LUẬN văn THẠC sĩ CÔNG NGHỆ SINH học (FULL) sử dụng chỉ thị SSR để phân tích tính đa dạng di truyền của một số giống đậu tương có khả năng bệnh gỉ sắt khác nhau

1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây cơng nghiệp ngắn ngày, có
giá trị kinh tế cao, mang ý nghĩa trong cải tạo đất trồng, dễ canh tác, đặc biệt có
khả năng thích nghi với nhiều vùng sinh thái khác nhau. Hạt đậu tương chứa
30-55% protein, chứa nhiều loại amino acid không thay thế, 12-25% lipid và
các vitamin cần thiết cho cơ thể. Các sản phầm từ đậu tương được sử dụng
rộng rãi cho các mục đích khác nhau như làm thức ăn, dầu ăn, thực phẩm chức
năng, nguyên liệu cho y học và công nghiệp…Bên cạnh giá trị dinh dưỡng cao,
cây đậu tương cịn có khả năng cố định đạm nhờ vi khuẩn R. japonicum sống
cộng sinh trên rễ cây tạo thành các nốt sần, giúp cải tạo đất hiệu quả. Do đó,
cây đậu tương đã được quan tâm trồng và phát triển mạnh ở nhiều quốc gia
trên thế giới. Ở Việt Nam, đậu tương là nhóm cây trồng chính được ưu tiên
khuyến khích phát triển, sản xuất đứng sau lúa, ngô và lạc.
Việt Nam từng là một nước xuất khẩu đậu tương vào những năm 1980,
tuy nhiên cho đến nay nước ta đã trở thành nước nhập khẩu đậu tương với số
lượng lớn với hàng triệu tấn khô dầu đậu tương đang được nhập khẩu hàng
năm. Mặc dù diện tích gieo trồng có tăng hàng năm những năng suất thấp và
sản lượng đạt được không ổn định, khả năng chống chịu bệnh và các stress
kém. Sâu bệnh nói chung và bệnh gỉ sắt nói riêng là nguyên nhân trực tiếp ảnh
hưởng tới diện tích gieo trồng và làm giảm năng suất, chất lượng hạt đậu
tương, gây tổn thất lớn về kinh tế.
Bệnh gỉ sắt ở đậu tương do loài nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra và
đang được coi là một trong những mối đe dọa chính trên cây đậu tương gây
thiệt hại đáng kể, làm giảm từ 10-80% năng suất và chất lượng đậu tương ở
nhiều nước


trên thế giới trong đó có Việt Nam.

Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở đậu tương đã
được tiến hành và thu được một số kết quả đáng kể, tuy nhiên hầu hết các
nghiên cứu này mới chỉ tập trung vào việc giám sát quá trình phát triển
bệnh, nghiên cứu dịch tễ học, đánh giá sự thất thu năng suất hoặc phân tích
phản ứng bệnh mà chưa chú trọng nhiều đến việc tìm hiểu khả năng kháng
bệnh gỉ sắt. Việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền của tập đồn đậu tương có
phản ứng khác nhau đối với bệnh gỉ sắt khơng chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn
các giống có khả năng kháng bệnh mà cịn có ý nghĩa quan trọng trong cơng
tác chọn tạo giống có chất lượng cao.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi lựa chọn và thực hiện đề tài:
“Sử dụng chỉ thị SSR để phân tích tính đa dạng di truyền của một số
giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Đánh giá được mức độ đa dạng di truyền của một số giống đậu tương
kháng bệnh gỉ sắt khác nhau bằng chỉ thị SSR.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tách và nhân bản các phân đoạn SSR bằng phản ứng PCR - SSR.
- Nghiên cứu, phân tích mức độ đa dạng di truyền của các giống đậu tương
dựa trên chỉ thị SSR.


Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY
ĐẬU TƯƠNG
1.1.1. Cây đậu tương
Đậu tương hay đỗ tương, đậu tương (tên khoa học Glycine max) là loại
cây họ Đậu (Fabaceae), là loài bản địa của Đơng Á. Cây đậu tương được
thuần hóa và trồng nhiều ở Trung Quốc vào khoảng thế kỷ XVII trước cơng

ngun. Sau đó cây đậu tương được truyền bá và du nhập sang các nước Nhật
Bản, Thái Lan, Philipppin, Việt Nam....vài thế kỷ sau đó. Cây đậu tương được
trồng ở châu Âu và ở Hoa Kỳ vào khoảng thế kỷ XVII và XVIII. Loài
này giàu hàm lượng chất đạm protein. Hạt đậu tương có hàm lượng protein
cao từ 20% – 45% dễ tan và hầu hết chứa các loại axit amin, đặc biệt là các
loại axit amin không thay thế, vitamin E, muối khống, lipid...vì vậy người ta
đã chế biến đậu tương thành hơn 600 sản phẩm dinh dưỡng có giá trị khác
nhau. Sản phẩm của đậu tương được dùng làm thực phẩm cho người, thức ăn
gia súc, nguyên liệu cho cơng nghiệp, làm hàng xuất khẩu và là lồi cải tạo đất
trồng rất tốt.
Về đặc điểm hình thái, đậu tương là cây thân thảo, lá có ba loại: lá mầm,
lá nguyên và lá kép. Hoa đậu tương nhỏ không hương vị, có dạng cánh bướm.
Quả thuộc loại quả giáp, khó tách, hơi cong, lúc quả non có màu xanh, nhiều
lơng khi chín có màu nâu. Hạt có nhiều hình dạng: hình trịn, hình bầu dục,
trịn dẹt... có giá trị dinh dưỡng cao. Về đặc điểm di truyền, đậu tương có bộ
nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n = 40 là cây tự thụ phấn, ít có khả năng thụ phấn
9

chéo. Bộ gen đơn bội của đậu tương có từ 1,29 -1,8 x 10 bp. Thời gian sinh


trưởng của đậu tương được chia làm 3 loại: chín sớm, chín trung bình và chín
muộn.


Trên thế giới cây đậu tương được coi là một trong những cây lương thực
chiến lược của nhiều quốc gia như Mỹ, Brazil, Argentina, Trung Quốc, Thái
Lan...do khả năng thích nghi rộng với các điều kiện khí hậu và sinh thái khác
nhau nên đậu tương được trồng rộng rãi trên cả năm châu lục, tập chung nhiều
tại Châu Mỹ, sau đó là Châu Á. Hoa Kỳ là nước có diện tích trồng cây đậu

tương lớn nhất thế giới và được đầu tư sản xuất cây đậu tương với quy mô
công nghiệp. Diện tích đậu tương của các quốc gia những năm gần đây luôn
biến động, các nước như Hoa Kỳ, Barazil, Argentina tăng theo từng năm, còn
các nước thuộc lục địa Châu Á lại giảm như Nhật Bản, Việt Nam, Trung Quốc
lại giảm trong các năm gần đây được thể hiện qua bảng 1.1.
Bảng 1.1. Diện tích thu hoạch đậu tương một số nước trên thế giới

Quốc gia

Diện tích thu hoạch (Nghìn ha)
Năm 2010

Năm 2011

Năm 2012

Năm 2013

Hoa kỳ

78849447

79260943

80359578

85632823

Brazil

23327296

23968663

24975258

27864915

Nhật Bản

137700

136700

131100

128800

Argentina

18130799

18746227

17577320

19418825

Ấn Độ

9554190

10180000

10840000

12200000

Trung Quốc

8516115

7889055

6750080

6600100

Indonesia

660823

620928

567871

550793

Việt Nam

197800

181390

120751

119600

* Theo số liệu thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp quốc
(FAO) ().

Đậu tương là cây trồng lấy hạt, là cây cung cấp dầu quan trọng nhất trong
các cây lấy dầu. Hiện nay qua thống kê của FAO cho thấy từ năm 1980 trở lại


đây sản lượng đậu tương thế giới đã tăng lên 2 lần chủ yếu nhờ vào tăng năng
suất và diện tích, tuy có biến động qua các năm. Trong vịng 20 năm qua diện
tích gieo trồng tăng nhanh, năng suất bình quân tăng khá cao 23 tạ/ha. Các nước
sản xuất đậu tương đứng đầu thế giới: Mỹ, Brazin, Argentina và Trung Quốc
chiếm khoảng 90-95% tổng sản lượng đậu tương trên thế giới.
Bảng 1.2. Sản lượng sản xuất đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới

Quốc gia

Sản lượng ( nghìn tấn)
Năm 2010

Năm 2011

Năm 2012

Năm 2013

Hoa Kỳ

227932,4

224594

203008,3

240826,1

Brazil

68756,3

74815,5

65848,9

81699,8

Argentina

52677,4

48878,8

40100,2

49306,2

Trung Quốc

15083,2

14485,1

13050,2

12500,2

Ấn Độ

12736,8

12214

14666

11948

Indonesia

907

843,8

843,2

780

Thái Lan

177,1

176,2

180

190

Việt Nam

298,1

266,5

175,3

173,7

* Theo số liệu thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp quốc
(FAO) ().

Hàng năm diện tích và sản lượng cây đậu tương ln được các nước quan
tâm và đầu tư mở rộng. Trong đó Hoa Kỳ là nước có diện tích gieo trồng cây
đậu tương lớn nhất. Tuy diện tích và sản lượng có tăng nhưng luôn biến động
giữa các năm trở lại đây nguyên nhân có thể kể đến là do kỹ thuật canh tác,

Số hóa bởi Trung tâm Học
liệu

/>

biến đổi khí hậu gây hạn hán, hay dịch bệnh như phấn trắng, gỉ sắt... đã làm
ảnh hưởng

Số hóa bởi Trung tâm Học
liệu

/>

tới năng suất và sản lượng đậu tương không nhỏ. Năng suất đậu tương của các
nước cũng biến động tăng giảm theo từng năm

1.3).


Bảng 1.3. Năng suất đậu tương một số nước trên thế giới

Quốc gia

Năng suất (tấn/ha)
Năm 2010

Năm 21011

Năm 2012

Năm 2013

Brazil

2947,5

3121,4

2636,6

2932,0

Hoa kỳ

2922,4

2819,9

2664,2

2914,5

Argentina

2905,4

2607,4

2281,4

2539,1

Thái Lan

1972,5

1963,1

1800,0

1792,5

Trung Quốc

1771,1

1836,1

1933,3

1893,9

Indonesia

1372,6

1359,0

1484,8

1416,1

Ấn Độ

1333,0

1199,8

1353,0

979,3

Việt Nam

1509,6

1469,4

1451,7

1452,3

* Theo số liệu thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên
hợp quốc (FAO) ().
Ở Việt Nam, hiện nay đậu tương được trồng trên cả 7 vùng nơng nghiệp,
trong đó vùng núi phía Bắc có diện tích gieo trồng lớn nhất là 46,6%, đồng
bằng Sông Hồng 19,3%, vùng Tây Nguyên 11%, miền Đông Nam Bộ 10,2%,
đồng bằng Sông Cửu Long 8,9%, khu Bốn 2,3% và vùng Duyên hải miền
Trung 1,6% [4]. Cây đậu tương chiếm một vị trí rất quan trọng trong nền

nơng nghiệp nước ta, đặc biệt là ở những vùng nông thôn nghèo, kinh tế chưa
phát triển. Tuy nhiên việc sản xuất đậu tương ở trong nước vẫn chưa được
đầu tư cao, năng suất còn thấp, do vậy nghiên cứu cải tiến các đặc điểm nông
học của các giống địa phương và tạo giống mới có năng suất cao, thích nghi
với điều kiện sinh thái ở những vùng khác nhau bằng phương pháp truyền
thống kết hợp với hiện đại sẽ đáp ứng được yêu cầu của thực tiễn đặt ra và đó
cũng là chiến lược quan trọng về sự phát triển cây đậu đỗ ở nước ta.
Năm 2013, Việ

556 nghìn tấ


, giảm 3,7% so với năm trƣớc nhƣng tăng 145% so với năm 2011. Đế
ụ 2013/14, với tình hình ngành công nghiệ

ự

tăng trƣờng, lƣợng xuất khẩu đậu tƣơng đƣợc dự đốn sẽ lên 600 nghìn tấn.
Cũng trong

2012/13, với sự phục hồi của ngành thức ăn sau suy thoái

kinh tế, tổng lƣợng khô đậu tƣơng nhập khẩu tăng trở lại đạt 2,97 triệu tấn,
tăng 19% so với năm trƣớc. Đây là lĩnh vực tiếp tục đƣợc cải thiện và USDA
dự đoán sẽ tăng nhẹ, đạt 3,1 triệu tấn vào năm 2014 và 3,2 triệu tấn năm
2015. Sản lƣợng dầu đậ

2013 đã giảm 9,8% do

nhu cầu thấp hơn so với dự kiến, lƣợng xuất khẩu cũng giảm xuống còn 13%

so với năm 2012 do sản lƣợng
thấp.
Bảng 1.4. Diện tích, năng suất, tổng sản lượng của đậu tương của nước ta
trong năm 2011, 2012, 2013 và dự báo trong các năm tiếp theo 2014 -2015

Năm
(nghìn ha)
Năng suất (tấn/ha)
Tổng sản lượng
(nghìn tấn)

2011

2012

2013

2014*

2015*

181,1

119,6

117,8

120

130

1,47

1,45

1,43

1,47

1,48

266,9

173,7

168,4

176,4

192,4

*

Điều kiện thời tiết không thuận lợi đã khiến sản lƣợng đậu tƣơng nƣớc
ta
năm 2013 giảm 3% so với năm 2012, xuống còn 168 nghìn tấn. Mƣa bão nặ


ốt năm đã khiến năng suất cây trồng và diện tích thu hoạch đậ
1.1). Quy mơ sản xuất nhỏ lẻ so với các loại cây trồng khác chính là

nguyên nhân khiến ngành đậu tƣơng vẫn không đáp ứng đƣợc nhu cầu tiêu
thụ
trong nƣớc. Tổ chức USDA dự báo nếu điều kiện thời tiết thuận lợi, diện tích


12

gieo trồng đậu tƣơng năm 2013 và 2014 lần lƣợt đạt 120 nghìn và 130
nghìn
héc-ta, với mức sản lƣợng tăng nhẹ khoảng 176 và 192 nghìn tấn. Khả năng
cạnh tran

ậu tƣơng so với ngơ vẫn cịn thấ

ỗi

héc-ta trồng đậu tƣơng thấp hơn so với trồng ngơ. Khu vực trồng đậu
tƣơng

chính tập trung ở vùng Đồng bằng sông Hồng, miền Bắc nƣớc ta.
1.1: Diện tích trồng và sản lượng cây đậu tương tại Việt Nam
(2011-2015)
* Nguồn: Tổng cục Thống kê Việt Nam, *số liệu dự báo

Sự biến động sản lượng, năng suất hay diện tích đậu tương của nước ta
là khơng cao, dự kiến các năm tiếp theo 2014 và 2015 cũng tăng không đáng
kể, nguyên nhân là người dân và nhà nước vẫn chưa đầu tư sâu sắc tới cây
đậu tương, bên cạnh đó bệnh dịch hại cây hay điều kiện khí hậu....làm thiện
hại đáng kể sản lượng đậu tương.
1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương

13

Hạt đậu tương có thành phần chủ yếu là protein, lipid, glucid, các
vitamin và các chất khoáng. Trong hạt đậu tương, hàm lượng protein chiếm
từ 30-55%. Protein được dự trữ trong bào quan có chức năng cung cấp


nguồn amino acid và nitơ hoặc là các enzyme tham gia vào quá trình nảy
mầm của hạt. Loại potein được dự trữ chủ yếu ở hạt đậu tương là globulin..
Ở đậu tương, hàm lượng lipid chiếm từ 12-25% khối lượng khô. Chất
lượng lipid của hạt đậu tương rất tốt, cho nên nó được sử dụng rộng rãi trong
cơng nghiệp chế biến thực phẩm. Hạt đậu tương cịn có các loại vitamin tan
trong lipid, đặc biệt là vitamin E. Ngoài ra, trong hạt đậu tương còn chứa một
số chất khác như carbohydrade, muối khống, nucleic acid, kích thích sinh
trưởng.
Các protein của lá đậu tương chủ yếu là các protein liên quan đến q
trình trao đổi chất và chuyển hóa năng lượng. Đó là các protein có liên quan
đến q trình vận chuyển điện tử, các enzyme, các protein dự trữ, hoặc các
protein có liên quan đến các q trình trao đổi và chuyển hóa của các amino
acid hoặc các protein liên quan đến tính kháng bệnh, stress. Một số nghiên
cứu phân tích hệ protin lá đậu tương đã đưa ra nhận xét rằng một số đoạn
protein có chức năng bảo vệ, một số protein có liên quan đến tính khàng bệnh
gỉ sắt [17], [47].
Tóm lại, hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng rất cao, giá trị của nó
được đánh giá đồng thời cả về hàm lượng protien và lipid. Trong đó do hàm
lượng protein cao là yếu tố quan trọng làm cho cây đậu tương trở thành nguồn
thực phẩm quan trọng cho người, động vật và ngoài ra cây đậu tương còn
dùng làm thuốc chữa bệnh rất tốt, nhất là hạt đậu tương có mầu đen.

1.2. BỆNH GỈ SẮT VÀ TÍNH KHÁNG BỆNH GỈ SẮT Ở CÂY ĐẬU
TƯƠNG
1.2.1. Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương
Bệnh gỉ sắt do nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra là một trong những
bệnh chính trên cây đậu tương (Glycine max) ở Châu Á và gây thiệt hại đáng
Số hóa bởi Trung tâm Học
liệu

/>

kể về năng suất ở các nước trồng đậu tương. Hầu hết các nước nhiệt đới và
cận nhiệt đới đều ghi nhận có sự xuất hiện của bệnh gỉ sắt đậu tương địa
phương [50]. Ở Đài Loan, bệnh gỉ sắt có thể gây thiệt hại nghiêm trọng trên
cây đậu tương không được bảo vệ bằng thuốc trị nấm và ở một số vùng, bệnh
gỉ sắt là một yếu tố làm giới hạn việc sản xuất đậu tương vụ xuân. Do sự thiếu
thông tin về bệnh gỉ sắt đậu tương ở Tây Bán cầu và nguy cơ tiềm năng ảnh
hưởng đến việc sản xuất đậu tương ở Mỹ, Bộ Nông nghiệp Mỹ, Phịng thí
nghiệm Nghiên cứu Bệnh Thực vật và Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển
Rau Châu Á (AVRDC) đã khởi động một dự án hợp tác vào năm 1978 để
nghiên cứu dịch tể học của bệnh gỉ sắt đậu tương. Dự án hợp tác này kéo dài
đến năm 1982 và các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt đậu tương được tiếp tục tiến
hành ở AVRDC cho đến năm 1992.
Ngoài ra, FAO đã thiết lập một mạng lưới nghiên cứu về bệnh gỉ sắt đậu
tương liên kết các nước Châu Á. Chương trình quốc gia của Thái Lan đã và
đang tiến hành các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt đậu tương với các chương trình
lai giống chủ động kéo dài hơn 10 năm qua [34]. Ở Indonesia, bệnh gỉ sắt
được xem là loại bệnh nghiêm trọng nhất trên cây đậu tương, xuất hiện cả ở
mùa mưa và mùa khô. Các hoạt động nghiên cứu ở Indonesia bao gồm cải
thiện tính kháng

, thử nghiệm thuốc trị nấm, sự tồn lưu của hạ bào tử

trên đồng ruộng, quản lý bệnh gỉ sắt thông qua trồng thử nghiệm và các
nghiên cứu về sự phát tán bào tử.
Dấu hiệu và triệu chứng bệnh: là những chấm màu trong ở phiến lá, cỡ
1mm, sau lớn dần và chuyển màu vàng rồi nâu, đạt tới kích thước từ 2-5mm
với hình đa dạng, có góc cạnh. Ở mặt dưới phiến lá xuất hiện lớp bột màu nâu
đó là các bào tử hạ của nấm, khi bệnh phát triển rộng ra trên các lá nó sẽ làm
rách phiến lá, các bào tử được phát tán nhờ gió. Ở điều kiện thích hợp (15Số hóa bởi Trung tâm Học
liệu

/>

0

30 C), ẩm ướt nó sẽ nảy mầm và xâm nhập vào lá qua các lỗ khí khổng. Vết
bệnh có thể hình thành ở các bộ phận của cây. Bệnh thường phát triển mạnh
vào thời điểm cây đậu tương ra hoa, từ lá tầng thấp rồi lan lên lá tầng trên,
làm lá vàng khô rồi rụng hàng loạt. Bệnh này xảy ra quanh năm và gây thiệt
hại tới 40-50% năng suất hạt.

Hình 1.2.

Quá trình nhiễm bệnh bắt đầu khi bào từ hạ nảy mầm để hình thành một
ống mầm phát triển trên bề mặt lá (đường kính 5-400 µm) cho đến khi sợi áp
hình thành. Tùy vào điều kiện thời tiết mà thời gian lây nhiễm bệnh kéo dài
theo từ 15 tuần tới 20 tuần.
1.2.2. Tính chống chịu bệnh gỉ sắt của cây đậu tương
Tính chống chịu bệnh gỉ sắt là khả năng cho năng suất tương đối của cây
dưới áp lực của bệnh gỉ sắt. Để so sánh năng suất tương đối, người ta so sánh

một dòng được trồng trên ô được và không được bảo vệ bằng thuốc trừ nấm.
Mặc dù cần có thêm diện tích ruộng, tính chống chịu cần được đánh giá vào
mỗi mùa vụ chứ không giống như việc thu thập dữ liệu đường cong tiến triển
bệnh, sự rụng lá và đếm nốt bệnh cho tính kháng gây giảm tốc độ phát bệnh.
Số hóa bởi Trung tâm Học
liệu

/>

Sự tương tác giữa vật chủ và vật ký sinh theo mơ hình tương tác gen đối
gen (gen for gen). Đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện thấy có năm gen
chính liên quan đến tính kháng bệnh gỉ sắt ở đậu tương bao gồm: gen Rpp1,
gen Rpp2; gen Rpp3; gen Rpp4; gen Rpp5 và gen Rpp6. Các nghiên cứu về
gen cho thấy sáu gen Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4, Rpp5 và Rpp6 đã được phát
hiện và mơ tả có khả năng liên quan tới tính kháng đối với một số chủng nấm
P.pachyrhizi. Tuy nhiên vẫn chưa có nghiên cứu nào công bố giống đậu
tương nào kháng được với tất cả các chủng nấm P.pachyrhizi.
1.2.3

ở cây

đậu tương
Trên thế giới, đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về gỉ sắt [35], [36],
[37], [38], [39], [40], [43], [44]. Ở các nước trên thế giới, bệnh gỉ sắt gây thiệt
hại nghiêm trọng đến cây đậu tương và một số cây trồng khác, làm hạn chế
năng suất đậu tương vụ xuân. Vì vậy ở nhiều quốc gia trên thế giới đã có rất
nhiều cơng trình nghiên cứu khắc phục và chọn tạo nhiều giống đậu tương có
tính kháng bệnh gỉ sắt cao và năng suất vợt trội như: giống Tainung 4 có sức
kháng bệnh nhiều hơn các giống khác. Các nước đã đầu tư rất nhiều kinh phí
và thời gian vào các dự án nghiên cứu, có dự án kéo đài tới chục năm như:

Mỹ, Brazil, Trung Quốc… Ở Đài Loan và Thái Lan, nhiều dịng đã được chọn
và sàng lọc thử nghiệm tính chống chịu bệnh gỉ sắt [34]. Dựa trên phần trăm
gia tăng năng suất khi so sánh giữa các dòng, người ta đã xác định được các
dịng tính chống chịu cao hoặc có thể kháng một phần.Thiệt hại năng suất của
các dịng chống chịu này thường ít hơn so với các dịng có năng suất cao
khác. Xu hướng tương tự cũng xảy ra ở những dòng bị giảm sút ở chỉ tiêu
trọng lượng 100 hạt. Các dòng mang khả năng chống chịu bệnh gỉ sắt có diện
tích lá bị bệnh nhỏ nhất hoặc có tính kháng một phần dựa trên số lượng vết
Số hóa bởi Trung tâm Học
/>liệu


bệnh trên mắt lá. Gần đây, cùng với mức độ phần trăm tăng năng suất thì chỉ
tiêu chống chịu stress đã được áp dụng trong đánh giá tính chống chịu bệnh gỉ
sắt bằng cách sử dụng các ô ba chiều để chia các nguyên liệu khảo nghiệm ra
thành bốn nhóm. Mặt phẳng X -Y (X: tính độc bệnh, Y: năng suất phần trăm)
được chia thành bốn đoạn bằng cách vẽ các đường phần cắt tại điểm chính
giữa của trục X và trục Y. Trục Z thể hiện mức độ chống chịu stress mà một
dịng có được ở bất kỳ nhóm nào trong bốn nhóm.
Bằng kỹ thuật phân tử, những biến đổi ở mức độ alen và tính di truyền
được tìm thấy ở đậu tương. Verma và cộng sự (1996) đã công bố về những
biến đổi alen của SSR ở mức độ cao trong sinh chất mầm đậu tương [41].
Theo ông, có 28 alen SSR được nhắc lại trong nhóm 96 kiểu gen đậu tương.
Akkaya và cộng sự(1992) đã lập bản đồ 40 locus SSR ở đậu tương cùng với
118 chỉ thị RFLP và RAPD [20].. Ngoài ra, Abe và cộng sự (2003) đã phân
tích 20 locus SSR của 131 giống đậu tương từ 14 nước Châu Á và nhận thấy
rằng trung bình trên mỗi locus SSR có đến 11,2 alen. Họ cũng đã nhận ra sự
khác nhau về nguồn gốc di truyền giữa tập đoàn giống đậu tương ở Nhật Bản
và Trung Quốc [21].. Các phát hiện của của nhóm nghiên cứu này đã chỉ ra
rằng các giống đậu tương của các nước Đông Nam Á và Trung Á phần lớn bắt

nguồn từ Trung Quốc. Trong khi đó, Cregan và cộng sự (1999) đã sử dụng
đồng thời các chỉ thị SSR, RAPD, AFLP và thiết lập được bản đồ gen với 20
nhóm gen liên kết ở đậu tương trên cơ sở ba quần lai của các trường đại học
Iowa, Utah và Nebraska [25].
Hiện nay ở Việt Nam, mặc dù cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)
chiếm một vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp và nền kinh tế quốc dân,
nhưng diện tích trồng và sản lượng vẫn cịn rất thấp so với các nước trên thế
giới. So với năm 2001, diện tích trồng đậu tương ở nước ta trong năm 2005
Số hóa bởi Trung tâm Học
liệu

/>

tăng 24,16%, sản lượng tăng 29,10%. Nhưng đáng chú ý là năng suất đậu
tương gần như không tăng hoặc tăng không đáng kể, do nhiều nguyên nhân
như hạn chế về giống và điều kiện canh tác, bên cạnh đó là các bệnh sương
mai, phấn trắng, gỉ sắt… là những loại bệnh thường xuyên xuất hiện gây ảnh
hưởng nghiêm trọng tới tình hình sản xuất đậu tương. Thực tiễn này địi hỏi
phải có sự đánh giá, lựa chọn các giống đậu tương mới có năng suất cao, chất
lượng tốt đồng thời có khả năng kháng được các bệnh, đặc biệt là bệnh gỉ sắt
[12]. Trong những năm gần đây, các công trình nghiên cứu về bệnh gỉ sắt đậu
tương đã được tiến hành nhiều nơi trên thế giới và ở Việt Nam [17], [32],
[33], [34], [35], [36], tuy nhiên việc nghiên cứu một các hệ thống về bệnh gỉ
sắt và khả năng kháng bệnh này ở cây đậu tương cịn ít được đề cập đến.
Ở nước ta, kết quả thí nghiệm của một số tác giả thuộc trường Đại học
Nông nghiệp Hà Nội cho thấy các giống đậu tương trồng đều bị nhiễm bệnh
với các mức độ khác nhau. Các giống ít bị bệnh hay bị nhiễm muộn trên đồng
ruộng hiện nay là M103, DT93, DT84, AK03, AK05, VX93, dòng 42. Các
giống nhiễm bệnh nặng là V74 (DT74) và DH4. Trong nghiên cứu về mối
quan hệ di truyền của 19 giống đậu tương Việt Nam với 25 cặp mồi bằng chỉ

thị RADP, tác giả Đinh Thị Phòng và cộng sự cho thấy có 17/25 mồi có tính
đa hình với giá trị PIC (Polymorphic Information Content-Hàm lượng thơng
tin đa hình) dao động từ 0,11 đến 0,6, trong đó có 3 mồi có tính đa hình cao
(PIC>0,5). Ngồi ra, tác giả cũng cho rằng các giống có tính chống chịu với
điều kiện bất lợi của môi trường như giống HL92 (kháng bệnh xoăn lá và thối
quả) và HL203 (chống chịu khá với sâu bệnh) đều nằm trong cùng nhóm phụ
III và có hệ số sai khác di truyền 0,114. Hoặc hai giống M103 (chịu nóng) và
giống DT84 (chịu lạnh và chịu úng) đều nằm trong nhóm phụ II và có hệ số
sai khác di truyền 0,082 [12].
Số hóa bởi Trung tâm Học
liệu

/>

Những năm gần đây, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ -Viện
Cây lương thực và cây thực phẩm đã nghiên cứu, lai tạo và kiểm định được
một số giống có khả năng kháng với bệnh gỉ sắt như: DT2000, CBU8325,
DT95. Giống DT2000 được công nhận là giống Quốc gia có khả năng kháng
cao đối với gỉ sắt ở các mùa vụ khác nhau. Các nghiên cứu sử dụng chỉ thị
SSR bước đầu khả quan. Như vậy, do các đoạn SSR có mức độ đa hình cao
và phân bố ngẫu nhiên trong hệ gen đậu tương nên chúng có thể cung cấp
những dẫn chứng chính xác và tin cậy trong nghiên cứu sinh học phân tử, di
truyền học và lai tạo giống cây trồng.
Trong nghiên cứu của Vũ Thanh Trà và cộng sự (2006), mười một giống
đậu tương bao gồm các giống nhập nội như DT2000 (có khả năng kháng bệnh
gỉ sắt), DT12, VX92 và VX93 (có năng suất cao), các giống địa phương như
Cúc Vàng, Vàng Mường Khương và CBU8325 (có khả năng chịu sâu, nấm và
chịu hạn tốt) và các giống tạo ra từ bằng phương pháp đột biến như DT84,
DT95, M103 và DT96, con lai của DT84 và DT90 (có khả năng kháng bệnh
gỉ sắt) được đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt dựa trên chỉ số tích luỹ bệnh

theo thời gian AUDPC kết hợp các phân tích về phản ứng bệnh, khả năng tạo
bào tử và tạo quầng [17]. Kết quả cho thấy, các giống DT95 và CBU8325 có
chỉ số AUDPC thấp khả khả năng kháng bệnh gỉ sắt gần tương đương với
giống kháng đối chứng (DT2000). Hạt giống của các giống này được tiếp tục
nghiên cứu về chất lượng hạt trên phương diện hố sinh và cho thấy chúng có
hàm lượng protein và lipid từ trung bình đến cao, có mặt đầy đủ các loại dự
trữ chính, đảm bảo là nguồn cung cấp thực phẩm có chất lượng dinh dưỡng
cao cho con người và gia súc.


1.3. M T S C

PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI

TRUYỀN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG
Hiện nay trong phân tích tính đa dạng di truyền của thực vật người ta có
thể tiến hành thực hiện ở các cấp độ và phương pháp khác nhau, từ các đặc
điểm hình thái, sinh lý và hố sinh đến đặc điểm của phân tử DNA, protein.
Phân tích đa dạng di truyền ở đậu tương dựa trên một số phương pháp như chỉ
thị hình thái, chỉ thị hố sinh và chỉ thị phân tử DNA.
1.3.1. Chỉ thị hình thái
Chỉ thị hình thái là một chỉ thị đồng trội, thường được biểu hiện dưới
dạng một tính trạng được kiểm soát bởi một locus đơn lẻ như các gen quy định
màu sắc hoa và hình dạng của hạt, vỏ... Mặc dù chỉ thị hình thái được sử dụng
như một chỉ thị di truyền, song khả năng ứng dụng của nó trong chọn giống
gặp phải nhiều hạn chế bởi chúng luôn chịu ảnh hưởng của các nhân tố di
truyền như sự tương tác giữa các sản phẩm của gen. Các nhân tố môi trường
như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm cũng có tác động qua lại giữa kiểu gen và kiểu
hình, gây ảnh hưởng không nhỏ đến các giai đoạn phát triển của thực vật.
Biểu hiện khả năng kháng và nhiễm bệnh về mặt hình thái ở thực vật

được xác định theo các tiêu chí nhất định. Đây là chỉ thị quan trọng để tìm
kiếm và tạo giống kháng bệnh. Ví dụ như bệnh gỉ sắt được xác định trên cơ sở
đánh giá vết bệnh trên lá, mức độ tạo quầng, mức độ tạo bào tử, từ đó có thể
phân biệt được các giống đậu tương kháng tốt, kháng trung bình và mẫn cảm
với bệnh.
Hơn nữa, một số tính trạng trội được tạo ra theo ý muốn của con người
thông qua đột biến. Các tác nhân này gây ra một số hiện tượng như lùn, bạch
tạng... có hại cho cơ thể của thực vật. Tuy nhiên, nhờ sự phát triển của các chỉ
thị phân tử DNA và chỉ thị hoá sinh học, những khó khăn trên đang từng bước


được giải quyết [17].
1.3
Các chỉ thị hố sinh có trong hầu hết các protein đa hình như isozymevà
các protein dự trữ (stograge protein). Các isozymecó thể được phân tách theo
trọng lượng, kích thước phân tử và các chất mang. Nhờ vậy, bằng kỹ thuật
điện di trên gel tinh bột hoặc gel polyacrylamide, người ta có thể phát hiện ra
các biến dạng khác nhau của phân tử enzyme, ví dụ như isozymeamylase,
esterase… Các biến dạng này có thể cung cấp thơng tin như là một loại chỉ thị
đồng trội.
Phương pháp phân tích isozyme tiết kiệm về mặt kinh tế, kỹ thuật và
đơn giản hơn phân tích DNA. Tuy nhiên, isozyme là sản phẩm của gen, số
lượng của chúng có hạn và chúng chỉ thể hiện ở những giai đoạn nhất định
quá trình phát triển của cá thể. Vì vậy, loại chỉ thị này chỉ phản ánh chính xác
một phần bản chất di truyền.
Hiện nay, kỹ thuật điện di 2 chiều (2-DE, two-dimensional
electrophoresis) là kỹ thuật phân tách protein theo điểm đẳng điện (chiều thứ
nhất) và theo trọng lượng phân tử (chiều thứ hai) . Kỹ thuật này ngày càng trở
thành một công cụ được ứng dụng rộng rãi nhằm phân tách các phức hợp
protein trong tế bào, mô và cơ thể [17].

1.3.3.Chỉ thị phân tử
Kỹ thuật RAPD là phương pháp khuếch đại ngẫu nhiên DNA để phân
tích sự đa dạng di truyền, kỹ thuật này được phát hiện vào năm 1990 bởi
Welsh và cộng sự [42]. RAPD đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu sự
đang dạng di truyền của cùng một loài hoặc sự khác biệt di truyền của những
loài khác nhau. Mồi được sử dụng trong kỹ thuật RAPD là những sợi
Số hóa bởi Trung tâm Học
/>liệu


oligonucleotide gồm 10 cặp nucleotide có trình tự sắp xếp ngẫu nhiên. Các
sản phẩm RAPD được phân tách bằng cách điện di trên gel agarose. Hệ gen
của các đối tượng khác nhau hoặc của hai loài sẽ cho sự khác nhau về những
phân đoạn DNA, từ đó có thể so sánh sự đa dạng sinh học của các đối tương
nghiên cứu.
Về nguyên tắc, kỹ thuật RAPD dựa trên phản ứng PCR (Polymerase
Chain Reaction), bằng cách sử dụng những mồi ngắn có trình tự biết trước,
bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với
trình tự của các mồi. Mồi (primer) là những đoạn oligonucleotide ngắn, một
mạch (khoảng 10 nucleotide) được tổng hợp một cách ngẫu nhiên, có hàm
lượng G+C cao (từ 60-70%) và khơng có đầu tự bổ sung. Các mồi dùng trong
RAPD thường ngắn vì vậy dễ dàng tìm được các đoạn tương đồng trên mạch
đơn DNA của hệ gen. Việc sử dụng chỉ thị RAPD trong việc nghiên cứu đa
dạng và lập bản đồ di truyền của các locus đặc trưng bao gồm các bước sau:
(i)Thiết kế mồi; (ii) Chuẩn bị mẫu DNA và chạy PCR; (iii) kiểm tra sản phẩn
nhân bản trên gel agarose; (iv) Phân tích kết quả bằng phần mềm chuyên
dụng; (v) Xác định hệ số đồng dạng di truyềnvà thiết lập sơ đồ quan hệ di
truyền của các đối tương nghiên cứu. Các sinh vật cùng lồi có kiểu gen hồn
tồn giống nhau thì các đoạn DNA được khuếch đại sẽ có kích thước giống
nhau, khi sử dụng bất kỳ mồi ngẫu nhiên nào trong phản ứng PCR-RAPD.

Với các sinh vật khác loài, khi sử dụng các mồi ngẫu nhiên trong phản ứng
PCR-RAPD, các đoạn DNA được khuếch đại sẽ có kích thước khác nhau. Để
tìm sự khác biệt giữa các loài, người ta thường sử dụng các mồi ngẫu nhiên
với số lượng lớn.
Kỹ thuật RAPD được ứng dụng phổ biến trong nghiên cứu tính đa dạng
di truyền các giống, phát hiện khả năng di truyền liên quan đến một tính trạng
Số hóa bởi Trung tâm Học
liệu

/>

hoặc thiết lập bản đồ di truyền. Có rất nghiều nghiên cứu đã được thực hiện
trên thế giới và Việt Nam sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu đa dạng sinh
học như ở Brazil về nghiên cứu trên đối tượng ngô, ở Hy Lạp trên đối tượng
chè, ở Việt Nam trên nhiều đối tượng cây trồng [12], [13], [19].
Chỉ thị SSR
Kỹ thuật SSR do Litt và Luty (1989) [28], phát hiện lần đâu tiên người.
SSR là một đoạn DNA có sự lặp lại của một trật tự nucleotide

nào đó.

Hiện tượng tồn tại các SSR trong cơ thể sinh vật nhân chuẩn là khá phổ biến.
Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có
thể thay đổi từ 1 đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ
2 đến hàng ngàn lần hoặc nhiều hơn. Các đoạn lặp lại hai, ba, bốn nucleotide
như (CA)n, (AAT)n và (GATA)n phân bố rộng rãi trong hệ gen của các loài
động và thực vật. Phương thức lặp lại được phân thành 3 loại chính: lặp lại
hồn tồn (các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau); lặp lại khơng hồn tồn
(xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một số nucleotide khác); lặp lại phức tạp (sự
xen kẽ giữa những đơn vị lặp lại khác nhau).

Việc sử dụng các chỉ thị SSR trong lập bản đồ di truyền của các locus
đặc trưng bao gồm các bước sau: (i) Phân lập đoạn SSR từ thư viện hệ gen;
(ii) Xác định trình tự của vùng có SSR; (iii) Xác định các cặp mồi đặc trưng là
các trình tự DNA bảo thủ giới hạn hai đầu của đoạn SSR; (iv) Nhân vùng gen
tương ứng bằng PCR sử dụng các mồi đặc trưng; (v) Phân tích kích thước của
sản phẩm PCR nhằm xác định được sự có mặt của các alen SSR.
SSR là cơng cụ hữu ích của phân tích hệ gen, lập bản đồ gen và đặc biệt
là chọn giống phân tử vì đây là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện tính đa
hình rất cao. Song nhược điểm cơ bản của chỉ thị này là quá trình thiết kế mồi
đắt đỏ, mỗi một loại mồi chỉ đặc trưng cho một lồi nhất định [25], [31], [33].
Số hóa bởi Trung tâm Học
liệu

/>

Trong thực tế, chỉ thị này đã được sử dụng trong chọn lọc tính kháng bệnh,
nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất cây trồng, các bệnh hại.
Kỹ thuật này được sử dụng trong việc phân định sự sai khác giữa các giống
trong cùng một loài phụ do khả năng cho phép đánh giá mức độ đa hình các
alen thuộc cùng một locus.
Các DNA vi vệ tinh hay các trình tự lặp lại đơn giản (simple sequence
repeats – SSRs) có mặt khắp nơi trong hệ gen của sinh vật nhân thực. Trong
thập kỷ qua, các chỉ thị này đã được nghiên cứu và khẳng định rất hữu dụng
trong phân tích hệ gen và phân tích quan hệ di truyền, xác định khoảng cách
di truyền, ước tính dịng chảy gen và xây dựng bản đồ liên kết [33], [40]. Mặc
dù các chỉ thị SSR có tính ưu việt rất lớn trong việc nghiên cứu di truyền hệ
gen, phân tích đa dạng di truyền, xác định khoảng cách di truyền và xây dựng
bản đồ liên kết… Tuy nhiên, cho đến nay chỉ có một số lượng rất ít các cơng
trình nghiên cứu cơng bố về một số lượng khơng lớn các chỉ thị SSR trong
nghiên cứu genome đậu tương. Hạn chế của kỹ thuật SSR là tốn kém về tiền

của và công sức trong việc thiết lập cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình.
Trong nghiên cứu đa dạng di truyền, SSR được áp dụng để nghiên cứu
đa dạng trên cả đối tượng động vật và thực vật vì nó cho độ đa hình cao và
đáng tin cậy. Ở thực vật, tần số và số lượng SSR đã được xác định trên một số
loài như lạc, mơ, lúa mì [10], [12], [16], và đang phát triển ở các giống cây
trồng khác như đậu tương [17]. Trong việc nghiên cứu tạo giống mới, chỉ thị
SSR liên quan đến một số tính trạng đã được xác định như chọn giống nhờ chỉ
thị (marker-assistedselection). Chọn các dịng lúa có năng suất cao và hàm
lượng protein dự trữ cao hoặc để xác định mối quan hệ họ hàng giữa các
giống cây trồng ở một số đối tượng như: lúa, mía, đậu tương hay xác định
giới tính thực vật trên đối tượng đu đủ.
Số hóa bởi Trung tâm Học
liệu

/>