Nghiên cứu thu nhận enzym endo ß 14 mannanase tái tổ hợp ứng dụng trong tẩy trắng bột giấy

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN VIỆT PHƯƠNG

Nghiên cứu thu nhận endo-β-1.4-mannanase
tái tổ hợp ứng dụng trong tẩy trắng bột giấy

LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội, 2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN VIỆT PHƯƠNG

Nghiên cứu thu nhận endo-β-1.4-mannanase tái
tổ hợp ứng dụng trong tẩy trắng bột giấy

LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN:
TS ĐẶNG THỊ THU

Hà Nội, 2010

Luận văn thạc sỹ

Công nghệ sinh học

MỞ ĐẦU
Mannanase hay endo 1.4-β-D-mananase là enzym thuộc nhóm hemicellulase
xúc tác q trình thủy phân liên kết β-1.4-mannosidic trong mạch chính của mannan
giải phóng ra mannobiose, mannotriose, oligosaccarid và một lượng nhỏ mannose.
Trên thế giới, mannanase đã được sản xuất trên quy mô công nghiệp. Chế
phẩm mannanase thương mại có ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp như công
nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, chế biến thức ăn gia súc, dầu khí… Tuy nhiên,
việc sử dụng mannanase trong các ngành cơng nghiệp cịn hạn chế do hiệu suất sinh
tổng hợp enzym này của vi sinh vật tự nhiên cịn thấp, chi phí sản xuất enzym còn
cao. Mặt khác, các chủng sinh tổng hợp mannanase trong tự nhiên thường đồng thời
sinh tổng hợp nhiều loại enzym khác làm ảnh hưởng đến hiệu quả sử dụng enzym.
Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật đặc biệt là sự phát triển của các kĩ
thuật sinh học phân tử tạo ra tiềm năng lớn để sản xuất mannanase từ vi sinh vật.
Công nghệ gen cung cấp khả năng để hiển thị chỉ một loại enzym mong muốn trong
các vật chủ mà khơng sinh tổng hợp enzym có liên quan, do đó khơng cần tách và
tinh chế enzym nhưng trong một số ứng dụng vẫn đạt được hiệu quả mong muốn
[31].
Ở Việt Nam, tiềm năng ứng dụng mannanase là rất lớn, trong đó ứng dụng
trong ngành cơng nghiệp giấy là một trong những hướng nghiên cứu trọng điểm
trong thời gian qua, đặc biệt kể từ khi thấy rõ được ứng dụng của enzym trong tẩy
trắng giấy. Công nghiệp giấy là một ngành kinh tế quan trọng cần được ưu tiên phát
triển phù hợp với đường lối đổi mới của nền kinh tế, với tiến trình cơng nghiệp hóa,
hiện đại hóa của đất nước.
Bên cạnh đó, với thực trạng hiện nay và trước tình hình mới, vấn đề đáp ứng
các yêu cầu về bảo vệ môi trường của công nghiệp giấy đang hết sức cấp bách. Vì
vậy song song với áp dụng các biện pháp kịp thời về xử lý chất thải, việc cải tiến

công nghệ nhằm nâng cao hiệu quả kinh tế và giảm thiểu ô nhiễm môi trường cũng
cần được quan tâm đúng mức.
1


Luận văn thạc sỹ

Công nghệ sinh học

Thực tế công nghiệp giấy thế giới cho thấy, có nhiều phương pháp hữu hiệu
để giảm hoặc loại bỏ hoàn toàn việc sử dụng chất tẩy chứa clo, như thay thế clo
bằng di oxit clo, ozon, hydropeoxit, …, [8] trong đó sử dụng enzym là biện pháp
hiệu quả và phù hợp với xu hướng phát triển của thời đại…
Từ thực tiễn đặt ra làm thế nào để giảm lượng hóa chất tiêu tốn trong q
trình sản xuất. Bên cạnh đó, ở Việt nam chưa có cơng bố nào về ứng dụng enzym
mannanase trong tẩy trắng giấy. Từ những ý nghĩa quan trọng trên tôi tiến hành
nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu thu nhận endo-β-1.4-mannanase tái tổ hợp ứng dụng
trong tẩy trắng bột giấy ”.
 Nội dung nghiên cứu bao gồm:
-

Nghiên cứu thu nhận endo-β-1,4-mannanase tái tổ hợp quy mô 5l.

-

Nghiên cứu điều kiện thích hợp tiền tẩy trắng bột giấy gỗ cứng và gỗ mềm
(Nhiệt độ, pH, nồng độ enzym, nồng độ bột giấy, thời gian).

-

Nghiên cứu hiệu quả tiền tẩy trắng của một số chế phẩm enzym trên bột gỗ
cứng và gỗ mềm (Mannanase tái tổ hợp, xylanase thương mại, mannanase tái
tổ hợp kết hợp với xylanase thương mại).

-

Xác định mức giảm hố chất trong q trình tẩy trắng sử dụng enzym trên
bột gỗ cứng và gỗ mềm.

2


Luận văn thạc sỹ

Công nghệ sinh học

PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về endo-β-1.4-mannanase
1.1.1. Chức năng của endo-β-1.4-mannanase
Endo 1.4-β-D-mananase (EC.32.1.78) là enzym xúc tác thủy phân liên kết β1,4 – mannopyranozit trong mạch chính của mannan và heteropolysaccharide có
chứa đường mannose, galactomannan, glucomannan. Endo 1.4-β-D-mananase thủy
phân glycoside và polymannan tạo ra các mano-oligosaccharide và một chuỗi các
oligosaccharide chứa D-manose, D-glucose và D-galactose.
Mức độ cắt mạch mannan phụ thuộc vào tỉ lệ glucose và mannose trong
mạch. Ví dụ: Bột glucomannan salep (glucose:mannose = 2:8) bị cắt nhiều hơn so
với glucomannan konjac (glucose:mannose = 66:100). Mức độ thay thế và phân bố
các nhóm bên làm ảnh hưởng đến hoạt tính của mannanase. Nhóm bên galactosyl
của galactomannan và nhóm acetyl hạn chế sự thủy phân mạch chính.
Ngồi khả năng thủy phân mannan, một số mannanase có thể chuyển đổi
glucosyl. Trong suốt q trình, các oligosaccharide đóng vai trị chất nhận thay

nước. Đây là nhóm enzym glucosidase, thủy phân các liên kết glucoside mà vẫn giữ
nguyên cấu hình [33].
1.1.2. Cấu tạo và đặc tính của endo-β-1.4-mannanase
Mannanase nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc khác
nhau. Mannanase của vi khuẩn ưa nhiệt Thermotoga neapolitana 5068 là enzym
một cấu tử , có khối lượng phân tử 65 kDa. Mannanase từ nấm Sclerotium rolfsii là
một glycoprotein có khối lượng phân tử 46.5 kDa [24], mannanse từ Aspergillus
Niger có khối lượng 45 kDa [10]. Mannanase được tách từ loài nhuyễn thể biển
Littovena reesei có khối lượng phân tử là 42 kDa [33].
Endo-beta-1,4-mannanase của Pseudomonas cellulose bao gồm 423 axit
amin, với cấu trúc được chia thành 3 vùng: vùng A từ prolin 44 đến isoleucin 323,
vùng B từ Leucin 32 đến Tryptophan 360 và vùng C từ Threonin 392 đến Threinin

3


Luận văn thạc sỹ

Công nghệ sinh học

419. Các chuỗi Arg 39- Lys 43, Arg 324-Gly 331, Arg 361-Thr 391 và Leu 420-Lys
423 có chức năng nối các vùng trên với nhau. Toàn bộ phân tử endo-beta-1,4mannanase được cấu tạo bởi 8 chuỗi xoắn α và 8 chuỗi β.

Hình 1.1. Cấu trúc không gian của endo-beta-1,4-mannanase 26 A Pseudomonas
cellulose
(Đỏ: chuỗi α; Xanh lục: chuỗi β, Ghi: đoạn nối; Chấm: ZnSO 4 )
Endo-beta-1,4-mannanase từ Tricoderma reesei bao gồm 344 axit amin tạo
thành 16 chuỗi α và 14 chuỗi β ngắn với 4 cầu disulfit. Trung tâm hoạt động của
enzym này nằm trong một hốc của phân tử, enzym này có ít nhất năm miền tiếp xúc
với cơ chất, mỗi miền sẽ gắn với một đơn vị monomer của chuỗi polysaccarit trong

quá trình xúc tác phản ứng. Glu169 và Glu276 nằm trên rãnh dọc theo bề mặt
enzym có vai trị quan trọng trong quá trình xúc tác.
1.1.2.1. Cấu tạo gen tái tổ hợp
Endo – β-1.4- mannanase được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp như
công nghiệp giấy [14], thực phẩm, chế biến thức ăn gia súc, dược phẩm, dầu khí.
Việc sử dụng các kĩ thuật khoa học hiện đại đặc biệt là kĩ thuật sinh học phân tử
trong các nghiên cứu sản xuất mannanase trên quy mô công nghiệp đang ngày càng
được quan tâm. Cho đến năm 1993 mới chỉ có 3 trình tự nucleotide được công bố
[3], nhưng từ khi thấy rõ cơng dụng của enzym trong việc tẩy trắng giấy thì số trình
tự nucleotide được cơng bố nhiều hơn. Các gen này đã được tách dịng, giải trình tự

4


Luận văn thạc sỹ

Công nghệ sinh học

và biểu hiện ở các tế bào chủ khác như E.coli [5], nấm men Saccharomyces
cerevisiae [26], [27] và Pichia Pastoris [32], [29]. Các tế bào tái tổ hợp có khả năng
sinh tổng hợp mannanase tái tổ hợp, mang các đặc tính tương tự với enzym gốc. Đã
có một số nghiên cứu nhân dịng gen endo – β-1.4- mannanase ở các vi sinh vật để
tạo các biến chủng có khả năng sinh tổng hợp mannanase cao. Gen mã hoá endo- β1.4- mannanase chịu nhiệt chủng Bacillus stearothermophilus đã được nhân dòng
và biểu hiện ở tế bào E.coli BL21. Gen endo- β-1.4- mannanase từ nấm
Trichoderma reesei được nhân dòng và biểu hiện ở nấm men S. cerevisiae [27], đã
tách dịng và biểu hiện thành cơng gen sinh tổng hợp endo-β-mannanase trong
Aspergillus niger. Yu QIAO và cộng sự (2008) đã tiến hành biểu hiện gen sinh tổng
hợp endo-β-mannanase từ Bacillus subtilis trong Pichia pastoris.
1.1.2.2. Đặc tính
Mannanase có nguồn gốc khác nhau có đặc tính khác nhau. Đặc tính của một

số lồi nấm mốc, vi khuẩn và động vật được giới thiệu sau đây:

5


Luận văn thạc sỹ

Công nghệ sinh học

Bảng 1.1. Một số đặc tính của endo-β-mannanase tái tổ hợp
Nguồn

Hệ thống biểu

t0 opt

pH opt

hiện

En
Thermoanaerobact
Man

erium

A

polysaccharolyticu

KLPT

Tham khảo

(kDa)

Escherichia coli

50C-

5.8

116

750C

Isaac

K. O.

Cann cs.,1998

m

Man

Clostridium

Escherichia

thermocellum

BL21(DE3)

coli 600C

6·5

70

Jonathan

R.

Halstead
cs.,1999

A
600C

Aspergillus

Aspergillus sojae

fumigatus IMI

và Pichia pastoris và

Gökhan

5.2

Duruksu

450C

385708
Aspergillus

4.5 và 60

Pichia pastoris.

00C

cs.,2008
2.4

48

sulphureus
MM

Caldibacillus

anA

cellulovorans

Chen

XiaoLing,

Escherichia coli

50C

6.0

Anwar Sunna
CS,1999

d3
Bacillus sp.N16-5

Pichia pastoris

700C

6.0

Xiuping.,cs
2008

Bacillus subtilis

Pichia pastoris

500C

5.5

40

Yu

QUIAO

cs., 2008

6


Luận văn thạc sỹ

Công nghệ sinh học

1.1.3. Cơ chế tác dụng của β-1.4- mannanase
1.1.3.1. Cơ chất đặc hiệu của β-1.4- mannanase
Endo β-1.4- mannanase có tác dụng thủy phân liên kết β-1.4- mannosidic
trong chuỗi polysaccaride galactomannan, glucomannan, galactoglucomannan và
mannan. Sự thủy phân mannan và các hợp chất của mannan bằng β-1.4- mannanase
tạo ra các sản phẩm là β-D mannooligosaccharides và hỗn hợp các oligosaccharides
có chứa các D-mannose, D-glucose và D-galactose.
Mannan tinh khiết
Mannan là polysaccharides có chứa các gốc đường mannose với tỷ lệ hơn
90%. Chúng dự trữ trong nội nhũ của hạt cọ, hạt cần tây, hạt cà rốt, hạt cà phê xanh
và mất dần trong quá trình hạt nảy mầm. Ngồi ra, mannan cịn chứa nhiều trong
hạt chà là và cùi dừa, chiếm một tỷ lệ lớn hơn trong bã cơm dừa.

Hình 1.2 . Cấu tạo mannan

Mannan có trong ngơ, mì, mạch, cám gạo, cám mì, đặc biệt có nhiều trong
các loại khô dầu như khô cọ (30-35%), khô dừa (25-30%), bột đậu guar (12-17%),
khô dầu vừng, vỏ đậu nành. Mannan chiếm thành phần nhỏ trong khô đỗ tương, khô
lạc, khô hướng dương, khô cải (1,6-0,49%).
Glucomannan
Glucomannan là phần sợi tách từ củ của cây Amorphophallus Konjac, một
loại cây trồng phổ biến ở một số nước Châu Á. Glucomannan có khả năng hút nước
rất lớn, một gram glucomannan có thể hấp thu khoảng 200 ml nước, vì vậy nó được
dùng cho những người ăn kiêng, sản xuất bông gạc và chỉ khâu y tế. Thành phần
7


Luận văn thạc sỹ

Công nghệ sinh học

glucomannan gồm các gốc đường glucose và mannose với tỷ lệ 5:8, các gốc glucose
và mannose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucoside.

Hình 1.3. Liên kết giữa Glucose và mannose trong Glucomannan
Galactomannan

Hình 1.4. Liên kết β 1.4 và α 1.6 trong Galactomannan
Galactomannan là polysaccharides chứa các gốc đường mannose trên khung
chính và các nhánh galactose. Các đơn vị mannopyranose trên mạch chính liên kết
nhau bởi liên kết β-1,4 glucoside, mạch nhánh là các gốc galactose được gắn vào
mạch chính nhờ liên kết α-1,6. Galactomannan có trong nhựa của cây gỗ cứng như
bạch đàn, trong nội nhũ của hạt cây họ đậu và trong hạt của một số thực vật khác.
Galactomannan được sử dụng làm tăng độ nhớt các sản phẩm trong công nghiệp
thực phẩm.

Galactoglucomannan
Galactoglucomannan được cấu tạo từ một mạch chính gồm các đường
glucopyranose và mannopyranose. Các gốc galactose được gắn với mạch chính nhờ
8


Luận văn thạc sỹ

Công nghệ sinh học

liên kết β-1,6-D-galactopyranosid. Galactoglucomannan tan tốt trong nước thường
có tỷ lệ mannose/glucose/galactose là 3/1/1 trong khi ở các galactoglucomannan
kém tan trong nước tỷ lệ này là 3/1/0.1. Khoảng 5.9-8.8% mannose và glucose gắn
với nhóm acetyl tại C2 và C3.

Hình 1.5. Galactoglucomannan
1.1.3.2. Cơ chế tác dụng của endo-beta-1,4-mannanase
Endo-β -1,4-mannanase (β-1,4-mannan mannohydrolase, EC 3.2.1.78) phân
cắt liên kết β-1,4-mannosit trong mạch mannan do vậy nó xúc tác thủy phân
mannan, glucomannan, galactomannan và galatoglucomannan thành mannobiose,
mannotriose và hỗn hợp các oligosaccarit [5]. Quá trình này phụ thuộc vào cấu tạo
của cơ chất và lượng sản phẩm tạo thành.
OH OH

H
OH OH

H
O

HO
H

H

H
O

HO

H

H
H

OH

H

H

H

HO

O
H

HO
H

H

H

H

HO

H

H

H

Endo-beta-mannanase

H

Hình 1.6. Cơ chế tác dụng của endo-beta-1,4-mannanase

9

H
H

H

H

H

H

H

HO

O

O
O

HO

OH
O

HO

HO

O

O

O

HO
HO

O

HO
HO

H

H

OH

H


Luận văn thạc sỹ

Công nghệ sinh học

Endo-beta-1,4-mannanase thuỷ phân tốt LBG, galactomannan chỉ chứa một
lượng nhỏ galactose trong phân tử. Các cơ chất như guar gum, galactomannan có tỷ
lệ galactose cao, bị thuỷ phân bởi endo-beta-1,4-mannanase với vận tốc chậm hơn.
Mức độ thủy phân cỏ linh lăng (48% galactose), guar gum (38% galactose), bột
trứng cá đối (28% galactose) và bột carob-bột giống sô cô la (24% galactose) bởi
endo-beta-1,4-mannanase từ A. niger lần lượt là 1, 5, 20 và 22% [12]. Trong khi đó,
sản phẩm chính của q trình thuỷ phân là mannotriose, mannobiose lại kìm hãm
hoạt động của endo-beta-1,4-mannanase. ở nồng độ 90 nM, mannotriose làm giảm
hoạt lực endo-beta-1,4-mannanase 50% [6].
Một số endo-beta-1,4-mannanase có khả năng thuỷ phân liên kết β-1,4 giữa
mannose và glucose trong galactomannan. Điều này phụ thuộc vào tỷ lệ giữa

glucose và mannose.
Bên cạnh khả năng thuỷ phân mannan, một vài endo-beta-1,4-mannanase thể
hiện

khả

năng

chuyển

nhóm

gluxit

(glycosyltransferase)

khi

có

mặt

mannooligosaccarit [12].

Hình 1.7. Cơ chế cắt của endo β-1.4 mannanase trong chuỗi galactomannan

10


Luận văn thạc sỹ

Công nghệ sinh học

1.1.4. Ứng dụng endo-β-1.4-mannanase
Mannanase có nhiều ứng dụng trong các q trình cơng nghiệp, nhu cầu sử
dụng enzym này trong từng lĩnh vực là rất lớn.
 Trong công nghiệp chung
Mannanase sử dụng cho quá trình thuỷ phân dịch chiết cà phê, làm giảm độ
nhớt của dịch chiết suất… [5]. Trong công nghiệp chế biến các loại rau quả làm
tăng năng suất lọc, đảm bảo độ trong của dịch quả, mặt khác làm tăng hiệu suất thu
hồi quả [12].
Gần đây, mananase là thành phẩn ổn định trong thành phần của các chất tẩy.
Mannanase thuỷ phân liên kết mannan có trong các chất keo như galactomannan,
glucomannan và guar gum có xu hướng bám vào các sợi cellulose và sợi cotton..
Mananase có thể ngăn cản bám dính của đất sau khi đã giải phóng khỏi mặt vải
trong suốt quá trình tẩy rửa. Việc tẩy trắng bằng mannanase cải thiện được độ trắng
cũng như ngăn cản quá trình bám hút trở lại của vết bẩn vào các thớ vải trong suốt
quá trình tẩy rửa.
Sự bổ sung β-mannanase vào thức ăn sẽ làm giảm dịch nhầy của ruột do đó
làm tăng chuyển hố thức ăn một cách có hiệu quả và làm tăng trọng lượng của gia
cầm. Gần đây, việc bổ sung enzym mannanase vào bữa ăn để phân huỷ β-mannan
đã đem lại hiệu quả rõ rệt. Và điều này đã được chứng minh ở gà giò, gà đẻ, gà
tây,…
Mannanase cịn có tác dụng là giảm độ nhớt của dịch cấp vào đầu mũi khoan
trong khai thác dầu mỏ và khí đốt [23].
Trong những năm gần đây mannooligosaccharide là mối quan tâm rất lớn
trong công nghiệp dược và thực phẩm [12]. Oligosaccharide, đặc biệt là
oligosaccharide dị thể đóng vai trò trong glycoprotein và glycolipid. Chúng là thành
phần của màng tế bào tại đó chúng đóng vai trị là các thụ thể nhận biết hormon,
chất độc, kháng thể, virus và vi khuẩn. Các kỹ thuật mới bao gồm cả công nghệ

11


Luận văn thạc sỹ

Công nghệ sinh học

enzym đang được nghiên cứu theo hướng tổng hợp các chất có cơ sở là
oligosaccharide dùng trong điều trị và chẩn đoán (các tác nhân gây sưng viêm, phát
hiện bệnh, kít thử kháng thể).
 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy
Sản xuất giấy là một trong những ngành công nghiệp lớn nhất trên thế giới,
với sản lượng 192 triệu tấn bột giấy mỗi năm (vietpaper.com). Khâu khó khăn nhất
trong q trình sản xuất bột giấy là loại bỏ lignin để tạo ra sợi cellulo nguyên chất.
Khâu này gồm hai công đoạn: nấu bột và tẩy trắng. Khi nấu bột, người ta sử dụng
kiềm mạnh và nhiệt độ cao, phân huỷ 90%-95% lignin, hoà tan một phần
hemicellulose (xylan, glucomannan…) trong gỗ. Khi nấu liên tục, pH giảm, xylan
và các dẫn xuất bị kết tủa trên bề mặt cellulose, kéo theo sự tái kết tủa của lignin đã
hoà tan trong dung dịch. Trong khi đó, một phần glucomannan gỗ bị phân huỷ khi
nhiệt độ dịch nấu xấp xỉ 1300C, phần còn lại phân bố chủ yếu trong sợi, tồn tại ở
dạng liên kết khá bền với sợi và lignin [8]. Sự tồn tại của hemicellulose trong bột
sau nấu là một trong những nguyên nhân gây cản trở quá trình loại bỏ lignin.
Để tạo ra giấy chất lượng cao, cần tiếp tục dùng các phương pháp khác nhau
để tẩy trắng bột. Yêu cầu đặt ra là phải tách bỏ nốt phần lignin còn lại sau khi nấu,
mà khơng làm giảm hàm lượng cellulose. Do đó người ta thường lựa chọn các chất
oxi hoá mạnh và có khả năng bẻ gãy chọn lọc phân tử lignin như clo phân tử hoặc
clo dioxit trong quá trình tẩy trắng giấy. Tuy nhiên quá trình này thường tạo ra các
chất độc hại cho sức khoẻ con người và môi trường sinh thái, nên thực tế địi hỏi
“cơng nghiệp giấy và bột giấy cần phải thay đổi công nghệ nấu, tẩy cũng như xử lý

chất thải để giảm thiểu tác động xấu đến môi trường”
Để đạt được mục tiêu trên, nhiều biện pháp đã được đưa ra như nấu tăng
cường, thay thế clo phân tử bằng các chất oxy hoá khác ít độc hại hơn (oxy, ozon,
peroxyt…) [8]. Tuy nhiên các biện pháp này hiệu quả chưa được như mong muốn
[8].

12


Luận văn thạc sỹ

Công nghệ sinh học

Các enzym với nhiều đặc tính ưu việt được cho là một trong những chất thay
thế clo khả thi, không những giải quyết vấn đề mơi trường mà cịn nâng cao chất
lượng sản phẩm và đem lại lợi ích kinh tế. Sử dụng mannanase, một phần mannan
vốn liên kết chặt chẽ với lignin trong bột giấy được tách bỏ, do đó làm tăng hiệu
suất loại lignin bằng phương pháp hoá học. Kết quả độ trắng của bột giấy được cải
thiện, lượng hoá chất tẩy trắng được giảm thiểu.
. Mannanase có thể sử dụng kết hợp với xylanase nhằm tẩy trắng lớp vỏ gỗ
mềm [12]. Mục tiêu chính của q trình tẩy trắng bằng enzym này là giảm lượng
hoá chất sử dụng trong phương pháp hóa học. Thêm vào đó, việc sử dụng enzym
trong làm trắng giấy và bột giấy lại cho chất lượng giấy tốt, điều này là chìa khóa
cho sự phát triển cơng đoạn làm trắng giấy hồn tồn khơng dùng clo. Việc sử dụng
hemicellulase là một phương pháp tẩy trắng gián tiếp, cho cấu trúc các sợi gỗ chặt
chẽ hơn so với sử dụng clo, chất hóa học. Tuy nhiên hiệu quả làm trắng giấy phụ
thuộc nhiều vào phương pháp nấu và quy trình làm trắng được sử dụng. Mannanase
và xylanase sinh tổng hợp bởi S. rolfsii có khả năng làm tăng độ trắng bột giấy lên
1.6-1.9% theo tiêu chuẩn ISO, khi sử dụng kết hợp với xylanase thu được bột giấy
có độ trắng tăng từ 2.5-2.8% [12].

Một số endo-β-1.4-mannanase của vi khuẩn và nấm mốc đã được nghiên cứu
ứng dung tiền xử lý bột giấy trước khi tẩy trắng [10], [15], [29]. Song mannanase có
tính đặc hiệu cơ chất cao, chỉ một số ít mannanase từ B. subtillis có thể hồ tan
mannan gỗ nhưng khơng thể hồ tan được mannan ở dạng kết hợp với bột kraft.
Hơn nữa hiệu quả thuỷ phân của enzym này thấp hơn rất nhiều so với mannanase
thu được từ T. reesei. Loại mannanase từ T. harzianum và T. reesei đều có hiệu quả
khi sử dụng chúng trước dây chuyền tẩy trắng bằng peroxit hoặc (D/C) E cũng như
DED.
Tác dụng của mannanase phụ thuộc vào xơ sợi. Mannanase từ T. reesei cũng
có tác dụng tốt đối với tẩy trắng bột cellulose gỗ lá kim sản xuất theo phương pháp
nấu biến tính và nấu liên tục, đặc biệt sau khi delignin hoá bằng oxy.

13


Luận văn thạc sỹ

Công nghệ sinh học

Các kết quả nghiên cứu sử dụng mannanase thu nhận từ Streptomyces galbus
NR trong tẩy trắng bột giấy của Kansoh và Nagieb (2004) cũng cho thấy mannanase
làm giảm hệ số kappa và tăng độ trắng của bột kraft gỗ mềm [16].
Các phương án sử dụng riêng rẽ, kết hợp lần lượt và đồng thời xylanase,
mannanase thu nhận từ chủng vi sinh vật này để tiền xử lý bột kraft gỗ mềm cũng
đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy sử dụng đồng thời cả hai enzym này tiền xử
lý bột giấy sẽ cho hiệu quả cao nhất, thời gian xử lý cũng được rút ngắn (từ 14 giờ
xuống cịn 8 giờ). Do đó khi áp dụng ở qui mơ cơng nghiệp, q trình tiền xử lý
đồng thời bằng hai enzym sẽ kinh tế và cho chất lượng giấy tốt hơn.
Những kết quả đạt được trên cho thấy, đối với công nghiệp giấy và bột giấy,
mannanase khơng những có khả năng giảm tiêu thụ hóa chất clo tẩy trắng để tiết

kiệm năng lượng và giảm ơ nhiễm mơi trường mà cịn có vai trị quan trọng trong
quá trình phát triển các quy trình tẩy trắng giấy hồn tồn khơng sử dụng hóa chất
clo [19].
Ở nước ta, các nghiên cứu về các chất tẩy trắng sinh học còn đang ở những
bước đầu tiên. Các nhà nghiên cứu công nghệ sinh học mới chỉ tập trung vào việc
phân lập, tuyển chọn và xác định khả năng sinh tổng hợp, đặc tính cơ bản của
enzym (mannanase) vi khuẩn. Các kết quả mới chỉ đơn lẻ ứng dụng trong thực
phẩm, thức ăn chăn nuôi. Những nghiên cứu ứng dụng enzym trong tẩy trắng bột
giấy mới chỉ dừng ở qui mơ phịng thí nghiệm, chưa có nghiên cứu đánh giá hiệu
quả công nghệ, kinh tế và môi trường của các qui trình sử dụng enzym trong quá
trình tẩy trắng.
Như vậy, mannanase có tiềm năng ứng dụng rất to lớn và rộng rãi. Bên cạnh
đó chưa có cơng trình nào nghiên cứu và khai thác khả năng ứng dụng của
mannanase trong công nghiệp giấy và bột giấy ở Việt Nam. Từ ý nghĩa trên, tôi tiến
hành nghiên cứu ứng dụng của mannanase thu nhận từ nấm men Pichia pastoris vào
việc tẩy trắng bột giấy gỗ cứng và gỗ mềm.

14


Luận văn thạc sỹ

Công nghệ sinh học

1.2. Môi trường, các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp endo-β-1.4mannanase
Cho đến nay, hầu hết những cơng trình tạo endo-β-mannanase tái tổ hợp từ vi
khuẩn E.coli, và nấm men Saccharomyces cerevisiae. Gần đây, hệ thống biểu hiện
là nấm men Pichia pastoris được quan tâm sử dụng bởi so với các hệ thống biểu
hiện khác thì Pichia pastoris có nhiều ưu điểm nổi bật. Chúng thường được lựa
chọn trong quá trình sản xuất protein nói chung và protein mannanase nói riêng ở

quy mô công nghiệp do các ưu điểm nổi trội sau đây:
Pichia là vi sinh vật không gây bệnh, đã biết rõ về đặc điểm di truyền và cấu
trúc bộ gen. Có promoter AOX (alcohol oxidase) là những promoter mạnh có khả
năng kiểm sốt đoạn DNA insert cao.
Khả năng tạo sản phẩm nhanh (sau 8h) với hiệu suất cao (50-5000mg/ml),
cho phép biểu hiện protein kích thước lớn hơn 50 kDa, có thể thực hiện phản ứng
glycosyl hóa hoặc cắt chuỗi tín hiệu, có cơ chế cắt intron, có thể thay đổi cấu trúc
protein và tạo nhiều phức hợp protein.
Ưu điểm cơ bản của Pichia so với E.coli là chúng có khả năng tạo cầu nối
disunfit và có khả năng glycozyl hoá các protein. Điều này cho thấy trong một số
trường hợp các cầu nối disunfit là rất quan trọng, trong khi đó E.coli thường sản
xuất protein với số lượng lớn hơn nhưng chúng thường ở trong trạng thái không
hoạt động hoặc không tan. Mặt khác, tế bào nấm men cho phép sử dụng cả hai
vectơ biểu hiện trong prokaryote và eukaryote, có thể biểu hiện protein có kích
thước lớn hơn 50 kDa.
Ngoài ra, Pichia Pastoris là nấm men tự dưỡng metyl, tức là chúng có thể sử
dụng các dẫn xuất của methal như là nguồn cacbon và năng lượng. Pichia có thể dễ
dàng phát triển trong mơi trường huyền phù tế bào có nồng độ methanol lớn, nồng
độ này có thể tiêu diệt được hầu hết các vi sinh vật khác. Có thể thấy đây thực sự là
một hệ thống biểu hiện dễ dàng điều khiển và chí phí cơng nghệ thấp.

15


Luận văn thạc sỹ

Cơng nghệ sinh học

Pichia có thể phát triển với mật độ tế bào cao, và dưới điều kiện lý tưởng
chúng có thể tạo ra rất nhiều điểm mà ở đó dịch tế bào thực tế ở dạng đặc sánh. Do

quá trình sản xuất protein sử dụng các vi sinh vật gần như có khả năng sản xuất đủ
luợng protein trên một tế bào hay một số tế bào, điều này đã làm cho Pichia có khả
năng ứng dụng to lớn trong việc sản xuất protein với số lượng lớn mà không cần
những trang thiết bị đắt tiền.
1.2.1. Môi trường sinh tổng hợp endo-β-1.4-mannanase
1.2.1.1. Nguồn cung cấp cacbon và năng lượng
Nguồn cơ chất chủ yếu được cung cấp là glycerol và methanol. Sở dĩ ta
không sử dụng các nguồn nguyên liệu là hydratcacbon như một số quá trình lên
men thơng dụng (q trình lên men sản xuất rượu, bia, một số axit hữu cơ…) là do
đặc điểm của chủng nấm men. Như đã trình bày ở phần tổng quan, Pichia pastoris
khác với Saccharomyces. Cerevisiae là chúng có khả năng sử dụng methanol như là
nguồn cung cấp cacbon và năng lượng. Các quá trình lên men đối với Pichia
pastoris đã được nghiên cứu từ lâu và đã có nhiều tài liệu giới thiệu về quy trình lên
men sử dụng loài nấm men này. Pichia pastoris X33 là chủng nấm men tái tổ hợp
đã được chuyển gen sinh tổng hợp mannanase, có khả năng sản sinh mannanase với
số lượng lớn. Quá trình lên men sử dụng chủng nấm men này đã được nghiên cứu
khá sâu, do đó chúng tơi dựa vào những nghiên cứu trước đây để là cơ sở xây dựng
quy trình lên men sinh tổng hợp mannanase sử dụng chủng tái tổ hợp này. Trong
quá trình lên men sử dụng chủng nấm men Pichia pastoris X33 tái tổ hợp thì vai trị
của methanol là hết sức quan trọng. Nó vừa đóng vai trị là nguồn cung cấp cacbon
và năng lượng đồng thời còn là chất cảm ứng để nấm men sinh tổng hợp enzym.
1.2.1.2. Nguồn cung cấp nitơ
Hiện nay trong cơng nghiệp sản xuất enzym, ta có thể cung cấp nitơ bằng
cách sử dụng nhiều loại nguyên liệu khác nhau. Có thể sử dụng nguồn ngun liệu
nitơ vơ cơ hay hữu cơ. Các nguồn nitơ bao gồm (NH 4 ) 2 SO 4 , NaNO 3 , NH 4 NO 3 …,
ta cũng có thể bổ sung các nguồn nitơ hữu cơ khác như nước chiết malt, nước chiết
16


Luận văn thạc sỹ

Công nghệ sinh học

ngô, cao ngô, cao nấm men, peptone, bột cá, khơ dầu… Trong q trình lên men
này, chúng tôi sử dụng cao nấm men và peptone là nguồn cung cấp nitơ cho lên
men hữu cơ.
1.2.1.3. Chất kích thích sinh trưởng
Do q trình lên men khơng sử dụng các nguồn nguyên liệu tự nhiên (tinh
bột, xenluloza) nên việc bổ sung các muối vô cơ và các vitamin cũng như chất kích
thích sinh trưởng là một yêu cầu cấp thiết. Trong quá trình lên men này, cần bổ
sung biotin với hàm lượng thích hợp để kích thích sự phát triển của nấm men.
1.2.2.Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp endo-β-1.4-mannanase
1.2.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là yếu tố có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym
của tế bào tái tổ hợp. Nhiệt độ quá thấp tế bào có thể không sinh trưởng được.
Ngược lại, nếu nhiệt độ môi trường quá cao sẽ gây chết tế bào, hoặc làm giảm khả
năng sinh tổng hợp enzym, hoặc làm biến tính enzym vừa tổng hợp được. Do vậy,
việc lựa chọn dải nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng tế bào, vừa khơng ảnh hưởng
đến q trình sinh tổng hợp enzym là cần thiết cho q trình ni cấy. Pichia
pastoris là vi sinh vật ưa ấm, phát triển tốt ở nhiệt độ 25-370C, nhiệt độ tối ưu cho
sự phát triển của chúng là 300C. Ở nhiệt độ dưới 250C, Pichia pastoris có thể phát
triển sinh khối nhưng hầu như không tổng hợp mannanase.
1.2.2.2. Ảnh hưởng của pH
pH là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp lên sự sinh tổng hợp mannanase. Pichia
pastoris thường phát triển ở pH trung tính và axit yếu. Nếu như môi trường quá
kiềm hay quá axit sẽ cản trở q trình sinh tổng hợp enzym. Mannanase thường bền
trong mơi trường hơi axit yếu, trong môi trường kiềm, enzym sau khi được tổng hợp
hoạt tính nhanh chóng giảm. Do đó, cần chú ý điều chỉnh pH canh trường cho phù
hợp với sinh trưởng của nấm men mà không làm ảnh hưởng đến quá trình sinh

17


Luận văn thạc sỹ

Công nghệ sinh học

mannanase. Khi khảo sát pH từ 3 đến 7 chủng nấm men cho hoạt độ endo-β-1,4mannanase cao nhất trong môi trường pH 5.5. [3]
1.2.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng
Đối với chủng tái tổ hợp, nồng độ chất cảm ứng có vai trò quan trọng quyết
định đến sự biểu hiện của protein ngoại lai. Pichia pastoris X33 tái tổ hợp sử dụng
methanol vừa là nguồn cacbon, vừa là nguồn cảm ứng cho sinh tổng hợp endo-βmannanase. Khi khảo sát nồng độ chất cảm ứng từ 0.5 đến 2% hoạt độ enzym đạt
cực đại tại 2%, tiếp tục tăng từ 2.5 đến 5% thì hoạt độ của enzym giảm dần. [3]
1.2.2.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống
Một trong những ưu điểm của Pichia pastoris là có thể phát triển với mật độ
tế bào rất cao, đặc tính này đã khiến cho Pichia pastoris trở thành một hệ thống biểu
hiện protein mạnh, có thể tiết protein tái tổ hợp cỡ g/l.
Khi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống ban đầu với OD đo ở bước
song 600 nm. Kết quả cho thấy khi OD tăng dần từ 1 đến 14, mật độ giống ban đầu
càng lớn, mannanase được tiết ra càng nhiều. Hoạt độ endo-β-1,4-mannanase thu
đươc đạt cao nhất khi OD = 14.
Hoạt độ mannanase giảm dần khi OD tăng dần từ 14 đến 25. Nguyên nhân là khi
mật độ tế bào càng cao, nhu cầu dinh dưỡng của tế bào nấm men trong canh trường
càng lớn, nguồn C và N trong môi trường không đủ cho sinh trưởng và phát triển
của các tế bào nấm men. Môi trường thiếu dinh dưỡng đã hạn chế khả năng sinh
trưởng cũng như khả năng sinh tổng hợp mannanase của nấm men tái tổ hợp [3].
1.3. Nguyên liệu trong sản xuất giấy
Nguyên liệu dùng làm giấy phải có tính chất sợi, có khả năng đan kết và ép
thành tấm đồng nhất. Độ liên kết sợi được đánh giá qua độ kháng kéo hay độ bục
của tờ giấy. Một số nguyên liệu có sợi rất dài nhưng lại khó liên kết nếu khơng qua

xử lý cơ học làm phát triển sự liên kết giữa các sợi thì cũng khó được dùng làm

18


Luận văn thạc sỹ

Công nghệ sinh học

giấy. Như vậy, giấy có thể được làm từ tất cả các loại cây có chứa sơ sợi cellulose
như gỗ và phi gỗ. Giấy đã sử dụng cũng được thu hồi để sản xuất giấy.
Nguyên liệu gỗ được chia làm 2 loại: gỗ lá kim (gỗ mềm) như các loại thông,
thông rụng lá, vân sam, linh sam… và gỗ lá rộng (gỗ cứng) như bạch đàn, sồi,
dương, keo các loại...
Nguyên liệu phi gỗ như rơm rạ, bã mía, đay, lanh, gai và một số loại cỏ (cỏ
bàng). Tuy nhiên, chỉ có một số cho hiệu suất bột tương đối cao mới được sử dụng.
Nguyên liệu gỗ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất bột giấy vì chúng có
nhiều ưu điểm vượt trội so với nguyên liệu phi gỗ: hiệu suất bột cao, thu hồi hoá
chất triệt để [ 1].
Bảng 1.2. Chiều dài, đường kính sơ sợi và tỉ lệ chiều dài và đường kính sơ sợi
của một số ngun liệu thơng dụng
Loại bột giấy
Bột gỗ:
Gỗ mềm
Gỗ cứng
Bột rơm rạ :
Rơm lúa
Cỏ
Rơm lúa mì
Bã mía

Tre, nứa
Cây thân thảo;
Lõi đay
Vỏ đay
Vỏ lanh
Vỏ gai
Sợi lá chuối
Lá dứa dại
Sợi bơng vải
Sợi bơng quả

Chiều dài (L) (mm)

Đường kính (D) (mm)

Tỉ lệ (L/D)

4.0
2.0

40
22

100
90

0.5
1.1
1.5
1.7

2.8

9
10
13
20
15

60
110
120
80
180

0.25
20
55
130
6
2.8
30
20

10
20
20
40
24
21
20

20

25
1000
2600
3500
250
130
1500
1000

19


Luận văn thạc sỹ

Cơng nghệ sinh học

1.3.1. Thành phần hóa học của gỗ mềm
Gỗ mềm là gỗ của các cây lá kim như : tùng, bách, thơng…Thành phần hóa
học của gỗ mềm chủ yếu gồm:
Cellulose chiếm 43-52%, là thành phần chính trong gỗ.
Hemicellulose chiếm 20-30%. Trong đó Galactoglucomannan là thành phần
chủ yếu. Copolyme này có thể chiếm tới 20% so với gỗ khơ tuyệt đối.
Mạch chính của copolyme này có thể là mạch thẳng hoặc mạch nhánh.
Galactoglucomannan được xếp thành hai nhóm, với hàm lượng đơn vị galactose
khác nhau: nhóm có hàm lượng galactopyranoza cao và nhóm có hàm lượng
galactopyranose thấp. Bên cạnh cấu tử chính cịn có arabinoglucuronoxylan, chiếm
khoảng 5-10% khối lượng gỗ khơ. Mạch chính của arabinoglucuronoxylan tạo
thành từ các đơn vị β-D-xylopyranose, nối với nhau nhờ liên kết glycozit 1-4[4].

Lignin chiếm 23-34%. Là hợp chất cao phân tử có đặc tính thơm. Bộ khung
của đơn vị mắt xích lignin là phenyl propan. Lignin gỗ lá kim gồm các đơn vị mắt
xích guaiacylpropan (4-hydroxy-3-metoxy phenylpropan).
Ngồi ra cịn 1 số ít chất phụ khác như chất màu, tinh dầu,…chiếm tỉ lệ rất ít.

Hình 1.8. Cấu trúc và thành phần của gỗ

20


Luận văn thạc sỹ

Cơng nghệ sinh học

1.3.2. Thành phần hóa học của gỗ cứng
Bột gỗ cứng được khai thác từ gỗ của các cây lá rộng như : sồi, dương, cáng
lị (cây bulơ), bạch đàn (cây khuynh diệp). Thành phần hóa học của gỗ lá rộng
gồm:[ 4].
Cellulose chiếm 41-49%, là thành phần chủ yếu trong gỗ cứng.
Hemicellulose chiếm 20-30%. Trong đó glucuronoxylan là polysaccarit hỗn
tạp chủ yếu của gỗ lá rộng. Các lồi gỗ lá rộng khác nhau có hàm lượng copolyme
này khác nhau, dao động từ 15-25% so với gỗ khô tuyệt đối. Glucuronoxylan là
cách đơn giản để gọi hợp chất được tạo thành từ đơn vị mắt xích xylose và vòng
pyranose của axit O-axetyl-4-O-metylglucuronic. Các copolyme chứa các đơn vị
mắt xích xylose thực tế cịn được gọi đơn giản hơn la xylan. Mạch chính được tạo
thành từ các đơn vị mắt xích β-D-xylopyranose. Các đơn vị này nối với nhau bằng
liên kết glycozit 1-4. Bên cạnh đó gỗ lá rộng còn chứa 2-5% glucomannan, được tạo
thành từ các đơn vị β-D-glucopyranose và β-D-mannapyranose. Các đơn vị mắt
xích được nối với nhau bằng liên kết glycozit 1-4.
Lignin chiếm 16-25%, ngồi guaiacylpropan trong gỗ lá rộng cịn chứa các

đơn vị mắt xích 3,5-dimetoxy-hydroxy phenylpropan.
Ngồi ra cịn có một số chất chiết xuất.
Thành phần các nguyên tố là tương đương nhau, tương tự gỗ lá kim khơng
phụ thuộc lồi cây: C ≈ 49-50%; O ≈ 43-44%; H ≈ 6%; N ≈ 1%.
1.4. Các phương pháp sản xuất bột giấy
Sản xuất bột giấy là giai đoạn chế biến để tách thành phần sơ sợi từ nguyên
liệu gỗ hay một số thực vật bằng các phương pháp hóa học hay cơ học. Tùy theo
yêu cầu sử dụng mà bột có thể có hoặc không được tẩy trắng hoặc được tẩy trắng
với mức độ khác nhau.

21


Luận văn thạc sỹ

Công nghệ sinh học

Bảng 1.3. Một số phương pháp sản xuất bột cơ bản
Độ bền
tương đối

Dạng
Phân loại

Bột cơ học

Bột cơ hóa

Bột bán hóa

Phương pháp

Loại gỗ

nguyên

Hiệu suất

liệu

(%)

Gỗ
mềm

Gỗ
cứng

Bột mài

Gỗ mềm

Gỗ đoạn

90-95

5

3

Bột nghiền

Gỗ mềm

Dăm gỗ

90-95

5-6

3

Bột nhiệt cơ

Gỗ mềm

Dăm gỗ

90

6-7

Bột mài có xử lý Gỗ cứng

Gỗ đoạn

85-90

5-6

Bột kiềm lạnh

Gỗ cứng

Dăm gỗ

85-90

5-6

NSCC

Gỗ cứng

Dăm gỗ

85-80

6

hiệu Gỗ mềm

Dăm gỗ

55-75

7

6

hiệu Gỗ mềm

Dăm gỗ

50-70

7

6

Sunphit
suất cao
Sunphat
suất cao
Bột hóa

Sunphat

Cả hai

Dăm gỗ

40-59

10

7-8

Sunphit

Cả hai

Dăm gỗ

45-55

9

7

Soda

Gỗ cứng

Dăm gỗ

45-55

7-8

Nguồn: TCVN 1864-2000, 3980-2001, 4360-2001, 4361-2002, 4407-2001, 70712002, 7072- 2002
Để biến gỗ thành bột giấy, cần làm mềm hoặc hoà tan phần lignin (chất kết
dính các bó sợi tạo nên cầu trúc chặt chẽ của gỗ), từ đó các bó sợi sẽ được giải
phóng. Dưới tác dụng của hoá học hoặc cơ học, các sợi cellulose sẽ được tách rời ra
và tạo nên huyền phù đồng nhất trong nước [1].
1.4.1. Phương pháp cơ học
Phương pháp này cho bột với hiệu suất rất cao, có thể đạt từ 85-95%. Bột
giấy này có thành phần tương đương như gỗ (chỉ có một tỉ lệ nhỏ các chất bị hoà tan

22

Luận văn thạc sỹ

Cơng nghệ sinh học

trong q trình nghiền), được gọi là bột cơ, bột gỗ hay bột hiệu suất cao. Với
phương pháp này, quá trình phân tách sợi chủ yếu nhờ tác động cơ học. Nếu q
trình có thêm tác động nhiệt ta có bột nhiệt cơ, nếu lại có thêm tác động của hố
chất ta có bột hoá nhiệt cơ.
Bột cơ là bột giấy được sản xuất bằng cách mài hoặc nghiền lóng gỗ hoặc
dăm gỗ để tách các bó sợi. Mài gỗ cho bột có độ che phủ rất cao, nhưng tính chất
cơ, lý lại kém. Nghiền dăm gỗ cho bột có tính chất cơ lý cao hơn nhưng tính quang
học lại kém hơn.
Bột cơ học được dùng trong thành phần nhiều loại giấy, còn bột hố tuy có
độ bền cơ, lý rất cao, nhưng phạm vi sử dụng hẹp hơn. Sản xuất bột cơ cần gỗ chất
lượng cao và tốn năng lượng. Khả năng tạo liên kết của bột cơ kém hơn bột hoá và
do vậy tính chất cơ, lý của bột cơ thấp hơn. Bột cơ thường chứa tạp chất, không thể
tẩy trắng bột cơ tới mức như bột hoá và độ hồi màu của bột cơ khá cao.
1.4.2. Phương pháp hóa học
Hiệu suất bột đạt 45-55%, các thành phẩm không phải là cellulose đã hoà tan
phần lớn trong dịch nấu. Bột giấy chủ yếu là sợi cellulo có độ bền tự nhiên và cơ lý
cao và được gọi là bột hoá hay bột cellulose. Tuỳ theo hố chất sử dụng ta có các
loại bột sau:[2]
Bột soda, thuộc loại bột kiềm – dịch nấu gỗ là dung dịch NaOH.
Bột sunphat (hoặc còn gọi là bột kraft), cũng thuộc loại bột kiềm (hóa chất
nấu là NaOH và Na 2 S).
Bột sunphit, có thể có bột sunphit axit, bột sunphit trung tính hay bột sunphit
kiềm.
Bột bán hoá là loại bột sunphit được nấu ở chế độ khá êm dịu với NaHSO 3 ,

sau đó sẽ hỗ trợ thêm một giai đoạn xử lý cơ học để tách sợi. Hiệu suất có thể tới
80%. Phổ biến là bột NSSC (Neutral Sulfite Semichemical).

23