Nghiên cứu phát triển hệ thống kháng sinh đồ helicobacter pylori bằng phương pháp vi pha loãng kháng sinh

.

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG KHÁNG SINH ĐỒ
HELICOBACTER PYLORI BẰNG PHƯƠNG PHÁP
VI PHA LỖNG KHÁNG SINH

Cơ quan chủ trì nhiệm vụ:

KHOA ĐIỀU DƯỠNG - KTYH

Chủ trì nhiệm vụ:

PHẠM THÁI BÌNH

Thành phố Hồ Chí Minh - 2019

.


.

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG KHÁNG SINH ĐỒ
HELICOBACTER PYLORI BẰNG PHƯƠNG PHÁP
VI PHA LOÃNG KHÁNG SINH
(Đã chỉnh sửa theo kết luận của Hội đồng nghiệm thu ngày 28 / 11 / 2019)

Cơ quan chủ quản
(ký tên và đóng dấu)

Chủ trì nhiệm vụ
(ký tên)

Phạm Thái Bình
Cơ quan chủ trì nhiệm vụ
(ký tên và đóng dấu)

Nguyn Văn B
- 1.


.

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
TP. Hồ Chí Minh, ngày

tháng

năm 2019

BÁO CÁO THỐNG KÊ
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

I. THÔNG TIN CHUNG
1. Tên đề tài: NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG KHÁNG SINH ĐỒ
HELICOBACTER PYLORI BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI
PHA LOÃNG KHÁNG SINH
Thuộc lĩnh vực:
2. Chủ nhiệm nhiệm vụ:
Họ và tên:

PHẠM THÁI BÌNH

Ngày, tháng, năm sinh:

05/02/1974

Học hàm, học vị:

Thạc sĩ

Chức danh khoa học:
Điện thoại:

Nam/ Nữ: Nam

Chức vụ: Giảng viên

Tổ chức:

Fax:

Nhà riêng:

Mobile: 0903866915

E-mail:

Tên tổ chức đang công tác: Bộ môn Xét nghiệm, Khoa ĐD - KTYH
Địa chỉ tổ chức:

131 Nguyễn Chí Thanh, P. 2, Q.5, TP. HCM

Địa chỉ nhà riêng:

335/9 Nơ Trang Long, P. 13, Q. BT, TP. HCM

3. Tổ chức chủ trì nhiệm vụ(1):

1

Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ:

Khoa Điều dưỡng – Kỹ thuật Y Học

Điện thoại:

Fax:

Tên Khoa hoặc Trung tâm, đơn vị - nơi quản lý trực tiếp cá nhân làm chủ nhiệm đề tài.

- 2.


.

E-mail:
Website:
Địa chỉ:

201 Nguyễn Chí Thanh, Q. 5, TP. Hồ Chí Minh

4. Tên cơ quan chủ quản đề tài: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
II. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN
1. Thời gian thực hiện nhiệm vụ:
-

Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 07 năm 2018 đến tháng 07 năm 2019

-

Thực tế thực hiện: từ tháng 09 năm 2018 đến tháng 10 năm 2019

-

Được gia hạn (nếu có):
Từ tháng…. năm…. đến tháng…. năm….

2. Kinh phí và sử dụng kinh phí:
a) Tổng số kinh phí thực hiện: 60 tr.đ, trong đó:
-

Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học của nhà trường: 5 tr.đ.

-

Kinh phí từ các nguồn khác: 55 tr.đ.

b) Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học:
Số
TT
1

Theo kế hoạch
Thời gian
(Tháng, năm)

Thực tế đạt được
Thời gian
(Tháng, năm)

Kinh phí
(Tr.đ)

10/2018

5

Ghi chú
(Số đề nghị
quyết tốn)

Kinh phí
(Tr.đ)

12/2018

5

2

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:
Đơn vị tính: Triệu đồng
Số
TT

Nội dung
các khoản chi

1
2

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

Tổng

NSKH

Nguồn
khác

Tổng

Trả công lao động
(khoa học, phổ thông)

15

0

15

10

0

10

Nguyên, vật
năng lượng

35

5

30

40

5

35

liệu,

- 3.

Nguồn
khác

NSKH


.

3

Thiết bị, máy móc

4

Xây
dựng,
chữa nhỏ

5

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Chi khác

10

0

10

10

0

10

Tổng cộng

60

5

55

60

5

55

sửa

Lý do thay đổi (nếu có): do nguyên vật liệu tăng nên giảm lại chi phí trả cơng lao

-

động thực hiện.
3. Tổ chức phối hợp thực hiện nhiệm vụ:
Số
TT

Tên tổ chức
đăng ký theo
Thuyết minh

Tên tổ chức đã
Nội dung
tham gia thực
tham gia chủ yếu
hiện

Sản phẩm
chủ yếu
đạt được

1

Đơn vị Xét
nghiệm Vi sinh
– SHPT lâm
sàng, Bệnh viện
Nguyễn Tri
Phương

Đơn vị Xét
nghiệm Vi sinh –

SHPT lâm sàng,
Bệnh
viện
Nguyễn
Tri
Phương

Chủng
vi
khuẩn dùng
cho đánh giá
thông
số
chất lượng

2

Công ty
Nam Khoa

Công
Nam Khoa

Cung cấp chủng vi
khuẩn H. pylori cho
thử nghiệm kháng
sinh đồ.

Ghi
chú*

ty Cung cấp thiết bị Hệ
thống
máy móc cho thực kháng sinh
hiện thử nghiệm
đồ dùng cho
thử nghiệm

Lý do thay đổi (nếu có):

-

4. Cá nhân tham gia thực hiện nhiệm vụ:
(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, khơng q
10 người kể cả chủ nhiệm)
Số
TT

Tên cá nhân
đăng ký theo
Thuyết minh

Tên cá nhân đã
tham gia
thực hiện

1

Phạm Thái Bình

Phạm Thái Bình

Chủ nhiệm đề tài

2

Phạm Hùng Vân

Phạm Hùng Vân

Cố vấn chuyên môn

Lê Thị Kiều
Thảo

Thực hiện
thử nghệm

3
-

Nội dung tham gia
chính

Sản phẩm
chủ yếu
đạt được

Ghi
chú*

Lý do thay đổi ( nếu có): Bổ sung Lê Thị Kiều Thảo tham gia thực hiện đề tài với
công việc thực hiện thử nghiệm kháng sinh đồ.

5. Tình hình hợp tác quốc tế:
- 4.


.

Số
TT

Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian, kinh
phí, địa điểm, tên tổ chức hợp
tác, số đoàn, số lượng người
tham gia...)

Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn,
số lượng người tham gia...)

Ghi chú*

1
2

Lý do thay đổi (nếu có):

-

6. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:
Số
TT

Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí,
địa điểm )

Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian, kinh
phí, địa điểm )

Ghi chú*

1
2

Lý do thay đổi (nếu có):

-

7. Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:
(Nêu tại mục .....của đề cương, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát
trong nước và nước ngoài)

Số
TT

Thời gian
(Bắt đầu, kết thúc
- tháng … năm)

Các nội dung, công việc
chủ yếu
(Các mốc đánh giá chủ yếu)

Theo kế
hoạch

Thực tế đạt
được

Số lượng

Theo kế
hoạch

Người,
cơ quan
thực hiện

1
2

Lý do thay đổi (nếu có):

-

III. SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI
1. Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:
a) Sản phẩm Dạng I:
Số
TT

Tên sản phẩm và chỉ
tiêu chất lượng
chủ yếu

Đơn
vị đo

1
- 5.

Thực tế
đạt được


.

Lý do thay đổi (nếu có):

-

b) Sản phẩm Dạng II:
Yêu cầu khoa học cần đạt

Số
TT

Tên sản phẩm

Theo kế hoạch

Phương pháp sản xuất hệ Thực hiện được
thống kháng sinh đồ H. pylori kháng sinh đồ
H. pylori bằng
phương pháp vi
pha loãng

1

Thực tế
đạt được

Ghi chú

Thực hiện được
kháng sinh đồ
H. pylori bằng
phương pháp vi
pha lỗng

Lý do thay đổi (nếu có):

-

c) Sản phẩm Dạng III:
u cầu khoa học cần đạt
Số
TT

Tên sản phẩm

Thực tế
đạt được

Theo
kế hoạch

Số lượng, nơi
cơng bố
(Tạp chí, nhà
xuất bản)

1

Lý do thay đổi (nếu có):

-

d) Kết quả đào tạo:
Số
TT

Cấp đào tạo, Chuyên ngành
đào tạo

1
2

Số lượng
Theo kế hoạch

Thực tế
đạt được

Thạc sỹ

0

0

Tiến sỹ

0

0

Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)

Lý do thay đổi (nếu có):

-

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp:
Số
TT

Tên sản phẩm
đăng ký

Kết quả
Theo
kế hoạch

Thực tế
đạt được

1

-

Lý do thay đổi (nếu có):

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế
- 6.

Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)


.

Số
TT

Tên kết quả
đã được ứng dụng

Thời gian

Địa điểm
(Ghi rõ tên, địa chỉ
nơi ứng dụng)

Kết quả
sơ bộ

1

2. Đánh giá về hiệu quả do đề tài mang lại:
a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:
Nắm vững được công nghệ cố định kháng sinh bằng kỹ thuật đông khô. Đây là
công nghệ mà các hãng nước ngoài áp dung để sản xuất các hệ thống định danh và
kháng sinh đồ.
Tìm kiếm được thành phần môi trường và cơ chất phát hiện để áp dụng cho kháng
sinh đồ trên vi khuẩn H. pylori.
b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:
Tạo ra sản phẩm có thể áp dụng thường quy tại các phịng xét nghiệm.
3. Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài:
Số
TT

Thời gian
thực hiện

Nội dung

I

Báo cáo tiến độ

II

Báo cáo giám định giữa kỳ

Ghi chú
(Tóm tắt kết quả, kết luận
chính, người chủ trì…)

Chủ nhiệm đề tài

Thủ trưởng tổ chức chủ trì

(Họ tên, chữ ký)

(Họ tên, chữ ký và đóng dấu)

Phạm Thái Bình

- 7.

.

MỤC LỤC

MỤC LỤC .................................................................................................................. 1
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU - CHỮ VIẾT TẮT ..................................................... 3
DANH MỤC CÁC BẢNG – HÌNH – BIỂU ĐỒ ....................................................... 4
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 5
TỔNG QUAN Y VĂN ............................................................................................... 6
1. 1. TỔNG QUAN VỀ H. pylori ..............................................................................6
1. 1. 1. Lịch sử phát hiện H. pylori .........................................................................6
1. 1. 2. Đặc điểm vi sinh vật của H. pylori..............................................................6
1. 1. 3. Dịch tễ và cơ chế lây truyền của H. pylori ..................................................7
1. 1. 4. Cơ chế sinh bệnh của H. pylori ...................................................................7
1. 2. PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN H. pylori .....................................................10
1. 2. 1 Phương pháp huyết thanh học ...................................................................10
1. 2. 2. Phương pháp hơi thở .................................................................................10
1. 2. 3. Phương pháp mô học.................................................................................11
1. 2. 4. Phương pháp urease nhanh .......................................................................11
1. 2. 5. Phương pháp nuôi cấy ...............................................................................11
1. 2. 6. Phương pháp sinh học phân tử ..................................................................12
1. 3. PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ H. pylori .............................................12
1. 3. 1. Phương pháp đĩa kháng sinh .....................................................................12
1. 3. 2. Phương pháp pha loãng kháng sinh trong môi trường thạch ....................13
1. 3. 3. Phương pháp vi pha lỗng kháng sinh trong mơi trường lỏng..................13
1. 3. 4. Phương pháp E – test ................................................................................14
1. 3. 5. Phương pháp sinh học phân tử phát hiện kiểu gen đề kháng ....................14
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................. 15
2. 1. VẬT LIỆU .......................................................................................................15
2. 1. 1. Chủng vi khuẩn .........................................................................................15

2. 1. 2. Hóa chất và nguyên vật liệu ......................................................................15
- 1.


.

2. 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................16
2. 2. 1. Phương pháp đánh giá hiệu quả của môi trường kháng sinh đồ ...............16
2. 2. 2. Phương pháp kháng sinh đồ pha loãng kháng sinh trong thạch ................17
2. 2. 3. Phương pháp kháng sinh đồ vi pha lỗng kháng sinh trong mơi
trường lỏng ................................................................................................18
2. 3. 4. Phương pháp phân tích số liệu ..................................................................20
KẾT QUẢ - BÀN LUẬN ......................................................................................... 22
3. 1. KẾT QUẢ ........................................................................................................22
3. 1. 1. Kết quả xác định môi trường thử nghiệm kháng sinh đồ ..........................22
3. 1. 2. Kết quả kháng sinh đồ xác định MIC bằng phương pháp pha loãng kháng
sinh trong thạch .........................................................................................22
3. 1. 3. Kết quả xây dựng hệ thống kháng sinh đồ bằng phương pháp vi pha lỗng
...................................................................................................................23
3. 1. 4. Kết quả xác định thơng số chất lượng hệ thống kháng sinh đồ vi pha loãng
...................................................................................................................25
3. 2. BÀN LUẬN .....................................................................................................26
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................. 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 29

- 2.


.

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU - CHỮ VIẾT TẮT
AD

Agar dilution method (Phương pháp pha loãng kháng sinh trong thạch)

Ax

Amoxicillin

BMD

Broth microdilution method (Phương pháp vi pha loãng)

Ch

Clarithromycin

CLSI

Clinical and Laboratory Standards Institute

E - test

Epsilometer test

EC 25922

Escherichia coli ATCC 25922

EUCAST

European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing

FBS

Fetal bovine serum (Huyết thanh bào thanh bò)

HP

H. pylori / Helicobacter pylori

HP 43504

Helicobacter pylori ATCC 43504

HPM

Helicobacter pylori medium

HPS

Helicobacter pylori substrate

I

Intermediate (Trung gian)

LHB

Laked Horse Blood (Máu ngựa ly giải)

Lv

Levofloxacin

MHA

Mueller Hinton Agar

MIC

Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ưc chế tối thiểu)

Mt

Metronidazole

PA 27853

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

PCR

Polymerase Chain Reaction

R

Resistant (Kháng)

S

Susceptible (Nhạy)

SA 29213

Staphylococcus aureus ATCC 29213

SP 49619

Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

Te

Tetracycline

- 3.


.

DANH MỤC CÁC BẢNG – HÌNH – BIỂU ĐỒ
Danh mục các bảng
Bảng 2. 1

Hàm lượng kháng sinh trong các đĩa thạch (µg/mL)

17

Bảng 2. 2

Tiêu chuẩn kiểm tra chất lượng và biện luận kháng sinh đồ

18

Bảng 2. 3

Kháng sinh và hàm lượng kháng sinh trong các giếng
(µg/mL)

19

Bảng 2. 4

Tiêu chuẩn biện luận kết quả kháng sinh đồ

19

Bảng 2. 5

Biện luận độ phù hợp theo hệ số Kappa

20

Bảng 3. 1

Kết quả thử nghiệm môi trường kháng sinh đồ

22

Bảng 3. 2

Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ trên chủng vi
khuẩn chuẩn

23

Bảng 3. 3

Kết quả giá trị MIC bằng phương pháp pha loãng kháng sinh
trong thạch

23

Bảng 3. 4

Kết quả kháng sinh đồ bằng hệ thống vi pha loãng

25

Bảng 3. 5

Kết quả độ tương đồng và độ phù hợp của hệ thống kháng
sinh đồ vi pha loãng so với kháng sinh đồ pha loãng kháng
sinh trong thạch

25

Danh mục các hình
Hình 2. 1

Bản vẽ đánh dấu vị trí điểm cấy trên đĩa thạch

17

Hình 3. 1

Kết quả thử nghiệm mơi trường kháng sinh đồ

22

Hình 3. 2

Quy trình thực hiện kháng sinh đồ bằng phương pháp vi
pha lỗng

24

Hình 3. 3

Hệ thống kháng sinh đồ vi pha pha loãng

25

Danh mục các biểu đồ
Biểu đồ 3. 1 Mơ hình phân bố giá trị MIC của H. pylori

- 4.

23

.

ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
H. pylori là một trong những tác nhân gây viêm loét dạ dày- tá tràng và có thể dẫn
đến ung thư dạ dày. Tỷ lệ nhiễm H. pylori khá phổ biến, khoảng trên 80% dân số ở các
nước đang phát triển và 20 - 50% dân số ở các nước phát triển. Riêng tại Việt Nam, có
trên 70% dân số nhiễm vi khuẩn này.
Hiện nay, việc điều trị tiệt trừ H. pylori đang gặp nhiều khó khăn, do những kháng
sinh được dùng kết hợp với thuốc ức chế bơm proton (PPI) rất hạn chế, với một số ít
kháng sinh như amoxicillin, metronidazole, clarithromycin, tetracycline, levofloxacin,
rifampicin…. Đồng thời, H. pylori ngày càng đề kháng với các kháng sinh điều trị.
Kháng sinh đồ đối với H. pylori có thể được thực hiện bằng một số phương pháp
như pha loãng kháng sinh trong thạch, E-test, vi pha lỗng kháng sinh trong mơi trường
lỏng…Tuy nhiên, đối với phương pháp pha lỗng kháng sinh trong thạch thì việc chuẩn
bị môi trường khá phức tạp và thời hạn sử dụng mơi trường ngắn nên khơng thể thương
mại hóa và các phòng xét nghiệm phải tự thực hiện. Phương pháp E-test có chi phí khá
cao và xác định kết quả tương đối khó. Chính vì thế, phát triển hệ thống kháng sinh đồ
H. pylori bằng phương pháp vi pha loãng giúp các phịng xét nghiệm vi sinh có thể thực
hiện thường quy kháng sinh đồ H. pylori, nhằm đáp ứng nhu cầu thiết thực hiện nay.
Mục tiêu đề tài nhằm phát triển hệ thống kháng sinh đồ H. pylori bằng phương
pháp vi pha loãng kháng sinh.
Mục tiêu chuyên biệt:
1. Phát triển hệ thống kháng sinh đồ H. pylori bao gồm môi trường thực hiện
kháng sinh đồ và bảng nhựa phủ kháng sinh.
2. Xác định các thông số chất lượng của hệ thống kháng sinh đồ.

- 5.

.

Chương 1
TỔNG QUAN Y VĂN
1. 1.

TỔNG QUAN VỀ H. pylori

1. 1. 1. Lịch sử phát hiện H. pylori
Năm 1874, Gulio Bizzozero lần đầu tiên ghi nhận có hiện diện vi khuẩn ở
dạ dày của chó. Tiếp theo năm 1886, W. Jaworski phát hiện vi khuẩn trong dạ
dày người và đặt tên là “Vibrio rugula”. Một lần nữa, Kreinitz (1906) xác nhận
lại sự hiện diện của vi khuẩn này trong dạ dày người[19]. Năm 1975, Steer tìm
thấy vi khuẩn này gắn kết chặt chẽ với các tế bào biểu mô bề mặt dạ dày nhưng
chỉ nuôi cấy phân lập được Pseudomonas aeruginosa[19].
Năm 1979, Warren ghi nhận có sự liên quan giữa viêm dạ dày mãn tính
với sự hiện diện của vi khuẩn này ở niêm mạc dạ dày. Đến năm 1982, Warren
và Marshall phân lập thành công xoắn khuẩn này từ bệnh phẩm sinh thiết qua
nội soi dạ dày bệnh nhân loét dạ dày – tá tràng và đặt tên Campylobacter
pylori[20]. Marshall (1984) đã chứng minh được vi khuẩn này chính là tác nhân
gây viêm loét dạ dày bằng cách tự uống huyền dịch vi khuẩn[18].
Những nghiên cứu tiếp theo cho thấy Campylobacter pylori khác hẳn với
những Campylobacter về đặc điểm sinh hóa học, do đó Goodwin đề nghị xếp
vào giống Helicobacter. Năm 1989, Thompson phát hiện ra thành phần 16S
RNA nhiễm sắc thể đặc trưng cho Campylobacter pylori, mà không có ở
Campylobacter. Từ đó Campylobacter pylori có tên là Helicobacter pylori[18].
Việc phát hiện vi khuẩn H. pylori đã làm thay đổi cơ bản những hiểu biết
về cơ chế sinh bệnh sinh của viêm loét dạ dày. Với những đóng góp vĩ đại này,
năm 2005, Robin Warren và Barry Marshall đã được nhận giải thưởng Nobel
về Y học[15, 18, 21].

1. 1. 2. Đặc điểm vi sinh vật của H. pylori
H. pylori là trực khuẩn Gram âm có dạng xoắn khuẩn hình chữ S hoặc hình
cánh chim hải âu… Vi khuẩn sống ở lớp nhầy trên bề mặt niêm mạc dạ dày,
- 6.


.

một số ít bám trên bề mặt niêm mạc. H. pylori tăng trưởng ở nhiệt độ 34 – 40oC,
tốt nhất là 37oC [4, 10]. Vi khuẩn có thể cư trú ở dạ dày người (pH = 2,0 – 3,0)
nhưng không phát triển ở pH thấp, chỉ mọc được trên môi trường pH trung tính.
H. pylori là vi khuẩn vi hiếu khí, chỉ mọc được trong khí trường có 5 -10%
Oxygen. Môi trường nuôi cấy cần phải giàu chất dinh dưỡng với sự hiện diện
của máu cừu, máu ngựa, huyết thanh bào thai bê… Thời gian mọc của H. pylori
chậm (3 – 7 ngày) nên trong môi trường nuôi cấy phân lập cần bổ sung kháng
sinh (Vancomycin, Trimethoprim, Colistin, Polymyxin B, Nystatine,
Amphotericin B….) để ức chế vi khuẩn khác và vi nấm. Khi mọc trên mơi
trường, H. pylori có khúm khuẩn nhỏ với đường kính khoảng 1mm, trơn láng
và hơi mờ[10].
1. 1. 3. Dịch tễ và cơ chế lây truyền của H. pylori
Tỷ lệ nhiễm H. pylori khá phổ biến, khoảng trên 80% dân số ở các nước
đang phát triển và 20 - 50% dân số ở các nước phát triển[25]. Tỷ lệ nhiễm H.
pylori cao ở khu vực Nigeria 87,7%, châu Phi 70,1%, thấp nhất ở Thụy Sĩ
18,9%[11, 17]. Tại Việt Nam, có trên 70% số nhiễm vi khuẩn này[3, 10, 11].
Người là vật chủ quan trọng nhất với H. pylori. Các cơ chế lây truyền của
H. pylori gồm lây từ người sang người người thông qua đường miệng - miệng
và phân - miệng. Lây truyền từ nguồn nước là do nước bị nhiễm H. pylori[10].
1. 1. 4. Cơ chế sinh bệnh của H. pylori
Các yếu tố liên quan đến cơ chế gây bệnh của H. pylori bao gồm tiêm mao,
urease, yếu tố bám dính và yếu tố độc lực của vi khuẩn[10].

Sự hoạt động của các tiêm mao và cấu trúc hình xoắn, vi khuẩn di chuyển
qua lớp niêm dịch vào lớp dưới niêm mạc dạ dày để tồn tại trong mơi trường
acid của dịch vị[10].
Urease có vai trị xúc tác thủy phân ure, một sản phẩm của quá trình phân
hóa protein trong thức ăn ở dạ dày, cuối cùng tạo ra amonium nhằm giúp giữ
môi trường chung quanh vi khuẩn có pH gần như trung tính. Urease cịn có vai
trị quan trọng trong biến dưỡng và tránh được đáp ứng miễn dịch: tham gia tổng
- 7.


.

hợp protein bằng cách cung cấp ni tơ, biến đổi glutamate thành glutamine và kết
hợp với kháng thể giúp ngăn chặn sự kết hợp với tế bào nên ngăn cản q trình
opsonin hóa[10, 28].
Các yếu tố bám dính là những protein màng ngồi, giúp vi khuẩn tăng
cường kết dính vào tế bào biểu mô dạ dày để gây bệnh[10].
H. pylori có nhiều yếu tố độc lực, trong đó quan trọng nhất kháng nguyên
kết hợp độc tố tế bào cagA (cytotoxin-associated gene A) và độc tố gây không
bào vacA (vacuolating cytotoxin)[6, 10, 25, 28, 29]:
•

Gen vacA (vacuolating toxin gene A) mã hóa cho protein có trọng lượng
phân tử 124kDa.. Các hoạt động của vacA bao gồm: (i) liên kết với một
thụ thể màng tế bào và bắt đầu một phản ứng tiền viêm; (ii) cảm ứng cho
quá trình apoptosis; (iii) cảm ứng hình thành các khơng bào trong bào
tương; (iv) hình thành kênh màng làm rò rỉ các chất dinh dưỡng ra ngoại
bào; (v) hạn chế sự kích hoạt tế bào T. Protein vacA có vai trị quan trọng
trong sinh bệnh trên những bệnh nhân loét lẫn ung thư dạ dày. Gen vacA
có trên tất cả các chủng H. pylori, nhưng mức độ khác nhau về hoạt tính

của độc tố gây không bào (vacuolating cytotoxin) tùy thuộc vào kiểu gen.
Gen vacA gồm có vùng tín hiệu (signal region, s) và vùng giữa (middle
region, m). Vùng gen s mã hóa cho peptide tín hiệu (signal peptide) với
hai kiểu s1 và s2. Vùng m cũng bao gồm hai kiểu gen m1 và m2. Những
chủng vi khuẩn mang kiểu gen s1/m1 là có độc tính cao nhất, và những
chủng vi khuẩn s2/m2 khơng có độc tính. Trong khi đó các chủng vi khuẩn
s1/m2 thường ở mức độ trung gian, chủng vi khuẩn s2/m1 cũng được mơ tả
với mức độ ít có độc tính. Những bệnh nhân bị loét dạ dày – tá tràng có
liên quan đến các chủng vi khuẩn vacA s1/m1 và s1/m2, và những chủng
vacA s1/m1 có liên quan trên bệnh nhân bị ung thư dạ dày.

•

Gen cagA (cytotoxin-associated gene A) mã hóa cho protein cagA có
trọng lượng phân tử từ 128 - 140kDa. Protein này có khả năng kích thích
phản ứng phosphoryl hóa tyrosine trong tế bào ký chủ, từ đó dẫn đến sự
tăng sinh bất thường các tế bào biểu mô dạ dày. Gen cagA hiện diện
- 8.


.

khoảng 50 - 70% chủng H. pylori. Trên những bệnh nhân nhiễm H. pylori
có mang gen cagA thường viêm dạ dày nặng hơn, nên có nguy cơ loét dạ
dày - tá tràng hoặc ung thư dạ dày cao hơn.
H. pylori gây ra các bệnh lý viêm dạ dày, loét dạ dày tá tràng, và ung thư
dạ dày. Nguyên nhân là do sự tương tác giữa vi khuẩn vật chủ và các yếu tố mơi
trường. Q trình gây bệnh của H. pylori gồm có 04 giai đoạn:
•

Vi khuẩn sống được trong môi trường axit dạ dày: H. pylori tiết urease để
phân hủy ure trong dạ dày thành ammonia, nhờ đó trung hịa được mơi
trường axit bao quanh vi khuẩn, giúp nó sống sót.

•

Vi khuẩn di chuyển về bề mặt tế bào biểu mô dạ dày nhờ hệ thống tiêm
mao: H. pylori tiết ra phospholipase và nhờ ammonia tạo ra từ thủy phân
ure làm lớp nhầy bị mỏng và lỗng hơn. Hình dạng xoắn ốc cùng với các
tiêm mao, giúp vi khuẩn di chuyển xuyên qua lớp nhầy để đến lớp đáy,
nơi mà pH gần như trung tính.

•

Vi khuẩn bám dính vào các thụ thể vật chủ nhờ các yếu tố bám dính: các
tiêm mao cũng có vai trị kết dính vi khuẩn với tế bào biểu mô. Đồng thời
sự tương tác giữa các yếu tố bám dính của vi khuẩn với các thụ thể trên bề
mặt tế bào biểu mô nên vi khuẩn được bảo vệ không bị tống xuất bởi nhu
động dạ dày.

•

Vi khuẩn là tiết độc tố gây bệnh: H. pylori tiết các độc tố bao gồm cả cagA,
vacA gây tổn thương mô. Bề mặt lớp biểu mô dạ dày là nơi tương tác giữa
vi khuẩn và vật chủ, tiết ra các protein hoạt hóa bạch cầu khởi động miễn
dịch bẩm sinh và kích hoạt bạch cầu đa nhân trung tính, dẫn đến các bệnh
lý viêm và loét. H. pylori kích thích tế bào vật chủ gia tăng sự sao chép
của các gen tạo cytokine tiền viêm và các chymokine, dẫn đến đáp ứng
viêm thể hiện bằng sự xâm nhập của các bạch cầu hạt trung tính vào lớp
cơ niêm. Thêm vào đó, urease do H. pylori tiết ra kích thích tế bào biểu

mơ tạo ra các interleukin (IL) tiền viêm như IL-2, 6, 8 và TNF (tumor
necrosis factor - yếu tố gây hoại tử khối u) làm gia tăng đáp ứng viêm
tại chỗ.
- 9.


.

1. 2.

PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN H. pylori
Từ khi phát hiện và xác định vai trò gây bệnh của H. pylori vào năm 1982,
đến nay đã có nhiều phương pháp chẩn đốn H. pylori. Mỗi phương pháp có ưu
và nhược điểm khác nhau, tùy thuộc vào mục đích và thực tế để có thể lựa chọn
phương pháp chẩn đốn phù hợp. Các phương pháp chẩn đốn H. pylori có thể
chia thành hai nhóm[1]:
•

Khơng xâm lấn bao gồm huyết thanh học và hơi thở.

•

Phương pháp xâm lấn bao gồm thử nghiệm mơ học, urease nhanh, nuôi
cấy và sinh học phân tử (PCR, Realtime PCR).

1. 2. 1 Phương pháp huyết thanh học
Phương pháp huyết thanh học dựa trên nguyên tắc phát hiện kháng thể IgG
đặc hiệu với H. pylori bằng thử nghiệm ELISA (Enzyme Linked Immuno
Sorbent Assay) hoặc sắc ký miễn dịch (hay cịn gọi là test nhanh).
Phương pháp này có độ nhạy (79,9 – 99,3%) và độ đặc hiệu (86,5 – 98,6%)

tùy thuộc vào các hãng sản xuất khác nhau[5]. Tuy nhiên, phương pháp này phù
hợp cho nghiên cứu cứu dịch tễ mà ít có giá trị trong chẩn đốn và theo dõi điều
trị. Do tỷ lệ nhiễm H. pylori trong dân số cao và sau khi điều trị tiệt trừ H. pylori
thành cơng thì kháng thể vẫn cịn tồn tại vào cho kết quả thử nghiệm dương tính
từ 6 tháng đến hơn 1 năm[1, 5].
1. 2. 2. Phương pháp hơi thở
Phương pháp hơi thở (UBT) được Graham mô tả đầu tiên vào năm 1987
với nghiệm pháp hơi thở 13C và tiếp theo vào năm 1988 Marshall và Surveyor
mô tả nghiệm pháp hơi thở 14C. Nghiệm pháp hơi thở 13C và 14C đều cho kết
quả như nhau. Tuy nhiên, 13C là chất khơng gây phóng xạ nên có thể sử dụng
cho tất cả các đối tượng bệnh nhân. 14C có hoạt tính phóng xạ nên khơng được
dùng cho trẻ em và phụ nữ mang thai.
Bệnh nhân được cho uống urea được đánh dấu 13C hoặc 14C. Sau khi uống,
men urease từ vi khuẩn sẽ tác động lên urea có chứa 13C hoặc 14C và giải phóng
13

CO2 hoặc .14CO2. Chất này đi vào máu và thải trừ qua phổi. Việc phát hiện
- 10.


.

trong hơi thở chất đồng vị được đánh dấu và/ hoặc là tỉ lệ 13C/12C được đo bằng
sắc ký hơi, quang phổ kế khối, quang phổ laser, quang phổ hồng ngoại…. Khi
thực hiện, bệnh nhân cần ngưng kháng sinh ít nhất 4 tuần để hạn chế kết quả âm
tính giả. Phương pháp hơi thở có độ chính xác hơn 95% và được dùng để theo
dõi hiệu quả điều trị tiệt trừ H. pylori[1, 5].
1. 2. 3. Phương pháp mô học
Phương pháp mô học được thực hiên dựa trên nguyên tắc nhuộm mẫu mô
sinh thiết dạ dày để đánh giá sự hiện diện của H. pylori. Các cách nhuộm thường

được thực hiện là Gram, Hematoxyline - eosin (HE), Giemsa, Warthin-Starry,
Acridin Orange…. Phương pháp mơ học có độ nhạy thấp (66%) và độ đặc hiệu
90 - 95%[1]. Tuy nhiên, thử nghiệm này cịn có ý nghĩa trong việc đánh giá tổn
thương kèm theo ở niêm mạc dạ dày như viêm cấp, viêm mạn tính hoạt động ,
viêm teo, chuyển sản, nghịch sản và carcinome dạ dày.
1. 2. 4. Phương pháp urease nhanh
Phương pháp urease nhanh (Rapid Urease Test) cịn có các tên gọi khác
nhưng CLO – test (Campylobacter Like Organism test), Pylori test… Phương
pháp này dựa trên nguyên tắc phát hiện urease của H. pylori. Đặc trưng của vi
khuẩn H. pylori là có khả năng sinh ra men urease tác dụng phân hủy rất nhanh
urea thành hydroxid amonium và làm kiềm hóa môi trường và được nhận diện
nhờ chất chỉ thị pH. Phương pháp này thường được đọc kết quả sau 20 phút, 1
giờ, 3 giờ và 24 giờ. Trong trường hợp nhiễm H. pylori, thử nghiệm dương tính
trong vịng 20 phút (75%) và 3 giờ (90%)[1]. Phương pháp này có độ nhạy giới
hạn (70 – 90%)[1]. Các trường hợp âm tính giả có thể do hàm lượng vi khuẩn
thấp, đang xuất huyết tiêu hóa, teo niêm mạc dạ dày, đang sử dụng kháng sinh.
Thử nghiệm dương tính giả khi mẫu mơ sinh thiết có lẫn máu, có sự hiện diện
của các vi khuẩn khác cũng sinh ra men urease như Proteus, Klebsiella…[1, 5].
1. 2. 5. Phương pháp nuôi cấy
Thực hiện dựa trên nguyên tắc nuôi cấy phân lập H. pylori từ bệnh phẩm
sinh thiết dạ dày. Đây là phương pháp có độ đặc hiệu cao (100%) và độ nhạy
- 11.


.

(70 – 100%). Bệnh phẩm sinh thiết dạ dày phải được bảo quản trong môi trường
chuyên chở chuyên biệt với thời gian khơng q 6 giờ. Sau đó, bệnh phẩm được
nghiền nát và cấy phân lập trên môi trường chuyên biệt, ni ủ trong điều kiện
khí trường vi hiếu khí (5 – 10% O2) từ 3 – 5 ngày. Chọn khúm khuẩn được trưng

để thực hiện định danh và kháng sinh đồ.
Tuy phương pháp này có những hạn chế như tương đối phức tạp vì địi hỏi
điều kiện ni ủ vi khí hiếu (5 - 10% O2), mơi trường ni cấy chuyên biệt, thời
gian nuôi cấy lâu (7 - 10 ngày). Nhưng trong tình hình H. pylori ngày càng đề
kháng với những kháng sinh thường dùng trong phác đồ điều trị hiện nay như
metronidazole, clarithromycin... thì phương pháp ni cấy rất có ý nghĩa trên
bệnh nhân nhiễm trùng mạn tính hoặc đã thất bại trong điều trị ban đầu[1, 30].
1. 2. 6. Phương pháp sinh học phân tử
Đây là phương pháp dựa trên nguyên tắc khuếch đại gen đặc hiệu của vi
khuẩn H. pylori (nếu có) trong bệnh phẩm bằng kỹ thuật PCR, multiplex PCR,
Realtime PCR…. Phương pháp này thường được thực hiện bằng kỹ thuật
multiplex PCR phát hiện đồng thời các kiểu gen vacA và gen cagA. Phương
pháp sinh học phân tử có độ nhạy (95,3 – 100%) và độ đặc hiệu (91,8 –
100%)[13].
1. 3.

PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ H. pylori

1. 3. 1. Phương pháp đĩa kháng sinh
Kháng sinh đồ bằng phương pháp đĩa kháng sinh hay còn gọi là phương
pháp khuếch tán kháng sinh trong thạch từ đĩa giấy tẩm kháng sinh, phương
pháp Kirby-Bauer. Nguyên tắc là kháng sinh được tẩm lên đĩa giấy với một hàm
lượng theo quy định được đặt trên bề mặt môi trường thạch dinh dưỡng đã được
trải vi khuẩn. Trong quá trình ủ, kháng sinh từ đĩa giấy khuếch tán ra môi trường
thạch và ức chế sự phát triển của vi khuẩn, nhờ vậy tạo thành một vịng khơng
có vi khuẩn mọc (gọi là vịng vơ khuẩn) xung quanh đĩa kháng sinh. Đo đường
kính vịng vơ khuẩn này và so với tiêu chuẩn đánh giá vịng vơ khuẩn để biện
luận là vi khuẩn kháng, nhạy hay trung gian đối với kháng sinh thử nghiệm[7].
- 12.

.

Mơi trường thực hiện kháng sinh đồ là MHA có bổ sung 10% máu ngựa.
Huyền dịch vi khuẩn được pha tương đương với độ đục chuẩn Mc Farland 3,0
– 4,0. Đọc kết quả sau khi nuôi ủ 72 giờ trong khí trường vi hiếu khí[14].
Đây là một phương pháp đơn giản, có thể thực hiện thường quy nhưng
khơng phù hợp khi thực hiện trên vi khuẩn khó mọc trong đó có H. pylori[22].
Hiện nay, phương pháp này tiêu chuẩn để biện luận kết quả kháng sinh đồ chỉ
dựa trên các cơng trình nghiên cứu khoa học[14].
1. 3. 2. Phương pháp pha lỗng kháng sinh trong mơi trường thạch
Kháng sinh đồ bằng phương pháp pha lỗng kháng sinh trong mơi trường
thạch được CLSI và EUCAST công nhận[9, 22] và được xem là “tiêu chuẩn vàng”
trong thử nghiệm kháng sinh đồ trên vi khuẩn H. pylori.
Thực hiện bằng cách pha loãng kháng sinh trong mơi trường MHA có bổ
sung 10% máu cừu. Huyền dịch vi khuẩn được pha trong nước muối sinh lý
tương đương độ đục chuẩn Mc Farland 2,0. Lấy 1 - 3L huyền dịch vi khuẩn
chấm thành một điểm trên môi trường đĩa thạch. Nuôi ủ 35  2oC, 3 ngày trong
khí trường vi hiếu khí. Đọc kết quả bằng cách xác định vi khuẩn có mọc hoặc
khơng mọc trên mơi trường[22, 26]. Phương pháp này có thể thực hiện để định
tính bằng cách pha kháng sinh vào mơi trường thạch với nồng độ kháng sinh tại
điểm gãy MIC của tiêu chuẩn biện luận. Thực hiện định lượng xác định giá trị
MIC bằng cách pha lỗng kháng sinh trong mơi trường thạch theo dãy nồng độ
kháng sinh giảm dần với hệ số pha lỗng ½[7, 22].
Tuy nhiên việc thực hiện kháng sinh đồ theo phương pháp này tương đối
phức tạp và tốn kém. Nếu thực hiện định tính mỗi loại kháng sinh phải pha từ 1
– 3 đĩa thạch có nồng độ kháng sinh tương ứng với điểm gãy MIC của tiêu chuẩn
biện luận kháng sinh đồ. Trường hợp thực hiện định lượng xác định giá trị MIC
thì mỗi loại kháng sinh phải pha 12 đĩa thạch tương ứng với 12 nồng độ kháng
sinh khác nhau. Chính vì thế, phương pháp này chỉ ứng dụng trong các nghiên

cứu mà không thể áp dung thường quy[7].
1. 3. 3. Phương pháp vi pha lỗng kháng sinh trong mơi trường lỏng
- 13.


.

Kháng sinh đồ bằng phương pháp vi pha loãng kháng sinh trong môi
trường lỏng với vi khuẩn H. pylori không có trong khuyến cáo của CLSI hoặc
EUCAST. Tuy nhiên, phương pháp này đã được thực hiện và công bố trên các
cơng trình nghiên cứu khác nhau[22, 24]. Phương pháp này được thực hiện bằng
cách vi pha loãng kháng sinh trong môi trường lỏng. Huyền dịch được pha trong
nước muối sinh lý vô trùng và cho vào môi trường với hàm lượng vi khuẩn trong
mỗi giếng trung bình 105cfu/mL. Ni ủ 35  2oC, 3 ngày trong khí trường vi
hiếu khí. Đọc kết quả bằng cách xác định vi khuẩn có mọc hoặc không mọc
trong môi trường[22, 24]. Phương pháp thực hiện riêng lẻ được trên từng chủng vi
khuẩn nên có thể áp dụng thường quy. Một trong những nhược điểm của phương
pháp này đối với vi khuẩn H. pylori là tương đối khó xác định vi khuẩn mọc
hoặc khơng mọc[8, 22].
1. 3. 4. Phương pháp E – test
E-test dựa trên kết hợp giữa phương pháp khuếch tán và vi pha loãng
kháng sinh trên một que giá thể. Que giá thể trên đó tẩm kháng sinh thành một
dãy có hàm lượng giảm dần. Giá trị trên que giá thể tương ứng với giá trị MIC.
Khi đặt que giá thể trên môi trường đã trãi vi khuẩn, kháng sinh từ que khuyếch
tán ra môi trường theo gradient nồng độ và ức chế sự phát triển của vi khuẩn tạo
thành vùng vô khuẩn có hình elip. Điểm cắt của vùng vơ khuẩn với que giá thể
là giá trị MIC[7, 8]. Cũng như phương pháp vi pha lỗng, kháng sinh đồ bằng Etest khơng có trong tiêu chuẩn của CLSI nhưng được sử dụng rộng rãi trong
nghiên cứu cũng như thường quy[8, 12, 22, 23].
1. 3. 5. Phương pháp sinh học phân tử phát hiện kiểu gen đề kháng
Phương pháp sinh học phân tử phát hiện kiểu gen đề kháng kháng sinh có

thể áp dụng kỹ thuật như PCR, Realtime - PCR, PCR - RFLP, lai huỳnh quang
tại chỗ (Fluorescence In Situ Hybridization - FISH). Mẫu thử để xác định tính
nhạy cảm kháng sinh kiểu gen của H. pylori thường là mô sinh thiết dạ dày, vi
khuẩn đã nuôi cấy phân lập. Ưu điểm của phương pháp sinh học phân tử là vừa
chẩn đoán được sự có mặt của H. pylori vừa xác định được H. pylori đề kháng
với một số loại kháng sinh[8, 22].
- 14.


.

Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2. 1.

VẬT LIỆU

2. 1. 1. Chủng vi khuẩn
Kiểm tra chất lượng của thử nghiệm kháng sinh đồ (phương pháp pha
loãng kháng sinh trong thạch và phương pháp vi pha loãng) theo tiêu chuẩn
CLSI trên các chủng vi khuẩn chuẩn: H. pylori ATCC 43504, S. aureus ATCC
29213, E. coli ATCC 25922. P. aeruginosa ATCC 27853, S. pneumoniae
ATCC 49619 trên mỗi lô thử nghiệm[9, 27].
H. pylori (118 chủng vi khuẩn) có nguồn gốc phân lập từ các bệnh phẩm
sinh thiết dạ dày trong năm 2018 tại Bệnh viện Nguyễn Tri Phương. Những
chủng vi khuẩn này được dùng thử nghiệm kháng sinh đồ bằng phương pháp
pha loãng kháng sinh trong thạch và phương pháp vi pha lỗng.
H. pylori được bảo quản ở – 70oC trong mơi trường thịt bị bằm có bổ sung
20% glycerol. Trước khi thực hiện thử nghiệm được cấy phân lập trên môi
trường Columbia Agar có bổ sung 10% máu ngựa (10%), Vancomycin

(10mg/L), Trimethoprim (5mg/L), Polymyxin B (2,500U/L), Amphotericin B
(2mg/L). Nuôi ủ ở 37oC, 72 giờ trong điều kiện khí trường 5 – 10% O2.
2. 1. 2. Hóa chất và nguyên vật liệu
Kháng sinh dùng cho thử nghiệm kháng sinh đồ là kháng sinh tinh khiết,
bao gồm Clarithromycin (Sigma), Amoxicillin (Sigma), Levofloxacin (Toku E),
Metronidazole (Toku E), Tetracycline (Sigma).
Bảng nhựa 12 giếng dùng cho thử nghiệm kháng sinh đồ vi pha lỗng có
cấu tạo là nhựa polystyren.
Môi trường thực hiện thử nghiệm kháng sinh đồ bằng phương pháp pha
loãng kháng sinh trong thạch là Mueller Hinton Agar có bổ sung 5% máu cừu.

- 15.


.

Môi trường thực hiện kháng sinh đồ bằng phương pháp vi pha loãng trên
các vi khuẩn chuẩn là Mueller Hinton broth (S. aureus ATCC 29213, E. coli
ATCC 25922. P. aeruginosa ATCC 27853) và Mueller Hinton broth có bổ sung
5% máu ngựa ly giải (S. pneumoniae ATCC 49619).
Môi trường thử nghiệm kháng sinh đồ của H. pylori bằng phương pháp vi
pha lỗng bao gồm các loại mơi trường:
 HPM 1: Mueller Hinton broth bổ sung 10% LHB.
 HPM 2: Mueller Hinton broth bổ sung 10% FBS.
 HPM

3:

Mueller

Hinton

broth

bổ

sung

10%

LHB

và

sung

10%

FBS

và

1% IsoVitaleX™ Enrichment (BD BBL).
 HPM

4:

Mueller

Hinton

broth

bổ

1% IsoVitaleX™ Enrichment (BD BBL).
HPS là cơ chất phát hiện Urease trong môi trường thử nghiệm kháng sinh
đồ với thành phần gồm urea (2%) và phenol red (0,0025%).
Khí trường vi hiếu khí (5 – 10%) được sử dụng túi ủ Anaerocult C (Merck).
2. 2.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2. 2. 1. Phương pháp đánh giá hiệu quả của môi trường kháng sinh đồ
Vi khuẩn thử nghiệm gồm có H. pylori ATCC 43504 và 10 chủng vi khuẩn
H. pylori có nguồn gốc phân lập từ bệnh phẩm sinh thiết dạ dày.
Vi khuẩn được pha thành huyền dịch trong nước muối sinh lý với độ đục
tương đương với 0,5 Mc Farland. Lấy 30µL huyền dịch vi khuẩn cho vào 3mL
môi trường thử nghiệm kháng sinh đồ (HPM 1 – 4). Phân phối vào bảng nhựa
12 giếng, mỗi loại môi trường được thực hiện trên một bảng nhựa. Mỗi giếng
của từng bảng nhựa có chứa 100µL mơi trường (có chứa vi khuẩn) theo thứ tự:
H. pylori ATCC 43504 (giếng 1), vi khuẩn có nguồn gốc phân lập từ bệnh phẩm
sinh thiết dạ dày (giếng 2 – 11), mơi trường HPM, khơng có chứa vi khuẩn
(giếng 12).

- 16.


.

Ni ủ ở 37oC, 72 giờ trong điều kiện khí trường 5 – 10% O2. Sau khi nuôi
ủ cho vào 25µL dung dịch HPS. Đọc kết quả dựa trên sự thay đổi màu sắc của
dung dịch có trong các giếng. Nếu có H. pylori phát triển, dung dịch chuyển từ
màu vàng sang đỏ do vi khuẩn sinh ra urease tác dụng phân hủy rất nhanh urea
(có trong cơ chất) thành hydroxid amonium, làm kiềm hóa mơi trường và được
nhận diện nhờ chất chỉ thị pH.
2. 2. 2. Phương pháp kháng sinh đồ pha lỗng kháng sinh trong thạch
Pha chế mơi trường đĩa thạch Mueller Hinton Agar có 5% máu cừu và
kháng sinh (Clarithromycin, Levofloxacin, Amoxicillin, Metronidazole,
Tetracycline) theo dãy nồng độ kháng sinh giảm dần với hệ số pha lỗng ½
(Bảng 2.1).
Bảng 2. 1:

Hàm lượng kháng sinh trong các đĩa thạch (µg/mL)

Đĩa thạch

1

2

3

4

5

6

7

8

Hàm lượng
128 64 32 16
kháng sinh

8

4

2

1

9

10

11

12

13

14

0.5 0.25 0.12 0.06 0.03 0

Đánh dấu vị trí cấy vi khuẩn trên

thạch bằng cách kẽ vịng trịn có

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

tương ứng với 14 vịng trịn. Mỗi

11

12

13

14

15

16

vịng trịn kẻ 32 ơ, kính thước mỗi ơ 1

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

đường kính 90mm trên giấy trắng.
Một bộ kháng sinh đồ 14 đĩa thạch

 1cm (Hình 2. 1). Dán các vịng trịn
này lên đáy của đĩa thạch môi
trường[7].
Pha huyền dịch vi khuẩn trong
nước muối sinh lý có độ đục tương

Hình 2.1: Bản vẽ đánh dấu vị trí điểm cấy
trên đĩa thạch.

đương 2,0 Mc Farland (hàm lượng vi khuẩn trong huyền dịch 107 – 108 cfu/mL).
Dùng micropipet lấy 1µL huyền dịch vi khuẩn chấm vào điểm cấy trên mặt
thạch đã đánh dấu. Mỗi điểm cấy trên mặt thạch tương ứng với một chủng vi
khuẩn thử nghiệm. Nuôi ủ ở 37oC, 72 giờ trong điều kiện khí trường 5 – 10%
- 17.