Nghiên cứu khả năng tái sinh cây mướp đắng (momordica charantia l ) từ callus bao phấn

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

TẠ TRẦN HỒNG THẢO

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH
CÂY MƯỚP ĐẮNG (MOMORDICA CHARANTIA L.)
TỪ CALLUS BAO PHẤN

Đà Nẵng – Năm 2019


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

TẠ TRẦN HỒNG THẢO

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH
CÂY MƯỚP ĐẮNG (MOMORDICA CHARANTIA L.)
TỪ CALLUS BAO PHẤN
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Giảng viên hướng dẫn: TS. NGUYỄN MINH LÝ

Đà Nẵng – Năm 2019


LỜI CAM ĐOAN

Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi.
Mọi số liệu, hình ảnh, kết quả là hồn tồn lấy từ các thí nghiệm sau khi thực
hiện. Các tài liệu có trong bài được tìm trong các sách, bài báo, tạp chí… trong nước
và thế giới đáng tin cậy và chính xác.
Tác giả

Tạ Trần Hồng Thảo

i


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn BGH trường Đại học Sư phạm – Đại học
Đà Nẵng, khoa Sinh – Môi trường, các thầy cô chuyên ngành Công nghệ Sinh học đã
truyền dạy cho tôi rất nhiều trong việc làm quen và phát triển kĩ năng thực hành thí
nghiệm trong q trình tơi thực hiện đề tài Khoá luận, cũng như trong 4 năm học đại
học.
Đặc biệt tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến TS. Nguyễn Minh Lý người
thầy tâm huyết đã tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi
và định hướng cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hồn thành khóa luận tốt nghiệp
này.
Cảm ơn các bạn 15CNSH, 16CNSH đã luôn hỗ trợ và nhiệt tình giúp đỡ tơi trong
suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và tất cả bạn bè đã ln động viên,
khích lệ tơi về cả vật chất lẫn tinh thần để tôi đạt được kết quả tốt nhất.
Xin chân thành cảm ơn!

ii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT............................................................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG .............................................................................. vi
DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................. vii
MỞ ĐẦU ............................................................................................................1
1. ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................ 1
2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI .................................................................... 2
3. Ý NGHĨA ............................................................................................... 2
4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 2
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..........................................................3
1. Giới thiệu về cây mướp đắng…………………………………………..3
1.1 Đặc điểm sinh học .............................................................................3
1.2 Phân bố và điều kiện sinh thái ..........................................................3
1.3 Thành phần dinh dưỡng và dược liệu ...............................................4
2. Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy in vitro………………………………...5
2.1.Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy in vitro ................................................5
2.2.Cơ sở khoa học..................................................................................5
2.3.Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn in vitro tạo cây đơn bội ........................6
2.4.Tình hình nghiên cứu tạo cây đơn bội ............................................10
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............13
2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................ 13
2.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................ 13
2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................... 13
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ................................................17
3.1. Ảnh hưởng của giai đoạn phát triển của hạt phấn đến khả năng phát
sinh callus từ bao phấn ........................................................................................ 17
3.2. Ảnh hưởng của môi trường nền đến khả năng phát sinh callus từ bao
phấn ..................................................................................................................... 19

3.3. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng phát sinh callus từ bao
phấn ..................................................................................................................... 20
3.4. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến khả năng phát sinh callus từ bao
phấn ..................................................................................................................... 21

iii


3.5. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến sự phát sinh chồi từ
callus .................................................................................................................... 23
3.6. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến sự tái sinh rễ từ
callus .................................................................................................................... 28
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................30
1. Kết luận ................................................................................................ 30
2. Kiến nghị .............................................................................................. 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..............................................................................31

iv


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
2,4-D

: dichlorophenoxyacetic acid

TDZ

: thidiazuron

NAA

: α-naphthalen acetic acid

BAP

: 6 - benzyl amino purine

IBA

: indole 3 - butyric acid

Kin

: kinetin

B5

: Gamborg (1968)

MS

: Murashige và Skoog (1962)

cs

: cộng sự

g/l

: gam/lit

v


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3. 1 Kích thước nụ hoa đến sự phát sinh callus từ bao phấn ............................... 19
Bảng 3. 2 Sự ảnh hưởng của môi trường nền đến sự phát sinh callus từ bao phấn ...... 20
Bảng 3. 3 Sự ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính đến sự phát sinh callus từ bao
phấn ............................................................................................................................... 21
Bảng 3. 4 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự phát sinh callus ...................... 22
Bảng 3. 5 Sự ảnh hưởng của BAP kết hợp NAA đến sự tái sinh chồi từ callus ........... 23
Bảng 3. 6 Sự ảnh hưởng của BAP kết hợp TDZ đến sự phát sinh chồi từ callus ......... 24
Bảng 3. 7 Sự ảnh hưởng của TDZ kết hợp 2,4D đến sự phát sinh chồi từ callus ....... 24
Bảng 3. 8 Sự ảnh hưởng của TDZ kết hợp NAA đến sự phát sinh chồi từ callus ...... 25
Bảng 3. 9 Sự ảnh hưởng của KIN đến khả năng phát sinh chồi từ callus bao phấn ..... 26
Bảng 3. 10 Sự ảnh hưởng của TDZ đến khả năng phát sinh chồi từ callus bao phấn .. 27
Bảng 3. 11 Sự ảnh hưởng cả BAP đến khả năng phát sinh chồi từ callus bao phấn .... 27
Bảng 3. 12 Sự ảnh hưởng cả IBA đến khả năng phát sinh rễ từ callus bao phấn ......... 28

vi


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 3. 1 Các giai đoạn phát triển tiểu bào tử của nụ hoa mướp đắng. ....................... 17
Hình 3. 2 Tỷ lệ phần trăm tiểu bào tử của nụ hoa mướp đắng ..................................... 17
Hình 3. 3 Callus phát sinh từ hai mơi trường nền ......................................................... 20
Hình 3. 4 Callus phát sinh từ bao phấn ở điều kiện chiếu sáng khác nhau .................. 22
Hình 3. 5 Rễ hình thành trong môi trường MS bổ sung 3mg/l IBA ............................. 28

vii

MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Mướp đắng (Momordica charantia L.) thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae) là loại
cây dây leo [20]. Mướp đắng có nguồn gốc từ Ấn Độ, Nam Trung Quốc và được trồng
rộng rãi ở các vùng nhiệt đới trên khắp thế giới như Philippin, Malaysia, Australia, các
nước ở Châu Phi, Tây Á và Mỹ La Tinh [17, 3].
Mướp đắng vừa là cây có giá trị thực phẩm vừa có giá trị dược liệu cao. Mướp
đắng giàu chất sắt, carbonhydrate, protein, vitamin C, B1, B2, PP, chất khoáng, protit,
lipit, đường, chất xơ, canxi, photpho, carotene [38].
Tại Việt Nam, loại cây này được trồng phổ biến ở các tỉnh đồng bằng và trung
du mang lại giá trị kinh tế cao cho người dân. Theo Nguyễn Quốc Hùng và cs tổng diện
tích trồng mướp đắng ở nước ta vào năm 2013 là 27.000 ha với năng suất trung bình là
16 tấn/ha [11]. Hiện nay, nguồn giống đang sử dụng phổ biến đa số là giống địa phương
có khả năng thích nghi tốt được người nông dân lưu lại và sử dụng cho nhiều mùa nên
có tỉ lệ thối hóa cao. Ngồi ra, các giống lai F1 nhập từ nước ngồi tuy có độ đồng đều
cao hơn, nhưng giá thành tương đối cao, thường xun bị thối hóa. Vì vậy việc tạo
giống trong nước phù hợp với điều kiện sinh thái để mang lại năng suất cao trở nên cần
thiết. Trong công tác tạo giống, việc đầu tiên là tạo dòng thuần. Phương pháp tạo dòng
thuần truyền thống thường tốn rất nhiều thời gian và kinh phí, đồng thời kéo dài thời
gian cho công tác chọn giống, nhiều trường hợp vẫn không cho các dịng đồng hợp tử.
Vì vậy, khi áp dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro bao phấn sẽ khắc phục nhược điểm của
phương pháp chọn tạo giống truyền thống. Cây đơn bội kép tạo ra từ ni cấy hạt phấn
có độ đồng hợp tử tuyệt đối, hồn tồn khơng phân ly trong các thế hệ và có thể tạo ra
trong một thời gian ngắn, tiết kiệm được rất nhiều kinh phí và rút ngắn thời gian cho
cơng tác chọn giống [28].
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu, ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn
bội in vitro đã thu được một số thành công nhất định. Tuy nhiên, công tác này mới chỉ
tập trung chủ yếu trên một số cây lương thực chính như lúa và ngơ. Những nghiên cứu

về nuôi cấy in vitro bao phấn mướp đắng còn rất hạn chế, Nguyễn Minh Lý và cs (2017)
đã chỉ ra được bao phấn cây mướp đắng được nuôi trên mơi trường MS có bổ sung 30g/l
đường saccharose, 8g/l agar; 2mg/l 2,4D và 2mg/l KIN với pH = 5,75 cho tỷ lệ phát sinh

1


callus cao nhất là 66,67%. Cho đến nay chưa có quy trình hồn thiện về ni cấy bao
phấn tạo cây mướp đắng đơn bội in vitro. Trước những yêu cầu thực tế của sản xuất với
việc kế thừa các kết quả nghiên cứu trước, chúng tôi tiền hành đề tài: “Nghiên cứu khả
năng tái sinh cây mướp đắng (Momordica charantia L.) từ callus bao phấn”.
2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố nội sinh, ngoại sinh đến khả năng tái sinh cây
mướp đắng từ callus của bao phấn
3. Ý NGHĨA
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần bổ sung dẫn liệu khoa học về kỹ thuật ni cấy
bao phấn mướp đắng nói chung, và về sự ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy in
vitro đến việc phát sinh callus và tái sinh chồi từ bao phấn nói riêng.
Là nguồn tài liệu tham khảo cho công tác giảng dạy, học tập và nghiên cứu
khoa học, trong lĩnh vực công nghệ sinh học, ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn
giống thực vật.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Góp phần hồn thiện quy trình nhân giống in vitro cây mướp đắng, phục vụ cho
quá trình tạo giống lai F1.
4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Đánh giá ảnh hưởng của giai đoạn phát triển tiểu bào tử đến khả năng phát sinh
callus từ bao phấn;
- Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy (ánh sáng, mơi trường nền, than
hoạt tính) đến khả năng phát sinh callus từ bao phấn cây mướp đắng;

- Đánh giá ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi
từ callus bao phấn cây mướp đắng;
- Xác định ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng phát sinh rễ
từ callus bao phấn cây mướp đắng.

2


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Giới thiệu về cây mướp đắng
1.1.

Đặc điểm sinh học

Đối tượng nghiên cứu là loài mướp đắng (Momordicar charantia L.) thuộc họ
bầu bí (Cucurbitaceae).
Phân loại khoa học: [6]
-

Giới (regnum): Plantae

-

Ngành (division): Magnoliophyta

-

Lớp (class): Magnoliopsida

-

Bộ (ordo): Cucurbitales

-

Họ (familia): Cucurbitaceae

-

Chi (genus): Momordica

-

Loài (species): Momordicar charantia L.
Mướp đắng là giống cây ngắn ngày, thân leo dài từ 5,0 – 7,0m, có màu xanh nhạt

và nhiều tua cuốn, lơng tơ ở ngọn. Lá đơn, mọc so le dài 5,0-10,0cm, rộng 4,0-8,0cm
mặt dưới lá màu nhạt hơn mặt trên, gân nổi rõ ở mặt dưới, phiến là chia làm 5,0-7,0 thùy
hình trứng mép có răng cưa. Hoa mọc đơn ở nách lá, cuống dài. Hoa đực có đài và ống
ngắn, tràng gồm năm cánh mỏng hình bầu dục, 5 nhị rời nhau. Hoa cái có đài và tràng
giống hoa đực. Tràng hoa màu vàng nhạt, đường kính khoảng 2,0 cm [11,18,21]. Quả
hình thoi, dài 8,0-15,0 cm, gốc và đầu thn nhọn, mặt vỏ có nhiều u lồi to nhỏ khơng
đều. Quả khi chưa chín có màu xanh hoặc vàng xanh nhạt, khi chín chuyển sang màu
vàng hồng. Hạt dẹp, dài 13-15mm, rộng 7-8mm, có màng bao quanh giống hạt bí ngơ
[4].
Căn cứ vào hình dạng bên ngồi, người ta chia mướp đắng thành hai loại [15]:
- Momordica charantia L. var. charantia L., quả to (đường kính > 5cm), màu xanh
nhạt, gai tù, ít đắng.
- Momordica charantia L. var. abbreviata Ser., quả nhỏ (đường kính < 5cm), màu
xanh đậm, gai nhọn, vị rất đắng.

1.2.

Phân bố và điều kiện sinh thái

Cây mướp đắng là cây có nguồn gốc vùng nhiệt đới và cận nhiệt nên sinh trưởng
tốt trong điều kiện khí hậu ấm áp, nhiệt độ thích hợp 24-27℃, nhiệt độ thích hợp cho

3


hạt nảy mầm là 30-32℃, nhiệt độ cho năng suất cao nhất dao động trong khoảng 2030℃ trong thời kì hình thành quả [19]. Cây mướp đắng được trồng ở vùng Đông Ấn và
Nam Trung Quốc, được sử dụng như là loại rau ăn quả giàu chất sắt và vitamin C. Sau
đó, cây được du nhập sang châu Phi và châu Mỹ Latinh. Quần thể mướp đắng đã trở nên
rất phong phú với các giống cây đa dạng được tạo ra trong quá trình chọn giống và lai
tạo [22].
Trên thế giới, cây mướp đắng có mặt ở hầu hết các nước nhiệt đới và cận nhiệt
đới như Trung Quốc; một số nước đông nam châu Á như Ấn Độ, Malaysia, Philippin;
châu Phi và vùng Caribbean [13]. Ở Việt Nam, mướp đắng được trồng tại nhiều tỉnh từ
Bắc vào Nam.
Mướp đắng là cây ưa ánh sáng, khi ánh sáng thiếu và yếu cây sinh trưởng và phát
triển kém, cây ra hoa cái muộn và dễ bị rụng. Vì vậy cây nên trồng với mật độ thưa để
dễ hấp thụ ánh sáng. Cây chịu được nhiều điều kiện đất khác nhau nhưng phát triển tốt
nhất trong điều kiện thoáng nước và đất giàu chất hữu cơ. Mướp đắng có thể trồng quanh
năm. Cây sinh trưởng nhanh trong mùa mưa ẩm, ra hoa sau 7 – 8 tuần gieo trồng. Sau
khi quả già, cây sẽ tàn lụi và kết thúc vòng đời sau 4 – 5 tháng tồn tại [19].
1.3.

Thành phần dinh dưỡng và dược liệu

Mướp đắng là một trong những cây rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao, phần

ăn được của quả mướp đắng chiếm khoảng 95%. Theo tài liệu của viện Đại học Purdue
về các loại rau quả châu Á nhập vào Mỹ (Willsetal 1984), thành phần dinh dưỡng tính
bằng gam trong 100g mướp đắng như sau: Phần ăn được 84g, nước 93,8g; Protein 0,9g;
Vitamin A 0,04mg; Vitamin B1 0,05mg; Vitamin B2 0,03mg; Niacin 0,4mg, Vitamin C
50,0mg; chất béo 0,1mg; Cacbohydrate 0,2mg; Calcium 22mg; Potassium 26,0mg;
Magnesium 16,0mg; Sắt 0,9mg
Trong mướp đắng có chất Alkaloid có cơng dụng lợi tiểu, giúp lưu thông máu
tốt, chống viêm, hạ sốt và tăng cường sức khỏe thị lực. Ngồi ra, mướp đắng cịn có tác
dụng kích hoạt một loạt các phản ứng hoạt hóa ở màng tế bào, làm giảm, ngừng di căn
và tiêu diệt các tế bào ung thư vú ở phụ nữ. Loại dầu có trong hạt mướp đắng rất giàu
cis(c) 9, trasn(t) 11 và axit linonic t13…, những chất này có tác dụng triệt tiêu các mầm
bệnh gây ung thư tá tràng và nhiều chứng bệnh nan y khác [4, 5, 10]. Khoa học ngày
nay đã chứng minh trái mướp đắng có khả năng hạ đường huyết. Chanrantin,

4


polypeptide-p, và vicine những hợp chất không chỉ giúp giảm đường huyết mà còn cải
thiện việc dung nạp glucose và giảm cholesterol.
Hiện nay, bệnh đái tháo đường là một trong các bệnh mãn tính, gây tử vong cao,
đứng hàng thứ 3 trên thế giới sau bệnh tim mạch và ung thư. Ở Việt Nam, tỉ lệ mắc bệnh
ngày một gia tăng, địi hỏi cấp thiết phải tìm ra các loại thuốc hiệu quả đặc trị [6]. Nhiều
nghiên cứu cho thấy mướp đắng có tác dụng làm chậm q trình thối hóa võng mạc,
một biến chứng thường gặp của bệnh tiểu đường [4].
2. Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy in vitro
2.1.

Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Nuôi cấy mô tế bào thực vật (tissue culture) hay nuôi cấy in vitro đều là thuật

ngữ mô tả nuôi cấy mô các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm
chứa mơi trường chất dinh dưỡng thích hợp như muối khống, vitamin, đường và các
chất điều hịa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng. Kỹ thuật ni cấy mơ dùng
cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền [7].
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ mô
lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng. Trước đây, phương pháp này được
sử dụng để nghiên cứu đặc tính cơ bản của tế bào và mơ trong q trình ni cấy. Hiện
nay các nhà khoa học sử dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật để nghiên cứu các vấn đề
liên quan thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật cũng mở rộng tiềm năng nhân giống
vơ tính đối với các loại cây quan trọng, có giá trị về mặt kinh tế và thương mại trong đời
sống hằng ngày của con người [7].
2.2.

Cơ sở khoa học

2.2.1. Tính tồn năng của tế bào
Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xướng ra phương pháp nuôi cấy tế bào
thực vật để chứng minh cho tính tồn thế của tế bào. Theo ông mỗi một tế bào bất kỳ
của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể
hoàn chỉnh. Như vậy mỗi tế bào riêng rẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ tồn bộ
lượng thơng tin di trùn cần thiết của cả sinh vật đó và nếu gặp điều kiện thích hợp thì
mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh.Tất cả mọi tế bào của
một cơ thể đều chứa một bộ gen giống nhau, do đó tất cá các tế bào của một cơ thế có
tiềm năng tổng hợp những kiểu protein – enzyme đồng nhất, khi tế bào được ni trong
mơi trường thích hợp có thể phát triển thành cây nguyên vẹn đặc trưng cho loài và thực

5


hiện q trình sinh sản bình trường. Khả năng đó được gọi là tính tồn năng của tế bào

thực vật [9].
2.2.2. Tính phân hóa và phản phân hóa của tế bào
Về bản chất của sự phân hóa và phản phân hóa là q trình hoạt hóa gen. Do
thơng tin về vị trí của tế bào, tương quan dinh dưỡng và tương quan của các chất điều
hòa sinh trưởng quy định. Trong đó quan trọng nhất là thơng tin về vị trí của tế bào, khi
nằm trong một cơ thể các tế bào có sự ức chế lẫn nhau, khi được tách rời và trong điều
kiện nhất định thì các gen được hoạt hóa dễ dàng hơn. Đó là cơ sở nền tảng cho việc
nuôi cấy mô, tế bào [9].
2.3.

Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn in vitro tạo cây đơn bội

Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro bao phấn trong có chứa các tiểu
bào tử hoặc hạt phấn chưa chín trong mơi trường dinh dưỡng tạo ra cây đơn bội, là một
lối thoát kỳ diệu đối với lĩnh vực ứng dụng cây đơn bội vào công tác chọn giống cây
trồng. Thơng qua phương pháp này ta có thể rút ngắn thời gian chọn giống, làm tăng
hiệu quả chọn lọc, tăng tính biến dị cho chọn lọc và giúp giải quyết những khó khăn
trong lai xa. Các dịng thuần có thể nhanh chóng được tạo ra từ ni cấy bao phấn của
con lai F1 hoặc F2 trong thời gian ngắn nhất [27].
Một số ưu điểm của phương pháp này như sau:
- Kỹ thuật khá đơn giản, ở một số lồi sự phân chia tế bào có thể xảy ra dễ dàng
ngay cả khi những tế bào hạt phấn chưa thực sự chín. Tỷ lệ hạt phấn có phản ứng tốt với
môi trường nuôi cấy cao (tần suất cảm ứng mơi trường cao) và có thể sản xuất thể đơn
bội với số lượng lớn trong thời gian ngắn giảm từ 3-4 lần [25].
- Nuôi cấy bao phấn là một phương pháp để tạo ra các dòng đồng hợp tử, trong
một quá trình chỉ vài tháng so với yêu cầu nhiều thế hệ khi sử dụng phương pháp truyền
thống [33, 42]. Cây đơn bội kép là sản phẩm cuối cùng của ni cấy bao phấn, chúng
có đặc điểm là đồng hợp tử tuyệt đối và được coi là nguồn vật liệu đa dạng phong phú
cho chọn tạo giống [35, 43].
Như vậy, phương pháp ni cấy bao phấn đã góp phần rút ngắn rất nhiều thời

gian chọn giống, làm tăng hiệu quả chọn lọc và giúp giải quyết vấn đề hiện tại và trong
lai. Hiện tại đang được áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng như Việt Nam.
Các yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật nuôi cấy bao phấn in vitro

6


2.3.1. Kiểu gen của cây cho bao phấn
Kiểu gen của cây mẹ có vai trị rất quan trọng trong việc xác định khả năng tái
sinh cây từ hạt phấn hoặc bao phấn. Ở lúa mì, tần số cảm ứng của callus hạt phấn và sự
tạo thành cây xanh tiếp sau đó được điều khiển bởi nhiều gen. Mỗi kiểu gen khác nhau
tương ứng với phản ứng sinh sản đơn tính khác nhau trong nuôi cấy bao phấn [8].
Zagorska khi nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen cây cà chua đến hiệu quả nuôi
cấy bao phấn cho thấy: trong số 85 kiểu gen của các giống được đưa vào nuôi cấy, callus
chỉ được tạo ra từ bao phấn của 53 giống. Sự tái sinh cây chỉ có được từ callus của 15
giống. Số liệu thu được cho thấy kiểu gen ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả nuôi cấy bao
phấn [41].
Nhiều cơng trình nghiên cứu về ni cấy bao phấn cho chúng ta thấy hiệu quả
của ni cấy bao phấn nói chung và bao phấn mướp đắng nói riêng phụ thuộc vào nhiều
yếu tố, kiểu gen của cây cho bao phấn ni cấy có ảnh hưởng rất lớn đến kết quả ni
cấy khơng những trong phạm vi một chi mà cịn khác nhau giữa các giống trong một
loài. Bao phấn phản ứng trong môi trường nuôi cấy là một đặc điểm có khả năng di
truyền [40, 44]. Kiểu gen là nguyên nhân chính và là yếu tố quyết định ảnh hưởng đến
sự hình thành callus và tái sinh cây khi ni cấy bao phấn. Niizeki (1983) và Haberlebos
(1985) đã chỉ ra tác động có ý nghĩa của kiểu gen và mối tương tác giữa kiểu gen, mơi
trường đến sự hình thành callus và tái sinh cây.
2.3.2. Giai đoạn phát triển của tiểu bào tử (hạt phấn)
Các giai đoạn phát triển của tiểu bào tử ni cấy cũng có ảnh hưởng rất quan
trọng đến kết quả nuôi cấy. Bao phấn càng già thì tỷ lệ tái sinh cây càng thấp, đồng thời
tỷ lệ cây bạch tạng tăng. Tuy nhiên không phải bất cứ lồi cây trồng nào cũng có hiệu

suất tối ưu ở giai đoạn trước hoặc sau một nhân, các loại hồ thảo có nhiều điểm khác
nhau. Theo Nizeki và Oono (1968) thì tiểu bào tử ở giai đoạn đơn nhân muộn là vật liệu
tốt nhất cho q trình ni cấy bao phấn lúa, tuy nhiên, Claphm (1971) xác định rằng
hiệu suất tạo cây đại mạch cao nhất đạt được ở giai đoạn đơn nhân sớm.
Tang Y. và cs phát hiện ra rằng một khoảng kích thước nụ tương ứng với chỉ một
giai đoạn phát triển của tiểu bào tử: những nụ dài 3,0-4,0 mm chứa tế bào đơn nhân sớm;
> 5,0 mm – tế bào hai nhân [36]. Sự khác biệt này có thể là mối quan hệ giữa kích thước
của callus và các giai đoạn phát triển của hạt phấn phụ thuộc vào kiểu gen. Để đạt được
hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn và tạo cây đơn bội, giai đoạn phát triển của hạt phấn

7


có ý nghĩa quan trọng, mỗi giai đoạn tương ứng với một phạm vi nhất định kích thước
của callus.
2.3.3. Mơi trường nuôi cấy
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát triển hình
thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường nuôi cấy.
Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo lồi và bộ phận
ni cấy, nhiều mơi trường đã được xây dựng và sử dụng như môi trường White (1953),
môi trường Miashige và Skoog (1962), môi trường Nitsch (1969), môi trường Gamborg
(1968). Tuỳ theo từng đối tượng nuôi cấy khác nhau những môi trường cơ bản này sẽ
được cải tiến thành nhiều môi trường khác cho phù hợp. Đối với cùng một mẫu cấy
nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì thành phần mơi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo
giai đoạn phân hóa của mẫu cấy. Việc lựa chọn mơi trường ni cấy phụ thuộc vào từng
lồi thực vật được nuôi cấy [15].
Mặc dù trong các bao phấn rất giàu các chất điều hòa sinh trưởng thực vật như
auxin và giberillin nhưng số lượng và chất lượng của các hooc môn và sự cân bằng giữa
auxin – cytokinin đựơc xem là rất quan trọng để xác định phản ứng giữa bao phấn với
môi trường và thay đổi sự biểu hiện di truyền. Auxin cao và cytokinin thấp sẽ xúc tiến

cho quá trình tăng sinh callus, ngựơc lại sẽ thích hợp cho sự hình thành chồi và cây con.
Trong một vài trường hợp lại không cần thiết đến sự có mặt của auxin [30].
Mơi trường N6 sau đó cũng được sử dụng cho nuôi cấy bao phấn của các loại ngũ
cốc khác như lúa, lúa mạch đen. Trong khi nhiều lồi cần có auxin và/hoặc cytokinin để
cảm ứng sinh sản đơn tính thì đa số các lồi thuộc họ Solanaceae chỉ cần môi trường cơ
bản. Sucrose là một thành phần không thể thay thế của môi trường, thông thường người
ta sử dụng ở nồng độ 2-4% nhưng các loài thuộc họ Cải cần nồng độ cao hơn (10%).
Thay thế sucrose bằng cách bổ sung glutathione, ascorbic acid và glucose cũng có tác
dụng tương tự, kích thích sinh sản đơn tính ở lúa mạch đen. Bổ sung than hoạt tính hoặc
2-chloroethyl-phosphate vào mơi trường ni cấy cũng có tác dụng kích thích sinh sản
đơn tính ở một số hệ thống nuôi cấy [8].
2.3.4. Điều kiện nuôi cấy
 Độ pH môi trường
pH của môi trường là yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát
sinh hình thái của mẫu nuôi cấy ở các giai đoạn khác nhau. Bởi vì, pH ảnh hưởng đến

8


sự hấp thụ các ion và q trình đơng đặc của agar. Ngồi ra sự ổn định pH trong mơi
trường sẽ giúp duy trì trao đổi chất trong tế bào. pH tối ưu cho môi trường nuôi cấy là
5,8 trước khi khử trùng. Giá trị pH thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7 sẽ ức chế sự tăng trưởng
và phát triển của cây. pH của môi trường nuôi cấy thường giảm 0,3 – 0,5 sau khi hấp
khử trùng và luôn thay đổi qua các giai đoạn của q trình ni cấy [23].
 Ánh sáng
Ánh sáng, một trong những yếu tố quan trọng cho sự sinh trưởng và phát triển
của thực vật. Ánh sáng tham gia vào nhiều quá trình sinh lý của thực vật, trong đó, có
q trình quang hợp; ngồi ra, cịn có q trình quang phát sinh hình thái, tính hướng
sáng. Mức độ ảnh hưởng của yếu tố ánh sáng tới thực vật phụ thuộc vào cường độ, chất
lượng và thời gian chiếu sáng. Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, ánh sáng là nhân tố

quan trọng đối với sự sinh trưởng, phát triển của cây trong điều kiện in vitro. Hiện nay,
đèn huỳnh quang được sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy in vitro thực vật [1].
 Nhiệt độ
Nhiệt độ trong phịng ni có ảnh hưởng đến khả năng hình thành callus và tái
sinh cây. Nhiệt độ tối thích cho sự hình thành callus là 25oC với biên độ là 25 – 28oC và
cho tái sinh cây là 20 – 25oC. Nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối thích chính là nguyên nhân
làm tăng cây bạch tạng. Chen (1983) cho rằng nếu nhiệt độ phịng ni cao hơn 30oC
thì hầu như chỉ tái sinh cây bạch tạng. Wang và cs (1974) kết luận: việc hình thành cây
xanh hay cây bạch tạng chủ yếu do nhiệt độ tại thời điểm bắt đầu phát triển bào tử chứ
không phải ở pha phân hoá callus, tuy nhiên quan điểm này vẫn cần phải làm sáng tỏ
thêm [43].
 Than hoạt tính
Hiện nay, than hoạt tính đã được tinh chế và sản xuất rộng rãi như một chất có
tính hấp thụ cao và được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mơ nhờ có tác động lên sự
phát sinh hình thái và phát sinh cơ quan của thực vật. Vai trò của than hoạt tính trong
ni cấy mơ tế bào thực vật chủ yếu là tạo điều kiện “tối” cho môi trường nuôi cấy, hấp
thụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng thực vật như các phenolic, dịch rỉ nâu
sinh ra từ mẫu môi trường nuôi cấy [54]. Ngồi ra, than hoạt tính cũng có thể hấp thụ
các vitamin, cytokinin và auxin, làm thay đổi tỉ lệ thành phần các chất có trong mơi
trường ni cấy cũng như pH mơi trường [56]. Từ khi than hoạt tính được ứng dụng
trong nuôi cấy mô, các nhà khoa học chủ yếu tập trung nghiên cứu và công bố về ảnh

9


hưởng của nó trong việc cải tiến mơi trường ni cấy, tăng cường khả năng tái sinh cây,
phát sinh phôi, tăng sinh tế bào trần, ngăn cản sự phát triển bất thường của cây con, kích
thích q trình hình thành và phát triển chồi, thúc đẩy hay ức chế sự tăng trưởng và hình
thành rễ [55, 59].
2.4.

Tình hình nghiên cứu tạo cây đơn bội

2.4.1. Tình hình nghiên cứu nước ngồi
Ni cấy bao phấn hay hạt phấn là một kỹ thuật hữu hiệu để tạo ra các dòng đồng
hợp tử ngay từ thế hệ đầu tiên (dòng đơn bội kép), do đó tiết kiệm nguồn lực và rút ngắn
thời gian cần thiết để tạo ra giống mới [9]. Trong nhiều năm qua đã có hàng loạt những
nghiên cứu về vấn đề này, tập trung vào hai hướng chính là cải tạo về mặt di truyền
trong nuôi cấy bao phấn thông qua chọn lọc, lai tạo và tối ưu hóa mơi trường ni cấy.
Năm 2003, Kumar và cs đã tiến hành thí nghiệm trên dưa chuột, kết quả cho thấy
bao phấn dưa chuột thích hợp cho sự tái sinh phơi trực tiếp và tái sinh phơi gián tiếp
thơng qua q trình tạo callus trên mơi trường cơ bản B5 có bổ sung 0,25M saccarose
và 2µM 2,4D hoặc kết hợp 2µM 2,4D + BAP 1µM. Nụ hoa trước khi ni cấy được xử
lý lạnh 4℃ trong 2 ngày là mức xử lý lạnh tối ưu. Callus hình thành sau hai tuần ni
cấy và có màu vàng. Callus sau khi hình thành được chuyển sang mơi trường B5 có chứa
0,09M saccarose + 0,05µM NAA + 0,05µM KIN. Sau đó lại được chuyển sang mơi
trường B5 chứa 0,09M saccarose và 5µM ABA để phát sinh phôi. Cuối cùng phôi nảy
mầm được chuyển qua môi trường cơ bản B5 + 0,09M saccarose + 0,25µM NAA +
0,25µM KIN [24].
Tại Trung Quốc năm 2007 Song và cs cũng nghiên cứu 20 kiểu gen của cây dưa
chuột chỉ có 16 kiểu gen tạo được callus. Tác giả đã khẳng định xử lý nụ hoa trước khi
ni cấy là chìa khố của sự thành cơng trong ni cấy bao phấn. Xử lý nhiệt phụ thuộc
vào kiểu sinh thái, các loài dưa chuột từ vùng lạnh có phản ứng tốt khi xử lý sốc lạnh,
các lồi dưa chuột từ vùng nóng có phản ứng tốt khi xử lý sốc nhiệt. Mơi trường tốt nhất
cho sự phát sinh callus là môi trường MS có bổ sung 4,44M BA, 2,26M 2, 4-D, 4,64M
KIN, 3% sucrose và 0,8% agar. Môi trường cho sự phát sinh phơi là MS có bổ sung
0,54M NAA, 13,32M BA, 3% sucrose và 0,8% agar. Môi trường cho sự tái sinh cây là
MS bổ sung 2,22M BA, 6% sucrose và 1,2% agar [29].
Năm 2009 Tang Y. và cs đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố như nhiệt
độ tiền xử lý, chất kích thích sinh trưởng, giai đoạn phát triển của hạt phấn lên sự hình

10


thành callus. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy bao phấn ở giai đoạn đơn nhân
muộn trong môi trường dinh dưỡng MS có bổ sung 0,5mg/l 2,4D và 2mg/l BAP cho tỉ
lệ phát sinh callus đạt giá trị cao nhất. Trong khi đó, ảnh hưởng của nhiệt độ tiền xử lý
cho kết quả không đồng nhất giữa các giống mướp đắng khác nhau [36].
Nghiên cứu của Usman và cs (2015) đã sử dụng kỹ thuật tạo phôi từ bao phấn
thu từ các chồi hoa có kích thước khác nhau (nhỏ 11-13 mm; trung bình 13-15 mm;
chiều dài lớn 15-17 mm) ở giai đoạn nụ hoa trước khi nở 1-2 ngày của cây mướp đắng.
Các nụ hoa được tiền xử lý lạnh ở 4°C lên đến 48 giờ và nuôi cấy trong điều kiện tối có
khả năng tạo callus (71% và 45%) cao hơn so với nuôi cấy sáng trong thời gian dài trên
cùng môi trường MS bổ sung NAA và BAP (3,22 + 0,88 µML-1). Tuy nhiên các callus
này không phát triển thành phôi và không thể nảy mầm được [39].
Như vậy, thông qua việc tổng hợp các tài liệu nghiên cứu về ni cấy bao phấn
mướp đắng có thể khẳng định rằng, tất cả các nghiên cứu đến thời điểm này mới chỉ
dừng lại ở mức độ tạo được callus, mà chưa đề cập đến việc tạo phôi, tái sinh cây mướp
đắng đơn bội thành công từ những callus này.
2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Năm 2009, Đặng Thị Mai khi nghiên cứu kỹ thuật tạo cây dưa chuột đơn bội từ
nuôi cấy in vitro bao phấn đã tìm ra mơi trường MS thích hợp nhất cho sự phát sinh,
phát triển callus đối với 2 giống dưa chuột Marinda và Valaspik. Mơi trường tạo callus
có hiệu quả nhất đối với cả 2 giống là môi trường MS + 1,5 ppm 2,4D + 1,0 ppm KIN,
cho tỷ lệ bao phấn tạo callus đạt 70,50% (Marinda) và 69,17% (Valaspik). Môi trường
thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi dưa chuột đơn bội của cả 2 giống là: MS + 2,0 ppm
BAP + 0,1 ppm IAA, hệ số nhân chồi đạt 3,28 - 3,64 (lần) sau 4 tuần nuôi cấy đồng thời
chất lượng chồi cũng được đánh giá tốt. Nuôi cấy nụ hoa có kích thước trong khoảng 10
- 15 mm và xử lý lạnh nụ hoa ở 4℃ trong 24 giờ là thích hợp nhất cho bao phấn tạo
callus đối với cả 2 giống, sau 5 tuần ni cấy có thể cấy chuyển callus để tái sinh cây.

Callus thu được có chất lượng tốt, sau 4 tuần có thể cấy chuyển tái sinh cây [2].
Khi tiến hành đánh giá ảnh hưởng của giai đoạn phát triển của hạt phấn, chất điều
hòa sinh trưởng và môi trường nuôi cấy đến sự tạo phơi vơ tính ở cây dâu tây Nguyễn
Xn Trường và cs(2015) đã nhận thấy: tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng (1mg/l BAP +
2mg/l IAA) trong môi trường MS cho tỉ lệ cây tái sinh cao nhất (10%), sự kết hợp giữa
môi trường B5 và mô sẹo 2 tháng tuổi đã cho số mầm tạo thành cao nhất (7,1 mầm)

11


[13]. Vào cùng năm, Nguyễn Thanh Hải và cs khi nghiên cứu môi trường nhân giống in
vitro bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn cây cải đông dư đã chỉ ra rằng nền mơi trường
B5 là thích hợp nhất trong việc ni cấy với khả năng hình thành phơi vơ tính cao nhất
(2,33%) có bổ sung 0,5mg/l NAA, 1mg/l KIN, 10g/l đường và 8g/l agar, phơi vơ tính
có thể tạo cây hồn chình trong mơi trường MS có bổ sung 0,5mg/l IAA, 0,5 mg/l BAP,
3% đường và 8g/l agar [12].
Năm 2015 Nguyễn Minh Lý và cs đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa
sinh trưởng đến sự phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng và chỉ ra, bao phấn ni cấy
trên các mơi trường có bổ sung chất điều hịa sinh trưởng riêng lẻ khơng cảm ứng sinh
callus. Trong khi đó, sự kết hợp giữa auxin (2,4D; NAA) và cytokinin (BAP; KIN; TDZ)
có hiệu quả đối với sự hình thành callus. Đặc biệt, tỷ lệ phát sinh callus đạt giá trị cao
nhất là 66,67% trên môi trường MS có bổ sung 3% saccarose, 0,8% agar, 2mg/l 2,4D
và 2mg/l KIN với pH=5,75 [10].
Như vậy, cho đến thời điểm hiện tại việc nghiên cứu tạo cây đơn bội bằng phương
pháp ni cấy bao phấn tại Việt Nam cịn rất hạn chế, đặc biệt là với mướp đắng. Ngoài
ra, kết quả của các nghiên cứu chưa được ứng dụng nhiều trong quy trình chọn, tạo
giống lai F1 cho năng suất cao, phẩm chất tốt. Vì vậy, việc nghiên cứu ni cây bao
phấn đối với nhiều loại cây trồng nhằm rút ngắn thời gian tạo giống là rất cần thiết. Đặc
biệt là trong công cuộc chuyển đổi cơ cấu cây trồng, để phát triển ngành nông nghiệp
cần phát triển ngành công nghiệp chế biến, đẩy mạnh xuất khẩu, vấn đề rút ngắn thời

gian tạo dịng thuần phục vụ cơng tác chọn tạo giống cần được quan tâm nhiều hơn nữa.

12


CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Nụ hoa mướp đắng giống lai F1 Diago 26 được thu tại trang trại của hợp tác xã
rau sạch Nơng Phú (Hịa Vang) và Trại thực nghiệm của khoa Sinh – Mơi trường.

B

A

Hình 2.1. Nụ hoa mướp đắng và bao phấn hoa mướp đắng.
(A) Nụ hoa mướp đắng. (B) Bao phấn hoa mướp đắng
2.2. Phạm vi nghiên cứu
Đề tài tiến hành nghiên cứu tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học thực vật,
Khoa Sinh - Môi trường, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng từ tháng 6/2018
– 3/2019.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Quy trình tiến hành thí nghiệm
Q trình ni cấy bao phấn bao gồm các bước: Thu mẫu nụ hoa, tách bao phấn
và cấy vào môi trường nhân tạo, nuôi cấy các mẫu bao phấn tạo callus, tái sinh chồi từ
callus, tạo rễ từ callus. Tất cả các môi trường nuôi cấy được khử trùng trong nồi hấp ở
nhiệt độ 121oC trong 15 phút. Mẫu được ni trên mơi trường thích hợp ở nhiệt độ 25 ±
2℃.

13

Nụ hoa mướp đắng
Tách bao phấn, cấy vào môi trường nuôi cấy
Callus phát sinh từ bao phấn hoa mướp đắng
Tạo chồi từ callus

Ra rễ in vitro
2.2.1. Phương pháp xử lý mẫu
Nụ hoa được hái từ cây mướp đắng vào khoảng thời gian từ 5h30-6h30 sáng, và
đặt trong đĩa pestri hoặc túi zipper, bảo quản lạnh trong vòng 24 giờ ở 4oC
Sau khi bảo quản lạnh trong 24 giờ sẽ được đưa vào tủ cấy vô trùng để tiến hành
xử lý. Nụ hoa được ngâm, lắc trong cồn 70o trong 30 giây, rửa lại 3 lần bằng nước cất
vô trùng. Tiến hành khử trùng bằng NaOCl 5% trong 4 phút, rửa lại bằng nước cất 5 lần,
tách lấy bao phấn đưa vào môi trường nuôi cấy.
2.2.2. Phương pháp tạo callus đơn bội.
a. Ảnh hưởng của giai đoạn phát triển của hạt phấn đến khả năng phát sinh callus từ
bao phấn.
Kích thước của nụ hoa là ngẫu nhiên. Tách bao phấn ra khỏi nụ hoa, đặt lên lam
kính và nghiền bao phấn trong giọt glycerin. Dùng ống mao dẫn hút lượng hạt phấn mới
nghiền sang một lam kính khác với 1 giọt dung dịch acetocarmine 2% đậy lamen và
quan sát dưới kính hiển vi. Giai đoạn phát triển được xác định bằng số lượng hạt nhân
và vị trí của chúng trong tế bào [26]. Lựa chọn được giai đoạn phát triển tương ứng với
kích thước nụ hoa sẽ được sử dụng để đưa vào nuôi cấy. Môi trường sử dụng là MS với
30g/l đường saccharose, 8g/l agar, pH 5,7-,58 bổ sung khác nhau về thành phần và nồng
độ chất điều hòa sinh trưởng: M1 – 1,0mg/l 2,4D và 1,5mg/l BAP; M2 - 1,5mg/l 2,4-D
và 1,0mg/l BAP; M3 - 1,5mg/l NAA, 1,0mg/l BAP và 0,5mg/l KIN. Đánh giá sự hình
thành callus với tỷ lệ cao nhất.

14

b. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nền đến khả năng phát sinh callus từ bao phấn
Tất cả mẫu nụ hoa đã được qua xử lý sẽ được tách lấy bao phấn và đặt vào bình
ni cấy hoặc đĩa pestri có chứa mơi trường nền cơ bản: Gamborg (B5), Murashige and
Skoog (MS) có bổ sung 30g/l đường saccharose và 8g/l agar, 1mg/l 2,4D + 1,5mg/l
BAP, pH 5,7-5,8.
Tỷ lệ bao phấn sống (%) =

số bao phấn sống
tổng số bao phấn cấy

x 100

c. Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng phát sinh callus từ bao phấn
Trong thí nghiệm, bao phấn mướp đắng sẽ được nuôi cấy trên các mơi trường cơ
bản: MS có bổ sung 30g/l đường saccharose và 8g/l agar, than hoạt tính (AC) với nồng
độ thay đổi trong khoảng 0-0,5mg/l, 1mg/l 2,4D + 1,5mg/l BAP, pH 5,7-5,8.
Hiệu quả đánh giá của từng mơi trường có sai khác về nồng độ AC được đánh
giá theo chỉ tiêu:
Tỷ lệ bao phấn sống (%) =

số bao phấn sống
tổng số bao phấn cấy

x 100

d. Khảo sát ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến khả năng phát sinh callus từ bao phấn
Trong thí nghiệm, các bao phấn mướp đắng được nuôi cấy trong môi trường cơ
bản MS bổ sung: 30g/l đường saccharose và 8g/l agar, 1mg/l 2,4D + 1,5mg/l BAP và
1mgl KIN + 1,5mg/l NAA + 0,5 mg/l BAP, pH 5,7-5,8, được đặt vào hai điều kiện chiếu

sáng khác nhau và ni cấy ở 25 ± 2℃, trong tối hồn toàn hoặc chiếu sáng 2000lux
trong 16 giờ/ngày.
2.3.3. Phương pháp tạo chồi và tái sinh rễ từ callus
a. Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi từ
callus của bao phấn
Trong thí nghiệm các callus sau 3-4 tuần nuôi cấy sẽ được chuyển vào mơi trường
MS cơ bản có bổ sung, 30g/l đường saccharose và 8g/l agar, pH 5,7-5,8 và 2,4-D; KIN;
NAA; BAP; TDZ; IBA, trong đó nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thay đổi trong
khoảng từ 0-10 mg/l, các chất này được bổ sung riêng rẽ hoặc kết hợp với nhau. Đánh
giá sự khác nhau về hình thái callus trên từng thí nghiệm.

15


b. Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh rễ từ callus
của bao phấn
Trong thí nghiệm các callus sau 3-4 tuần ni cấy sẽ được chuyển vào mơi trường
MS cơ bản có bổ sung, 30g/l đường saccharose và 8g/l agar, pH 5,7-5,8 và NAA; IBA,
trong đó nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thay đổi trong khoảng từ 0,5-3,5 mg/l,
các chất này được bổ sung riêng rẽ với nhau. Đánh giá sự khác nhau về hình thái callus
trên từng thí nghiệm.
2.3.3. Bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu
Mỗi cơng thức thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần. Số liệu được xử lý thống kê
bằng cách sử dụng phần mềm phân tích thống kê SPSS ver. 23 theo phương pháp Turkey
với α = 0,05.

16