Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu hạn ở lúa Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
----------------

NGUYỄN THỊ AN TRANG

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN
GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở
LÚA VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

HÀ NỘI 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
----------------

NGUYỄN THỊ AN TRANG

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN
GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở
LÚA VIỆT NAM
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học
TS. Lã Tuấn Nghĩa

HÀ NỘI 2012


Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Công nghệ sinh hoc

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong luận văn này.
Mọi kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao chép từ các
nghiên cứu khác. Các số liệu, sơ đồ kết quả của luận văn này chưa từng được cơng
bố.
Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!
Học viên

Nguyễn Thị An Trang

Nguyễn Thị An Trang

Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Công nghệ sinh hoc

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Lã Tuấn
Nghĩa, TS. Lê Thanh Hà người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và chỉ bảo và hỗ
trợ tơi trong suốt q trình cơng tác cũng như trong thời gian học tập, nghiên cứu

và hồn thành luận văn này.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới các thầy cô và cán bộ công tác tại Viện Công
nghệ Sinh học thực phẩm, Viện Đào tạo Sau Đại học- Trường Đại học Bách khoa
Hà Nội đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt q trình học tập
tại trường.
Tơi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, anh chị em trong Bộ môn Đa dạng
sinh học nông nghiệp – Trung tâm tài nguyên thực vật đã giúp đỡ và động viên tôi
trong q trình cơng tác và thực hiện luận văn.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè và
người thân đã động viên, khuyến khích giúp tơi vượt qua những khó khăn trong suốt
q trình nghiên cứu.
Luận văn này được thực hiện với nguồn kinh phí từ chương trình Cơng nghệ
sinh học nơng nghiệp.
Hà nội, ngày 19 tháng 2 năm 2013
Học viên

NGUYỄN THỊ AN TRANG

Nguyễn Thị An Trang

Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Công nghệ sinh hoc

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................4
1.1.Giới thiệu chung về cây lúa .............................................................................4
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây lúa .................................................................4
1.1.2. Nguồn tài nguyên lúa Việt Nam .................................................................6
1.2. Hạn hán và cơ chế chống chịu hạn ở thực vật .............................................8
1.2.1. Khái niệm và phân loại hạn hán .................................................................8
1.2.2. Phân loại hạn hán đối với cây trồng ...........................................................8
1.2.3. Cơ sở di truyền của tính chịu hạn ...............................................................9
1.2.4. Ảnh hưởng của hạn hán đối với cây lúa ...................................................10
1.2.5. Phản ứng của cây lúa với hạn hán ............................................................11
1.3. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền ......................................12
1.3.1. Đa dạng di truyền .....................................................................................12
1.3.2. Chỉ thị hình thái ........................................................................................13
1.3.3. Chỉ thị hóa sinh.........................................................................................14
1.3.4. Chỉ thị phân tử ADN ................................................................................15
1.4. Thành tựu trong nghiên cứu đa dạng di truyền lúa ..................................22
1.4.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hình thái .........................23
1.4.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hóa sinh ..........................25
1.4.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị ADN ...............................25
1.5. Nghiên cứu lúa chịu hạn trên thế giới và Việt Nam ..................................26
1.5.1. Nghiên cứu lúa chịu hạn trên thế giới ......................................................26
1.5.2. Nghiên cứu lúa chịu hạn ở Việt Nam .......................................................28
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................30
2.1. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................30
Nguyễn Thị An Trang

Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Công nghệ sinh hoc

2.1.1. Các giống lúa nghiên cứu ........................................................................30
2.2. Hóa chất và thiế bị nghiên cứu ................................................................32
2.3.Phương pháp nghiên cứu ..............................................................................34
2.3.1. Đánh giá khả năng chịu hạn của dòng/giống lúa trong điều kiện phòng thí
nghiệm. ...............................................................................................................34
2.3.2. Tách chiết ADN tổng số từ lá lúa .............................................................36
2.3.3. Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ ADN ...................................................37
2.3.4. Nhận dạng di truyền các giống lúa bằng chỉ thị SSR ...............................37
2.4. Phân tích xử lý số liệu ...................................................................................39
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................41
3.1. Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng/giống lúa trong phịng
thí nghiệm. ............................................................................................................41
3.1.1 Kết quả đánh giá tỷ lệ nảy mầm, tỷ lệ rễ mầm đen (héo) ở giai đoạn nảy
mầm. ...................................................................................................................41
3.1.2. Đánh giá mức độ chống chịu hạn của 50 dòng/giống lúa ........................44
3.2. Kết quả đánh giả khả năng chịu hạn ở giai đoạn mạ ................................46
3.2. Kết quả tách chiết ADN tổng số ..................................................................48
3.3. Kết quả phản ứng PCR và phân tích đa hình trên gel polyacrylamide ..49
3.4. Quan hệ di truyền liên quan đến tính chịu hạn của các dòng/giống lúa .....56
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................64
4.1. Kết luận ..........................................................................................................64
4.2. Kiến nghị ........................................................................................................64

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................65
PHỤ LỤC

Nguyễn Thị An Trang

Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Công nghệ sinh hoc

DANH MỤC VIẾT TẮT

ABA

: Abcisis acid

AND

: Acid Deoxyribonucleic

AFLP (Amplified Fragment Length

: Đa hình chiều dài đoạn khuếch đại

Polymorphism)
bp (Base pair)

: Cặp bazơ nitơ

Chr

: Nhiễm sắc thể

cs.

: Cộng sự

CSGE

: Conformation Sensitive Gel
Electrophoresis

CTAB

: Cetyltrimethyl Amonium Bromide

DAMD-PCR

: Direct Amplification of Minisatellite

EDTA

: Cetyltrimethyl Amonium Bromide

IRRI

: Viện nghiên cứu lúa quốc tế

ISSR

: Inter Simple Sequencen Repeat

Kb

: Kilo base

LED

: Late embryogenesis abundant

MAS

: Marker Assisted Selection

TT

: Thứ tự

PCR (Polymerase Chain Reaction)

: Phản ứng chuỗi trùng hợp

PIC (Polymorphism Information

: Chỉ số thơng tin đa hình của mồi

Nguyễn Thị An Trang

Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Công nghệ sinh hoc

Content)
QTL (quantity trait loci)

Locus kiểm sốt tính trạng số lượng

RAPD( RADNom Amplified

: Đa hình ADN khuếch đại

Polymorphic DNA)
RFLP (Restriction Fragment Length

: Đa hình chiều dài đoạn phân cắt

Polymorphism)
SCARs

: Sequence Characterized Amplified Regions

SDS

: Sodium Dodecyl Sulphate

SNP (Single Nucleotide

:Hiện tượng đa hình nucleotit đơn

Polymorphism )
SSR (Simple sequence repeat)

: Trình tự lặp đơn giản

STMS

: Sequence – tagged microsatellite marker

TBE

: Tris-Boric Acid-EDTA

EDTA

: Tris-EDTA

Nguyễn Thị An Trang

Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Công nghệ sinh hoc

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1.
Bảng 2.2.
Bảng 2.3.
Bảng 2.4.
Bảng 2.5.
Bảng 2.6.
Bảng 3.1.
Bảng 3.2.
Bảng 3.3.
Bảng 3.4.
Bảng 3.5.
Bảng 3.6.

Danh sách 50 mẫu dòng/ giống lúa trong nghiên cứu.................................30
Danh sách 32 cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu ...............................32
Thang điểm đánh giá mức chống chiu hạn của lúa sau khi xử lý
Saccarin1% và KClO3(3%)...........................................................................35
Thành phần phản ứng PCR (thể tích phản ứng 20µl/tube) .........................37
Các bước phản ứng trong máy PCR.............................................................38
Thành phần gel polyacrylamide 8% .............................................................38
Tỷ lệ nảy mầm, tỷ lệ rễ mầm đen khi xử lý bằng dung dịch đường Saccarin
1 % và KClO3 3 %.........................................................................................42
Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của 50 dòng/giống lúa ở giai đoạn mạ
khi xử lý bằng dung dịch KClO3 (3%) trong 7 ngày...................................47
Số băng ADN, số alen thể hiện, hệ số PIC của các chỉ thị nghiên cứu ......50
Tỷ lệ khuyết số liệu và dị hợp tử của các dòng/giống lúa nghiên cứu .......54
Một số kết quả phân tích đa dạng di truyền SSR trên cây lúa đã được
công bố ...........................................................................................................56

Bảng ma trận tương đồng giữa 50 mẫu giống lúa nghiên cứu ...................59

Nguyễn Thị An Trang

Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Công nghệ sinh hoc

DANH MỤC HÌNH
Sơ đồ tiến hóa hai lồi lúa trồng ........................................................................ 5
Đa hình ADN SSR giữa hai cá thể có motif (AT)n ........................................20
Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm .....................41
Đồ thị biểu diễn mức độ chống chịu hạn của 50 dòng/giống lúa ở giai đoạn
nảy mầm ............................................................................................................45
Hình 3.3. Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu hạn giai đoạn mạ...................................46
Hình 3.4. Hình ảnh nhận dạng ADN tổng số của các mẫu dịng/giống lúa ..................48
Hình 3.5. Kết quả nhận dạng di truyền 50 dòng/giống lúa bằng chỉ thị RM231 ..........49
Hình 3.6. Kết quả nhận dạng di truyền 50 dịng/ giống lúa bằng chỉ thị RM201. ........49
Hình 3.7. Kết quả nhận dạng di truyền của 50 dòng/giống lúa bằng chỉ thị RM240. ..49
Hình 3.8. Kết quả nhận dạng di truyền của 50 dịng/giống lúa bằng chỉ thị RM255. ..50
Hình 3.9. Kết quả nhận dạng di truyền 50 dòng/giống lúa bằng chỉ thị RM261 ..........50
Hình 3.10. Sơ đồ hình cây quan hệ giữa các giống ..........................................................61
Hình 1.1.
Hình 1.2.
Hình 3.1.
Hình 3.2.

Nguyễn Thị An Trang

Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Công nghệ sinh hoc

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Lúa trồng (Oryza sativ L.) là cây lương thực lâu đời và phổ biến nhất trên thế
giới [50] . Cây lúa được gieo trồng tại 114 quốc gia, tập trung chủ yếu ở Châu Á, Phi,
Mỹ Latinh. Đây là những nước có tỷ lệ dân số tăng cao do vậy nhu cầu về lúa gạo
ngày càng tăng. Tuy nhiên ở các nước này, đặc biệt là các nước Châu Á, diện tích
trồng lúa đang giảm nhanh do sự mở rộng các vùng dân cư, các khu cơng nghiệp và
giao thơng. Thêm vào đó, các điều kiện bất lợi của môi trường như lũ lụt, hạn hán,
xâm nhập mặn… cũng là nguyên nhân chính làm cho sản lượng lúa suy giảm [2].
Theo đánh giá của các nhà chun mơn, khơ hạn sẽ là yếu tố chính gây ảnh
hưởng đến an ninh lương thực thế giới, nó có thể làm giảm tới 70% năng suất cây trồng
nói chung [30] . Tại Châu Á, hàng năm có 46 nghìn ha diện tích đất canh tác nhờ vào
nước trời ( mưa tự nhiên). Tuy nhiên do sự biến đổi khí hậu sẽ làm thay đổi tình hình
phân phối lượng mưa và làm gia tăng tỷ lệ các diện tích khô hạn ở những vùng đất
nông nghiệp chủ chốt[85]. Bên cạnh đó, nhu cầu sản lượng gạo ngày một tăng, theo
báo cáo của FAO cho những năm 1990 – 2025 thì lúa gạo sản xuất mỗi năm phải
tăng 21% để đáp ứng nhu cầu lương thực cho 1,7% dân số tăng mỗi năm.
Việt Nam là một nước đang phát triển, sản xuất nông nghiệp đang chiếm tỷ
trọng lớn trong nền kinh tế quốc dân. Đồi núi chiếm 3/ 4 diện tích lãnh thổ, ở những
vùng đồi núi nơng nghiệp chủ yếu là đất dốc, kém màu mỡ và chưa có hệ thống
tưới tiêu chủ động, canh tác lúa và lương thực chủ yếu nhờ vào nước trời (rainfed).

Do vậy cây trồng ở những vùng này năng suất thấp và bấp bênh. Tuy nhiên để cân
đối lương thực trong cả nước giữa miền xi và miền núi thì cây lúa vẫn là cây
trồng chủ đạo trong nền nông nghiệp giúp cho sự ổn định về kinh tế và canh tác
định cư ở những vùng này.
Trước tình hình đó, chọn tạo các giống lúa chịu hạn phù hợp với tập quán và
điệu kiện canh tác ở các vùng địa phương đang được nhà nước đầu tư. Nhiều cơng
trình nghiên cứu về tính chống chịu hạn ở lúa được công bố và một số giống lúa
chịu hạn (CH133, CH1, CH2, LC93 -1 …) đã được chọn tạo đem lại lợi ích kinh tế Nguyễn Thị An Trang

1

Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Công nghệ sinh hoc

xã hội cao. Tuy vậy, phương pháp chọn giống chịu hạn chủ yếu vẫn là truyền thống,
tốn nhiều công sức, thời gian và chưa đảm bảo độ tin cậy lâu dài vì sự lựa chọn chỉ
được đánh giá qua biểu hiện hình thái.
Ngày nay, nhờ vào tiến bộ của công nghệ sinh học nên công tác chọn tạo giống
đã trở nên hiệu quả hơn. Trong đó, ứng dụng chỉ thị phân tử như RAPD, SSR,
RFLP, AFLP được nghiên cứu và phát triển để trở thành cơng cụ mạnh mẽ để phân
tích đa dạng di truyền và xác định được sự khác biệt về mặt di truyền của quần thể
giống khời đầu, từ đó xác định được các cặp lai có khoảng cách di truyền phù hợp
có thể cho ưu thế lai cao nhất. Việc tiếp cận ở mức độ phân tử cho phép đánh giá
các giống bố mẹ một cách chính xác, không bị tác động bởi điều kiện ngoại cảnh,
rút ngắn thời gian và nâng cao hiệu quả công tác lai tạo. Vì vậy, chúng tơi tiến hành
thực hiện đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu

hạn ở lúa Việt Nam”.
2. Mục đích của đề tài
Kết hợp phân tích đa dạng di truyền các dịng/giống lúa sử dụng chỉ thị phân
tử SSR và tính chịu hạn của các dịng/giống lúa nghiên cứu nhằm góp phần quan
trọng cho việc khai thác nguồn gen chịu hạn và định hướng cho chọn tạo giống lúa
chịu hạn ở Việt Nam.
3. Nội dung nghiên cứu của đề tài
- Đánh giá khả năng chịu hạn của các mẫu dòng/giống lúa nghiên cứu.
- Nhận dạng di truyền các mẫu dòng/giống lúa nghiên cứu bằng chỉ thị phân
tử SSR.
- Phân tích, đánh giá sự đa dạng di truyền của các mẫu dòng/giống lúa bằng
chỉ thị SSR.
- Mối liên kết giữa kiểu gen và kiểu hình về khả năng kháng hạn của các mẫu
dịng/giống lúa.
Kết quả của đề tài góp phần xác định và phân loại nguồn gen lúa chịu hạn, tạo
nguồn vật liệu cho công tác chọn tạo giống chống chịu hạn cũng như công tác bảo
tồn nguồn gen.
Nguyễn Thị An Trang

2

Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Công nghệ sinh hoc

4. Đối tượng nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Trong nghiên cứu này chúng tơi sử dụng 50

dịng/giống lúa làm vật liệu nghiên cứu được cung cấp bởi Ngân hàng gen cây trồng
Quốc gia – Trung tâm Tài nguyên thực vật.
- Địa điểm thực hiện nghiên cứu: Đề tài nghiên cứu của chúng tôi được thực
hiện tại Bộ môn Đa dạng sinh học Nông nghiệp – Trung tâm tài nguyên thực vật.

Nguyễn Thị An Trang

3

Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Công nghệ sinh hoc

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Giới thiệu chung về cây lúa
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây lúa
Cây lúa (Oryza sativa L) còn được gọi là lúa Châu Á vì nó được thuần hóa từ
lúa dại ở ba trung tâm đầu tiên vùng Đông Nam Á: Assam (Ấn Độ), biên giới Thái
Lan- Myanmarr, trung du Tây Bắc Việt Nam Theo tài liệu của Trung Quốc thì
khoảng năm 2800- 2700 TCN, ở Trung Quốc đã có nghề trồng lúa[17]. Markey và
De CADNolle, Roievich cho rằng nguồn gốc cây lúa trồng là Miền Nam Việt Nam
và Campuchia. Gutschin cho rằng cái nôi của nghề trồng lúa là ở chân dãy Himalaya
đổ xuống các vùng đồng bằng Bengale, Assam, Thái Lan vì ở vùng này có nhiều
loại lúa hoang dại và các giống lúa trồng phong phú [3].
Tuy có nhiều các tài liệu khác nhau, các khảo cổ đã chứng minh nguồn gốc

khác nhau của cây lúa nhưng đa số các tài liệu đều cho rằng nguồn gốc cây lúa là ở
vùng đầm lầy Đông Nam Á, có thể thuộc nhiều quốc gia khác nhau, sau đó do khí
hậu nhiệt đới nóng ẩm cây lúa đã nan rộng ra các vùng khác nhau [13] .
Lúa thuộc ngành thực vật có hoa (Angios Permes), lớp một lá mầm (Mono
Cotyledones), bộ hịa thảo có hoa (Graminales), họ hịa thảo (Graminae), lúa trồng
thuộc chi Oryza (có 24 hoặc 48 nhiễm sắc thể), có 23 lồi phân bố khắp thế giới
trong đó có hai lồi lúa trồng. Lồi Oryza sativa L. trồng phổ biến trên thế giới và
phần lớn tập trung ở Châu Á bao gồm ba loài phụ: Japonica phân bố ở những nơi có
vĩ độ cao (Bắc Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên), chịu rét cao, ít chịu sâu bệnh.
Indica (được trồng ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới như Việt Nam, Thái Lan,
Ấn Độ, Mianma), có đặc điểm hạt dài, thân cao, mềm dễ đổ, chịu sâu bệnh, năng
suất thấp, mẫn cảm với ánh sáng. Javanica có đặc điểm trung gian, hạt dài, dày và
rộng hơn hạ Indica, chỉ được trồng ở vài nơi thuộc Indonesia [13].
Theo điều kiện sinh thái, cây lúa chia làm hai loại, lúa cạn và lúa nước. Lúa
cạn được trồng vào mùa mưa trên đất cao, đất thoát nước tự nhiên, trên những chân
ruộng khơng đắp bờ hoặc khơng có bờ và khơng có nước dự trữ trên bề mặt.
Nguyễn Thị An Trang

4

Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Công nghệ sinh hoc

Theo nghiên cứu của nhiều tác giả thì lúa cạn do lúa nước biến đổi thành và
những giống lúa này có khả năng trồng được ở những vùng khơ hạn, vẫn có khả
năng sinh trưởng phát triển bình thường trên ruộng có nước. Đây là một đặc tính

nơng học của lúa cạn, khác với cây lúa trồng khác.
Hiện nay có thể chia lúa cạn thành hai nhóm:
- Nhóm lúa cạn cổ truyền: Bao gồm những giống lúa cạn địa phương, thích
nghi cao và tồn tại lâu đời, tính chống chịu cao, tuy nhiên giống lúa này có hạn chế
là năng suất thấp.
- Nhóm lúa khơng chủ động nước hoặc sống nhờ nước trời: Loại này được
phân bố trên những nương bằng, chân đồi thấp có độ dốc dưới 50. Đây là những
giống lúa cạn mới lai tạo, có khả năng chịu hạn trong những giai đoạn sinh trưởng
nhất định, hiệu suất sử dụng nước và tiềm năng năng suất cao [27].
Năng suất của các giống lúa cạn thường thấp do hai nguyên nhân chủ yếu:
Giống xấu và đất nghèo dinh dưỡng, phát triển trên những vùng dân trí thấp và điều
kiện canh tác kém [27]. Tuy năng suất lúa cạn không cao, trung bình đạt 15 tạ/ha,
những cây lúa cạn đã góp phần vào tổng sản lượng lúa một cách đáng kể (từ 20%40% ở những vùng sản suất lương thực khó khăn), góp phần giải quyết lương thực
tại chỗ cho nhân dân, giảm được công vận chuyển và chủ động lương thực trong
một khoảng thời gian nhất định, phù hợp với điều kiện nhiều địa phương.
Tổ tiên chung

Nam và Đông Nam Á
Lúa dại đa niên
Lúa dại hàng niên

Tây châu Phi

O. rufipogon

O. longistamina

O. nivara

O. breviligutala

O. sativa indica

O.sativa japonica

O. glaberrima

Hình 1.1. Sơ đồ tiến hóa hai lồi lúa trồng
Nguyễn Thị An Trang

5

Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Công nghệ sinh hoc

1.1.2. Nguồn tài nguyên lúa Việt Nam
Lãnh thổ Việt Nam trải dài trên 15 vĩ độ từ 8-230 vĩ Bắc nên địa hình và khí
hậu đều phức tạp. Địa hình của Việt Nam rất đa dạng, có núi cao ở phía Bắc, vùng
đất cao rộng lớn ở nam Trung Bộ, hai đồng bằng lớn là đồng bằng sông Hồng và
đồng bằng sông Cửu Long.
Việt Nam có 54 dân tộc, mỗi dân tộc có tập qn canh tác và sở thích về phẩm
chất lúa gạo khác nhau. Trong quá trình hình thành và phát triển nền văn minh nông
nghiệp lâu đời, nhân dân ta đã thuần hóa các dạng lúa trồng từ dạng này sang dạng
khác và có thể đã thuần hóa từ lúa hoang dại sang lúa trồng ngày nay. Nhiều nhà
khoa học trên thế giới đã cho rằng Việt Nam là một trong những trung tâm khởi
nguyên của cây lúa trong vùng Đơng Nam Á, Ấn Độ [23].

Có thể nói rằng, sự phong phú về điều kiện tự nhiên, sự đa dạng về thành phần
dân tộc, sự phân bố cư trú ở độ cao khác nhau với những tập quán canh tác khác
nhau và thị hiếu sử dụng lúa gạo khác nhau của từng vùng, từng dân tộc là nguyên
nhân tạo nên sự phong phú đa dạng nguồn gen cây lúa của nước ta [23],[24].
 Tài nguyên lúa hoang dại
Lúa hoang dại hiện được các nhà khoa học chú ý đặc biệt vì chúng cung cấp
một số gen quý giúp cho việc tạo ra giống mới sử dụng trong công nghệ sinh học.
Lúa hoang dại tồn tại rải rác trên lãnh thổ Việt Nam, phổ biến ở đồng bằng Bắc Bộ
và duyên hải miền Trung, do quá trình thâm canh tăng vụ nên lúa dại bị mất dần. Ở
đồng bằng sông Cửu Long lúa dại là nguồn lương thực quan trọng của nhân dân địa
phương. Cho đến thập kỷ 70 của thế kỷ 20, nơng dân Nam Bộ vẫn cịn nghề lượm
lúa dại để lấy gạo ăn. Ở Việt Nam có 4 lồi lúa hoang dại [23].
- Oryza rufipogon: có ở Điện Biên Phủ, Thừa Thiên Huế, đồng bằng sông
Cửu Long. Theo viện nghiên cứu lúa IRRI thì lồi này có nguồn gen chịu chua phèn
cao nhất thế giới.
- Oryza nivaza: Ở tỉnh Đăklăk và dọc biên giới Việt Nam –Campuchia, là
nguồn gen kháng rầy nâu và rầy lưng trắng.
- Oryza oficinalis: Có nhiều ở đồng bằng sơng Cửu Long.
Nguyễn Thị An Trang

6

Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Công nghệ sinh hoc

- Oryza granulata : Ở các tỉnh vùng Tây Bắc, đang được các nhà khoa học

khai thác nguồn gen chịu hạn.
Trải qua thời gian gieo trồng và thuần hóa cây lúa hàng nghìn năm cùng với
sự đa dạng và phong phú về địa lý sinh thái trên toàn lãnh thổ, nhân dân ta đã tạo
nên nguồn tài nguyên lúa trồng đa dạng và phong phú. Việt Nam tồn tại 3 nhóm lúa
địa phương có đặc tính di truyền khác nhau:
- Nhóm lúa Việt –Thái ở vùng núi phía Bắc, chủ yếu là lúa nương. Đây là cây
lương thực chính ni sống các dân tộc ít người, và là một trong những nhóm lúa có
sự đa dạng di truyền cao nhất thế giới.
- Nhóm giống lúa mang đặc tính thâm canh ở vùng đồng bằng sơng Hồng:
+ Lúa Chiêm: có những nguồn gen quý hiếm nổi tiếng thế giới như kháng đạo
ôn, chịu chua phèn, chịu đất nghèo lân, chịu rét trong thời kỳ mạ và thời kỳ lúa trỗ.
Lúa Chiêm tồn tại rất ít trong sản xuất nhưng giá trị của nguồn gen lúa Chiêm là độc
nhất vô nhị.
+ Lúa thơm: cùng với lúa Basmati của Ấn Độ và lúa Khaodak Mali của Thái
Lan là 3 nhóm giống lúa thơm chính trên thế giới.
- Nhóm giống lúa Việt –Kh’mer mang đặc tính quảng canh ở vùng đồng bằng
sông Cửu Long. Đây là nguồn gen về lúa nổi, lúa chịu phèn, mặn, hạt gạo thon dài
thích hợp cho sản xuất phục vụ mục đích xuất khẩu.
Các giống lúa địa phương thường có khả năng thích nghi cao với điều kiện khí
hậu, có khả năng chống chịu tốt, năng suất không cao nhưng ổn định. Thông thường
những giống lúa được gieo trồng trên các vùng đất cao như đất nương thường có
khả năng chịu hạn rất tốt. Ngược lại, các giống lúa được gieo trồng ở vùng đất thấp,
ln có lớp nước trên bề mặt ruộng lúa, khơng có điều kiện rút nước khi mưa lớn,
hoặc rút nước chậm trong một thời gian dài thường có khả năng chịu úng ngập. Bên
cạnh đó, có những giống lúa địa phương cịn có khả năng chịu mặn, chịu phèn,
kháng sâu bệnh... Đó là những nguồn gen quý giá cần được đánh giá và khai thác
nhằm phục vụ cho công tác bảo tồn nguồn gen và tạo nguồn vật liệu cho cơng tác
chọn tạo giống vừa có khả năng chống chịu với những điều kiện môi trường bất lợi
Nguyễn Thị An Trang

7

Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Cơng nghệ sinh hoc

và có năng suất cao [15].
1.2. Hạn hán và cơ chế chống chịu hạn ở thực vật
1.2.1. Khái niệm và phân loại hạn hán
Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nước do môi trường gây
nên trong cả quá trình hay trong từng giai đoạn làm ảnh hướng đến sinh trưởng và
phát triển của cây.
Mức độ khô hạn do môi trường gây nên ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển
của cây, nhẹ thì làm giảm năng suất, nặng thì có thể dẫn đến tình trạng hủy hoại cây
và mùa màng. Theo Robert và cs., (1991)[65] hạn được xem là nhân tố gây thiệt hại
lớn nhất đối với năng suất lúa. Trên thế giới, thiệt hại do khô hạn hằng năm gây ra
đối với sản suất lúa khoảng 1,024 triêu đôla [65].
1.2.2. Phân loại hạn hán đối với cây trồng
 Hạn khơng khí
Hạn khơng khí thường có đặc trưng là nhiệt độ cao (390 - 420C) và độ ấm thấp
nhỏ hơn 65%. Hiện tượng này thường gặp ở những tỉnh Miền Trung nước ta vào
những đợt gió Lào và ở vùng Bắc Bộ vào cuối thu, đầu đông. Hiện tượng này cũng
xuất hiện ở một số nước trên thế giới như gió Chamsin ở Israel, gió Mistral ở miền
nam nước Pháp.. làm ảnh hưởng nghiệm trọng đến một số loại cây trồng như phong
lan, cam, chanh,đậu tương…[11].
Hạn khơng khí ảnh hưởng trực tiếp lên các bộ phận của cây trên mặt đất như
hoa, lá, chồi non… Đối với thực vật nói chung và cây lúa nói riêng thì hạn khơng

khí thường gây ra hiện tượng héo tạm thời, vì nhiệt độ cao, ẩm thấp làm cho tốc độ
thốt hơi nước nhanh vượt q mức bình thường, lúc đó rễ hút nước khơng đủ để bù
đắp lại lượng nước mất, cây lâm vào trạng thái mất cân bằng về nước. Mức độ phản
ứng của cây đới với sự mất nước sẽ tùy thuộc vào giai đoạn phát triển của chúng.
Riêng đối với cây lúa hạn gây ảnh hưởng nghiêm trọng đặc biệt vào thời kỳ bắt đầu
hình thành các cơ quan sinh sản cho đến lúc kết thúc quả trình thụ phấn. Hạn khơng
khí gây thiệt hại nhất ở giai đoạn lúa phơi màu và thậm chí gây nên mất mùa nếu
gặp phải đợt nhiệt độ cao và độ ẩm khơng khí thấp (mặc dù nước trong đất không
Nguyễn Thị An Trang

8

Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Công nghệ sinh hoc

thiếu) làm cho hạt phấn khơng có khẳ năng nảy mầm, q trình thụ tinh khơng xảy
ra và hạt bị nép [11].
 Hạn đất
Mức độ khô hạn của đất tùy thuộc vào sự bốc hơi nước trên bề mặt và khả
năng giữ nước của đất. Hạn đất sẽ làm cho áp suất thẩm thấu của đất tăng cao đến
mức cây không cạnh tranh được nước của đất làm cho cây không thể lấy nước vào
tế bào qua rễ, chính vì vậy hạn đất thường gây nên hiện tượng cây héo lâu dài. Hạn
đất có thể xảy ra ở bất kỳ vùng đất nào và thường xảy ra nhiều ở những vùng có
điều kiện khí hậu, địa hình, địa chất, thổ nhưỡng đặc thù như sa mạc ở Châu Phi,
đất đồi trọc của Châu Á, mùa ít mưa nhất và nhiệt độ thấp ở châu Âu. Tóm lại hạn
đất tác động trực tiếp lên bộ phận rễ của cây làm ảnh hưởng rất lớn đến quá trình

sinh trưởng và phát triển của cây nói chung [11].
 Hạn tồn diện
Hạn tồn diện là hiện tượng khi hạn có cả hạn đất và hạn khơng khí xảy ra
cùng một lúc. Trong trường hợp này cùng với sự mất nước do khơng khí làm cho
hàm lượng nước trong lá giảm nhanh dần đến nồng độ dịch bào tăng lên, mặc dù sức
hút nước từ rễ của cây cũng tăng nhưng lượng nước trong đất đã cạn kiệt khơng đủ
cung cấp cho cây. Hạn tồn diện thường dẫn đến hiện tượng héo vĩnh viễn, cây
khơng có khả năng phục hồi [11]. Ở nước ta, hiện tượng hạn toàn diện thường xảy
ra ở các tỉnh miền Trung (Nghệ An, Quảng Trị…) gây nên thiệt hại đáng kể về nắng
suất lúa vào các tháng cuối hè
1.2.3. Cơ sở di truyền của tính chịu hạn
Sự thể hiện tính chống chịu khơ hạn được quan sát thơng qua những tính trạng
cụ thể như hình thái rễ cây, lá, chồi thân, phản ứng co ngun sinh, bao phấn, q
trình trỗ bơng, v.v.. Những tính trạng như vậy được gọi là tính trạng thành phần
(Component traits). Trong đó người ta nhận thấy rằng cơ chế chống chịu khô hạn
cơ bản là giống nhau ở các loài cây trồng. Đặc biệt sự giống nhau thể hiện ở mức
độ phân tử rõ ràng hơn so với sinh lý học và hình thái học. Do vậy chúng ta có thể
nghiên cứu từ một cây rồi suy diễn ra đối với nhiều cây khác [65].

Nguyễn Thị An Trang

9

Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Công nghệ sinh hoc

Đáp ứng lại hiện tượng stress do khơ hạn, cây trồng có một cơ chế rất tiến bộ
từ việc nhận tín hiệu đến truyền nó đi vào hệ thống tinh vi của tế bào, kích thích
hoạt động của gen mục (Thomashow, 1999; Xiong và cs., 2002) [76, 86]. Chống
chịu khô hạn là tính trạng cực kỳ phức tạp, bị ảnh hưởng bởi sự thể hiện đồng thời
cả một hệ thống gen mục tiêu [76] và bị hạn ảnh hưởng bởi các yếu tố về mơi
trường,vật lý, hóa học (Soltis và Soltis, 2003). Để chống chịu với điều kiện khơ hạn
cây trồng có rất nhiều cách như tăng hàm lượng các chất hòa tan ví dụ như: proline,
trehalose, betaine và mannitol, đóng vai trò như những thể bảo vệ thẩm thấu
(osmoprotestant), trong vài trường hợp, chúng ổn định được các phân tử chức năng
dưới điều kiện bị stress [70], giảm nồng độ các hoocmon kích thích (Auxin,
giberelin, xitokinin), tăng nồng độ các chất ức chế (Abscicis acid (ABA), etylen và
các hợp chất phenol). Hàm lượng ABA tăng kéo theo sự đóng lỗ khí làm giảm
cường độ thoát hơi nước, ABA xúc tiến quá trình tổng hợp protein và amino axit có
tác dụng tăng khả năng giữ nước của tế bào trong điều kiện khô hạn. Protein LEA
(Late embryogenesis abundant) cũng được chú ý trong điều kiện bị stress do thiếu
nước [87]. Protein này có chức năng ổn định màng tế bào [87]. Sự thể hiện của
protein LEA và đặc điểm cấu trúc đại phân tử của nó cho thấy vai trị bảo vệ cây
chống chịu sự mất nước [44]. Nhiều nghiên cứu đã cơng bố rằng có sự thay đổi
biểu hiện của gen khi hạn hán xảy ra đáp ứng với cả stress sinh học và stress phi
sinh học. Bao gồm cả gen liên kết với những chức năng đa dạng như gen MAP
kinase, DREB genes, calcium – dependent protein kinase, endo – 1,3 – glucanase,
nhân tố kéo dài dịch mã [51], và glutathione reductase. Nhiều nghiên cứu đã chứng
minh rằng sự thay đổi biểu hiện của một gen có thể gây ảnh hưởng tới phản ứng
của lúa trong tình trạng thiếu nước hoặc Trehalose – 6- phosphate synthase và
phosphatase chức năng phát triển và tăng trưởng mô phân sinh, Aquaporin chức
năng hoạt động kênh nước, Expansin chức năng điều khiển sự mở rộng của thành tế
bào [52]. Arginine decarboxylase chức năng tạo ra putrescine đóng vai trị bảo vệ.
1.2.4. Ảnh hưởng của hạn hán đối với cây lúa
Nước vừa là sản phẩm khởi đầu, trung gian và cuối cùng là các quá trình
chuyển hóa hóa sinh, vừa là mơi trường để các phản ứng trao đổi được xảy ra. Vì

Nguyễn Thị An Trang

10

Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Công nghệ sinh hoc

vậy việc cung cấp nước cho cây là biện pháp canh tác và hướng nghiên cứu tăng
cường tính chịu hạn của cây trồng là mục tiêu tạo ra giống luôn được quan tâm.
Mức độ thiếu hụt nước càng lớn thì ảnh hưởng càng xấu đến quá trình sinh trưởng
và phát triển của cây. Thiếu nước nhẹ thì giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước
nghiêm trọng sẽ dẫn đến biến đổi hệ keo ngun sinh chất làm tăng q trình già
hóa tế bào. Khi bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào
và mô bị tổn thương và chết [78].
Đối với cây lúa, đặc biệt là lúa nước thì Paleg (1991)[61] cho rằng nếu lượng
nước trong đất chỉ cịn 50% lượng nước cần thiết thì mức độ ảnh hưởng năng suất
phụ thuộc vào giai đoạn phát triển:
- Giảm 1/5 năng suất khi hạn hán xuất hiện vào giai đoạn đẻ nhánh.
- Giảm 1/3 năng suất khi cây lúa đang trong giai đoạn phân hóa làm địng và
trỗ bơng.
- Giảm 2/3 năng suất hay thậm chí là mất mùa hoàn toàn vào giai đoạn cây lúa
đang trỗ bông và thụ phấn.
Trong những năm 1998, 1999 ở Nghệ An, Hà Tĩnh và Quảng Trị năng suất đã
giảm 4/5 ở những diện tích bị hạn trong giai đoạn lúa làm địng. Thậm chí có những
địa phương phải hủy bỏ lúa đang trong thời kỳ đẻ nhánh để cấy lúa lại.
Kháng hạn được định nghĩa như khả năng ra hoa và tạo hạt dưới điều kiện

thiếu nước của cây. Dưới điều kiện bị hạn hán quá trình ra hoa và phát triển bị chậm
lại. Hạn hán xảy ra trước 30 - 10 ngày ảnh hưởng tới bầu nhụy và sự giảm phân của
hạt phấn, hạn hán xảy ra trước 10 - 5 ngày làm chậm lại quá trình kéo dài nhụy và
mô chống đỡ. Sự thay đổi về mặt di truyền ở giai đoạn ra hoa bị chậm lại dưới điều
kiện hạn hán [62].
1.2.5. Phản ứng của cây lúa với hạn hán
Khi gặp hạn bộ lá ngừng phát triển hoặc phát triển chậm để hạn chế sự thoát hơi
nước. Đồng thời phiến lá mỏng hơn, nhiều lông hơn để hạn chế sự tích tụ nhiệt [92].
Phản ứng thiết thực nhất của lúa chịu hạn là đóng khí khổng khi gặp điều kiện
hạn. Điều này có tác dụng hạn chế sự thốt hơi nước nhưng đồng thời nó cũng làm
giảm khả năng quang hợp. Vì vậy, đối với lúa chịu hạn có một đặc điểm thích nghi
Nguyễn Thị An Trang

11

Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Cơng nghệ sinh hoc

đó là nâng cao hiệu suất quang hợp trước khi xảy ra hiện tượng đóng khí khổng khi
gặp điều kiện hạn[92].
Lá có xu hướng cuộn lại và giảm góc độ lá. Điều này có tác dụng làm giảm
cường độ bức xạ trên bề mặt lá tăng cường ánh sáng đi xuống dưới và duy trì trạng
thái thốt hơi nước bề mặt lá ở mức độ tối thiểu [92].
Khi gặp điều kiện hạn axit abcisic (ABA) được tăng cường tổng hợp ở rễ, sau
đó vận chuyển lên lá, đẩy nhanh tốc độ già hóa của lá, đóng khí khổng làm giảm sự
thốt hơi nước. Bên cạnh đó ABA được tăng cường trên lá làm mức độ héo tăng lên

giúp cây tránh bớt được mức độ bức xạ mặt trời trên, làm giảm sử dụng nước và
hiện tượng tăng bề mặt lá [92].
Rễ mọc dài hơn phân bố rộng và sâu hơn vào lớp đất giúp cây lúa tận dụng
nước tầng sâu. Khi bắt đầu gặp điều kiện hạn ở giai đoạn cây con, khối lượng rễ và
tỉ lệ rễ/thân lá tăng lên, sinh nhiều rễ đốt vì rễ đốt có thể đâm sâu vào các lớp đất, do
đó tăng cường khả năng hấp thụ nước đồng thời khi gặp hạn tốc độ dài của rễ lớn
hơn tốc độ dài của lá. Ở các giống lúa chịu hạn (CH5; 103S - R20 và Toitsu). Chiều
dài rễ, số lượng rễ/cây lúa, trọng lượng khô của rễ/cây và tốc độ hút nước của rễ ở
các giống chịu hạn cao hơn nhiều so với giống đối chứng khi có nước trở lại [17].
Bên cạnh đó lúa chịu hạn, thì tế bào rễ có áp suất thẩm thấu cao hơn làm cho sức hút
nước lớn.
Khi gặp hạn, cây có phản ứng giảm chiều cao cây để hạn chế nhu cầu sử
dụng nước, đồng thời hạn chế sự tác động của bức xạ mặt trời, phản ứng thấp cây
cũng làm tăng khả năng chống đổ [92].
1.3. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền
1.3.1. Đa dạng di truyền
Đa dạng sinh học là vấn đề rất được quan tâm hiện nay. Giữ gìn và bảo tồn đa
dạng sinh học là mục tiêu sống cịn trong việc duy trì cân bằng sinh thái, đảm bảo
môi sinh của các sinh vật trên trái đất, trong đó có con người. Khái niệm đa dạng
sinh học được hiểu theo nhiều cấp, đó có thể là sự đa dạng của các quần xã sinh vật
trong hệ sinh thái, là sự đa dạng giữa các loài trong quần xã hay sự đa dạng ở các
Nguyễn Thị An Trang

12

Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Công nghệ sinh hoc

cấp độ di truyền giữa các cá thể trong cùng một loài. Mặc dù là cấp độ thấp nhất,
nhưng đa dạng di truyền lại có vai trị vơ cùng quan trọng trong tiến hóa và thích
nghi của các sinh vật, mọi biến động ở cấp độ đa dạng di truyền đều có tác động
đến những cấp độ cao hơn và cuối cùng là ảnh hưởng đến đa dạng sinh học [72].
Đa dạng di truyền là sự thể hiện phong phú ở nguồn gen và kiểu gen trong
mỗi lồi. Mỗi lồi có một bản đồ nhiễm sắc thể và số lượng nhiễm sắc thể khác
nhau, cho nên hiếm có các cá thể của cũng một lồi hoặc cùng một giống có trật tự
các gen trong hệ gen giống hệt nhau. Trong quá trình tiến hóa, các nhiễm sắc thể
ln biến đổi từ nhiễm sắc thể tâm cân đến nhiễm sắc thể tâm lệch và hơn nữa là sự
có mặt của nhiễm sắc thể kèm. Mỗi một sự biến đổi bên trong của cơ thể đều được
thể hiện ra bên ngoài để tạo ra các dạng khác biệt nhau [12].
Những nghiên cứu trước về mức độ đa dạng di truyền chủ yếu dựa trên các đặc
điểm hình thái. Với các phương pháp phân tích mới, người ta đã thấy rằng biến dị di
truyền bên trong các lồi được cấu trúc có thứ bậc giữa các nhóm có đặc hiệu bên
trong như dưới lồi, thứ và quần thể. Xét về thực chất, mức độ đa dạng di truyền
phụ thuộc vào số lượng và sự khác biệt của các gen bên trong loài. Nếu biến dị xảy
ra giữa các alen bên trong locut và tế bào thì được gọi là dị hợp tử và biến đổi như
vậy ở các tế bào đa bội có thể lơn hơn các tế bào lưỡng bội. Mức độ khác biệt giữa
các locus trong tế bào lớn hay nhỏ phụ thuộc vào việc các gen có được lặp lại trong
hệ gen hay khơng.
Nghiên cứu đa dạng di truyền có vai trị và ý nghĩa rất quan trọng trong chọn
giống. Từ những kết quả đánh giá đa dạng di truyền, các nhà khoa học có thể chọn
lọc và bào tồn các nguồn gen quý nhằm duy trì đa dạng sinh học hoặc hỗ trợ cho
q trình lai tạo giống thơng qua chọn lựa các cặp bố mẹ trong các phép lai nhằm
thu được ưu thế lai cao nhất. Đó là nhân tố giúp cho sinh vật duy trì được nịi giống,
kháng với loại dịch bệnh và thích nghi với những thay đổi trong điều kiện ngoại
cảnh [15].
1.3.2. Chỉ thị hình thái

Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị hình thái là phương pháp đánh

Nguyễn Thị An Trang

13

Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Công nghệ sinh hoc

giá thông qua các đặc điểm hình thái (hình dạng, kích thước, đặc điểm các bộ phận).
Với ưu điểm là dễ dàng tiếp cận, khơng địi hỏi các thiết bị đặc đắt tiền cũng như
quy trình phức tạp. Hiện nay phương pháp này vẫn được sử dụng phổ biến trên cây
trồng để giúp các nhà nghiên cứu phân biệt các giống khác nhau bằng mắt thường.
Tuy nhiên, việc sử dụng chỉ thị hình thái trong phân tích đa dạng di truyền có những
hạn chế: (i): Số lượng các chỉ tiêu hình thái có hạn, chỉ thị hình thái chịu tác động
của mơi trường và phụ thuộc vào giai đoạn nhất định của q trình phát triển, (ii):
Việc đánh giá mang tính chất thống kê nên cần thực hiện với số lượng lớn để đảm
bảo tính chính xác, (iii): Có nhiều tính trạng đa gen quy định mà khơng phải tồn bộ
gen đều biểu hiện ra kiểu hình mà có thể đánh giá được. Vì thế cho đến nay, các nhà
chọn giống thường kết hợp sử dụng các chỉ tiêu hình thái với xác định bằng chỉ thị
sinh hóa và chỉ thị ADN để đạt được kết quả chính xác nhất [4].
1.3.3. Chỉ thị hóa sinh
Protein và các hoạt chất trao đổi khác là sản phẩm của quá trình biểu hiện
gen ở sinh vật. Nghiên cứu sự khác biệt trong thành phần của các sản phẩm này có
thể giúp xác định những khác biệt về mặt di truyền giữa các cá thể và loài khác
nhau. Điện di protein trên gel là phương pháp hữu hiệu có thể giúp phân biệt, nhận

diện giữa các loài và phân loại vi sinh vật. Các protein, sản phẩm trao đồi chất…
được sử dụng như những chỉ tiêu đánh giá, phân biệt các sinh vật được gọi là chỉ thị
hóa sinh. Chỉ thị hóa sinh được sử dụng phổ biến nhất là chỉ thị isozyme (các
enzyme có trình tự amino acid khác nhau những cùng xúc tác cho một phản ứng hóa
học). Isozyme được trích ly, tinh sạch và điện di trên gel. Các thành phần trong gel
biến tính (thường là SDS) phá vỡ các cấu trúc bậc cao của chuỗi amino acid và dưới
tác động của điện trường, các isozyme biến tính sẽ phân tích trên gel dựa trên khối
lượng và độ tích điện. Từ sự đa hình các băng điện di thu được sec giúp nhận diện
từng cá thể và đánh giá được sự đa dạng trong quần thể nghiên cứu.
So với chỉ thị hình thái thì chỉ thị hóa sinh đáng tin cậy hơn bởi mỗi protein
là sản phẩm của một gen, do đó sự đa hình các protein cũng phán ánh gián tiếp sự đa
hình trong kiểu gen của sinh vật. Tuy nhiên, đối với các cá thể có quan hệ di truyền
gần gũi (đặc biệt là giữa các giống cây trồng) thì các sản phẩm biểu hiện gen
Nguyễn Thị An Trang

14

Đại học Bách Khoa Hà Nội


Luận văn Thạc sỹ Khoa học

Công nghệ sinh hoc

(protein, enzyme…) khơng cho sự đa hình rõ ràng. Cho nên loại chỉ thị này cũng
chưa phản ánh thật chính xác bản chất di truyền của mỗi tính trạng. Do đó khả năng
ứng dụng của chỉ thị hóa sinh cịn hạn chế rất nhiều. Bởi vậy trong hầu hết những
nghiên cứu đa dạng di truyền ngày nay, chỉ thị ADN được sử dụng phổ biến hơn cả.
1.3.4. Chỉ thị phân tử ADN
Các chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị dựa trên bản chất đa hình ADN. Nó

được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc
giữa các loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hóa giữa các lồi, dùng để lựa
chọn tổ hợp lai.
Chỉ thị phân tử ADN có thể là một gen hoặc những đoạn ADN đặc hiệu. Chỉ
thị di truyền phân tử có tính ổn định cao và có thể xác định trong tất cả các loại mơ
với độ chính xác cao mà khơng bị ảnh hưởng bởi điều kiện của môi trường. Chỉ thị
phân tử được chia làm hai nhóm chính:
- Chỉ thị dựa trên cơ sở nguyên lý lai ADN: chỉ thị RFLP
- Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN bằng kỹ thuật PCR: RAPD, AFLP, SSR…
1.3.4.1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism- Đa hình chiều dài
đoạn phân cắt giới hạn).
Năm 1980, Botstein và cs đã phát minh ra phương pháp RFLP (đa hình chiều
dài đoạn phân cắt giới hạn).
RFLP là một kỹ thuật nhận dạng ADN bằng cách lai axit nucleic. Nguyên lý
của phương pháp: ADN của bộ gen sau khi cắt bằng enzyme giới hạn sẽ thành
những đoạn có kích thước khác nhau. Khi điện di những đoạn này sẽ phân bố ở
những vị trí khác nhau trên gel, qua biến tính các đoạn này trở thành sợi đơn và
được chuyển lên màng cellulose băng nylon. Trong quá trình lai ADN tiếp theo, nếu
chúng bổ sung với mẫu dò (là một đoạn ADN đã được đáng dấu phóng xạ hoặc hóa
học) thì sẽ cho phản ứng lai. Kết quả của phản ứng lai là chúng ta có thể xác định
được sự đa hình giữa các mẫu ADN khác nhau [10].
Kỹ thuật RFLP đã được các nhà di truyền lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên
cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở người (Botstein và cs. 1980). Chỉ thị
Nguyễn Thị An Trang

15

Đại học Bách Khoa Hà Nội