Nghiên cứu khả năng tái sinh cây tỏi lý sơn (allium sativum l ) từ phôi vô tính

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

HỒ CHUNG ANH QUÝ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH
CÂY TỎI LÝ SƠN (ALLIUM SATIVUM L.)
TỪ PHƠI VƠ TÍNH

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đà Nẵng, tháng 4 năm 2019


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH
CÂY TỎI LÝ SƠN (ALLIUM SATIVUM L.)
TỪ PHƠI VƠ TÍNH

Chun ngành : CƠNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hướng dẫn : TS. Võ Châu Tuấn
Sinh viên thực hiện

: Hồ Chung Anh Quý

Lớp

: 15CNSH

Đà Nẵng, tháng 4 năm 2019


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực, khách quan và chưa từng
được ai cơng bố trong bất kì cơng trình nào khác.
Đà Nẵng, ngày 24 tháng 4 năm 2019
Sinh viên

Hồ Chung Anh Quý

1


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành khóa luận này em xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Sự Phạm,
khoa Sinh – Môi trường, bộ môn công nghệ sinh học, cùng q thầy cơ, gia đình và bạn
bè đã tạo điều kiện thuận lợi cả về vật chất và tinh thần để em có thể hồn thành để tài
này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Võ Châu Tuấn, thầy giáo đã trực tiếp
hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho em từ khi nhận đề tài cho đến khi hồn thành khóa
luận.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Nguyễn Minh Lý, đã giúp đỡ em rất
nhiều trong việc trau dồi kiến thức, kĩ năng thí nghiệm cũng như theo sát em trong suốt
q trình em thực hiện khóa luận.
Xin chân thành cảm ơn!

Đà Nẵng, ngày 24 tháng 4 năm 2019
Sinh viên

Hồ Chung Anh Quý

2


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... 1
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. 2
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ 5
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... 6
DANH MỤC HÌNH ẢNH........................................................................................... 7
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 8
1. Tính cấp thiết ....................................................................................................... 8
2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................ 9
3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 9
4. Ý nghĩa và tính mới ............................................................................................. 9
4.1 Ý nghĩa khoa học.............................................................................................. 9
4.2 Ý nghĩa thực tiễn .............................................................................................. 9
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 10
1.1 Giới thiệu về cây tỏi ......................................................................................... 10
1.1.1. Đặc điểm phân loại .................................................................................... 10
1.1.2. Đặc điểm sinh thái ..................................................................................... 10
1.1.3. Nguồn gốc và phân bố................................................................................ 10
1.1.4 Quy mô sản xuất và giá trị kinh tế ............................................................... 11
1.2. Nhân giống bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................ 11
1.2.1. Cơ sở khoa học........................................................................................... 11
1.2.2. Ưu, nhược điểm của nhân giống vơ tính bằng kỹ thuật ni cấy mơ tế bào. 12

1.2.3. Các nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy nhân giống in vitro........................... 13
1.3. Giới thiệu về phôi vô tính ở thực vật ............................................................. 15
1.3.1. Lịch sử ....................................................................................................... 15
1.3.2. Khái niệm ................................................................................................... 15
1.3.3 Sự phát sinh hình thái của phơi vơ tính........................................................ 16
1.3.4. Những điều kiện ảnh hưởng tới hình thành phơi vơ tính ............................. 18
1.4. Sơ lược về tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro ở tỏi ............................ 21
1.4.1. Nhân giống in vitro cây tỏi bằng con đường phát sinh cơ quan trực tiếp .... 21
1.4.2. Nhân giống in vitro cây tỏi bằng con đường phát sinh cơ quan gián tiếp ... 22
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 24
3


2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 24
2.2 Sơ đồ thí nghiệm .............................................................................................. 24
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 24
2.2.1. Phương pháp vô trùng mẫu ........................................................................ 24
2.2.2. Phương pháp tạo cây tỏi in vitro ................................................................ 25
2.2.3. Phương pháp cảm ứng tạo phôi gián tiếp ................................................... 25
2.2.4. Tái sinh chồi............................................................................................... 25
2.2.5 Ra rễ ........................................................................................................... 25
2.2.6. Xử lý số liệu ............................................................................................... 25
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 26
3.1 Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN đến khả năng tạo callus ................................. 26
3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D để khả năng phát sinh phôi ........................................ 27
3.4. Ảnh hưởng của 2,4-D, KIN và NAA đến khả năng sinh phơi vơ tính. ......... 30
3.5 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi ........................................... 32
3.6. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tái sinh chồi ............................ 33
3.7 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ ....................................................... 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................. 36

Kết luận ................................................................................................................. 36
Kiến nghị ............................................................................................................... 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 37

4


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
2,4-D
BAP
B5
IAA
IBA
Kin
MS
NAA
SH
TDZ
Cs
ĐHST

: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid
: 6 - benzyl amino purine
: Gamborg (1968)
: indole-3-acetic acid
: indole 3 - butyric acid
: kinetin
: Murashige và Skoog (1962)
: α-naphthalen acetic acid
: Schenk và Hildebrandt (1972)

: thidiazuron
: cộng sự
: điều hòa sinh trưởng

5


DANH MỤC BẢNG
Bảng
1.1
1.2
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7

Tên bảng
Tổng quan nghiên cứu in vitro tái sinh cơ quan trực tiếp trên
Allium sativum L.
Tổng quan nghiên cứu về in vitro tái sinh cơ quan gián tiếp
Allium sativum L.
Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN đến khả năng tạo callus
Ảnh hưởng của 2,4-D để khả năng phát sinh phôi soma
Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN đến khả năng sinh phôi soma
Ảnh hưởng của 2,4-D, KIN và NAA đến khả năng sinh phôi
soma.
Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi

Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tái sinh chồi
Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ

6

Trang
23
24
27
28
30
31
33
34
35


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình
1.2
1.3
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7

Tên hình

Những giai đoạn phát sinh phơi vơ tính ở cây một lá mầm
Những giai đoạn phát sinh phơi vơ tính ở cây hai lá mầm
Callus tỏi phát sinh từ lát cắt gốc thân
Phơi hình cầu trên môi trường 2,4-D
Phôi phát sinh trên môi trường 2,4-D và Kin
Những giai đoạn phát sinh phôi trên môi trường MS bổ sung 2,4D, KIN và NAA
Chồi tái sinh trên môi trường MS bổ sung BAP
Chồi tái sinh từ môi trường MS bổ sung BAP và NAA
Rễ phát sinh trong quá trình ni cấy

7

Trang
16
16
27
29
30
32
33
34
36


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết
Tỏi có tên khoa học là Allium sativum L., có nguồn gốc từ Trung Á và chủ yếu ở
các vùng Địa Trung Hải cũng như Châu Á, Châu Âu và Châu Phi. Từ lâu tỏi đã được
con người biết đến và sử dụng như một loại thảo dược quý dùng để điều trị bệnh cũng
như là một loại gia thơng dụng trong q trình chế biến thực phẩm. Đã có nhiều kết quả

nghiên cứu cho thấy trong tỏi chứa kháng chất Allicin có khả năng ngăn ngừa sự phát
triển của vi khuẩn, ngồi chất chính là allicin – kháng sinh thảo mộc rất mạnh, tỏi chứa
các hợp chất sulphur và polyphenol có nhiều tác dụng sinh học khác nhau và hơn 100
loại hợp chất chứa lưu huỳnh có giá trị trong y học cao, các chất này đóng vai trị chống
ung thư trong cơ thể con người [1][10][12][13].
Hiện nay tại Việt Nam có rất nhiều giống tỏi cũng như nhiều vùng chuyên canh
trồng tỏi khác nhau, đặc biệt trong đó có tỏi Lý Sơn được người tiêu dùng ưa chuộng với
rất nhiều mặt hàng khác nhau như tỏi tươi, nước ép tỏi, tỏi lên men.... Tỏi Lý Sơn khác
so với những loại tỏi khác bởi có mùi vị thơm ngon đặc trưng cũng như hàm lượng dược
liệu có được là rất cao. Trong đó hàm lượng allicin ở tỏi Lý Sơn chiếm 0,767% cao hơn
so với tỏi khác ở nước ta (0,67%) và tỏi Trung Quốc (0,712%)[8]. Do có những đặc tính
ưu việt nên tỏi Lý Sơn đã được Cục Sở hữu trí tuệ, Bộ Khoa học và Công nghệ thương
hiệu nhãn hiệu tập thể.
Mặc dù có rất nhiều đặc tính rất tốt nhưng lượng tỏi Lý Sơn cung cấp cho thị trường
còn rất hạn hẹp, việc canh tác tỏi ở Lý Sơn chịu tác động từ nhiều yếu tố khác nhau trong
đó điều kiện tự nhiên là yếu tố ảnh hưởng lớn nhất, ngoài ra phương pháp canh tác và
chất lượng nguồn giống cũng chi phối rất lớn đến sản lượng của vùng chuyên canh tỏi
này. Trong đó canh tác theo pháp truyền thống đã dẫn đến chất lượng cũng như năng
suất ngày càng đi xuống, người nông dân thường lấy trực tiếp những củ tỏi sản xuất ra
được để làm cây giống cho những mùa vụ tiếp theo, đó là một hình thức sinh sản vơ tính
của cây tỏi từ đó làm cho giống tỏi ngày càng bị thối hóa [23]. Giống bị suy thoái xuất
hiện nhiều bệnh và những biến dị di truyền rất khó kiểm sốt cũng như khắc phục, dẫn
đến những đặc tính ban đầu bị thay đổi, hàm lượng dược tính thấp, cây phát triển yếu,
củ nhỏ, bị dị dạng...[24]. Ảnh hưởng rất lớn đến kinh tế cũng như thương hiệu của tỏi
Lý Sơn.
Để khắc phục vấn đề về giống, nhiều nông dân đã chuyển vùng sản xuất tỏi để
tránh sâu bệnh, sử dụng những tép tỏi Lý Sơn được trồng ở những vùng khác để làm
giống tuy nhiên cách làm này chẳng mang lại hiệu quả, mà còn làm ảnh hưởng tới những
đặc trưng riêng của giống tỏi Lý Sơn. Năm 2009, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp
duyên hải Nam Trung bộ đã về Lý sơn để thực hiện để tài “Nghiên cứu phục tráng giống

tỏi ở Lý Sơn” nhằm đưa những giống tỏi ở Lý Sơn trở về những đặc tính ban đầu. Đến
8


nằm 2013 Viện đã phục tráng được 9 dòng của giống tỏi Lý Sơn đạt cấp siêu nguyên
chủng với 65.800 củ được phục tráng, kết quả ban đầu ghi nhận được năng suất của
giống tỏi được phục tráng cao hơn từ 12,3 – 39,2% so vơi giống tỏi chưa được phục
tráng, mang lại niềm hi vọng rất lớn cho người nơng dân [5]. Nhưng có những vấn đề
đang được đặt ra với những giống tỏi đã được phục tráng duy trì được những đắc tính
trong bao lâu, số lượng giống tỏi được phục tráng có đáp ứng đủ nhu cầu của người nơng
dân và có thể áp dụng những cơng nghệ mới để duy trì tính tráng của giống đã phục tráng
hay khơng.
Từ đó chúng tơi thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng tái sinh cây tỏi Lý Sơn
(Allium sativum L.) từ phơi vơ tính”. Nhằm tạo ra một sản phẩm mới bền vững và mang
lại giá trị cao cho người nông dân canh tác tỏi Lý Sơn.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xây dựng được một quy trình tạo phơi vơ tính ở cây tỏi Lý Sơn, làm cơ sở để sản
xuất hạt nhân tạo.
3. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng hình thành phơi vơ tính ở cây
tỏi trong điều kiện in vitro.
- Khảo sát ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng sinh trưởng của phơi vơ tính
ở cây tỏi.
- Khảo sát ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng tái sinh cây tỏi in vitro hồn
chỉnh từ phơi vơ tính .
- Khảo sát ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng tạo rễ in vitro của cây tỏi.
4. Ý nghĩa và tính mới
4.1 Ý nghĩa khoa học
Cung cấp dẫn liệu khoa học cơ bản về hình thành phơi vơ tính ở cây tỏi Lý Sơn và
những ảnh hưởng của các điều kiện môi trường nuôi cấy in vitro.

4.2 Ý nghĩa thực tiễn
Từ quy trình hình thành phơi vơ tính ở cây tỏi Lý Sơn sẽ là cơ sở để tạo ra một
nguồn cung cấp cây giống đủ lớn, chất lượng tốt cũng như đảm bảo được những đặc tính
cốt yếu của cây tỏi Lý Sơn, từ đó giúp người nơng dân cải thiện được phương thức canh
tác, nâng cao sản lượng và chất lượng sản phẩm.

9


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về cây tỏi
1.1.1. Đặc điểm phân loại
Tỏi, tên khoa học là Allium sativum L., thuộc họ Hành Alliaceae. Có nguồn gốc từ
vùng Trung Á. Tỏi là cây thân thảo sống nhiều năm. Thân hình trụ, phía dưới mang nhiều
rễ phụ, phía trên mang nhiều lá, lá cứng, hình dải, thẳng dài 15-20cm, rộng 1-2,5cm có
rảnh khía, mép lá hơi ráp. Ở mỗi nách lá phía gốc có một chồi nhỏ sau này phát triển
thành một tép tỏi. Các tép này nằm chung trong một bao (do các bẹ lá tạo ra) [9].
Củ và tép tỏi: Ở mỗi nách lá phía sau gốc có một chồi nhỏ sau này phát triển thành
một tép tỏi, các tép này nằm chung trong một bao ( do các bẹ lá trước tạo ra) thành một
củ tỏi thành hành (giò) của tỏi. Củ tỏi nằm dưới mặt đất.
1.1.2. Đặc điểm sinh thái
Tỏi là cây chịu lạnh tốt, cây có thể sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ18 - 20°C,
cịn để tạo củ thì cần từ 20 - 22°C. Tỏi ưa ánh sáng dài ngày, nếu có đủ nắng trong 12
giờ/ngày thì cây sẽ ra củ nhanh.
Tỏi cũng là loại cây ưa nước nhưng ở mức độ vừa phải. Nếu thiếu nước cây sẽ đanh
lại, củ nhỏ cịn nếu thừa nước thì sẽ gây ra hiện tượng úng củ, thối củ làm cho củ không
giữ được lâu. Tỏi được chia làm 2 loại: Tỏi trắng: lá xanh đậm, to bản, củ to, đường kính
khoảng 4cm. Củ tỏi vỏ màu trắng nên gọi là tỏi trắng, loại tỏi này bảo quản kém. Tỏi tía:
lá dầy, cứng màu xanh nhạt, củ chắc và cay; dọc thân gần củ có màu tía. Củ tỏi tía nhỏ
hơn củ tỏi trắng (dường kính 3,5 - 4cm). Tỏi tía cỏ hương vị đặc biệt nên được trồng

nhiều.
1.1.3. Nguồn gốc và phân bố
Tỏi là một thảo dược quý có chứa kháng sinh thực vật với rất nhiều ưu điểm, được
canh tác ở nhiều nơi như Việt Nam, Trung Quốc, các nước Trung Á, Châu Âu
(FAO,2012). Trong tỏi có chứa chất Allicin - kháng sinh thảo mộc rất mạnh và các hợp
chất sulphur, polyphenol có nhiều tác dụng sinh học khác tỏi đã được sử dụng nhiều
trong phòng và trị bệnh ở người và vật nuôi, được dùng làm thuốc chữa các bệnh cảm
cúm, cảm lạnh, đầy hơi, mụn nhọt, tim mạch và một số bệnh khác. Gần đây, không chỉ
ở Việt Nam mà nhiều nước trên thế giới đã chiết tách và sử dụng những hoạt chất của
tỏi như những dược phẩm quý trong y học và thú y. Ngoài ra, dịch chiết tỏi có tác dụng
diệt khuẩn in vitro [8].
Ở Việt Nam tỏi được trồng phổ biến ở một số nơi như Huyện đảo Lý Sơn-Quảng
Ngãi, Phan Rang-Ninh Thuận, Bắc Giang. Tỏi ở vùng Lý Sơn là một loại đặc sản của
10


đất nước mang lại giá trị kinh tế cao, có các đặc điểm đặc trưng về hình thái, mùi vị riêng
biệt cũng như đặc tính sinh học nổi bật [4].
1.1.4 Quy mô sản xuất và giá trị kinh tế
Tỏi được trồng ở rất nhiều nơi trên thế giới, theo thống kể năm 2016, sản lượng tỏi
trên thế giới đạt 26,6 triệu tấn, riêng Trung Quốc chếm 80% tổng sản lượng. Ấn Độ là
nhà sản xuất lớn thứ hai với sản lượng 5% sản lượng thế giới. Hoa Kỳ đứng thứ 10 về
sản lượng sản xuất tỏi trên thế giới [22].
Hiện nay tổng diện tích gieo trồng tỏi hàng năm tại Lý Sơn khoảng 350ha, sản
lượng ước đạt 1.700 tấn và năng suất bình quân từ 5,0 - 7,0 tấn/ha. Tuy nhiên, năng suất
thường không ổn định theo từng năm, năm khí hậu thích hợp năng suất có thể đạt đến
6,0 - 7,0 tấn/ha, nhưng năm mất mùa năng suất chỉ đạt từ 3 - 4 tấn/ha. Đặc biệt, tỏi tại
Lý Sơn chỉ trồng ở vụ đơng xn, các vụ cịn lại không canh tác do điều kiện khắc nghiệt
của thiên nhiên và thiếu nước tưới. Vì rất khó khăn trong q trình canh tác nên tỏi Lý
Sơn có giá thành rất cao, giá tỏi Lý Sơn xấp xỉ 40.000vnđ/kg, đặc biệt cịn có tỏi cơ đơn

Lý Sơn có giá trị cao hơn rất nhiều. Trên thị trường, giá tỏi Lý Sơn giao động từ
150.000vnđ/kg đến 400.000vnđ/kg, có những thời điểm giá tỏi cô đơn Lý Sơn được bán
trên thị trường với giá 1.700.000vnđ/kg. Ngoài ra những sản phẩm khác được chế biến
từ tỏi Lý Sơn cũng có giá thành rất cao và đem lại giá trị kinh tế vô cùng lớn, điển hình
như nước ép tỏi, rượu tỏi, tỏi lên men.
1.2. Nhân giống bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1. Cơ sở khoa học
a. Tính tồn năng của tế bào
Haberlant G. (1902) là người đầu tiên đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế
bào thực vật để chứng minh cho tính tồn năng của tế bào. Theo ơng mỗi một tế bào bất
kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá
thể hoàn chỉnh [12]. Như vậy, mỗi tế bào riêng rẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy
đủ lượng thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật và nếu gặp điều kiện thích hợp thì
mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hồn chỉnh [12].
Ni cấy mô tế bào thực vật được thực hiện dựa trên tính tồn năng của tế bào,
được thể hiện khi nuôi cấy mô và các tế bào riêng biệt, trong mơi trường thích hợp thì
có khả năng phát triển thành cây hồn chỉnh, đặc trưng cho lồi và có thể phát triển bình
thường. Do trong nhân tế bào có chưa bộ DNA hồn chỉnh chứa tồn bộ thơng tin di
truyền cho một chu kì sống hồn chỉnh

11


b. Tính phân hóa và phản phân hóa của tế bào
Q trình phát sinh hình thái trong ni cấy mơ tế bào in vitro là kết quả của quá
trình phân hóa và phản phân hóa tế bào [12]. Trong đó:
Tính phân hóa của tế bào là sự biển đổi của các tế bào phôi sinh thành các tế bào
của các mơ chun hóa đảm nhận các chức năng khác nhau. Trong cơ thể thực vật có
khoảng 15 loại mơ khác nhau đảm nhận các chức năng khác nhau (mô giậu, mơ dẫn, mơ
bì, mơ khuyết…) nhưng chúng đều có nguồn gốc từ tế bào phôi sinh đã trải qua giai đoạn

phân hóa để hình thành các mơ riêng biệt [12].
Tính phản phân hóa của tế bào: tế bào khi đã được phân hóa thành các mơ có chức
năng riêng biệt, nhưng trong những điều kiện nhất định chúng vẫn có thể quay lại trạng
thái phôi sinh và phân chia tế bào mạnh mẽ [12].
Trên thực tế đã chứng minh khả năng tái sinh của một cơ thể thực vật hoàn chỉnh
từ một tế bào riêng rẽ. Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên quy mô thương
mại bằng cách nuôi cấy chúng trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng
thành cây [12].
Trong kĩ thuật nuôi cấy cơ quan dinh dưỡng của cây như thân, rễ, lá thì giai đoạn
tạo mơ sẹo (callus) chính là những tế bào đã quay trở lại trạng thái phôi sinh có khả năng
phân chia liên tục mà mất hẳn chức năng của cơ quan sinh dưỡng [12].
Tùy vào từng tế bào, từng mơ, từng thời kì sinh trưởng, phát triển mà các gen phù
hợp hoạt động; các gen không cùng hoạt động như nhau trong các giai đoạn phát triển
của cơ thể (cơ chế điều hòa hoạt động của gen) [12].
Về bản chất của sự phân hóa và phản phân hóa là q trình hoạt hóa gen. Do thơng
tin về vị trí của tế bào, tương quan dinh dưỡng và tương quan hormone quy định. Trong
đó quan trọng nhất là thơng tin về vị trí của tế bào, khi nằm trong một cơ thể các tế bào
có sự ức chế lẫn nhau, khi được tách rời và trong điều kiện nhất định thì các gen được
hoạt hóa dễ dàng hơn. Đó là cơ sở nền tảng cho việc ni cấy mô, tế bào [12].
1.2.2. Ưu, nhược điểm của nhân giống vơ tính bằng kỹ thuật ni cấy mơ tế bào
a. Ưu điểm
Theo E.F. Gerge (1993) cho biết ưu điểm của nhân giống in vitro [13]
- Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành một số lượng lớn cây
giống từ một mơ, cơ quan với kích thước nhỏ 0,1 -10 mm.
- Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo được sạch bệnh
- Sử dụng vật liệu sạch virus có khả năng nhân được các giống sạch bệnh
12


- Có khả năng điều chỉnh các tác nhân ảnh hưởng đến khả năng tái sinh cây như

thành phần dinh dưỡng, nhiệt độ, các chất điều hòa sinh trưởng … theo ý muốn.
- Hệ số nhân giống khá cao, có khả năng sản xuất lượng lớn cây giống trong một
thời gian ngắn
- Có thể tiến hành quanh năm, khơng chịu sự chi phối của các nhân tố mơi trường
- Có thể bảo quản cây giống in vitro trong thời gian dài nếu chưa sử dụng
b. Nhược điểm
- Vì cây giống được cung cấp nguồn dinh dưỡng nhân tạo nên khả năng tự tổng
hợp các chất hữu cơ kém. Cây giống được ni trong bình thủy tinh có độ ẩm bão hòa,
nên khi trồng dễ mất cân bằng nước, gây ra hiện tượng héo rũ. Vì vậy, cây giống in vitro
đưa ra trồng tự nhiên cần qua giai đoạn thích nghi để quen dần với điều kiện tự nhiên
[13]
1.2.3. Các nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy nhân giống in vitro
a. Mơi trường ni cấy
Thành phần hóa học của mơi trường ni cấy thay đổi tùy theo mỗi lồi cây, bộ
phận ni cấy, thậm chí mỗi kiểu gen và mục đích nuôi cấy (nuôi cấy mô sẹo, huyền phù
tế bào, tế bào trần, bao phấn, hạt phấn). Các mơi trường khống cơ bản thường được sử
dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là MS (1962), B5 (1968), SH (1972) hoặc White
(1963) [15].
Hiện nay môi trường cơ bản MS (1962) được xem là mơi trường có hàm lượng và
thành phần các muối khống phong phú hơn cả. Vì thế hầu hết các thí nghiệm ni cấy
mơ đều được thực hiện trên mơi trường này [7][13].
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, đường được xem là nguồn cung cấp carbon
quan trọng giúp các tế bào phân chia, tăng sinh khối. Hai dạng thường được sử dụng nhất
là saccharose và glucose, nhưng saccharose phổ biến hơn. Saccharose là cacbonhydrate
phổ biến nhất trong vỏ cây và nhựa cây, tham gia trong việc kiểm soát q trình phát
triển [20].
b. Điều kiện ni cấy
Để tăng hiệu quả của kỹ thuật ni cấy in vitro, ngồi thành phần mơi trường thì
điều kiện ni cấy như ánh sáng, nhiệt độ, pH cũng phải được tối ưu hóa [7][13].
- Ánh sáng: Chất lượng ánh sáng (chất lượng quang phổ), số lượng (photon thơng

lượng) và thời gian chiếu sáng có ảnh hưởng sâu sắc đến sự phát triển và phát sinh hình
thái của các mơ ni cấy [20]. Nhìn chung, đèn huỳnh quang là nguồn ánh sáng chính 9
13


cho việc duy trì ni cấy mơ [20]. Ánh sáng phải được sử dụng liên tục với quang chu
kỳ là 16 giờ, 18 giờ hoặc 24 giờ tùy loài [7][13].
Nhiều nghiên cứu cho thấy ánh sáng đóng vai trị quan trọng trong việc tạo hình
thái cây ni cấy mơ. Trong giai đoạn tạo chồi ban đầu và nhân chồi tiếp theo, cường độ
ánh sáng chỉ cần 1000 lux. Nhưng trong giai đoạn tạo rễ, cây cần nhiều ánh sáng, cường
độ ánh sáng cao từ 3000 – 10.000 lux để kích thích cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng
sang tự dưỡng [7][13][15].
- Nhiệt độ: Là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình
trao đổi chất của mơ ni cấy, đồng thời nó có ảnh hưởng tới sự hoạt động của auxin, do
đó làm ảnh hưởng đến khả năng ra rễ của cây con được nuôi cấy [7][13].
- Độ pH: pH của môi trường là yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng đến sự phát sinh
hình thái của mẫu ni cấy tại các giai đoạn khác nhau. Sự ổn định pH của môi trường
là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào. Giá trị của pH trong mơi trường thích hợp cho
sinh trưởng và phát triển của nhiều loài thực vật biến đổi từ 5,5 – 6,0.
c. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (ĐHST) là các yếu tố hóa học cần thiết cho sự
sinh trưởng và phát triển của thực vật, có thể là những chất tự nhiên được sản sinh với
một hàm lượng rất nhỏ trong một bộ phận nào đó của cá thể thực vật hoặc những chất
được tổng hợp nhân tạo [12][13].
Việc bổ sung một hoặc nhiều chất ĐHST như auxin, cytokinin, … là rất cần thiết
để kích thích sự sinh trưởng phát triển và phân hóa cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho
mô và các tổ chức. Tuy vậy, yêu cầu của những chất này thay đổi theo từng lồi thực
vật, loại mơ, hàm lượng chất ĐHST nội sinh của chúng [7].
- Nhóm auxin Các chất nhóm auxin có tác động thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở
của tế bào, tăng cường các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ

và tham gia vào cảm ứng phát sinh phơi vơ tính. Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều
ở thực vật là IAA. IAA có tác dụng ĐHST kéo dài tế bào, điều khiển sự hình thành rễ.
NAA và 2,4-D cũng đóng vai trị quan trọng trong sự phân chia mơ và trong q trình
tạo rễ. 2,4-D kích thích sự hình thành callus và kìm hãm sự hình thành rễ trong mơi
trường ni cấy tại nồng độ cao. Mặc dù cùng nhóm chất auxin nhưng hai chất này lại
có tính chất đối kháng. NAA được Went và Thimann (1937) tìm ra. Chất này có tác dụng
làm tăng hơ hấp của tế bào và mơ ni cấy, tăng hoạt tính enzim và ảnh hưởng mạnh
đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường
nuôi cấy [13].

14


- Nhóm cytokinin: Cytokinin là chất ĐHST có tác dụng làm tăng sự phân chia tế
bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro, cảm ứng sự sinh trưởng của chồi bên
và loại bỏ ưu thế đỉnh. Các cytokinin thường gặp là BAP, Kin. Kin được Shoog phát
hiện ngẫu nhiên trong khi chiết xuất axit nucleic. Kin là dẫn xuất của base nito adenin.
BAP là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn Kin. BAP và Kin có
tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và
làm hạn chế sự già hóa của tế bào [12][13].
1.3. Giới thiệu về phơi vơ tính ở thực vật
1.3.1. Lịch sử
Bắt đầu từ năm 1958, Street và Reinert đã mơ tả sự hình thành phơi vơ tính từ các
tế bào đơn của cà rốt. Sau đó, vào 1977, Murashige đưa ra ý kiến tạo phơi vơ tính có thể
trở thành biện pháp vi nhân giống. và tiếp tục cho đến nay thì cơng nghệ phơi vơ tính
được xem là rất có triển vọng cho nơng nghiệp thế kỉ 21
1.3.2. Khái niệm
Phơi vơ tính hay phơi soma là các thể nhân giống (propagule) có cực tính bắt nguồn
từ các tế bào dinh dưỡng, bao gồm cả phần mô phân sinh ngọn và mơ phân sinh gốc, do
đó có thể hình thành chồi và rễ.

Không giống như các tế bào eukaryote, hầu hết tế bào thực vật đều có khả năng
phát triển thành phôi dưới những diều kiện nhất định. Williams và Maheswaran (1986)
đã cho rằng phơi vơ tính có thể được hình thành từ một tế bào đơn hay từ cả một cụm tế
bào phơi [19]Tiến trình này khác với những quá trình tự nhiên khác và được gọi là q
trình hình thành phơi vơ tính.
Phơi vơ tính rất giống phơi hữu tính ở hình thái và sinh lí nhưng khơng có q trình
tái tổ hợp di truyền do phơi vơ tính khơng phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử
đực và giao tử cái. Do đó tất cả những cây con tái sinh bằng con đường này thì có vật
chất di truyền giống hệt các tế bào sinh dưỡng đã sinh ra chúng (Nguyễn Văn Uyển,
1992) [11]. Đặc tính này của phơi sinh dưỡng khơng những cho phép thực hiện sự nhân
giống vơ tính mà cịn tạo ra những thay đổi chuyên biệt và trực tiếp để đưa các tính chất
mong muốn vào các cá thể bằng việc chèn thêm những trình tự gen cố định vào tế bào
sinh dưỡng. (Saiprasad, 2001).
Giống như các tế bào của mơ phân sinh, các tế bào sinh phơi có các đặc tính cơ bản
như sau: tế bào nhỏ, có cùng một đường kính, có hoạt động biến dưỡng rất mạnh mẽ, có
cường độ tổng hợp ribonucleic acid rất cao, có tế bào chất đậm đặc, khơng bào rất nhỏ,
nhân to, dễ nhận thấy, hạch nhân rất to và sậm màu, đặc biệt là các tế bào này có một
lượng lớn các ribosom, ty thể, lưới nội chất nhỏ và có vách rất dày (Ammirato, 1987;
Emons, 1994; Raghvan, 1983; Thorpe, 1988)
15


1.3.3 Sự phát sinh hình thái của phơi vơ tính
Tất cả các phơi vơ tính đều có cấu trúc lưỡng cực, gồm có mơ phân sinh của cả
chồi và rễ, do đó có thể hình thành một cây hồn chỉnh trong ni cấy in vitro. Sự phát
sinh hình thái ở phơi vơ tính rất giống so với phơi hữu tính. Những phơi phát triển bình
thường sẽ trải qua những giai đoạn phát triển riêng biệt. Đối với phôi của thực vật một
lá mầm sẽ trải qua gia đoạn hình cầu (hình trứng hay hình chùy), Bao lá mầm và lá mầm
(một lá mầm hay thuẫn) (Hình1.2). Đối với phơi của thực vật hai lá mầm thì sau giai
đoạn tiền phơi sẽ là giai đoạn phơi hình cầu, hình tim, hình thủy lôi và giai đoạn 2 lá

mầm tưng tự như phơi hữu tính (Hình 1.3).

Hình 1.2 Những giai đoạn phát sinh phơi vơ tính ở cây một lá mầm [25].
A: Giai đoạn hình cầu; B: Giai đoạn bao lá mầm; C: Giai đoạn lá mầm

Hình 1.3 Những giai đoạn phát sinh phơi vơ tính ở cây hai lá mầm. [25].
A: giai đoạn tiền phơi; B: Giai đoạn hình cầu; C: Giai đoạn hình tim;
B: Giai đoạn hình thủy lơi; E: Giai đoạn hai lá mầm.

16


* Cơ chế phát sinh phôi soma
Những quan sát chi tiết về q trình phát sinh phơi phát hiện có 4 pha: 0, 1, 2 và 3,
được nhận thấy trong giai đoạn đầu của tiến trình phát sinh phơi trong hệ thống ni cấy
nói trên (Fujimura và Komamine, 1979) [21].
Ở pha 0, những tế bào đơn (giai đoạn 0) hình thành những cụm tế bào có khả năng
phát sinh phơi (giai đoạn 1) trên mơi trường có auxin. Trong suốt giai đoạn này, những
cụm tế bào hình thành từ những tế bào đơn có khả năng tạo phơi khi mơi trường ni
cấy khơng auxin, để hình thành những cụm tế bào giai đoạn 1.
Sau đó, pha 1 xuất hiện khi cấy chuyển những cụm tế bào giai đoạn 1 qua mơi
trường khơng có auxin. Trong suốt pha 1, những cụm tế bào tăng sinh chậm và dường
như khơng biệt hóa.
Sau pha 1 sự phân bào xuất hiện nhanh trên một phần của những cụm tế bào, dẫn
đến việc hình thành những tế bào phơi hình cầu. Pha này được gọi là pha 2.
Pha tiếp theo sau, pha 3, cây con in vitro phát triển từ những phơi hình cầu qua phơi
hình tim và phơi hình thủy lơi.
*Các kiểu phát sinh phôi soma
- Sự phát sinh phôi soma bất định
Các phôi vơ tính có thể phát triển từ các tế bào hay các mơ sẹo có liên quan của

một số lồi thực vật nhiệt đới, các phơi bất định này có thể được tạo trực tiếp từ tế bào
đơn trên bề mặt của phôi non hoặc gián tiếp từ bề mặt của phôi non này. Phương pháp
này được sử dụng trong chương trình di truyền cải tạo giống, chẳng hạn như cứu các
phôi bị chết non do lai tạo.
- Sự phát sinh đa phơi vơ tính
Hiện tượng này xảy ra khi ni cấy các nỗn non của thực vật hạt trần. Các khối
mơ có khả năng tạo phơi cao khi được cấy chuyền sang môi trường mới sẽ phát triển và
tăng trưởng thành phơi. Mơ có khả năng phát triển thành phơi có thể được phân biệt với
mơ khơng có khả năng phát triển thành phôi do màu trắng của phôi và hoá đỏ khi nhuộm
bằng acetocarmine. Dưới ánh đèn tử ngoại các tế bào phơi có thể phát huỳnh quang màu
xanh lá cây. Sự phát sinh phôi soma do cảm ứng
Hiện tượng này do sự nuôi cấy lỏng các tế bào và mô sẹo sau khi các mô này chịu
các xử lý đặc biệt đem lại sự cảm ứng khả năng tạo phôi. Người ta đã thực hiện nhiều
nghiên cứu trên nhiều loại thực vật ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau để quan sát khả
năng tạo thành mô sẹo.
17


1.3.4. Những điều kiện ảnh hưởng tới hình thành phơi vơ tính
Việc cảm ứng tạo phơi vơ tính là một trong những cơng việc khá mới mẻ và rất khó
khăn. Để đạt được hiệu quả cao và thành công, việc tìm hiểu các điều kiện sinh lý, hóa
học tác động đến sự hình thành phơi là một cơng việc rất quan trọng.
- Mẫu cấy
Mỗi loại mẫu cấy có những khả năng cảm ứng tạo phôi khác nhau. Sự lựa chọn
mẫu cấy rất khắc khe, ví dụ, nhiều lồi một lá mầm đòi hỏi mẫu cấy phải ở một giai đoạn
cụ thể nào đó của hợp tử phơi non thì mới hình thành mơ sẹo từ đó tạo phơi vơ tính.
Những bộ phận thích hợp được sử dụng để ni cấy tạo phơi Asparagus officinalis,
Lilium như chồi đỉnh, cuống lá, lóng thân, mầm, phơi chưa trưởng thành, cịn những bộ
phận khác thì hiệu quả tạo phơi rất thấp (Hisato Kunitake, 1998).
- Môi trường nuôi cấy

Gần 70% nghiên cứu thành công đều nhờ vào sử dụng môi trường MS với hàm
lượng muối khoáng cơ bản (Ammirato, 1983; Litz và Gray, 1992; Thorpe, 1988). Lý do
vì mơi trường này có chứa hàm lượng muối nitrat và ammonia cao. Tỉ lệ giữa muối nitrat
và ammonia trong môi trường rất quan trọng trong việc cảm ứng tạo phôi (Niedz, 1993,
1994). Polyamine trong môi trường dinh dưỡng có hiệu quả kích thích đến việc hình
thành phơi vơ tính (Minocha và Minocha, 1995). Những chất hữu cơ khác như nước dừa,
casein thủy phân, tinh chất mạch nha (malt extract)… ở những nồng độ khác nhau cũng
được sử dụng và đã cho thấy có nhiều ảnh hưởng đến cảm ứng tạo phơi ở một số lồi
thực vật. Bên cạnh đó cũng đã có những đề nghị về vai trò của nitrogen, amino acid,
amid, cũng như của kali, photphat đến sự hình thành phơi (Tisserat và cộng sự, 1979;
Ammirato, 1983).
- Nguồn cacbohydrate
Sucrose là một nguồn cacbon chính trong mơi trường nuôi cấy. Tuy nhiên trong
một vài trường hợp, galactose (Cabasson và cộng sự, 1997), lactose (Jumin và Nato,
1995), maltose (Dhir và Yavada, 1995), glucose và fructose (Canhoto và Cruz, 1994) và
manitol (Kunitake và cộng sự, 1991) khi kết hợp với sucrose đã đẩy mạnh sự cảm ứng
tạo phôi cũng như sự phát sinh hình thái bình thường của phơi.
- Chất điều hòa sinh trưởng
Chất điều hòa tăng trưởng được chia làm 5 nhóm chính là auxin, cytokinin, acid
abscisic, gibberellin, ethylen. Các chất điều hòa tăng trưởng là tối cần thiết cho việc cảm
ứng tạo phôi và mỗi chất điều hịa tăng trưởng thì lại có những tác dụng lên việc tạo phơi
khác nhau trên những lồi thực vật khác nhau và ở những nồng độ khác nhau. Quá trình
18


cảm ứng hình thành phơi vơ tính ở những lồi thực vật khác nhau cho thấy có 3 kiểu ảnh
hưởng của chất điều hịa tăng trưởng đối với phơi:
1) Sự hiện diện của chất điều hòa sinh trưởng là cần thiết trong tất cả các giai đoạn
phát triển của phôi.
2) Chất điều hòa tăng trưởng cần thiết trong giai đoạn cảm ứng, tuy nhiên, sang

đến giai đoạn phát triển cao hơn thì các chất điều hịa này cẩn phải được loại bỏ
3) Sự hình thành phơi vơ tính chỉ xuất hiện khi có sự có mặt của chất điều hịa tăng
trưởng, nhưng khi phơi vơ tính phát triển sau giai đoạn hình cầu thì sự có mặt của chất
điều hịa khơng cịn tác dụng nữa.
Chất điều hịa tăng trưởng là auxin, thường là 2,4-D và NAA được sử dụng trong
hơn 50% và 25% trường hợp cảm ứng tạo phôi (Evans và cộng sự, 1983; Litz và Gray,
1992). Có những sự khác biệt ở mức tế bào và mức độ phôi trong hoạt động phân chia
tế bào của các tế bào phơi vơ tính và tế bào mơ sẹo, cũng như là những sự khác biệt trong
sự phát triển hình thái của phơi vơ tính được cảm ứng trên những chất auxin khác nhau
( Rodrigeuz và Wetztein, 1998).
Auxin được chứng tỏ cho thấy có một tác dụng tích cực khi được sử dụng kết hợp
với cytokinin và TDZ. Tuy nhiên ở nồng độ auxin cao thường hạn chế sự phát triển của
phơi vơ tính trong những giai đoạn đầu tiên của sự phát triển phơi.
Cytokinin cũng có những tác dụng tương đối lên sự hình thành phơi, nhưng nó
khơng có những tác dụng đáng kể. Mặc dù vậy, sự kết hợp của cả auxin và cytokinin cho
thấy nhiều thuận lợi để đạt được hiệu quả cảm ứng phôi tối đa trên một số loài (Cruz và
cộng sự, 1990; Nishi, 1997). Tuy nhiên hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu sự dụng TDZ,
chất điều hịa tăng trưởng thuộc nhóm cytokinin, nhằm mục đích cảm ứng tạo phơi vơ
tính ở một số thực vật hai lá mầm (Murthy và cộng sự, 1998). Vì vậy trong những năm
gần đây việc sử dụng TDZ đã trở nên phổ biến.
Mơi trường khơng có hormone thường được sử dụng cho sự phát triển của phơi vơ
tính từ dạng hình cầu cho tới khi phát triển thành cây con. Đôi khi, những nồng độ thấp
của hormone trong môi trường cần cho sự biểu hiện hoặc trong môi trường cần cho sự
phát triển thì có thể có lợi, thậm chí là bắt buộc phải có, tùy theo lồi, để kích thích sự
phát triển bình thường của phơi.
Tóm lại, để cảm ứng tạo một cấu trúc lưỡng cực cần phải có tín hiệu của một loại
hormone. Ngược lại, để cảm ứng tạo cơ quan thì phải có hai tín hiệu hormone khác nhau:
đầu tiên là tạo chồi, sau đó tạo rễ, sử dụng hai môi trường khác nhau. Để những tế bào
phơi phát triển bình thường thành những cây con thì cần một mơi trường khác, có hoặc
khơng có hormone.

19


- Thời gian xử lý
Khoảng thời gian mẫu cấy được xử lý với chất điều hòa tăng trưởng là một nhân tố
quan trọng trong việc cảm ứng cũng như hình thành phơi vơ tính một cách bình thường.
Khi mẫu cấy được chuyển sang mơi trường khơng có nhân tố tăng trưởng, một khoảng
thời gian tối thiểu là 8 ngày rất cần thiết cho việc cảm ứng hình thành phơi với một hiệu
quả rất cao mà không cần quan tâm đến dạng chất điều hòa tăng trưởng đã sử dụng.
- Sự tương quan giữa độ tuổi của mẫu cấy và sucrose
Thường thì độ tuổi hay giai đoạn phát triển của mẫu cấy (Karunaratne và cộng sự,
1991) là một nhân tố quan trọng trong cảm ứng tạo phơi. Do đó, sự phát triển tối đa hay
độ tuổi sinh lý của mẫu cấy là một nhân tố chủ yếu trongcảm ứng tạo phôi có hiệu quả ở
một số lồi thực vật. Hơn nữa, nguồn dinh dưỡng cơ bản cần thiết cho các loại mơ thì
khác nhau đáng kể tùy vào độ tuồi phát triển. Bên cạnh đó, sự ảnh hưởng của các chất
kích thích tăng trưởng khác nhau đến các loại mơ khác nhau thì phụ thuộc nhiều vào
nồgn độ sucrose có trong môi trường nuôi cấy Một nồng độ sucrose cao (4-6%) được bổ
sung ở giai đoạn cảm ứng và phát triển của phơi thì rất có lợi cho việc tạo phơi ở một số
lồi thực vật.
- Nồng độ mơi trường
Nồng độ của các thành phần trong mơi trường cơ bản có ảnh hưởng đến việc cảm
ứng tạo phơi vơ tính. Hầu hết các nghiên cứu tạo phôi trên môi trường MS đều cho hiệu
quả tạo phôi cao. Nồng độ môi trường càng lỗng thì khả năng tạo phơi càng kém.
- Trạng thái của mơi trường
Sự tạo thành phơi vơ tính thường được cảm ứng trên môi trường bán rắn. Tuy nhiên,
trạng thái của mơi trường (bán rắn hay lỏng) thì rất quan trọng trong việc duy trì và làm
tăng cường sự phát triển của phơi vơ tính. Sự cảm ứng tạo phơi vơ tính của Gossypium
klotzschiapum trên mơi trường MS lỏng có bổ sung vitamin B, có chứa các chất điều hòa
tăng trưởng cho thấy đạt hiệu quả cao. Ở Lilium longiflorum, kết quả tương tự cũng được
phát hiện.

- Kiểu gen
Một vấn đề thường gặp trong cảm ứng tạo phôi nữa là sự phụ thuộc rất lớn vào loại
cây trồng và kiểu gen. Kiểu gen có một ảnh hưởng to lớn trong việc cảm ứng tạo phơi
của hầu hết các lồi thực vật. Không phải tất cả các thực vật đều có khả năng cảm ứng
tạo phơi. Đối với những cây tự thụ phấn, những giống cây khác nhau thì khả năng phát
sinh phơi vơ tính cũng có thể khác nhau.

20


Đã có các thí nghiệm khác nhau tiến hành trên các lồi có kiểu gen khác nhau để
khảo sát khả năng hình thành phơi vơ tính. Chẳng hạn như ở cây Asparagus, người ta đã
quan sát khả năng tạo phôi vơ tính trên các giống có kiểu gen khác nhau (Hisato và
Masahiro, 1998). Delbreil và Julien (1994) đã mô tả những khác biệt quan sát được từ
tần suất tạo phôi từ chồi đỉnh của 12 giống Asparagus có các kiểu gen khác nhau.
Những khác biệt về tần suất hình thành phơi ở các lồi đa bội (lưỡng bội, tứ bội)
cũng đã được phát hiện (Kunitake và cộng sự, 1992). Haensch và cộng sự (1996) đã quan
sát khả năng hình thành phơi vơ tính và tái sinh cây ở những giống Lilium có kiểu gen
khác nhau.
- Cường độ chiếu sáng
Các nhân tố khác trong môi trường nuôi cấy như là cường độ ánh sáng cũng có ảnh
hưởng đến việc cảm ừng tạo thành phơi vơ tính. Các nghiên cứu cũng đã báo cáo về
những ảnh hưởng khác nhau của chế độ sáng và tối. Nhìn chung, chế độ tối đã cho thấy
có những ảnh hưởng tốt hơn trong giai đoạn cảm ứng. Ở một số loài thực vật, sự cảm
ứng cần có những điều kiện ủ trong tối. Những điều kiện trong tối có thể được tạo bằng
cách bao mơi trường nuôi cấy bằng những tấm nhôm mỏng hoặc đặt chúng trong hộp
carton. Những nghiện cứu tạo phơi vơ tính ở loài Gossypium kltzschianum và
L.longiflorum đạt được kết quả tốt khi nuôi cấy trong tối (Yuqiang Sun và cộng sự, 2003;
Tribulato, 1997).
1.4. Sơ lược về tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro ở tỏi

1.4.1. Nhân giống in vitro cây tỏi bằng con đường phát sinh cơ quan trực tiếp
Vào đầu những năm 1980 đã có những nghiên cứu đầu tiên về nhân giống in vitro
cây tỏi được thực hiện ở nhiều nơi trên thế giới với nhiều giống tỏi khác nhau. Tiêu biểu
là nghiên cứu của Sant S. Bhojwani vào năm 1980, nhân giống in vitro cây tỏi bằng cách
sinh chồi thực hiện trên cây tỏi thương mại New Zealand kết quả cho thấy trên môi
trường B-5 bổ sung 0,5 mg/l 2-ip và 0,1 mg/l NAA sau 6 tuần số chồi đã tăng lên 8 lần
vào thì lệ hình thành cây là 70%. [27]
Sau đó Conci chỉ ra răng sự kết hợp auxin ở tỷ lệ cao hơn dẫn đến sự phát sinh và
sinh trưởng tốt hơn ở chi A. sativum (Conci và cộng sự, 1986).
Nagakubo là người đầu tiên báo cáo sự hình thành củ tỏi trong ống nghiệm trên
mơi trường cơ bản LS. Sau đó, Zet đã ghi nhận củ tỏi được tạo ra trong môi trường B-5
bổ sung sucrose 8 %.(Nagakubo và cộng sự,1993; Zet và cộng sự,1997).
Ở những năm tiếp theo Haque đã công nhận khả năng phát sinh cơ quan trong nuôi
cấy in vitro ở cây tỏi (Haque và cộng sự, 1998).

21


Dưới đây là bảng thống kê những nghiên cứu đã được thực hiện trên Allium sativum
L. về nhân giống trực tiếp in vitro
Bảng 1.1 Nghiên cứu in vitro tái sinh cơ quan trực tiếp trên Allium sativum L.
Bộ phận
Củ
Đỉnh chồi
Đỉnh chồi
Đỉnh chồi

Mơi trường(mg/l)
B5 + 0,5 2-iP + 0,1 NAA
MS+0,57µM IAA+0,46 µM Kn

MS+ 8,9 µM 2-iP+1,7µM NAA
LS+ 5µM NAA + 10µM BA + 56,5 mM KNO 3
+3,5mM NH4Cl
LS
MS + 8µM BA + 0,1 µM NAA

Thân

Tác giả
Bhojwwanii(1980)
Conci et al.(1986)
Nagakubo et al
(1993)
Mohamed-Yasseen
et al.(1994)
Ma et al.(1994)

MS + 0,5 NAA + 0,5 Kn
MS + 1 µM NAA + 10 µM BA
Rễ
Haque et al.(1997)
MS
B5 + 5 µM JA + 5 µM 2iP
Thân rễ
Zet et al.(1997)
B5 + 8% sucrose
MS + 0,5 µM BA
Đỉnh rễ
Haque et al.(1998a)
MS + 12% sucrose

Củ
MS + 0,5 2-iP + 0,25 NAA
Roksana et al.(2002)
Liquid MS +0,5 2iP+2% sucrose
Rễ
Kim et al.(2003)
Liquid MS + 0,1 NAA + 11% sucrose + 10 µM JA
Chú thích: AC: than hoạt tính; B5: Mơi trường ni cấy của Gamborg (Gamborg và
cộng sự,1968); JA: axit Jasmonic; LS: Linsmaier and Skoog medium ( Linsmaier and
Skoog, 1965) ;
1.4.2. Nhân giống in vitro cây tỏi bằng con đường phát sinh cơ quan gián tiếp
Tạo cây in vitro thơng qua hình thức phát sinh callus hay phơi vơ tính đã được
nghiên cứu từ những năm 1988, thông qua nghiên cứu đầu tiên về phát sinh callus và tái
sinh cây của Nagaswa và Finer (1988). Tiếp theo sau là những nghiên cứu để tối ưu
những tác nhân ảnh hưởng tới hình thành callus cũng như tái sinh cây hoàn chỉnh với
nhiều giống tỏi khác nhau trên khắp thế giới.
Đến đầu những năm 2010, mới có một nghiên cứu chun sâu về hình thành phơi
vơ tính và tái sinh cây hoàn chỉnh được thược hiện bởi Nasim và cộng sự (2010) [35].
Toàn bộ những nghiên cứu tiêu biểu về in vitro tạo cơ quan gián tiếp của Allium
sativum L. được thống kê theo bản sau:
22


Bảng 1.2 Những nghiên cứu về in vitro tạo cơ quan gián tiếp Allium sativum L.
Bộ phận

Môi trường(mg/l)

Chồi

MS + 0.3 2,4-D

Tác giả
Nagasawa and Finer
(1988)

B5 + (4,7 µM picloram + 0,49 µM 2iP) or
Myers and Simon
Chồi
4,5 µM 2,4-D
(1998)
B5 + 1,4 µM picloram +13,3µM BA
MS + 1 2,4-D
Al-Zahim et al.
Thân rễ
MS + 1 IAA + 10 2iP
(1999)
MS + 0,3 ppm 2,4-D
Barandiaran et al.
Chồi
MS + 3 ppm BA
(1999a)
N6 + 2,2 µM 2,4-D
Robledo-Paz et al.
Đỉnh chồi
MS + 4,5 µM 2,4-D + 4,6 µM Kn
(2000)
Củ
MS + 4,44 µM NAA + 0,54 µM BA
Parisi et al. (2002)

Mơ phân sinh
BDS + 0,45 µM 2,4-D + 4,43 µM BAP
Luciani et al. (2006)
Thân rễ
MS + 1 BAP + 0,25 2,4-D
Nasim et al. (2010)
Chú thích: BDS: BDS medium ( Dunstan and Short,1977); Ca: Callus; Em: Somatic
embryo; JA: Jasmonic acid; N6: Nitsch’s basal medium (Nitsch,1969).

23