SKKN: Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp

… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HƯNG YÊN
TRƯỜNG THPT TIÊN LỮ

SÁNG KIẾN KINH NGHIỆM
Năm học: 2012 – 2013
Mụn: Sinh học
Đề tài: “ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC
THỰC VẬT TRONG NÔNG NGHIỆP”

Người thực hiện: ĐỖ NGỌC THÁI

Tiên Lữ, tháng 4 năm 2013

PHẦN A: ĐẶT VẤN ĐỀ
I. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Thế kỉ XXI là thế kỉ của cơng nghệ sinh học, nó đang trở thành ngành khoa học mũi nhọn
và then chốt của nhiều nước. Sự phát triển của công nghệ sinh học là một trong những tiêu chí
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái
-1Trường THPT Tiên Lữ


… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

hàng đầu để đánh giá trình độ phát triển của một nước nào đó. Chính vì vậy, các nước đã tập
trung rất ngân sách của và nhân lực cho sự phát triển của ngành công nghệ sinh học
(biotechnology).
Với tầm quan trọng như vậy nên ở tất cả các Trường Đại học: Nông nghiệp, Lâm nghiệp,

Thủy Sản, Y học và Sự phạm đều có bộ mơn hay khoa cơng nghệ sinh học.
Trong chương trình mơn Sinh học và Cơng nghệ Trung học phổ thơng có khoảng từ 5 -10
bài học có liên quan đến cơng nghệ sinh học. Trong các đề thi tuyển sinh đại học có khoảng 2 5 câu hỏi trắc nghiệm có liên quan đến cơng nghệ sinh học. Điều này địi hỏi các đồng chí giáo
viên và các em học sinh phải có những hiểu biết sâu sắc và tồn diện về cơng nghệ sinh học. Tuy
nhiên, do đây là nội dung mới nên các đồng chí giáo viên và các em học cịn nhiều bỡ ngỡ.
Xuất phát từ những lí do trên, nên khi tiến hành nghiên cứu viết sáng kiến kinh nghiệm,
tôi đã mạnh dạn chọn đề tài:
“Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nơng nghiệp”

II. MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI
1- Mục đích :
Xây dựng và hồn thiện chun đề “ Ứng dụng cơng nghệ sinh học thực vật trong nông
nghiệp” và trở thành nguồn tư liệu quý cho giáo viên và học sinh.
2- Yêu cầu :
Trình bày được ứng dụng của cơng nghệ sinh học thực vật trong các lĩnh vực sau:
- Vi nhân giống bằng nuôi cấy mô thực vật
- Tạo cây đơn bội bằng ni cấy hạt phấn
- Chọn dịng tế bào thực vật
- Lai tế bào thực vật
- Chuyển gen thực vật
- Thành tựu công nghệ sinh học thực vật ở Việt Nam
III. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
Sự hoàn thiện đề tài này sẽ trở thành nguồn tư liệu phong phú giúp cho mỗi giáo viên và
học sinh có cái nhìn tồn diện và sâu sắc về tầm quan trọng của ứng dụng công nghệ sinh học
thực vật trong nông nghiệp. Từ nhận thức đến hành động, biến mỗi giáo viên và học sinh trở
thành những kĩ thuật viên, tuyên truyền viên tích cực, cổ vũ cho sự phát triển của ngành công
nghệ sinh học nước nhà.

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái
-2Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Ngồi ra, đề tài này cịn giúp giáo viên và học sinh dạy - học tốt mơn Sinh học nói chung
và chun đề ứng dụng cơng nghệ sinh học nói riêng. Qua đó nâng cao tỉ lệ thi đỗ vào chuyên
ngành khối B của các trường Đại học, Cao đẳng và Trung cấp chuyên nghiệp.

IV. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu: Thực vật.
Phạm vi nghiên cứu: Công nghệ sinh học là môn khoa học đa ngành và đa lĩnh vực. Tuy
nhiên, với đề tài này tôi chỉ tập trung nghiên cứu ứng dụng của 5 lĩnh vực: nuôi cấy mô, tạo cây
đơn bội bằng ni cấy hạt phấn, chọn dịng tế bào, lai tế bào và kĩ thuật chuyển gen ở thực vật.
Vì đây là những kiến thức có liên quan trực tiếp đến vần đề dạy - học và ôn thi đại học và cao
đẳng của học sinh Trung học phổ thông.

V. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp nghiên cứu các tài liệu được lấy từ các nguồn thông tin như giáo trình đại
học và cao học, các chuyên đề chuyên sâu dành cho bồi dưỡng giáo viên các trường chuyên,
internet, .... Rồi tiến hành tổng hợp, so sánh, đối chiếu các tài liệu để thực hiện đề tài.
Phương pháp trao đổi kinh nghiệm, học hỏi các đồng nghiệp và các chuyên gia.
Phương pháp tham gia các hội thảo về chuyên đề “ Công nghệ sinh học”
Phương pháp tham quan các cơ sở Công nghệ sinh học : Viện rau quả trung ương, Viện
công nghệ sinh học, Khoa công nghệ sinh học, ...
Đặc biệt là trực tiếp làm thí nghiệm: trong thời gian học cao học, tôi đã trực tiếp tham gia
đề tài cấp nhà nước “Chuyển gen sinh auxin và gen mẫn cảm auxin hoạt động đặc thụ bầu nhụy
vào cây cam Vinh và quýt Đường canh“.
Phương pháp đánh giá qua thực tiễn sư phạm.

PHẦN B. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
I. VI NHÂN GIỐNG BẰNG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT
Vi nhân giống bằng ni cấy mơ hay cịn gọi là vi nhân giống in vitro. Quá trình nhân
giống này phải trải qua nhiều công đoạn:
Chọn nguyên liệu ban đầu cho vi nhân giống là rất quan trọng, nó khơng những quyết
định sự thành cơng ban đầu mà cả q trình nhân tiếp theo. Các cơng trình của D.Amato (1977)
cho thấy chỉ có đỉnh sinh trưởng của chồi mới bảo đảm sự ổn định về di truyền. Tiếp đến là đỉnh

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái
-3Trường THPT Tiên Lữ


… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

mơ phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp với xử lý nhiệt để làm sạch bệnh là nguyên liệu tốt để
nhân.
Các chồi nhân ban đầu thường được tạo từ đỉnh chồi hoặc đỉnh mô phân sinh trên mơi
trường thạch chứa các muối khống, cabonhydrat, vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng
(xitokinin và auxin). Vi nhân giống được bắt đầu bằng tách đỉnh chồi hoặc mơ phân sinh từ các
cây định nhân sau đó khử trùng và đưa vào nuôi cấy ở môi trường phù hợp có xitokinin. Sự phát
triển nhanh của mơ ni cấy phụ thuộc vào ánh sáng và nhiệt độ. Chồi được nhân lên sau 3 đến 4
tuần. Các chồi hình thành lại được tách ra chuyển sang môi trường mới và qui trình cứ thế được
lặp lại. Để tạo rễ thì chồi nhân phải chuyển sang mơi trường có auxin. Đây là phương pháp nhân
cho hệ số nhân thấp hơn phương pháp nhân qua giai đoạn mô sẹo hoặc phôi, nhưng các chồi
nhân giữ lại được những đặc điểm của phôi gốc, ít hoặc khơng bị thay đổi về mặt di truyền. Hiện
nay nhờ phát triển những môi trường và hệ thống nhân phù hợp, hệ số nhân đã được tăng lên
nhiều (58 – 5 15 chồi/tháng). Đặc biệt là nhân chồi trong mơi trường lỏng có lắc hoặc nhân trong
các reactor.
Trong một số trường hợp, vi nhân giống có thể thực hiện thông qua việc tạo phôi hoặc tái

sinh cây thẳng từ mô sẹo. Phương pháp này cho hệ số nhân cao hơn, nhưng thường kéo theo sự
biến dị sôma nên trước khi chuyển sang giai đoạn nhân đại trà cần kiểm tra kỹ những thay đổi về
di truyền.
Vi nhân giống có những ưu việt sau:
- Hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất.
- Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ. Trong 1 m2 nền có thể để
được tới 18.000 cây.
- Cây được làm sạch bệnh và không tiếp xúc với các nguồn bệnh vì vậy bảo đảm các cây
giống sạch bệnh.
- Thuận tiện và hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000 cây dâu tây chỉ nặng 15kg).
Việc bảo quản cây giống cũng thuận lợi. Các cây giống giữ ở nhiệt độ 4oC trong hàng tháng vẫn
cho tỉ lệ sống đến 95%.
Nhu cầu về cây giống nhân in vitro ngày càng nhiều. Mấy năm gần đây, hàng năm trên
thế giới sản xuất khoảng 50 triệu cây, ước tính phải đạt 250 triệu cây/năm mới đáp ứng được yêu
cầu thực tiễn.
Một vấn đề hiện nay là giá cây trồng nhân bằng phương pháp vi nhân còn cao (300 8000 đ/cây) vì vậy cần phải cải tiến các qui trình nhân để làm hạ giá thành, đặc biệt là cơ giới
hóa các khâu nhân hoặc chỉ nhân những giống cây thật q hiếm và có giá trị kinh tế cao. Trên
thực tế cây nhân bằng phương pháp vi nhân bao giờ cũng đắt hơn cây giống từ hạt.
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái
-4Trường THPT Tiên Lữ


… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Hiện nay nhân giống đã thành công trên nhiều giống cây như lan, hoa cúc, hoa hồng, cẩm
chướng, dứa, mía, dâu tây, chuối, cam, qt, thơng....
Vi nhân giống ngoài việc ứng dụng để nhân nhanh một số giống cây, cịn có thể rút ngắn
thời gian đưa các cây lai và các loài cây nguyên chủng tự nhiên có các đặc điểm tốt vào sản xuất
hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai trong sảnh xuất hạt lai.

II. TẠO CÂY ĐƠN BỘI BẰNG NUÔI CẤY HẠT PHẤN
Có nhiều phương pháp tạo cây đơn bội, nhưng từ những năm 60, việc tạo cây đơn bội
bằng nuôi cấy bao phấn và hạt phấn được phát triển. Cây đơn bội có thể nhận bằng ni cấy bao
phấn hoặc hạt phấn trên môi trường thạch (Keller & cs, 1975; Wenzell & cs, 1977) hoặc môi
trường lỏng (Wernicke & cs, 1976). Trong q trình ni cấy, hạt phấn phân chia, tạo mơ sẹo
hoặc phơi và tiếp theo có thể tạo cây.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành phơi và mô sẹo
2.1.1. Các yếu tố liên quan đến nguyên liệu nuôi cấy
Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn hay hạt phấn ảnh hưởng rất lớn đến hạt phấn
nuôi cấy in vitro. Tuổi của cây, sự thay đổi chu kỳ quang cũng như nhiệt độ là những yếu tố ảnh
hưởng đáng kể đến nuôi cấy tạo cây đơn bội. Kết quả nghiên cứu của Dunwell (1976) cho thấy
tỉ lệ phôi cao nhận được khi sử dụng những nụ hoa hình thành sớm và cây phát triển ở nhiệt độ
thấp hoặc ngắn ngày với cường độ chiếu sáng cao cho tỉ lệ tạo phôi từ hạt phấn cao hơn.
Ở một số loại cây hạt phấn ở giai đoạn nhân sớm cho tỉ lệ tạo phôi và mô cao, ở một số
giống khác thì hạt phấn ở giai đoạn mitos đầu cho hiệu quả tốt hơn. Vấn đề kiểu gen cũng rất
quan trọng, Jacobsen (1978) bao phấn của các cây khoai tây nhị bội tạo từ cây đơn bội sử dụng
để ni bao phấn có hiệu quả hơn so với bao phấn từ cây bố mẹ. Ngồi ra, xử lí bao phấn ở nhiệt
độ thấp (3 - 10oC) cũng gia tăng tỉ lệ tạo mô và phôi từ hạt phấn (Wenzel & cs, 1977).

2.1.2.Các yếu tố liên quan đến điều kiện nuôi cấy in vitro
Thành phần cacbonhydrat trong môi trường hết sức quan trọng, đặc biệt là đường sucrose
khi nuôi cấy bao phấn thuốc lá cần từ 2% - 4%. Đối với khoai tây và lúa cần đến 6%, thậm chí
12%.
Trong các chất hữu cơ, các axit như glutamic có tác dụng kích thích phát triển phơi ở một
số giống cải và thuốc lá, serin đặc biệt cần cho phát triển phôi từ hạt phấn thuốc lá. Các dịch
chiết tự nhiên như dịch chiết khoai tây, dịch chiết nấm và một số chất khác như vitamin C, nước
dừa có tác dụng tích cực cho tạo phơi, mơ sẹo và tái sinh cây trong nuôi cấy bao phấn.
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái

-5Trường THPT Tiên Lữ


… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Auxin đặc biệt quan trọng cho tạo mơ sẹo nhưng lại ức chế tạo phơi. Vì thế trong trường
hợp tạo phôi cần tránh sử dụng auxin. Nói chung auxin thường có tác dụng ở giai đoạn ni cấy
ban đầu. Xytokinin cực kì quan trọng cho phản ứng của hạt phấn ni cấy. Trong một số ít
trường hợp etylen kích thích tạo mơ sẹo. Wilson & cs (1978) cho biết nuôi cấy bao phấn trong
môi trường lỏng làm tăng tần số tạo phôi ở thuốc lá và lúa mạch.
Bổ sung vào mơi trường than hoạt tính có tác dụng loại bỏ các chất ức chế và làm tăng
hiệu quả nuôi cấy bao phấn.
Đối với nuôi cấy hạt phấn, mật độ hạt thích hợp làm tăng hiệu quả nuôi cấy. Đối với
thuốc lá mật độ tối ưu là 105 hạt/ml môi trường. Đối với các cây khác mật độ dao động từ 10 4 10 5.
Ánh sáng đối với nuôi cấy bao phấn lúa cần đến 3200 lux, đối với thuốc lá chỉ cần 300500 lux. Nhiệt độ bình thường từ 25-28oC là thích hợp đối với ni cấy bao phấn và hạt phấn của
hầu hết các giống cây.

2.2. Tái sinh cây
Việc tái sinh cây từ bao phấn thuốc lá và một số cây họ cà khác tương đối dễ, thậm chí
cây có thể tái sinh ngay trên môi trường tạo mô sẹo hoặc tạo phôi. Đối với một số loài cây khác,
nhất là cây một lá mầm (lúa, ngơ, mì), trên mơi trường ni cấy ban đầu chứa chất sinh trưởng
và đường cao không thể tái sinh cây, muốn tái sinh cây phải chuyển sang môi trường khơng có
chất điều hịa sinh trưởng. Một số trường hợp phải dùng zeatin và nước dừa mới có thể tái sinh
cây.
Trong trường hợp tạo cây qua mô sẹo, việc tái sinh cây cũng có thể xảy ra trên mơi
trường khơng có chất điều hịa sinh trưởng, nhưng thường thì phải chuyển sang mơi trường có
nồng độ auxin thấp và nồng độ cytokinin. Các cytokinin thường hay dùng là BAP và kinetin.
Cho thêm các chất như casein, lactoabumin thủy phân và nước dừa thường làm gia tăng tỉ lệ tái
sinh cây nhất là đối với các cây ngũ cốc.

Mô già do lâu không cấy chuyển hoặc mô qua cấy chuyển nhiều lần thường cho tỉ lệ tái
sinh cây thấp hoặc mất khả năng tái sinh. Khi nuôi cấy bao phấn, các cây ngũ cốc thường có hiện
tượng tái sinh nhiều cây bạch tạng (có khi đến 50%). Wang và cs (1977) thấy rằng tăng nhiệt độ
và nồng độ 2,4D là nguyên nhân dẫn đến tỉ lệ cây bạch tạng cao. Ngoài ra, cây bạch tạng xuất
hiện nhiều từ các bao phấn chứa nhiều vi nhân (Teng Li-Ping, 1978).

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái
-6Trường THPT Tiên Lữ


… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Phần lớn cây tái sinh từ hạt phấn là cây đơn bội, nhưng ở một số lồi cây có cả cây nhị
bội và đa bội. Những kết quả nghiên cứu tế bào học cho thấy sự tạo thành các cây nhị bội và đa
bội là do kết quả của dung hợp nhân hoặc nhân bản di truyền mà khơng có sự phân chia nhân xảy
ra trong q trình ni cấy.

2.3. Ứng dụng cây đơn bội từ hạt phấn
Các cây đơn bội từ hạt phấn có ý nghĩa thực tiễn lớn, trước hết là làm nguyên liệu để tạo
các dòng thuần. Muốn tạo dòng thuần phải lưỡng bội hóa các cây đơn bội bằng xử lí consixin
hoặc thông qua tạo mô sẹo từ các cây đơn bội sau đó tái sinh cây. Như đã nói trên, ở một số loại
cây có thể nhận được cây nhị bội ngay trong q trình ni cấy bao phấn hoặc hạt phấn, nhưng
trong trường hợp này cần kiểm tra sinh hóa và tế bào học kỹ lưỡng.
Các dịng thuần có ý nghĩa rất lớn trong cải biến cây trồng. Chúng được sử dụng tạo các
cây lai khỏe mạnh từ các cặp lai giữa bố mẹ bất tương hợp ( Chu & cs, 1978) và rút ngắn thời
gian tạo hạt lai. Các dòng đơn bội kép đã tạo được ứng dụng trong sản xuất lúa mạch, thuốc lá,
cải dầu, lúa... Trong thời gian ngắn khoảng 3 đến 4 năm hai giống thuốc lá cho năng suất cao và
chất lượng tuyệt hảo đã được tạo ra bằng phương pháp cấy bao phấn (Hu han & cs, 1978). Nhiều
giống lúa mới như Huayu1, Huayu2, Tanfong1 (Yin & cs, 1976), những giống lúa mì Huapei1,

Lunghua1 (Tsun, 1978) cũng đã được tạo bằng phương pháp nuôi cấy hạt phấn. Ngồi ra các
dịng đơn bội kép cịn được sử dụng để phát triển quần thể cho việc lập bản đồ phân tử.
Trong nghiên cứu, cây đơn bội là đối tượng tốt để nghiên cứu kết hợp đôi giữa các cặp
NST, ngồi ra phân tích di truyền trên quần thể cây đơn bội để xác định kiểu di truyền các tính
trạng lặn. Các cây đơn bội cịn dùng làm nguyên liệu tạo các cây đa bội lệch. Cây đơn bội cũng
được dùng trong lai khác loài để rút ngắn thời gian ổn định về NST. Nuôi cấy bao phấn có thể
ứng dụng để nghiên cứu và tạo đột biến.
Sơ đồ ứng dụng nuôi cấy bao phấn
Bao phấn hoặc

Giống mới

hạt phấn

Ni cấy bao phấn

Cây đơn bội

Lưỡng bội hóa

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái
-7Trường THPT Tiên Lữ


… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Cây lưỡng bội

Dòng thuần

Dòng siêu chủng

III. CHỌN DÒNG TẾ BÀO THỰC VẬT (CDTBTV)
3.1.Cơ sở khoa học.
Cơ sở khoa học đầu tiên của CDTBTV là tế bào thực vật mang tính tồn năng. Mỗi lồi
thực vật có khả năng tái sinh khác nhau.
Cơ sở thứ hai là mô hoặc quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm một số lượng lớn các tế bào
khơng đồng nhất. Vì thế quần thể tế bào ni cấy có thể xem như quần thể thực vật ở đấy cũng
diễn ra những thay đổi về kiểu gen, kiểu hình và tuổi. Khi những tế bào được tái sinh thành cây
sẽ thể hiện những thay đổi đó ở mức độ cơ thể, thậm chí có những quần thể tế bào phát triển từ
một tế bào ban đầu nhưng trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển tế bào đến khi hình
thành một cơ thể hồn chỉnh có thể diễn ra nhiều thay đổi về di truyền do ảnh hưởng của các yếu
tố trong môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các chất điều hịa sinh trưởng. Mặt khác, cũng có các
quần thể tế bào đồng đều về mặt sinh lý, di truyền và phát triển, những quần thể tế bào này là đối
tượng hết sức lí tưởng trong việc sử dụng các chất gây đột biến để thu nhận các đột biến có ý
nghĩa. Cũng như cây trồng, trong ni cấy mơ và tế bào, có thể quan sát thấy hai loại thay đổi
kiểu hình. Một loại là kết quả của sự thay đổi gen, được gọi là những thay đổi di truyền, cịn một
loại khơng liên quan đến thay đổi gen, được gọi là biến đổi ngoài gen. Những thay đổi ngồi gen
khơng di truyền được.
Ngồi những vấn đề vừa nêu, trong ni cấy mơ và tế bào cịn gặp một hiện tượng phổ
biến là: một phần đáng kể mô hoặc cây tái sinh từ cụm tế bào thậm chí từ một tế bào có thể thay
đổi một số đặc điểm mà không cần áp dụng các phương pháp chọn lọc nào. Hiện tượng này gọi
là hiện tượng phân dịng sơma. Có tác giả gọi các dịng cây tái sinh từ tế bào nuôi cấy là
“calliclones” (Skirvin & cs, 1976), tác giả khác gọi các dòng cây tái sinh từ protoplast là
“protoclones” (Sheppard & cs, 1980). Larkin va Scowcroft (1981) đưa ra một định nghĩa có tính
chất khái qt hơn “somaclonal variation’ để chỉ tất cả những thay đổi của cây tái sinh từ bất kỳ
loại tế bào nuôi cấy nào.

3.2. Vật liệu và phương pháp chọn dòng

Chọn vật liệu cho các thí nghiệm CDTBTV là rất quan trọng. Các vật liệu có thể là tế bào
cho đến các mơ phân hóa. Mỗi loại vật liệu có những ưu điểm và nhược điểm riêng. Việc chọn
vật liệu này hay vật liệu khác còn phụ thuộc vào sự thuần phục của các phương pháp nuôi cấy
đối với từng loại cây.

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái
-8Trường THPT Tiên Lữ


… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Vật liệu thường dùng hơn cả trong CDTBTV là mô sẹo (callus). Mô sẹo được dùng để
chọn các dòng chống chịu như chịu bệnh (Chawla & Wenzel, 1987), chịu muối (McHughen,
1987; Kavi Kishor, 1988), và chọn các dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao (Nozue và cs,
1987; Hiraoka, 1986).
Đối với mơ sẹo có thể sử dụng các phương pháp chọn lọc trực tiếp tức là chọn trên môi
trường chọn lọc chứa một nồng độ nhất định của chất chọn lọc, các mô và tế bào đột biến có tính
chọn lọc hơn hẳn so với quần thể, Một số tác giả khác lại sử dụng phương pháp chọn lọc từng
bước tức là khi mô hoặc tế bào sống sót trên một nồng độ nhất định của tác nhân chọn lọc thì lại
chuyển sang nồng độ cao hơn. Ngồi ra cũng có thể sử dụng kết hợp cả hai phương pháp. Sự ổn
định của mô chọn lọc là khả năng phát triển bình thường liên tục trên môi trường chọn lọc hoặc
khi chuyển môi trường chọn lọc và sau một thời gian dài cấy trên môi trường không chọn lọc vẫn
mất đi đặc điểm đã được chọn lọc.
Sử dụng mơ sẹo làm ngun liệu CDTBTV có ưu điểm là đơn giản nhưng nguyên liệu
này có một số nhược điểm là: dễ tạo ra các dạng khảm vì trong mơ chọn lọc cịn có nhiều tế bào
bình thường nên khi tái sinh cây, trong quần thể cây tái sinh có cả những cây mang đặc điểm
chọn lọc và những cây vẫn mang đặc điểm giống bố mẹ, thậm chí trong một cây có thể có phần
chứa các tế bào chọn lọc, phần khác vẫn chứa các tế bào bình thường. Để khắc phục nhược điểm
này có thể giảm kích thước của mơ: mơ càng nhỏ càng tốt. Trọng lượng mơ thường dùng là 100150 mg, nhưng có thể giảm xuống đến 10-20 mg (Wakaha & Widholin, 1987).

Tế bào nuôi cấy dịch lỏng đã được nhiều tác giả sử dụng trong CDTBTV (Kishinami &
Widholin, 1986; Watad và cs, 1985). Đối với loại tế bào này các phương pháp chọn lọc trực tiếp
và chọn từng bước cũng đã tiến hành có kết quả trên nhiều đối tượng. Sử dụng tế bào dịch lỏng
để CDTBTV có ưu điểm là tế bào hoặc cụm nhỏ các tế bào được tiếp xúc đồng đều với tác nhân
chọn lọc, nhưng một nhược điểm quan trọng là sau khi chọn lọc khả năng tái sinh cây bị giảm
đáng kể và trong nhiều trường hợp có thể mất hẳn. Hầu hết các dịng chọn lọc thông qua hệ
thống tế bào dịch lỏng đều không nhận đuợc cây (Dix, 1990). Vì thế hệ thống tế bào dịch lỏng có
thể sử dụng để chọn các dịng có khả năng tổng hợp và tích lũy các chất thứ cấp thì phù hợp hơn.
Trong trường hợp này thì tế bào dịch lỏng đáp ứng được mục đích ni cấy tế bào trên qui mô
lớn đặc biệt là việc sử dụng các công nghệ nuôi tế bào thực vật trên qui mô công nghiệp.
Protoplast (tế bào trần) thực vật là nguyên liệu có thể đáp ứng được nhiều mặt trong
CDTBTV. Protoplast là hệ thống tế bào đơn triệt để nhất. Từng tế bào được phát triển đồng đều
trong môi trường, mỗi tế bào phân chia tạo ra các quần thể tế bào và mô sẹo, cuối cùng là các mô
sẹo tái sinh thành cây hồn chỉnh, chính vì thế có thể tránh được hiện tượng khảm. Nhiều dòng tế
bào kháng thuốc (Cseplo & cs, 1985; Blonstein & cs, 1988; Hamill & cs, 1986) và các dòng cho
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái
-9Trường THPT Tiên Lữ


… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

năng suất các chất thứ cấp cao (Fujita & cs, 1985) đã được chọn lọc nhờ sử dụng hệ thống
protoplast.
Trước đây việc nuôi cấy và tái sinh cây từ protoplast cịn gặp nhiều khó khăn, nhất là tái
sinh cây từ protoplast của những lồi cây có ý nghĩa kinh tế, nên việc sử dụng hệ thống ni cấy
protoplat trong CDTBTV cịn bị hạn chế. Hiện nay hệ thống nuôi cấy protoplast với hiệu quả cao
ở nhiều lồi cây trong đó có cả các cây trồng quan trọng như khoai tây, cà chua, ngơ, lúa, lúa mì
đã được cơng bố. Vì vậy protoplast sẽ trở thành vật liệu lý tưởng cho CDTBTV. Cần phải nói
thêm rằng protoplast còn là đối tượng quan trọng trong cải biến di truyền thực vật thông qua hệt

thống nuôi cấy in vitro đặc biệt là dung hợp tế bào và chuyển gen.
Để tránh những khó khăn trong tái sinh cây từ mơ sẹo, tế bào nuôi cấy dịch lỏng và
protoplast, một số tác giả đã sử dụng các mơ phân hóa hoặc mô tách rời làm nguyên liệu
CDTBTV. Một trong những mô phân hóa được sử dụng là phơi từ hạt (Kueh & Bright, 1981)
hoặc phôi phát triển từ tế bào nuôi cấy (Chandler & Vasil, 1984). Fluhr & cs (1985) đã chọn
được dịng kháng thuốc khi xử lí mầm bằng kháng sinh. McCabe & cs (1989) cũng nhận được
dòng kháng thuốc khi xử lí mảnh lá.
Bên cạnh việc sử dụng các phương pháp chọn lọc in vitro đối với mô sẹo, tế bào dịch
lỏng, prptoplast và mơ phân hóa có thể kết hợp xử lí các tác nhân gây đột biến để làm tăng dần
số đột biến và các kiểu đột biến. Miller & cs (1985) xử lí protoplast sau khi tách bằng tia cực tím
(UV) hoặc N -methyl-N-Nitro- N-Nitrosoguanidine (MNNG). Phương pháp tương tự cũng được
một số tác giả khác tiến hành có hiệu quả khi sử dụng. N -ethyl-N-Nitrosourea (Cseplo & cs,
1985), MNNG, UV, và tia X (Maliga & cs, 1981). Ngồi ra có thể xử lí mẫu vật bằng các chất
gây đột biến trước khi đưa vào nuôi cấy và chọn lọc.

3.3. Chọn dòng chịu bệnh
Mặc dù phương pháp truyền thống có thể tạo được các dịng hoặc giống chịu bệnh nhưng
trong một vài trường hợp không thể chọn được các dòng chịu bệnh bằng những phương pháp này
hoặc chọn được nhưng tốn nhiều công sức và thời gian. Việc gây nhiễm bệnh nhân tạo cho một
số lượng lớn cây để tạo chọn giống chịu bệnh là cả một vấn đề, ngồi ra gây nhiễm trong nhà
kính nhiều khi cũng không thành công. Không những thế bằng phương pháp truyền thống việc
chọn các đột biến đơn gen hoặc đa gen kháng cùng một loại bệnh gặp rất nhiều hạn chế: thứ nhất
là phải chọn bố mẹ phù hợp, thứ hai là lai ngược mất rất nhiều thời gian, thứ ba là không chuyển
được các gen lặn hoặc nhiều gen một lúc. Đặc biệt đối với các loài cây chỉ nhân vơ tính thì
chuyển gen khơng thể thực hiện được bằng lai tạo.

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái
- 10 Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Đột biến thực nghiệm có thể tạo được giống cây chịu bệnh nhưng tần số xuất hiện các đột
biến đơn gen rất thấp (10 -4 - 10-6), ngoài ra tỉ lệ khảm ở các cây đột biến tương đối cao.
Từ 1970 đã có nhiều nghiên cứu cho thấy kỹ thuật CDTBTV in vitro có thể khắc phục
được nhiều vấn đề trong chọn dòng chịu bệnh như: qui mơ thí nghiệm, thời gian chọn lọc, khống
chế được điều kiện gây nhiễm. Ngồi ra có thể nhận được các đột biến đơn gen và đột biến lặn.
Nếu tần số đột biến đơn gen trong trường hợp đột biến thực nghiệm là 10 -4 - 10-6 thì ở quần thể
cây tái sinh (Ro) từ mô hoặc tế bào lên tới 0,2-0,5% (Larkin & Scowcroft, 1981). Nếu kết hợp xử
lí các tác nhân gây đột biến trong nuôi cấy in vitro có thể làm tăng tần số đột biến hơn nữa (
Maliga & cs, 1981).
Tuy nhiên chọn dòng chịu bệnh trong điều kiện in vitro có một số vấn đề cần nghiên cứu
giải quyết như vấn đề tương hợp giữa chủ và tác nhân gây bệnh vì đối tượng lây nhiễm ở đây là
mô sẹo hoặc tế bào chứ không phải là cây trong tự nhiên vì thế tác nhân gây bệnh không nhận ra
chủ (nhất là đối với các nấm kháng sinh).
Để chọn dịng chịu bệnh có thể sử dụng trực tiếp tác nhân gây bệnh hoặc các độc tố gây
bệnh (ĐTGB).
Phần lớn tác nhân gây bệnh đã được sử dụng là virus và đối tượng được lây nhiễm là
protoplast. Vấn đề then chốt là phải tạo được quần thể tế bào bị nhiễm đồng đều và phân biệt
được tế bào chịu bệnh với tế bào không bị nhiễm vì cả hai đều có khả năng phát triển trên cùng
một điều kiện nuôi cấy. Để giải quyết các vấn đề trên, Shepard (1975), Murakishi và Carlson
(1982) đã tách protoplast từ cây bị lây nhiễm liên tục, sau đó ni vấy và chọn lọc. Murakishi và
Carlson còn sử dụng chủng virus (TMV-Flavum) có màu vàng lây nhiễm cây thuốc lá đơn đơn
bội, sau đó cấy mảnh lá lên mơi trường phù hợp cho sự sinh trưởng của tế bào sạch virus hoặc
kháng virus. Các tác giả thấy rằng mô từ tế bào sạch virus sinh trưởng nhanh và có màu xanh,
còn tế bào kháng virus sinh trưởng chậm hơn và có màu vàng.
Một số nấm và vi khuẩn gây bệnh như Phoma lingam, Plamidomonas brassicae
(Sacristan, 1955; Sacristan và Hoffman, 1979; Pullman và Rappaport, 1983; Prasad & cs, 1984),
Fusarium oxysporum, Selerospora graminicola, Selerpspora sacchari (Chen & cs, 1979),

Puecinia melanocepha (Peros, 1984), Phytophthora parasitica varnicotianae (Deaton & cs,
1982), Helminthosporium sacchari (Bronson & Schffor, 1977), Xanthomonas oryzae (Sun & cs,
1986) cũng đã được sử dụng để chọn dòng chịu bệnh.
Prasad và cs (1984) đã chọn được dòng kê ngọc kháng bệnh mốc sương bằng phương
pháp tái sinh cây từ hoa tự non đã bị nhiễm nấm. Sun & cs (1986) đã nuôi mô sẹo từ phôi lúa
cùng với vi khuẩn gây bệnh Xanthomonas oryzae và đã chọn được các dòng kháng bệnh. Một số
tác giả khác đã tiến hành gây nhiễm các cây tái sinh từ mô trong điều kiện in vitro và nhận được
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái
- 11 Trường THPT Tiên Lữ


… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

những kết quả đáng ghi nhận (Peros, 1984; Barlass, 1986; Joung & cs, 1987). Ngoài ra có thể
đưa các cây tái sinh từ mơ hoặc tế bào trồng trên đất bị nhiễm nấm, nhưng hướng này chưa được
tiến hành nhiều.
Các độc tố gây bệnh (ĐTGB) từ một số nấm và vi khuẩn đã được dùng nhiều trong chọn
dòng chịu bệnh, sử dụng ĐTGB trong chọn dòng có ưu điểm là các tế bào có thể bị nhiễm đồng
đều và nhiều ĐTGB có tác dụng lây nhiễm tế bào (Daly, 1981), vì thế có thể sử dụng các ngun
liệu một cách đa dạng. Ngồi ra cịn có sự tương quan thuận giữa kháng ĐTGB trong điều kiện
in vitro và in vivo. Chọn các dòng kháng ĐTGB đã được tiến hành thành công đối với protoplast
(Shahim & Spivey, 1986), tế bào nuôi dịch lỏng (Connell & Heale, 1986), mô sẹo từ protoplast
(Thanutong & cs, 1983; Shahim & Spivey, 1986), phôi thứ cấp (Sacristan, 1982) và đỉnh chồi
(Gantotti & cs, 1985). Sử dụng ĐTGB đối với tế bào còn mở ra nhiều triển vọng chọn được các
đột biến kháng bệnh hiếm (Carlson, 1973).
Bên cạnh những ưu điểm của ĐTGB, trong chọn dòng chịu bệnh cần lưu ý một số vấn đề
như xác định cụ thể vai trò của độc tố trong quá trình gây bệnh vì trong nhiều trường hợp cây bị
bệnh nhưng khơng phát hiện có độc tố hoặc xác định được trong cây có độc tố gây bệnh nhưng
độc tố lại khơng có vai trị trong việc gây bệnh (Scheffer, 1983). Một vấn đề nữa là trong nhiều

trường hợp cây tái sinh từ mô kháng ĐTGB lại khơng có khả năng kháng bệnh. Để khắc phục
vấn đề này, Meredith (1984) cho rằng mặc dù có những đặc điểm có thể khơng thể hiện ở cây tái
sinh, nhưng nếu ta tái sinh được số lượng cây nhiều đến mức cần thiết thì cũng có thể có những
cây mang những đặc điểm mong đợi. Điều này đã được khẳng định bằng cơng trình của
Thanutong & cs (1983). Các tác giả đã nhận được 10-20% số cây tái sinh có khả năng kháng độc
tố của Pseudomonas và độc tố của Alternaria.
ĐTGB dùng trong chọn dịng chịu bệnh có thể là dạng thô hoặc tinh khiết. ĐTGB thô
dưới dạng dịch chiết từ nấm hoặc vi khuẩn được sử dụng nhiều để chọn dòng chịu bệnh. Nhiều
dòng cây kháng ĐTGB đã được công bố khi sử dụng ĐTGB thô như khoai tây kháng P.infestas
(Behnke, 1979), thuốc lá kháng Alternarria alternata f.sp.tabaci, thuốc lá kháng Pseudomonas
syringe pv-tabaci (Thanutong, 1983), alffa kháng F.oxysporum f.sp.medicaginis (Hartman et al,
1984). Brettel & cs (1980), Rines và Luke (1985) đã nhận được dịng ngơ kháng H.maydis r.t và
dịng lúa mạch kháng H.victoriae khi sử dụng độc tố sạch (tinh khiết) từ hai loại nấm trên.
Ngoài phương pháp chọn dòng chịu bệnh trong điều kiện in vitro, bằng xử lí tế bào, mơ
hoặc cây tái sinh từ tế bào và mô với virus, nấm, vi khuẩn gây bệnh hoặc ĐTGB, ứng dụng khả
năng phân dịng sơma của cây tái sinh từ tế bào hoặc mơ, ta có thể chọn được dịng chịu bệnh mà
khơng cần xử lí tác nhân gây bệnh. Nhiều tác giả (Bretter & cs, 1980; Hartan & cs, 1984;
Pullman & cs, 1983; Sacristan, 1982) đã chọn các dòng chịu bệnh theo phương pháp này. Giống
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái
- 12 Trường THPT Tiên Lữ


… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

mía chịu bệng Fiji (Krishnamurthi & Tlalka, 1974) và giống lhoai lang “Sarlet” chịu bệnh
(Moyer & Collins, 1983) đã được chọn và đưa vào sản xuất. Hiện nay khi việc tái sinh cây từ tế
bào hoặc mô đã trở nên dễ dàng đối với hầu hết các giống cây thì chọn lọc theo hướng này có
nhiều hứa hẹn và trên thực tế đã có các giống chịu bệnh đuợc đưa vào sản xuất nhưng có một số
mặt hạn chế của phương pháp này: Thứ nhất là phải thử nghiệm một quần thể lớn cây tái sinh

trong điều kiện tự nhiên; thứ hai là phân dịng sơma làm thay đổi nhiều đặc điểm khác nên nhiều
khi chọn được dòng chị bệnh nhưng lại ảnh hưởng đến đặc điểm kinh tế (Bidney & Shepard,
1981).
Nhìn chung đã có nhiều cơng trình mở ra triển vọng trong việc sử dụng ni cấy mơ và tế
bào để chọn dịng chịu bệnh ở cây trồng nhưng cho đến nay vẫn còn nhiều vấn đề cần giải quyết
như cơ chế tương hợp giữa chủ (mô hoặc tế bào) với các tác nhân gây bệnh, liên quan đến vấn đề
này là cơ chế nhiễm bệnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro. Một vấn đề quan trọng nữa là xác
định được vai trò của các ĐTGB trong quá trình chọn lọc in vitro. Một số vấn đề liên quan về
mặt kĩ thuật trong nuôi cấy mô và tế bào là rút ngắn thời gian nuôi cấy và tái sinh cây để tránh
những thay đổi về hình thái và một số đặc điểm khác. Việc chọn lựa đối tượng để áp dụng kĩ
thuật nuôi cấy mơ và tế bào vào chọn dịng chịu bệnh cũng rất quan trọng. Một số tác giả khác
cho rằng nuôi cấy mơ, tế bào có thể áp dụng để chọn dịng chịu bệnh ở các lồi cây sinh sản vơ
tính thì phù hợp và có kết quả hơn (Daub, 1986; Jones, 1990). Ngồi ra ni cấy mơ và tế bào có
thể áp dụng để chọn các dịng chịu bệnh đơn gen hoặc chịu bệnh mang gen lặn (Jones, 1990).
Việc sử dụng các ĐTGB khơng đặc hiệu để chọn các dịng chịu bệnh đặc biệt mà bằng các
phương pháp thông thường không chọn được cũng đã được đề cập (Jones, 1990).

3.4. Chọn dịng chống chịu các stress của mơi trường
Các stress môi trường bao gồm những điều kiện bất lợi của mơi trường như phèn, chua,
mặn, khơ, hạn, nóng, lạnh.... Việc chọn tạo những giống cây trồng chống chịu được các stress
môi trường là rất cần thiết. Theo Nabors (1990) hiện nay có ít nhất 25% đất trồng bị mặn (chủ
yếu do NaCl), 25% số đất chua (là do ion nhôm). 40-60% đất khơ hạn. Ngồi ra do việc cải tạo
mơi trường như tưới tiêu, bón phân, sử dụng các chất diệt sâu bọ và diệt cỏ cũng dẫn đến việc
cần thiết chọn tạo các giống cây trồng chống chịu với các tác nhân trên.
Như đã trình bày ở các phần trên, ni cấy mơ và tế bào có thể đóng góp một phần trong
việc tạo chọn các dịng chống chịu các stress môi trường. Trước khi giới thiệu một số thành tựu
trong lĩng vực này chúng tôi đề cập đến một số vấn đề liên quan đến cơ sở cũng như phương
pháp chọn các dịng chống chịu stress mơi trường. Ngoài một số vấn đề chung được đề cập ở các
phần chọn dòng chịu bệnh và dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao, chọn dòng chống chịu
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái

- 13 Trường THPT Tiên Lữ


… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

stress mơi trường cịn có một số vấn đề liên quan đến cơ sở của tính chống chịu ở mức độ tế bào
và ở cây hoàn chỉnh. Đặc biệt là cơ sở di truyền của tính chống chịu stress mơi trường cịn chưa
được biết rõ.Nhiều tác giả cho rằng có thể có nhiều alen tham gia vào tính chống chịu stress mơi
trường, ngồi ra các alen này thường là lặn nên không thể hiện trong trường hợp dị hợp tử. Đây
là những vấn đề làm cho việc chọn các dịng chống chịu stress mơi trường chưa có được những
thành tựu mong muốn. Ngồi ra một số vấn đề quan trọng nữa là tương quan giữa khả năng
chống chịu các stress mơi trường ở cây hồn chỉnh và tế bào ni cấy rất phức tạp vì thế chọn
dịng bằng ni cấy mơ có thể khơng tạo được cây chống chịu những điều kiện đặc biệt trên
đồng ruộng. Mặc dù có một số vấn đề hết sức quan trọng được nêu ở trên, thực tế vẫn có những
cơ sở và số liệu đáng tin cậy về triển vọng ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào để chọn các dịng
chống chịu với các stress mơi trường: chúng ta đều biết nhiều đặc điểm đa gen có thể biến đổi
bởi đột biến xảy ra ở một trong các gen tham gia vào đặc điểm này. Những kết quả nghiên cứu
của Gorham và cs ( 1987 ) và Ashraf và cs ( 1986 ) đã cho thấy tính chống chịu với một số stress
liên quan đến thay đổi nhiễm sắc thể và di truyền qua thế hệ sau. Ngoài ra đã có những số liệu về
sự phân ly theo Mendel của các đặc điểm được chọn lọc (Comner & Meredits, 1985).
Cho đến nay hầu hết các cơng trình chọn dịng chống chịu stress môi trường đều chọn
theo phương pháp chọn lọc trực tiếp. Việc tiến hành xử lý các stress có thể tiến hành khi mơ sẹo
(callus) mới hình thành hoặc khi mơ sẹo đã phát triển. Các stress có thể ở mức độ thấp hoặc ở
mức độ gây chết, và có thể xử lý một nồng độ nhất định hoặc khi tế bào chịu được một nồng độ
nào đó lại đưa lên nồng độ cao hơn. Việc tiến hành xử lý có thể liên tục hoặc gián đoạn, thời gian
xử lý có thể ngắn hoặc dài. Cho đến nay chưa có những nghiên cứu so sánh cụ thể đối với từng
trường hợp trên. Tốt nhất tùy từng đối tượng cụ thể mà kết hợp việc chọn lọc theo cách này hay
cách khác. Đây là một vấn đề nghiên cứu về mặt phương pháp nhưng hết hết sức quan trọng, nó
đóng góp vào sự thành cơng trong việc chọn các dịng chống chịu stress mơi trường. Muốn nhận

những đột biến mới hoặc đột biến lặn, chọn lọc có thể tiến hành ở mô đơn bội từ hạt phấn, nếu
chọn lọc ở mơ đơn bội từ hạt phấn lai F1 có thể nhận được các đột biến đơn gen và các tái tổ hợp
của các alen sẵn có.
Trong những năm gần đây đã có những bước tiến đáng kể trong việc chọn dòng chống
chịu muối, hạn, chua và nhiệt độ. Nhiều dịng chịu muối (NaCl) đã được chọn lọc từ mơ ni cấy
của các lồi Nicotiana tabacum (Nabors 1980, 1983), Cicer arietium, Ipomoea babatas L.
(Pandey & Ganapathy, 1984; Salgado Garcigila & cs, 1985), Medicago sativa L. (McCoy 1987,
Winicov, 1991), Linum usitatium (Mc Hughen and Swartz, 1984). Tính chống chịu trong một vài
trường hợp được thông báo là ổn định ở mức độ tế bào và cây hoàn chỉnh (Winnicov, 1991). Về
cơ chế của tính chịu muối cũng đã có những kết quả đáng ghi nhận. ở Việt Nam việc tiến hành
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái
- 14 Trường THPT Tiên Lữ


… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

chọn các dòng thuốc lá địa phương chịu muối cũng được tiến hành và đã thu được những kết quả
tiến bộ (Nguyễn Hoàng Lộc & cs, 1990). Kết quả nghiên cứu của một số tác giả cho thấy
abscisic axit (ABA) là chất có liên quan đến việc tổng hợp các protein mới (đặc biệt là protein
với phân tử lượng 26) xuất hiện ở các dòng chịu muối (Sigh & cs, 1987). Mối tương quan giữa
ABA, tính chịu muối và sự tổng hợp các protein đặc biệt là vấn đề nghiên cứu hết sức lý thú
trong những năm tới. Các dịng chịu hạn đã được thơng báo (Bressan & cs, 1981, Hand & cs,
1983), các tác giả đã sử dụng chất gây hạn PEG 4000 hoặc PEG 6000 đưa vào mơi trường để
chọn. Vấn đề tạo dịng kháng nhôm được Couner và cs nghiên cứu khá tỉ mỉ (Conner &
Meredith, 1985). Các tác giả đã chọn được các dịng thuốc lá kháng nhơm ổn định, tính kháng
nhơm là đặc điểm trội và di truyền qua thế hệ sau. Việc chọn các dòng chống chịu với nhiệt độ
thấp hoặc cao cũng đã có tiến bộ: Preil và cs. (1983) đã nhận được các cây cúc chịu được nhiệt
độ thấp. Nhìn chung phần lớn các nghiên cứu từ trước đến nay đều tập trung vào tìm cơ chế của
tính chịu lạnh và chịu nóng. Những kết quả của Chen và Gusta (198) nhận được trên Triticum

aetivum L, Secale cereale L, và Bromus inermis Leyss cho thấy ABA làm tăng khả năng chịu
lạnh đáng kể. Các tác giả cho rằng ABA là chất cần thiết để tạo dòng chịu lạnh. Orr và cs cũng
nhận được những kết quả tương tự về tác dụng của ABA. Cả tính chịu lạnh và tính chịu nhiệt đều
liên quan đến việc tổng hợp hàng loạt các protein mới nhưng vai trò cụ thể của từng loại protein
mới này như thế nào? Chúng có vai trị gì trong q trình chịu lạnh và chịu nhiệt cao? Đây là
những câu hỏi còn đang để ngỏ.
Chọn dòng chống chịu stress môi trường là yêu cầu chiến lược trong công tác giống cây
trồng nhưng cho đến nay phần lớn các cơng trình tập trung vào tìm kiếm các phương pháp chọn
lọc và tìm ra cơ chế của loại chống chịu này. Những kết quả nhận được mới chỉ là những cơ sở
hết sức ban đầu. Để có được những thành cơng trong tương lai và có được những áp dụng vào
thực tiễn những nghiên cứu thuộc hai hướng trên vẫn là điều quan tâm hàng đầu.

3.5. Chọn dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao
Các chất thứ cấp ở thực vật là những hợp chất trong cơ thể thực vật nhưng khơng có vai
trị đối với các quá trình sống cơ bản, những hợp chất này giữ vai trò thứ cấp trong cây. Thực ra
về mặt tiến hố, các chất thứ cấp đóng vai trị hết sức quan trọng trong quá trình đấu tranh sinh
tồn vì đây là những chất độc đối với động vật và vi sinh vật, các chất có tác dụng quyến rũ cơn
trùng hoặc có mầu sắc và hương vị đặc biệt. Sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào
trong những năm gần đây đã mở ra triển vọng sử dụng kỹ thuật này để nuôi sinh khối lớn có khả
năng tổng hợp các chất thứ cấp. Hiện nay có nhiều phịng thí nghiệm đã ký với các hãng sản xuất
để thu nhận các chất thứ cấp từ tế bào thực vật nuôi cấy trên quy mô công nghiệp. Một trong
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái
- 15 Trường THPT Tiên Lữ


… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

những yêu cầu của quá trình cơng nghiệp hố tế bào ni cấy để thu nhận các chất thứ cấp là vấn
đề tạo các dòng cho năng suất cao và ổn định.

Vật liệu thường dùng để chọn dòng tế bào cho năng suất chất thứ cấp cao là mô hoặc tế
bào nuôi cấy dịch lỏng.
Đối với các chất thứ cấp có màu, có thể chọn bằng mắt. Đối với các chất thứ cấp khơng
có màu trước khi cấy chuyển cần được phân tích. Đây là việc làm tốn khá nhiều công sức và thời
gian. Để khắc phục, Ogino và cs (1978) đã đưa ra phương pháp ép tế bào. Theo phương pháp
này, các cụm tế bào hoặc mô được ép giữa hai tờ giấy lọc, nhựa tế bào sẽ ngấm vào giấy lọc sau
đó dùng phương pháp nhuộm để xác định. Đối với một số chất được tế bào tiết ra mơi trường thì
có thể xác định theo phương pháp dùng màng phủ than hoạt tính để hấp thụ các chất sau đó dùng
tia cực tím (UV) để xác định (Knoop and Beiderback, 198). Ngoài ra có thể sử dụng phương
pháp xác định dựa vào tính chất kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn của các chất do tế bào tiết ra
như berberine chẳng hạn (Suzuki & cs, 1987). Các phương pháp khác như phóng xạ hoặc phân
biệt tế bào bằng huỳnh quang cũng đã được sử dụng.
Để thiết lập một hệ thống chọn các dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao thành
công, việc nghiên cứu các yếu tố liên quan đến tích lũy các chất trong tế bào ni cấy là rất quan
trọng, mặc dù vấn đề này cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ.Tuy nhiên vai trò của các chất điều
hoà sinh trưởng và nồng độ đường đã được ghi nhận. Hàm lượng các chất thứ cấp trong tế bào
còn phụ thuộc vào tăng trưởng về sinh khối, tốc độ tổng hợp và tiết ra môi trường của các chất
này.
Thường thường tế bào ni cấy tích lũy các chất thứ cấp ở giai đoạn cuối của chu kỳ sinh
trưởng (Zenk & cs, 1977) vì thế tế bào ni cấy có tốc độ sinh trưởng nhanh và khơng kèm theo
sự gia tăng tốc độ tổng hợp các chất thứ cấp. Những tế bào ni cấy có tốc độ phân chia chậm thì
có ưu thế hơn trong việc tạo các chất thứ cấp.
Vật liệu khởi đầu cho chọn dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao là một vấn đề được
nhiều tác giả quan tâm. Zenk (1978) nhận thấy tế bào dịch lỏng từ cây C.roseur có năng suất cao
cho hàm lượng chất thứ cấp cao hơn tế bào dịch lỏng từ cây có năng suất thấp. Cũng trên đối
tượng này Roller (1978) lại nhận thấy tế bào nuôi cấy từ cây có năng suất cao khơng phải lúc nào
cũng cho năng suất chất thứ cấp cao. Kết quả này cũng được cơng bố trên những lồi cây khác
(Bohm 1977, 1980, Kurz & Constabel, 1979). Cho đến nay vẫn chưa có chứng minh chắc chắn
về tương quan giữa năng suất của cây làm nguyên liệu và năng suất của tế bào nuôi cấy. Theo
Wilson (1990) nên sử dụng những cây đa dạng về di truyền để tạo dòng tế bào khởi đầu.

Một số tác giả thấy rằng các bộ phận khác nhau của cây dùng để tạo ra các dịng tế bào
khơng ảnh hưởng tới năng suất các chất thứ cấp (Speake & cs, 1964). Nhiều tác giả khác lại nhận
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái
- 16 Trường THPT Tiên Lữ


… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

được các kết quả cho thấy các dòng tế bào từ các bộ phận khác nhau của cây, thậm chí từ cùng
một bộ phận cũng cho năng suất các chất thứ cấp khác nhau (Zenk & cs, 1975; Constabel & cs,
1981; Kinnersley, 1982). Hall và Yeoman (1987) cịn cho biết trong quần thể tế bào ni cấy khả
năng tổng hợp các chất (đặc biệt là đối với các chất màu) cũng khác nhau giữa các tế bào. Những
sự biến động về tích lũy các chất thứ cấp này là những cơ sở để tìm các phương pháp phù hợp
cho việc chọn ra các dòng cho năng suất cao.
Cho đến nay đã tồn tại ba hệ thống chọn lọc, hệ thống thứ nhất là sử dụng các tế bào nuôi
cấy đồng đều và ổn định; hệ thống thứ hai là sử dụng hổn hợp tế bào, nhưng các tế bào riêng rẽ
ổn định; và hệ thống thứ ba là sử dụng hỗn hợp tế bào mà tế bào riêng rẽ không ổn định.
Hệ thống chọn lọc thứ nhất tạo ra các dòng cho năng suất ổn định còn hệ thống thứ hai và
thứ ba tạo ra các dịng ổn định và khơng ổn định.
Một vấn đề rất quan trọng mà cho đến nay vẫn chưa sáng tỏ là cơ sở của những thay đổi
kiểu hình, quá trình điều khiển trao đổi các chất thứ cấp ở tế bào thực vật ni cấy in vitro. Để có
được những phương pháp chọn các dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao những nghiên
cứu về vấn đề này là rất quan trọng.
Ngoài những phương pháp chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất chất thứ cấp cao đã
nêu, ứng dụng công nghệ gen để tạo các dòng tế bào này là một hướng cần được tiến hành, tuy
nhiên ở đây cũng còn nhiều vấn đề liên quan chưa được hiểu biết đặc biệt là những cơ sở sinh
hố và phân tử trong chu trình trao đổi chất thứ cấp.
Mặc dù còn một số vấn đề cần giải quyết nhưng những thành tựu đạt được trong chọn
dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao đã mở ra triển vọng lớn trong việc đưa tế bào

thực vật nuôi cấy vào sản xuất các chất thứ cấp có ý nghĩa trong nơng nghiệp, cơng nghiệp và y
học. Đặc biệt là sự phát triển hệ thống công nghiệp để sản xuất sắc tố đỏ và chất diệt khuẩn
Shikonin ở Nhật (Curtin, 1983) đã mở ra triển vọng cơng nghiệp hố việc thu nhận các chất thứ
cấp từ tế bào nuôi cấy. Viện Công nghệ sinh học Canada và các phòng nghiên cứu của hãng
Vipont đã hợp đồng nghiên cứu phát triển hệ thống công nghiệp sản xuất Sangninarine sử dụng
trong sản xuất thuốc đánh răng (Agricell Report, 1989).
Thực vật là nguồn cung cấp nhiều chất sinh học quan trọng sử dụng trong công nghiệp
dược, công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm. Các chất này rất khó tổng hợp và hiện nay nguồn
cung cấp chủ yếu vẫn là từ cây trồng. Việc sử dụng tế bào nuôi cấy để tăng nguồn cung cấp hoặc
thay thế việc trồng trọt các cây cho những chất này đang được quan tâm đặc biệt. Vấn đề tìm ra
các phương pháp chọn các dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao là khâu then chốt để đưa
nuôi cấy tế bào thực vật lên quy mơ cơng nghiệp. Những thành tích đạt được trong lĩnh vực này

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái
- 17 Trường THPT Tiên Lữ


… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

đặc biệt là việc công nghiệp hố sản xuất Shikonin bằng tế bào ni cấy là những tiền đề cho
việc sử dụng tế bào thực vật ni cấy để nhận các chất thứ cấp có giá trị kinh tế cao.
Ở Việt Nam các nghiên cứu liên quan đến vấn đề thu nhận các chất thứ cấp đã được bắt
đầu từ những năm 80 trên các đối tượng thuốc lá, tam thất, thanh hao, taxus. Năm 1988, Phan
Huy Bảo và cs đã thơng báo chọn được dịng tam thất cho hàm lượng saponin cao. Những thay
đổi về hàm lượng nicotine liên quan đến q trình phân hố mô và cây tái sinh cũng đã được
công bố (Nguyễn Đức Thành và cs, 1991 ).
IV. LAI TẾ BÀO
4.1. Dung hợp protoplast và lai nhân.
Do khơng có vách xellulơ nên protoplast (tế bào trần) trở thành một đối tượng lý tưởng

trong việc nghiên cứu biến đổi di truyền ở thực vật. Bằng phương pháp dung hợp hai loại
protoplast có thể tạo đươc các cây lai sôma (lai nhân hoặc lai tế bào chất). Ngồi ra có thể sử
dụng kỹ thuật dung hợp protoplast để chuyển các bào quan như nhân, lục lạp, ty thể hoặc chuyển
các vectơ mang các gen mã hố cho một số đặc điểm biết trước.
Protoplast có thể dung hợp tự nhiên. Hiện tượng này thường xảy ra sau khi tách
protoplast từ một loại cây. Tần số dung hợp tự nhiên phụ thuộc vào các giống cây Schieder &
Vasil, 1980), ở cà độc dược tần số này đạt tới 8% (Schieder, 1974).
Để dung hợp hai loại protoplast khác nhau thường phải xử lý một số tác nhân. Một số tác
giả dùng nước biển (Hofmeister, 1954; Binding, 1966, 1974), hoặc nitrat natri (Power & cs,
1970; Carlson, 1972), một số khác sùng các chất kích thích như lectin nhưng hiệu suất dung hợp
rất thấp (Hartman & cs, 1973; Burges & Fleming, 1974; Glimelus & cs, 1974). Hiệu suất dung
hợp khá cao có thể đạt được bằng cách xử lý protoplast bằng ion Ca2+ ở 37 oC và môi trường
kiềm (pH=10,5) (Keller & Melchers, 1973; Binding, 1974; Schieder, 1974).
Hiện nay phương pháp có hiệu quả và được sử dụng rộng rãi là phương pháp dung hợp
của Kao và đồng nghiệp (Kao & Michayluk, 1974; Constabel & Kao, 1974). Các tác giả đã dùng
polyethylen glycol (PEG) có phân tử lượng cao (6000) để gắn các protoplast với nhau. Quá trình
dung hợp xảy ra khi làm lỗng dung dịch PEG bằng mơi trường ni cấy. Khi PEG bị làm lỗng
thì protoplast dần dần trở lại bình thường và ở phần tiếp giáp giữa hai protoplast bị vỡ ra và quá
trình dung hợp được xảy ra. Trong cùng thời gian Wallin và cs. đã sử dụng thành công phương
pháp này (Wallin & cs, 1974). Nagata đã thay PEG bằng rượu polyvinyl để dung hợp protoplast
của thuốc lá, cà rốt và cây họ đậu (Nagata, 1978). Phương pháp sử dụng PEG có hiệu quả đối với
nhiều trường hợp khi dung hợp protoplast của các cây cùng loài và khác loài, dung hợp tế bào
động vật và cả trường hợp dung hợp protoplast thực vật với tế bào động vật (Pontecorvo, 1975;
Jone & cs, 1976; Dudits & cs, 1976; Vasil, 1976; Vasil & cs, 1976).
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái
- 18 Trường THPT Tiên Lữ


… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Về cơ chế của quá trình dung hợp đã được Nagata và Melchers nghiên cứu tỉ mỉ (Nagata
& Melchers, 1978).
Cuối những năm 70 và đầu 80 một số tác giả đã đưa ra phương pháp dung hợp bằng dòng
điện (Sanda & cs, 1979; Zimmermann & Sheurich, 1981; Zimmermann, 1982; Zimmermann &
Vienken, 1982; Vienken & cs, 1983). Bằng phương pháp này, các tác giả đã đạt được tần số
dung hợp tới 60 và 80%. Tuy tần số dung hợp có cao nhưng vấn đề tái sinh các sản phẩm dung
hợp lại gặp khó khăn. Chỉ gần đây một số tác giả mới nhận được cây tái sinh sau khi sử dụng
phương pháp dung hợp này (Kohn & cs, 1985).
Khi dung hợp hai loại protoplast với nhau thường có ba nguồn gen tham gia (nhân, lục
lạp, ty thể) được kết hợp trong các sản phẩm dung hợp. Nếu dung hợp hai loại protoplast giống
nhau ta sẽ tạo được các sản phẩm đồng hợp gen (homogenome). Trong trường hợp dung hợp hai
loại protoplast khác nhau sẽ tạo ra sản phẩm dị hợp gen (heterogenome). Các sản phẩm đồng hợp
gen sẽ tạo ra các kiểu hình giống như bố mẹ nhưng với mức bội thể gấp đôi. Các sản phẩm dị
hợp gen sẽ tạo ra tế bào dị nhân với hỗn hợp lục lạp và ty thể. Một trong hai nhân có thể bị thối
hố hoặc cả hai đều phân ly trong q trình phân chia tế bào. Sự thối hoá hoặc phân ly của một
nhân trong tế bào dị hợp gen sẽ tạo ra những tế bào chứa tế bào chất của cả hai loại protoplast và
chỉ có một nhân. Những tế bào kiểu này được gọi là các thể lai tế bào chất.
Muốn chọn các thể lai sôma bằng dung hợp protoplast có thể sử dụng các đặc điểm phối
hợp, các đặc điểm kháng sinh hoá và các đột biến sắc tố, ngồi ra có thể sử dụng các đặc điểm
khác nhau tự nhiên giữa các loại protoplast.
Melcher là người đầu tiên sử dụng sự phối hợp hai đột biến bạch tạng để chọn sản phẩm
dung hợp ở thuốc lá (Melchers & Labil, 1974). Một số tác giả khác đã sử dụng phương pháp
tương tự trong các thí nghiệm lai giữa các cây dại trên cùng loài như P.innoxia (Schieder, 1977)
và các cây khác loài như P Parodii + P.Hybrida (Cocking 1978), N. Tabacum + N. Glauca
(Evans & cs, 1978). Sự phối hợp các đột biến tự dưỡng như thiếu nitrate reductase, thiếu các axit
amin và vitamin hoặc mẫn cảm với nhiệt độ đã được nhiều tác giả sử dụng có kết quả (Schieder,
1974; Glimelius & cs, 1978; Muller & Grafe, 1978; Sidorov & cs, 1981; Sidorov & Maliga,
1982; Evola, 1983; Gebhardt & cs, 1983;Shimamoto & cs, 1983). Điều đáng chú ý là các đột
biến sử dụng để chọn phối hợp phải là các đột biến lặn và khác alen.

Đặc điểm kháng các chất ức chế trao đổi chất cũng được sử dụng rộng rãi để chọn thể lai.
Power và cs (1976) đã sử dụng actinomyxin để chọn thể lai giữa P. Parodii và P. Hybrida.
Maliga và cs (1977, 1982) dùng kanamyxin và streptomyxin để chọn thể lai trong các thí nghiệm
dung hợp giữa các lồi thuốc lá với nhau.

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái
- 19 Trường THPT Tiên Lữ


… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Một số dòng tế bào và cây lai còn được chọn bằng sự khác nhau về khả năng sinh trưởng
và tái sinh của sản phẩm dung hợp và từng loại protoplast (Carlson & cs, 1972; Power & cs,
1977), bằng ưu thế trong sự phát triển của cây lai (Cocking & cs, 1977; Schieder, 1978; Schieder
& cs, 1978; Krumbiegel & Schieder, 1979; Dudits & cs, 1979; Lonnerndoker & Schieder, 1980),
hoặc hình dạng khơng bình thường của mơ và cây lai (Melchers & cs, 1978; Binding & Nehls,
1978).
Năm 1977 Kao đưa ra phương pháp tách thể dung hợp bằng cơ học. Phương pháp này
được Gleba và đồng nghiệp phát triển và sử dụng tại phịng thí nghiệm của mình (Gleba &
Hofman, 1978; Gleba & cs, 1978; Gleba & Hofman, 1979).
Cho đến nay dung hợp protoplast là phương pháp hiệu quả nhất để tạo cây lai sơma. Nó
cho phép tạo các tổ hợp lai bất kỳ theo ý muốn. Vấn đề là phải nghiên cứu cải tiến phương pháp
dung hợp, kỹ thuật nuôi cấy và phương pháp chọnlọc.
Từ công trình lịch sử của Carlson (Carlson & cs, 1972) đến nay bằng phương pháp dung
hợp protoplast các nhà khoa học trên thế giới đã tạo được cây lai sôma từ hàng trăm tổ hợp lai
giữa các cây cùng loài, khác loài và khác chi. Đây là những thành tựu hết sức lớn lao mà các nhà
khoa học đã đạt được trong lĩnh vực lai sôma bằng dung hợp protoplast. Gần đây các nhà nghiên
cứu đã tạo được cây lai sôma ở cả những giống cây trồng có ý nghĩa kinh tế như khoai tây, cà
chua và lúa (Handley & cs, 1986; O’Connell & Hasnon, 1986; Ausutin & cs, 1985, 1986; Terada

& cs, 1987; Guri cs, 1988). Qua đây ta thấy được triển vọng lớn lao của việc ứng dụng phương
pháp này để cải biến di truyền ở thực vật nhằm tạo ra giống cây đáp ứng với yêu cầu đòi hỏi của
thực tiễn.

4.2. Lai tế bào chất
Ngoài việc tạo ra các thể lai sôma chứa dị hợp nhân, dung hợp protoplast cịn có thể tạo
được các thể lai tế bào chất (hay còn gọi là lai sinh chất). Trong những năm gần đây nhiều phịng
thí nghiệm ở Pháp, Thụy Điển, Canada, Ixraen, Nga, Ucrain và Hungary đã đầu tư nhiều cho các
nghiên cứu trong lĩnh vực này, vì đến nay một số các đặc điểm chống chịu của thực vật được
chứng minh liên quan đến vật chất di truyền tế bào chất.
Trong thời kỳ đầu, các nhà nghiên cứu đã cố gắng tạo các thể lai tế bào chất bằng cách
đưa các bào quan tách rời vào protoplast. Potrykus là người đầu tiên công bố chuyển được lục
lạp vào protoplast của Petunia hybrida (cây dạ n) nhưng khơng có những số liệu chứng minh
chắc chắn sự tồn tại của lục lạp trong tế bào (Potrykus, 1973). Những cơng trình của Carlson
(1973), Bonnet & Erikson (1974 ) và Kung ( 1975) cũng ở tình trạng tương tự.

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái
- 20 Trường THPT Tiên Lữ


… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Vasil và vợ của ông đã công bố kết quả chuyển ty thể từ cây bất dục đực (BDĐ) ở cây
ngô và cây Dã yên vào protoplast của cây bình thường và tái sinh được cây (Vasil & Vasil, 1974;
Vasil, 1976). Các tác giả còn xác định được gen điều khiển tính BDĐ ở ngơ.
Những cơng trình trên đã đi vào lịch sử. Từ đó đến nay khơng có những cơng bố tiếp
theo. Sở dĩ như vậy là do những hạn chế về việc tách nhận các bào quan nguyên vẹn và giữ
nguyên hoạt động của chúng. Đây là vấn đề hết sức khó khăn vì trong quá trình tách và làm sạch,
các bào quan bị giảm sức sống. Ngồi ra chúng cịn dễ bị ảnh hưởng bởi các tác nhân trong quá

trình dung hợp. Mặt khác nữa là trong các cơng trình kể trên hiệu suất dung hợp còn rất thấp.
Bắt đầu từ năm 1978 đến nay các nhà nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật dung hợp hai loại
protoplast, trong đó một loại có các đặc điểm di truyền lục lạp và ty thể đã được xác định để tạo
các cây lai tế bào chất. Belliard và cs (1978) là những người đầu tiên sử dụng thành công phương
pháp này. Tuy nhiên tỷ lệ cây lai tế bào chất nhận được còn thấp và việc phân tích di truyền các
cây lai nhận được bị gặp nhiều khó khăn do sự hình thành cả các thể lai nhân. Để khắc phục
những hạn chế trên, Zelcer và đồng nghiệp lần đầu tiên sử dụng phương pháp dung hợp “cho và
nhận“ (Zelcer & cs, 1978). Ông dùng tia X để giết nhân của một loại protoplast. Những
protoplast đã bị chiếu xạ này không thể phân chia được mà chỉ đóng góp tế bào chất trong q
trình tạo cây lai. Zelcer dung hợp protoplast đã giết nhân (protoplast cho tế bào chấ) của N.
Tabacum với protoplast nguyên vẹn (protoplast nhận) của N. Sylvestris. ỡng đã chuyển được
tính BDĐ (đặc điểm ty thể) từ N. Tabacum sang N. Sylvestris.
Các đặc điểm liên quan tới lục lạp cũng đã được chuyển thành công nhờ phương pháp
trên (Beversdorf & cs, 1980; Menczel & cs, 1982; Aviv & cs, 1984; Fluhr & cs, 1983, 1984,
1985; Kemble & Barsby, 1988).
Ngoài việc dùng tia phóng xạ để giết nhân có thể dùng một số chất hoá học như
iodoacetate (Medgyey & cs, 1980), hoặc dùng ly tâm để loại bỏ nhân (Wallin & cs, 1977; Maliga
& cs, 1982). Nhưng trong các trường hợp này tỷ lệ nhân sống sót vẫn cịn đáng kể.
Đối với các đặc điểm di truyền lục lạp rất dễ dàng chọn lọc và theo dõi sau khi dung hợp
bằng các chỉ thị di truyền lục lạp như các đột biến lạp thể (Gleba & cs,1978), các đột biến kháng
sinh hoá như kháng một số độc tố nấm (Aviv & cs, 1980; Flick & cs, 1985), các đột biến kháng
thuốc (Medgyesy & cs, 1980; Maliga cs, 1982; Cseplo & Maliga, 1982; Cseplo & cs, 1984) và
các đột biến kháng chất diệt cỏ ( Gressel 1984).
Đại phân tử của enzim ribulozo 1, 5 difotfat carbonxylase được tổng hợp nhờ thông tin di
truyền lục lạp đã được sử dụng để nghiên cứu sinh hoá lục lạp (Kung & cs, 1975). Phương pháp
phân tích sinh hố chính xác hơn nữa đó là phương pháp phân tích điện di đồ của ADN lục lạp
(cpADN) sau khi dùng các enzim cắt giới hạn, cắt cpADN thành những đoạn khác nhau và phân
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái
- 21 Trường THPT Tiên Lữ

… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

lập các đoạn cắt này bằng điện di (Belliard & cs, 1978). Hiện nay phương pháp này được sử
dụng rộng rãi ở nhiều phịng thí nghiệm trên thế giới. Ngoài khả năng sử dụng với bất kỳ tổ hợp
lai nào, phuơng pháp này cịn rất chính xác nó cho phép xác định được 1% hỗn hợp của cpADN.
Khác với lục lạp các đặc điểm liên quan tới ty thể khơng có những chỉ thị để chọn trong
khi nuôi cấy in vitro. Một số tác giả đã dùng chỉ thị lục lạp để chọn (Medgyesy & cs, 1980;
Menczel & cs, 1982). Trường hợp này chỉ sử dụng được khi lục lạp và ty thể liên kết với nhau
theo một cơ chế nào đó.
Nghiên cứu hình thái của hoa có thể gíup cho việc xác định ty thể ngoại lai trong các cây
lai. Tính BDĐ cũng đã được sử dụng làm chỉ thị để chọn đặc điểm ty thể ở thuốc lá (Belliard &
cs, 1979) và Dã yên (Izhar & Power, 1979; Izhar & Tabib, 1980).
Giống như lục lạp phương pháp phân tích điện di đồ của ADN ty thể (mtADN) cũng
được sử dụng rộng rãi để xác định ty thể trong cây lai tế bào chất. Belliard và cs đã dùng phương
pháp này để nghiên cứu ty thể ở những cây lai trong thí nghiệm dung hợp protoplast thuốc lá và
đã phát hiện thấy sự tái tổ hợp của mtADN trong các cây lai (Belliard & cs, 1979). Tiếp sau đó
Nagy và cs (1981), Galun và cs (1982) và nhiều tác giả khác đã sử dụng những phân tích
mtADN để nghiên cứu và theo dõi hoạt động của ty thể ở các cây lai tế bào chất.
Số phận của lục lạp cũng như ty thể ngoại lai trong cơ thể lai tế bào chất là một vấn đề
được các nhà nghiên cứu quan tâm hàng đầu vì việc biến đổi di truyền tế bào chất chỉ có ý nghĩa
khi những thông tin di truyền lục lạp và ty thể ngoại lai tồn tại và hoạt động bình thường trong
cơ thể lai.
Những kết quả đầu tiên của Kung (Kung & cs, 1975, 1977) và Chen (Chen & cs, 1977)
cho thấy các cây lai giữa N. Glauca và N. Langsdorffii phần lớn chỉ chứa một loại lục lạp (hoặc
của bố, hoặc của mẹ). Trong cơng trình của Belliard, tác giả chỉ xác định được một loại cpADN
trong cây lai tế bào chất (Belliard & cs, 1978). Thành và cs đã chứng minh cây thuốc lá nhận
được từ dung hợp protoplast của hai loại cây khác tông Salpiglossis sinuata (cây cho lục lạp) và
N. Tabacum (cây nhận lục lạp) chỉ chứa một loại lục lạp của S. Sinuata (Thanh & cs, 1988).

Trong một vài trường hợp các tác giả này lại xác định được cả hai loại lục lạp. Một số tác giả
khác cũng thu được những kết quả tương tự (Aviv & cs, 1980, 1984; Glimelius, 1981; Bonnet &
Glimelius, 1983).
Mặc dù trong một số cơng trình các tác giả chứng minh được sự tồn tại của hai loại
cpADN trong cây lai nhưng chưa ai thấy được hiện tượng tái tổ hợp của cpADN. Vấn đề tái tổ
hợp của cpADN ở thực vật bậc cao tuy đã được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới nghiên cứu,
xong đến cuối những năm 80 mới có hai cơng bố về sự tái tổ hợp cpADN trong cây lai tế bào
chất ở thuốc lá (Medgyesy & cs, 1985) và cây lai tế bào chất giữa thuốc lá và khoai tây (Thanh
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái
- 22 Trường THPT Tiên Lữ


… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

& cs, 1989). Tái tổ hợp ADN lục lạp là một vấn đề rất có ý nghĩa, thơng qua tái tổ hợp cpADN
có thể tạo ra các tổ hợp gen tế bào chất mới.
Đối với ty thể trong tồn bộ các cơng trình đã cơng bố đều cho thấy ở các cây lai tế bào
chất luôn xảy ra sự tái tổ hợp mtADN (Belliard & cs, 1978; Nagy & cs, 1981, 1983; Clark & cs,
1986; Kemble, 1986; Robertson & cs, 1987). Kết quả của sự tái tổ hợp này là tạo ra các kiểu
hình hoa mới, và các kiểu hình này rất ổn định (Belliard & Pelletier, 1979). Tái tổ hợp mtADN
xảy ra ngay cả sau khi dung hợp protoplast của hai giống thuốc lá có mtADN tương tự nhau, tuy
nhiên sự tái tổ hợp xảy ra nhiều hơn khi dung hợp hai loài thuốc lá khác nhau như N. tabacum và
N. Plumbaginifolia (Nagy & cs, 1981, 1983).
Cho đến nay, việc nhận cây lai tế bào chất bằng kỹ thuật dung hợp protoplast mới được
thực hiện chủ yếu ở các loài thuốc lá, cải và bước đầu thành công ở khoai tây. Tuy vậy những
thành tựu đạt được đã mang lại những ứng dụng thực tiễn trong việc cải biến cây trồng. Chuyển
lục lạp có thể giúp cho việc khôi phục năng suất ở cây cải dầu –Brasica napus (Bennerot & cs,
1974; Pelletier & cs, 1983) và tạo các giống cây trồng kháng các chất diệt cỏ (Benversdof & cs,
1980; Binding & cs, 1982; Gressel & cs, 1984; Pelletier & cs, 1985).

Lai tế bào chất bằng dung hợp protoplast có thể rút ngắn thời gian tạo các dịng bất dục
đực 4-5 năm. Chuyển tính BDĐ đã thành công ở thuốc lá (Zelcer & cs, 1978; Aviv &Galun,
1980; Aviv & cs, 1980; Glimelius & cs, 1981; Uchimiya, 1982; Menczel & cs, 1983; Fluhr & cs,
1984) và dã yên (Izhar & Power, 1979; Izhar & Tabib, 1980; Izhar & cs, 1983, 1984; Boeshore
& cs, 1983; Clark cs, 1985; Rothenbenrg & cs, 1985). Đặc biệt là chuyển tính BDĐ để tạo hạt lai
ở cải dầu đã mang lại lợi ích kinh tế (Pelletier & cs, 1985; Chetrit & cs, 1985).
V. CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT
5.1. Một số vấn đề chung về chuyển gen ở thực vật.
Chuyển gen ở thực vật đã phát triển cùng với sự phát triển của các kỹ thuật nuôi cấy mô
và tế bào thực vật. Nó trở thành một phương tiện quan trọng để nghiên cứu cơ bản trong sinh học
thực vật. Nó cho phép nghiên cứu cấu trúc và điều khiển hoạt động của gen. Ngồi ra nó mở ra
triển vọng chuyển các gen có ý nghĩa kinh tế vào cây trồng. Từ khi khám phá ra rằng chuyển gen
có thể thực hiện nhờ Agrobacterium tumefaciens (Klee & Rogers, 1989) các nhà khoa học tin
rằng Arobacterium có thể chuyển gen vào tất cả các lồi cây. Nhưng sau đó kết quả thực tế cho
thấy chuyển gen bằng Agrobacterium không thể thực hiện được trên các cây ngũ cốc vì thế hàng
loạt các kỹ thuật chuyển gen đã được phát triển đó là kỹ thuật chuyển gen trực tiếp (Paszkowski
& cs, 1989), kỹ thuật bắn gen (Klein & cs, 1989), kỹ thuật vi tiêm (Neuhaus & cs, 1987), kỹ
thuật chuyển gen qua hạt phấn (Hess & cs, 1977 ; Ohta, 1986), kỹ thuật đường dẫn bằng ống
phấn (Luo & cs, Wu, 1988), kỹ thuật ủ hạt hoặc mô với ADN (Ledoux & cs, 1974), kỹ thuật
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái
- 23 Trường THPT Tiên Lữ


… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

nhiễm vi khuẩn (Grimsley & cs, 1986), sử dụng ADN của virus (Gronenborn & Matzeit,1989),
Kỹ thuật điện di (Linsay & Jones, 1990), dung hợp liposom (Ahokas, 1987), phương pháp vi
tiêm (De la Pena & cs, 1987), và phương pháp xử lý laser (Weber & cs, 1988). Đến nay nhờ cải
tiến các vectơ chuyển gen nên kỹ thuật chuyển gen bằng A. tumefaciens đã thành công cả ở cây

ngũ cốc đặc biệt là lúa (Hiei và cs, 1994). Kỹ thuật này trở nên một kỹ thuật đầy triển vọng đối
với chuyển gen ở thực vật.
Chuyển gen được thực hiện qua các bước sau:
- Xác định gen liên quan đến tính trạng quan tâm.
- Phân lập gen.
- Gắn gen vào các vectơ biến nạp.
- Biến nạp vào E. Coli.
- Tách ADN plasmid.
- Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật.
- Chọn các thể biến nạp.
- Tái sinh cây biến nạp.
- Chứng minh sự có mặt của gen biến nạp trong cây tái sinh.
Khi đặt ra mục đích và thực hiện thí nghiệm chuyển gen cần chú ý một số vấn đề sinh
học của hệ thống chuyển gen như:
- Khơng phải tồn bộ tế bào đều thể hiện tính tồn năng.
- Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả năng thu nhận
gen biến nạp vào genôm.
- Mô thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào có những khả năng khác nhau. Cần xem xét
một số vấn đề như: chỉ có số ít tế bào có khả năng tái sinh và biến nạp; một số khác có một trong
hai khả năng; một số nếu tạo điều kiện phù hợp thì trở nên có khả năng; một số khác hồn tồn
khơng có khả năng tái sinh và biến nạp.
- Thành phần các quần thể tế bào được xác định bởi loài, kiểu gen, từng cơ quan, từng
giai đoạn phát triển của mô và cơ quan.
- Cho đến nay gen chỉ có thể chuyển vào tế bào có thành xellulô bằng Agrobacterium,
virus, vi tiêm, bắn gen và chuyển gen trực tiếp.
Khả năng xâm nhập của gen vào genôm một cách ổn định không tỷ lệ với sự thể hiện tạm
thời của gen.
Các ADN không phải là của virus khi có trong genơm chưa bảo đảm là đã gắn ổn định
với genôm.

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái
- 24 Trường THPT Tiên Lữ


… Đề tài: “Ứng dụng cụng nghệ sinh học thực vật trong nụng nghiệp” …
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

- Các ADN không phải của virus không chuyển rời từ tế bào nọ sang tế bào kia, nó chỉ ở
nơi mà nó được đưa vào.
- ADN virus không xâm nhập vào genôm cây chủ, chuyển từ tế bào này sang tế bào khác
và bị loại ở mô phân sinh.

5.2. Các phương pháp chuyển gen
5.2.1. Chuyển gen bằng Agrobacterium.
Chuyển gen bằng Agrobacterium là phương pháp hữu hiệu đầu tiên dùng để chuyển gen
ở thực vật. Phương pháp này dùng Ti- plasmid của A. tumefaciens hoặc Ri plasmid của A.
rhizogenes làm vectơ đưa ADN vào tế bào. Ti plasmid gồm hai thành phần T -ADN và vùng vir
(virulence). T-ADN có thể chuyển từ Agrobacterium vào tế bào thực vật, chính nhờ vậy mà có
thể gắn gen muốn chuyển nạp vào T -ADN để đưa vào tế bào. T -ADN chức gen điều hoà sinh
trưởng cục bộ và gen tổng hợp các chất opine. Đoạn cuối có 25 cặp bazơ lặp lại, bất kỳ đoạn nào
trong vùng này cũng có thể xâm nhập vào phân tử ADN thực vật. Vùng vir gồm sáu nhóm từ
virA đến virG trong đó virC và virE có tác dụng làm tăng tần số biến nạp.
Để thiết kế vectơ dùng cho biến nạp, trước hết là cắt bỏ các gen điều hoà sinh trưởng cục
bộ sau đó gắn thêm gen chỉ thị (kháng thuốc hoặc chất diệt cỏ) cùng với đoạn điều khiển
(promote) phù hợp để chọn các thể biến nạp và cuối cùng là gắn gen cần biến nạp.
Chuyển gen bằng Agrobacterium đã thực hiện có hiệu quả trên nhiều loại cây hai lá mầm
như: thuốc lá, cà chua, khoai tây (Cheng và cs, 1992), đậu tương (Hinchee & cs, 1988; Dhir &
cs, 1992), bông (Perlak & cs, 1990), Arobidopsis, ngô (Gould & cs, 1991; Citovsky & cs, 1994).
Những thành công mới nhất trên lúa (Hiei & cs, 1994; Rashid & cs, 1996) đã làm cho phương
pháp chuyển gen bằng Agrobacterium trở nên hấp dẫn và củng cố vị trí của nó như các nhà tiền

bối hy vọng ngay từ đầu. Cho đến nay chuyển gen thông qua Agrobacterium là phương pháp cho
tần số biến nạp cao hơn và có thể xác định được sự xâm nhập ổn định hơn bất cứ phương pháp
chuyển gen nào (Chan & cs, 1993)

5.2.2. Phương pháp nhiễm Agrobacterium bằng virus.
Phương pháp nhiễm Agrobacterium bằng virus là phương pháp gắn ADN virus vào T ADN của Ti plasmid và chuyển vào tế bào thực vật. Khi vào tế bào thì ADN virus được giải
phóng để tạo virus hoạt động và xâm nhập vào genôm tế bào gần vùng u do Agrobacterium gây
nên. Bằng phương pháp này Grimsley và cs (1987) lần đầu tiên cho thấy khả năng chuyển gen ở
cây ngũ cốc bằng Agrobacterium.

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GV: Đỗ Ngọc Thái
- 25 Trường THPT Tiên Lữ