-endotoxin của Bt trong hệ lên
men với tốc độ khuấy 550 rpm........................................................................65
Hình 3.16. DO trong hệ lên men ở các tốc độ thổi khí khác nhau..................66
Hình 3.17. Sinh trưởng và sinh độc tố của Bt khi nuôi trên môi trường nước
thải tinh bột sắn ở điều kiện thổi khí 0.2vvm..................................................67
Hình 3.18. Sinh trưởng và sinh độc tố của Bt khi nuôi trên môi trường nước
thải tinh bột sắn ở điều kiện thổi khí 0,5vvm..................................................68
Hình 3.19. Sinh trưởng và sinh độc tố của Bt khi nuôi trên môi trường nước
thải tinh bột sắn ở điều kiện thổi khí 1,0vvm..................................................68
Hình 3.20. Biến độ pH trong quá trình lên men trong mơi trường nước thải
tinh bột.............................................................................................................71
Hình 3.21. Sinh trưởng và phát triển của Bt trên mơi trường khơng điều chỉnh
pH....................................................................................................................72
Hình 3.22. Ảnh hưởng của sự ổn định pH đến khả năng sinh trưởng và phát

triển của Bt trên môi trường nước thải tinh bột sắn.........................................73
Hình 3.23. Khả năng sinh trưởng và sinh độc tính của chủng vi khuẩn Bt
trong suốt quá trình lên men............................................................................76


Hình 3.24. Ảnh hưởng của lượng dịch ni cấy vi khuẩn Bt lên khả năng diệt
sâu so sánh với chế phẩm trừ sâu sinh học V-BT............................................78

MỞ ĐẦU
Nhu cầu về tinh bột sắn ngày càng tăng trong những năm trở lại đây do
những ứng dụng rộng rãi của chúng trong công nghiệp cũng như đời sống con
người. Điều này dẫn đến sự gia tăng nhanh chóng của nhà máy chế biến tinh
bột sắn cả về quy mộ lẫn số lượng. Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích mà
chúng đem lại, chúng ta cũng không thể làm ngơ về một thực trạng môi trường
đáng báo động do chất thải mà đặc biệt là nước thải tạo ra trong quá trình chế
biến tinh bột đang hàng ngày hàng giờ đầu độc môi trường. Tình trạng này do
trong nước thải chế biến tinh bột có hàm lượng ơ nhiễm hữu cơ q cao, do đó
chúng phải được xử lý trước khi thải ra mơi trường hoặc tái sử dụng để sản
xuất những sản phẩm có ích nhằm giảm thiểu lượng nước thải ra mơi trường.
Sản phẩm thương mại từ Bacillus thuringiensis đã và đang được sử dụng
trong việc bảo vệ rừng và nông nghiệp, tuy nhiên, việc ứng dụng rộng rãi các
sản phẩm này đang gặp trở ngại do giá thành sản xuất còn cao. Do đó, với
mong muốn tìm ra một giải pháp nhằm tái sử dụng có hiệu quả nước thải chế
biến tinh bột sắn – ô nhiễm nhưng cũng rất giàu dinh dưỡng cho vi sinh vật,
đồng thời tìm ra một nguồn nguyên liệu rẻ tiền, sẵn có để sản xuất các sản
phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bacillus thuringiensis, chúng tôi thực
hiện đề tài: “Nghiên cứu sử dụng nước thải chế biến tinh bột sắn để nuôi cấy
Bacillus thuringiensis”. Đề tài bao gồm những nội dung sau:

1. Phân tích thành phần nước thải tạo ra từ quá trình chế biến sắn để sản
xuất tinh bột (nước thải tinh bột sắn), đánh giá sơ bộ khả năng sử dụng nước
thải tinh bột sắn để nuôi cấy vi sinh vật có ích nói chung và Bacillus
thuringiensis (Bt) nói riêng. Đánh giá khả năng phát triển của Bt trên môi
trường nước thải tinh bột sắn.
2. Tiền xử lý nước thải tinh bột sắn (loại bỏ chất độc, tạo điều kiện phù
hợp hơn cho sự phát triển của chủng Bt nghiên cứu: điều chỉnh pH) và đánh
giá khả năng phát triển của chủng Bacillus thuringiensis nghiên cứu trên môi
trường nước thải đã qua tiền xử lý.
3. Đánh giá sự ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường (pH, độ thống
khí) lên khả năng sinh trưởng và tạo tinh thể độc của chủng Bacillus
thuringiensis nghiên cứu khi nuôi trên nước thải tinh bột sắn đã qua tiền xử lý.
4. Đánh giá ảnh hưởng của điều kiện cấp khí (tốc độ khuấy, tốc độ thổi
khí) lên khả năng sinh trưởng và sinh độc tố của chủng Bacillus thuringiensis
nghiên cứu trong bình lên men quy mơ phịng thí nghiệm (thể tích 5L).
5. Nghiên cứu biến động pH trong quá trình sinh trưởng của chủng Bt
nghiên cứu, so sánh khả năng sinh trưởng và sinh độc tố của chủng Bacillus
thuringiensis nghiên cứu khi nuôi trên nước thải chế biến tinh bột sắn.
6. Nghiên cứu biến động về mật độ tế bào, mật độ bào tử, hàm lượng
độc tố delta-endotoxin sinh ra trong quá trình lên men. Thử nghiệm sinh học,
so sánh khả năng diệt sâu của dịch sản phẩm lên men trên nước thải tinh bột
sắn với chế phẩm thương mai có mặt trên thi trường (chế phẩm N-Bt).


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về Bacillus thuringiensis
1.1.1 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus thuringiensis
Bacillus thuringiensis (thường
được viết tắt là Bt) – là nhóm vi
khuẩn đại diện cho thuốc trừ sâu sinh

học, Bacillus thuringiensis là một loại
trực khuẩn gram dương, tế bào có
dạng hình que, Bacillus thurnigiensis
là lồi vi khuẩn rất điển hình được
phân lập ở vùng Thuringia - Đức.
Hình 1.1. Hình dạng Vi khuẩn
Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis có khả năng
tổng hợp độc tố tiêu diệt cơn trùng

gây hại qua đường tiêu hóa, làm chúng chết chỉ sau một vài ngày. Đến nay,
hơn 100 loại protein của Bacillus thuringiensis đã được phát hiện với các
nồng độ độc tố diệt một số ấu trùng, sâu hại khác nhau. Chúng được coi là
một trong rất ít thuốc trừ sâu đạt tiêu chuẩn hữu cơ. Các chủng Bacillus
thuringiensis khác nhau sản sinh ra các protein độc đối với một số loài côn


trùng nhất định. Độc tố protein của Bacillus thuringiensis tương tác trực tiếp
với thụ thể. Một số loại ấu trùng côn trùng hại cây khi ăn phải protein tiền độc
tố của Bacillus thuringiensis, protein tiền độc tố này đi vào cơ quan tiêu hóa
kết hợp với dịch ruột của ấu trùng, sâu hại tạo thành protein độc làm chúng bị
tích nước và chết. Một số nghiên cứu cho thấy protein của Bacillus
thuringiensis không độc với người, các động vật và cơn trùng có ích [36].
Protein đặc hiệu được sản sinh trong quá trình sinh trưởng và phát triển
của vi khuẩn Bacillus thuringiensis có khả năng diệt sâu hại, đặc biệt vào giai
đoạn hình thành bào tử của Bacillus thuringiensis. Sự sản sinh protein gây
độc này được duy trì, chỉ đạo bởi một đoạn gen di truyền. Dưới sự chỉ đạo của
đoạn gen di truyền này, cơ thể của vi khuẩn Bacillus thuringiensis sản sinh ra
tác nhân tiêu diệt ấu trùng gây hại trong quá trình xâp nhập và ký sinh trong

hệ tiêu hố của cơn trùng [2].
1.1.2. Độc tố delta-endotoxin của Bacillus thuringiensis và cơ chế tác động
của chúng
Trong quá trình hình thành bào tử, Bt tạo ra một sản phẩm phụ
(parasporal) thường được gọi là tinh thể độc. Tinh thể này có bản chất là các
protein. Một số lượng lớn các protein tinh thể liên quan được các nhà nghiên
cứu phát hiện ra và nhiều hơn một loại protein có thể có mặt trong một tinh
thể. Nhằm tránh sự lộn xộn trong việc định danh, các nhà khoa học đã đề xuất
ra một phương pháp để phân loại dựa trên đặc điểm về hình dạng và dạng tác
động của các protein độc tố và gen của chúng [12]. Phân loại này dựa vào cấu
trúc protein tinh thể và trên phạm vi tác động của vật chủ. Hơn 40 protein
riêng biệt (Cry) được mô tả, các protein này đã và đang được bổ sung thêm
[17].
Các gen được phân loại dựa trên sự tác động của tinh thể độc của chúng
lên côn trùng được gọi chung là “cry”. Chúng được chia thành bốn lớp chính:



chỉ tác động lên Bộ cánh vẩy (Lepidoptera) (1), tác động lên Bộ cánh vẩy
(Lepidoptera) và Bộ hai cánh (Diptera) (2), chỉ tác động lên Bộ cánh cứng
(Coleoptera) (3) và chỉ tác động lên Bộ hai cánh (Diptera) (4). Một số phân
lớp, dựa trên tính chất cơn trùng, cấu trúc, cũng được công nhận trong mỗi
lớp. Gần đây một hệ thống phân loại mới chỉ dựa trên nhận dạng acid amin đã
được đề xuất [9]. Việc phân loại mới cho phép các độc tố có liên quan chặt
chẽ được xếp với nhau và loại bỏ phải tiến hành thử nghiệm sinh học
(BioAssay) với mỗi độc tố phát hiện được.
Từ những hiểu biết về phương thức hoạt động của tinh thể độc, có thể
được suy ra rằng ít nhất bốn yếu tố có liên quan đến mức độ protein tinh thể
độc: 1. hiệu quả của hòa tan, 2. hiệu quả của protoxin-độc tố chuyển đổi, 3.
quá trình liên kết của protein tinh thể độc lên các thụ thể của tế bào ruột và 4.

tạo lỗ thủng trên thành ruột. Tất cả các yếu tố này xác định các tác động của
một loại protein tinh thể độc [14].
Khi Bacillus thuringiensis hoặc bào tử của Bacillus thuringiensis được
đưa vào đường tiêu hóa của ấu trùng gây hại, nhờ dinh dưỡng lấy được trong
đường ruột của ấu trùng, Bacillus thuringiensis sinh trưởng và sản sinh nhanh
chóng về số lượng. Đồng thời Bacillus thuringiensis cũng sản sinh ra các
phân tử protein đặc hiệu, gây ngộ độc cho đường tiêu hoá của ấu trùng, sâu
hại. Các protein này sẽ gây độc và làm thủng đường ruột hoặc làm bào mòn
mỏng đường ruột của các ấu trùng, sâu non của côn trùng. Môi trường kiềm ở
ruột của ấu trùng là điều kiện lý tưởng cho Bacillus thuringiensis phát triển.


Chính vì vậy sau một thời gian khoảng từ 2-5 ngày sâu ngừng ăn và chết.

Hình 1.2. Sâu bị chết khi ăn phải lá nhiễm Bt [33, 34]
Mức độ và thời gian diệt sâu của chế phẩm Bacillus thuringiensis phụ
thuộc vào lượng protein độc mà ấu trùng ăn phải, vào độ tuổi, từng loài ấu trùng,
sâu hại và phụ thuộc vào chủng Bacillus thuringiensis được sử dụng [2].
Không chỉ tiêu diệt một cá thể, Bacillus thuringiensis còn được lây lan
cho các ấu trùng khác qua nước dãi, phân, xác chết của ấu trùng nhiễm
Bacillus thuringiensis. Do đó, Bacillus thuringiensis có thể tạo ra sự lây
nhiễm trên một diện tích lớn. Khi ấu trùng, sâu hại nhiễm Bacillus
thuringiensis bị tiêu diệt tới 90% thậm chí đạt tới 99% (Theo số liệu báo cáo
của FAO và UNEP).


Hình 1.3. Tinh thể độc của Bt dưới kính hiển vi điện tử [35]
Bacillus thuringiensis có thể được ni cấy dễ dàng nhờ quá trình lên
men. Vì vậy, Bacillus thuringiensis đã được sử dụng rộng rãi làm thuốc diệt
côn trùng từ hơn 40 năm nay ở nhiều nơi trên thế giới. Đặc biệt, Bacillus

thuringiensis đã đem lại những lợi ích to lớn cho các nơng nghiệp vì chúng
được coi là một trong rất ít thuốc trừ sâu đạt tiêu chuẩn hữu cơ. Tuỳ thuộc vào
cấu trúc (dạng hạt hay dạng dịch) thuốc diệt côn trùng Bacillus thuringiensis
được phun hay rắc. Tuy nhiên, có một số hạn chế như Bacillus thuringiensis
rất khó tiếp xúc với cơn trùng đích do chúng ẩn, nấp dưới lá, đất. Để khắc
phục hạn chế này, các nhà khoa học đã tiến hành chuyển gen Bacillus
thuringiensis mã hóa cho protein tinh thể độc tố từ vi khuẩn Bacillus
thuringiensis vào thực vật. Cây trồng được chuyển gen Bacillus thuringiensis
này sẽ có khả năng tự kháng lại sâu hại đích. Các protein sản sinh trong thực
vật khơng bị rửa trôi hay bị phân huỷ dưới ánh nắng mặt trời. Vì vậy, bất kể
trong điều kiện sinh thái, khí hậu thế nào thì cây trồng vẫn được bảo vệ khỏi
sự tấn công của sâu đục thân, hay đục quả. Hiệu quả diệt sâu của cây trồng từ
Bacillus thuringiensis chuyển gen đạt gần 90% [35].


Hình 1.4. Chuyển gen sinh độc tố của Bt vào ngô [36]
Tuy nhiên, việc tạo ra các loại thực phẩm từ cây trồng chuyển gen vẫn
còn nhiều tranh cãi và các câu hỏi đặt ra với các loại sản phẩm này vẫn chưa
có câu trả lời:
- Các thực phẩm chuyển gen có được tạo ra từ thực phẩm truyền thống
đã được cơng nhận an tồn hay khơng?
- Nồng độ các độc tố hay chất gây dị ứng trong thực phẩm có thay đổi
hay khơng?
- Hàm lượng các chất dinh dưỡng chính có thay đổi hay khơng?
- Các chất mới trong thực phẩm chuyển gen có đảm bảo tính an tồn
hay khơng?
- Khả năng tiêu hóa thức ăn có bị thay đổi hay khơng?
- Các thực phẩm có được tạo ra từ các qui trình đã được chấp nhận
hay khơng?
Tại Việt Nam, các chuyên gia thuộc Viện Công nghệ sinh học (Viện

KH&CN Việt Nam) đã nghiên cứu và sản xuất thành công thuốc trừ sâu sinh


học Bacillus thuringiensis hiệu quả cao bằng cách sử dụng gần 10 chủng vi
khuẩn Bacillus thuringiensis được phân lập ở Việt Nam.
1.1.3. Khái quát về thuốc trừ sâu sinh học
Một loạt các biện pháp đã được con người áp dụng vào trong sản xuất
nơng nghiệp nhằm phịng trừ và diệt sâu bệnh, tiên phong đó là biện pháp sử
dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật hoá học như DDT, 666 đã trở thành cứu
cánh của loài người trong diệt sâu bệnh hại từ giữa thế kỷ20. Tuy nhiên mặt
trái của việc sử dụng các loại thuốc trừ sâu hoá học đó là phá huỷ mơi trường
một cách khủng khiếp. Các hố chất bảo vệ thực vật có tác động không chỉ tới
sức khoẻ của những người nông dân mà cịn làm mất đi nhiều nguồn sinh vật
có lợi cho con người như chim, tôm, cá và cả những ký thiên địch có lợi như
bọ rùa, ong ký sinh, các nguồn vi sinh vật khác như nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn,
tuyến trùng. Có một nghịch lý xảy ra trong vấn đề sản xuất nơng nghiệp đó là
trình độ thâm canh càng cao thì sâu bệnh phát sinh, phát triển càng nhiều,
càng phun thuốc để phòng trừ và diệt sâu hại thì đồng thời cũng càng huỷ diệt
nhiều sinh vật có ích và càng làm tăng thêm khả năng kháng thuốc của sâu
hại. Thêm vào đó, hố chất bảo vệ thực vật tồn dư lâu dài trong mơi trường và
rất khó phân huỷ, chính vì thế mà nó gây tác động lâu dài tới con người, môi
trường và hệ sinh thái tự nhiên.
Từ khi vấn đề môi trường, bảo vệ sức khoẻ con người, nâng cao sản
lượng và chất lượng nông sản được quan tâm, thì một loạt các nghiên cứu
trong lĩnh vực này được triển khai trên thế giới với sự tham gia của nhiều tổ
chức quốc tế như WHO, FAO, UNEP. Đã có một số nghiên cứu sử dụng biện
pháp sinh học để phòng trừ và diệt sâu hại như: sử dụng thiên địch diệt sâu
hại, thuốc trừ sâu từ thực vật và sử dụng thuốc trừ sâu sinh học từ các chủng
vi sinh vật có ích mà đứng đầu là vi khuẩn Bacillus thuringiensis [3].

1.1.3.1. Lịch sử phát hiện của thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc Bt
Cả hai nhà tiên phong thế kỷ 19 cho rằng các vi sinh vật có thể được sử
dụng để kiểm soát sự phát triển sâu hại. Mặc dù những nghiên cứu về việc sử
dụng vi sinh vật để khống chế và kiểm soát sâu bệnh đã diễn ra vào cuối
những năm 19 và nửa đầu thế kỷ này, nhưng nó đã khơng được để ý đến cho
đến khi Bacillus thuringiensis Berliner được phát hiện và phát triển, thuốc trừ
sâu sinh học mới được triển khai sử dụng và sản xuất thực tế và đã bắt đầu
trên một quy mô lớn [15]. Cho đến nay, mặc dù hơn 400 loài vi khuẩn đã
được xác định là tác nhân gây bệnh cơn trùng, chỉ có nhóm vi khuẩn Bacillus
đặc biệt là Bacillus thuringiensis là được sản xuất và đạt được thành cơng về
mặt thương mại hóa.
1.1.3.2. Hoạt động thương mại từ chế phẩm Bt
Bt đã được áp dụng trong thực tế từ năm 1933 và được thương mại hóa
đầu tiên ở Pháp vào năm 1938. Tuy nhiên, nó không được thành công cho đến
những năm 1950, khi công nghệ mới của q trình lên men trên mơi trường
lỏng trong bể hiếu khí được sử dụng để sản xuất các chế phẩm bào tử và tinh
thể. Ứng dụng chính của chế phẩm Bt đã diễn ra ở Bắc Mỹ trong vai trị là
nhân tố kiểm sốt của hơn 40 lồi dịch hại trong các địa điểm như: rừng, cơng
viên, vườn nho và vườn nói chung. Các hoạt động thương mại hóa đầu tiên về
chế phẩm Bt đã có sẵn được thử nghiệm trên thực địa tại Hoa Kỳ năm 1958
[10]. Năm 1961, Bt subsp.kurstaki (Btk) được sử dụng như là một nhân tố trừ
sâu sinh học cho sự kiểm soát của sâu bệnh thuộc bộ cánh phấn. Hầu hết các
thuốc trừ sâu Bt được xây dựng dựa trên các hỗn hợp của tinh thể độc tố
delta-endotoxin và bào tử Bt, được gọi chung là độc tính của các tinh thể.
Mặc dù hiệu quả của các thuốc trừ sâu Bt lúc ban đầu thường thất thường,
nhưng những tiến bộ chậm chạp trong việc nghiên cứu và phát triển xây dựng


Bt ngày càng được cải thiện, việc quảng bá sản phẩm được đẩy mạnh và các

công nghệ ứng dụng được phổ biến, cũng như trong việc phát hiện ra thêm
nhiều chủng có hoạt lực trừ sâu mạnh. Chiếm thị phầm chủ yếu là các chế
phẩm có thành phần là vi sinh vật thuộc các phân lồi kurstaki để kiểm sốt
sâu hại cánh phấn trong lâm nghiệp và nông nghiệp. Cho đến giữa những năm
1970, nó đã được chấp nhận chung rằng các lồi sâu bộ cánh phấn là đối
tượng chính của Bt.
Các thị trường mới được mở ra bởi sự khám phá năm 1976 của các loài
phụ israelensis, là gây độc cho ấu trùng muỗi và ruồi đen [11] và khám phá ra
Bt subsp.tenebrionis, là tác nhân gây hại đối với một số loài bọ cánh cứng
[13]. Những khám phá bất ngờ và có tính đột phá này đã làm sáng lên ý nghĩa
về lợi ích thương mại trong sản xuất các sản phẩm có nguồn gốc từ Bt [25].
Lambert và Perferoen (1992) ước tính có 40.000 chủng Bt hiện đang được lưu
trữ, chủ yếu trong bộ sưu tập tư nhân, trên toàn thế giới [16].
Hiện nay, dưới loài đăng ký bao gồm Bt. kurstaki, Bt. aizawai, Bt
.israelensis, và Bt. tenebrionis (tương đương với dưới lồi Bt. sandiego),
trong đó chủ yếu liên quan đến khả năng tiêu diệt nhóm cơn trùng cánh phấn,
cánh kép và các lồi cơn trùng cánh cứng. Thời gian hiệu quả của các chế
phẩm Bt khi sử dụng trong điều kiện thực tế phụ thuộc nhiều vào mức độ tác
động của tia cực tím, vì vậy đã kích thích các nhà khoa học cũng như các
doanh nghiệp nghiên cứu nhằm tìm ra các phương pháp cho phép kéo dài thời
gian hiệu quả của chế phẩm Bt. Gần đây đã xuất hiện một chiến lược đến nay
gây tranh cãi nhiều nhất đó là việc chuyển các gen kháng sâu bệnh tạo deltaendotoxin lên cây trồng [14].
Ở nước ta, nghiên cứu sử dụng các chế phẩm sinh học BVTV đã được
tiến hành từ những năm đầu thập kỷ 70 của thế kỷ trước và thực sự phát triển


khoảng 10 năm gần đây. Năm 1971, chế phẩm Bacillus thuringiensis được
khảo nghiệm ở Viện BVTV. Năm 1973, Viện sinh vật, Viện Khoa học Việt
Nam lần đầu tiên nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bacillus thuringiensis trong
phịng thí nghiệm bằng phương pháp lên men trên máy lắc. Năm 1982, chế

phẩm thuốc BVTV được sản xuất ở Việt nam với qui mơ cơng nghiệp. Tuy
nhiên, hoạt tính chủng Bacillus thuringiensis khơng cao, do thiếu thiết bị thu
hồi, nên chế phẩm chủ yếu ở dạng dịch thể không bảo quản được lâu, hoạt lực
giảm nhanh chóng [36].
Trong chương trình Cơng nghệ sinh học giai đoạn 1996-2000, 20012004 đề tài KHCN02-07, KC04-12 sản xuất và ứng dụng thuốc trừ sâu
Bacillus thuringiensis đã được nâng lên một bước mới về chất. Chế phẩm
Bacillus thuringiensis được sản xuất trên một hệ thống thiết bị lên men dạng
pilot hiện đại. Chế phẩm bột thấm nước lần đầu tiên được sản xuất đạt tiêu
chuẩn quốc tế. Chế phẩm BioBact WP (dạng bột thấm ướt), BioBact EC (dạng
sữa) do phịng Di truyền Vi sinh vật sản xuất có hoạt lực diệt sâu đạt 16000
IU/mg và 4000 IU/ml. Hoạt tính của chế phẩm đã được khảo nghiệm trong
phịng thí nghiệm và trên đồng ruộng tại các hợp tác xã Tiền Phong, Mê LinhVĩnh Phúc, Văn Đức, Gia Lâm, Hà Nội, Vân Tảo- Thường Tín- Hà Tây cho
kết quả tương đương với chế phẩm Bacillus thuringiensis ngoại nhập [2,3].
Nghiên cứu sản xuất và sử dụng chế phẩm vi rút diệt côn trùng (NPV),
diệt sâu hại cây trồng nông lâm nghiệp cũng được các cơ quan như Viện bảo
vệ thực vật, Viện CNSH thực hiện trong chương trình CNSH 1990-1995,
2001-2004. Các nghiên cứu này đã tạo được chế phẩm dạng dịch diệt sâu
xanh, sâu khoang, sâu keo da láng trên bông, thuốc lá, cà chua, đậu tại các
tỉnh miền Bắc. Chế phẩm V-Bt (Virut NPV và Bacillus thuringiensis) do Viện


CNSH và Viện bảo vệ thực vật sản xuất đã cho hiệu quả diệt sâu cao hơn 40%
so với dùng NPV hoặc Bacillus thuringiensis riêng lẻ [2].
Việc sử dụng thuốc trừ sâu sinh học ở Việt Nam còn hạn chế. Thuốc
trừ sâu sinh học được xem là một phương cách hữu hiệu trong việc giảm thiểu
sâu bệnh, bảo vệ sức khoẻ con người. Tuy nhiên, việc sử dụng chúng ở nước
ta hiện nay cịn khá nhiều khó khăn: trong nghiên cứu triển khai còn thiếu
nhiều điều kiện, phương tiện để nghiên cứu; ít người đi sâu vào lĩnh vực này.
1.1.4. Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Bt ở Việt Nam [2]
Ở Việt Nam, thuốc trừ sâu sinh học Bt được ứng dụng đầu tiên tại Viện

Bảo vệ thực vật năm 1971. Nguyễn Văn Cảm và cộng sự, đã khảo nghiệm 5
loại thuốc trừ sâu sinh học Bt nhập nội từ Liên Xô, Trung Quốc... đã cho kết
quả rất khả quan. Tuy nhiên những nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Bt đầu
tiên được Nguyễn Cơng Bình và cộng sự thực hiện lần đầu tiên năm 1973 tại
Viện Sinh vật, Viện Khoa học Việt Nam (nay là Viện Khoa Học và Cơng
Nghệ Việt Nam). Có thể chia lịch sử 35 năm phát triển Bt của Việt Nam
thành 3 thời kì như sau:
1.1.4.1 Thời kì mở đầu nghiên cứu (1973-1984)
Tư liệu của thời kì này rất ít. Hai cơng trình của nhóm tác giả Nguyễn
Cơng Bình, Phạm Bá Nhạ, Ngơ Đình Bính là những người đầu tiên mở đầu
nghiên cứu Bt tại Việt Nam. Năm 1973 sau khi Nguyễn Cơng Bình đi thực
tập ngắn hạn tại Quảng Đông, Trung Quốc về sản xuất Bt bằng phương pháp
thủ công và bán công nghiệp trong phịng thí nghiệm, những nghiên cứu về
sản xuất chế phẩm Bt mới được thực hiện tại Viện Sinh Vật. Trong thời kì 7376, chủ yếu sản xuất trên môi trường đặc với giá thể là agar tự chế tạo từ rong
câu. Các nguyên liệu khác sẵn có trong nước như bã khô lạc, bột đậu tương,
bột cá đã được nghiên cứu sử dụng. Các chủng giống Bt lúc đó do Nguyễn


Cơng Bình mang từ Trung Quốc về có lồi phụ Bacillus thuringiensis var
thuringiensis, Bacillus thuringiensis var kurstaki. Các chế phẩm Bt sản xuất
bằng phương pháp thủ công này đã được sử dụng cho vùng rau ngoại thành
Hà Nội. Hiệu quả diệt sâu của chế phẩm Bt tự sản xuất rất tốt đã có tiếng
vang lớn lúc đó. Vì vậy sau giải phóng miền Nam 1975, đề tài sản xuất Bt
được lựa chọn là một trong những kết quả khoa học thực nghiệm đầu tiên của
miền Bắc xã hội chủ nghĩa đưa vào phát triển ở miền Nam. Tại phòng Sinh
Học thực nghiệm thuộc Phân viện Viện Khoa học Việt Nam đóng tại thành
phố Hồ Chí Minh, cơng nghệ sản xuất Bt đã được tiến thêm một bước mới,
chế phẩm Bt được sản xuất bằng phương pháp lên men chìm trong nồi lên
men tự chế tạo. Sau đó cơng nghệ sản xuất được triển khai áp dụng tại công ty
3

Thanh Sơn thành phố Hồ Chi Minh với quy mô nồi lên men dung tích 3m .
Chế phẩm sản xuất ở Cơng ty này được đánh giá tại Bộ môn Bảo vệ Thực vật,
Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội và tại Trại ươm rau giống, Ty Nông
nghiệp, tỉnh Lâm Đồng.
Trên cơ sở những kết quả đạt được đó, năm 1982 Ban khoa học kĩ thuật
Hà Nội (nay là Sở Khoa học và Cơng nghệ Hà Nội) và Chương trình Sinh học
phục vụ nông nghiệp của Uỷ ban Khoa học và Kỹ thuật nhà nước (nay là Bộ
Khoa học và Công nghệ) đã cho phép đề tài triển khai sản xuất tại Viện Cơng
3

nghiệp Thực phẩm trong nồi lên men chìm dung tích 5m . Chế phẩm dạng
dịch thể sản xuất tại đây được dùng phòng trừ sâu hại rau tại các vùng rau
ngoại thành Hà Nội. Để nâng cao hoạt tính và thời gian bảo quản chế phẩm,
các tác giả đã kết hợp với Tổng cục Hoá chất thử nghiệm công nghệ thu hồi
sản phẩm bằng máy sấy phun tại Cầu Diễn. Tuy nhiên do nhiều hạn chế về kĩ
thuật lúc đó, hiệu suất thu hồi thấp, bào tử bị chết nhiều và hoạt tính bị giảm
đáng kể.


Nhìn chung, trong thời kì này đã bước đầu sản xuất và áp dụng thành
công chế phẩm Bt đã khiến cho các nghiên cứu Bt của nước ta đã mở đầu khá
thuận lợi và tốt đẹp.
1.1.4.2 Thời kì sản xuất và áp dụng (1985-1994)
Tư liệu về thời kì này khó tra cứu, hầu như khơng có. Mặc dù đề tài
triển khai của nhóm Nguyễn Cơng Bình đã kết thúc, nhưng các chế phẩm Bt
sản xuất theo phương pháp dịch thể được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả phịng
trừ rất rõ rệt, hơn nữa giá bán khơng cao (khoảng 6000đồng/lít) nên hợp với
thu nhập của nông dân. Chế phẩm Bt có hiệu quả diệt sâu tơ mạnh trong khi
đó nó lại kháng với thuốc trừ sâu hố học. Điều đó khiến nông dân ư chuộng

thuốc trừ sâu Bt hơn. Một số đơn vị thuộc các trường đại học đề xuất và phát
triển phương pháp lên men hở không cần vô trùng phục vụ trực tiếp cho các
vùng trồng rau. Nhưng do số lượng bào tử trong các mẻ lên men không tương
quan tỷ lệ với hiệu quả diệt sâu, hơn nữa kĩ thuật sản xuất thủ công, thô sơ
nên hiện tượng nhiễm khuẩn và đặc biệt là nhiễm thực khuẩn thể không thể
khắc phục được làm hiệu quả diệt sâu kém thậm chí khơng diệt được sâu.
1.1.4.3 Thời kì nghiên cứu cơ bản, ứng dụng và phát triển (1995 - nay)
Cuối thời kì sản xuất và ứng dụng 1984-1994, chế phẩm Bt kém chất
lượng, không tiêu thụ được, một số cơ sở phải đóng cửa và chuyển sang sản
xuất các loại hàng hoá khác. Sản xuất và ứng dụng Bt bước vào thời kỳ thoái
trào, các nhà nghiên cứu lại phải quay lại nghiên cứu cơ bản để phục vụ cho
xây dựng công nghệ sản xuất và cho cơ sở ứng dụng.
Các tư liệu đã công bố về nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Bt rất phong
phú được rải đều trong suốt thời kì này, đặc biệt là trong 10 năm gần đây.
 Chế phẩm Bt dạng bột thấm ướt


Như trên đã đề cập, trước 1993 do thiếu thiết bị thu hồi, máy sấy phun
nên chúng ta không sản xuất được Bt dạng bột. Từ năm 1994, Viện Công
nghệ Sinh học đã được trang bị hệ thống lên men chìm đồng bộ của hãng
New Brunswick (Hoa Kỳ) với các nồi lên men dung tích 5,6 lít; 20 lít và 80
lít. Các thiết bị cho thu hồi sản phẩm (giai đoạn sau lên men) gồm có các loại
máy ly tâm, trong đó có ly tâm liên tục cơng suất 500 lít/giờ, máy sấy phun và
các loại tủ sấy. Với thiết bị hiện đại này, nhóm đề tài nhánh KHCN 02-07
“Hồn thiện công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Bacillus
thuringiensis... của Chương trình Cơng nghệ sinh học nhà nước 1996 -1998
và KHCN02 - 07B (1999 - 2000) lần đầu tiên ở Việt Nam đã sản xuất được
chế phẩm Bt dạng bột thấm ướt (wetable powder). Trên nền chất bột kỹ thuật
đó, các cơng thức phối trộn đã được thực hiện. Các chế phẩm đã hoàn thiện
hơn và điều tiến bộ nhất là đã tiêu chuẩn hoá được chế phẩm theo tiêu chuẩn

quốc tế. Hai chế phẩm mang nhãn hiệu BioBact WP dạng bột có hoạt lực
16000 IU/mg và BioBact EC dạng sữa có hoạt tính 4000 IU/ml được sản xuất.
 Chế phẩm Bt thế hệ mới
Một trong những hạn chế của thuốc trừ sâu sinh học là tính tác động
chọn lọc của nó, nghĩa là mỗi một gen mã hố một protein độc tố diệt sâu nhất
định nào đó. Vì vậy, muốn có một chế phẩm trừ được nhiều loại sâu thì chủng
sản xuất phải chứa một tổ hợp gen mã hóa các protein diệt sâu.
* Nguyên liệu để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học khá đa dạng. Ngoài
Bacillus thuringiensis được coi là nguồn nguyên liệu truyền thống, các sản
phẩm khác có nguồn gốc từ thiên nhiên cũng được thử nghiệm. Tại
Bangladesh, lợi dụng tập tính ghét tỏi của côn trùng, một nhà khoa học đã chế
biến thành công thuốc trừ sâu sinh học.