Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của loài địa y mọc trên thân cây dừa

.

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA
LỒI ĐỊA Y MỌC TRÊN THÂN CÂY DỪA
Mã số: 97-18

Chủ nhiệm đề tài: DS. PHAN CẢNH TRÌNH

.


.

Tp. Hồ Chí Minh, 03/2019
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA
LOÀI ĐỊA Y MỌC TRÊN THÂN CÂY DỪA

Mã số: 97-18

Chủ nhiệm đề tài
(ký, họ tên)

Tp. Hồ Chí Minh, 03/2019
.


.

DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA
NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH
STT

Họ và tên

1

Phan Cảnh Trình

2

Võ Lê Công Tráng

.

Học hàm/ học vị

Cơ quan công tác

Dược sĩ

Khoa Dược, Đại học Y Dược
TP. HCM

Sinh viên

Khoa Dược, Đại học Y Dược
TP. HCM

iii


.

MỤC LỤC
DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ
PHỐI HỢP CHÍNH ..............................................................................................................iii
MỤC LỤC ............................................................................................................................ iv
DANH MỤC BẢNG BIỂU ................................................................................................... v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................. vii
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 8
1. ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................... 8
2. TỔNG QUAN .................................................................................................................... 8
3. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ......................................................................................... 22
4. PHƯƠNG PHÁP VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ........................................................ 26
ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT .............................................................................. 31
THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN .............. 36
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 47

Tài liệu tham khảo ............................................................................................................... 48

.

iv


.

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1. Các chủng vi sinh vật dùng trong thử nghiệm........................................................ 23
Bảng 2. Các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong đề tài .............................................................. 24
Bảng 3. Hóa chất và dung môi............................................................................................. 25
Bảng 4. Tiêu chuẩn đánh giá sơ bộ mức độ kháng vi sinh vật qua vòng ức chế ................. 29
Bảng 5. Kết quả định tính thành phần hóa học tại chỗ ........................................................ 33
Bảng 6. Bảng định tính hóa học theo qui trình Cuiley ........................................................ 36
Bảng 7. Khối lượng cao toàn phần và cao phân đoạn sắc ký cột chân không ..................... 37
Bảng 8. Các vết tương ứng với Rf của cao methanol toàn phần ......................................... 38
Bảng 9. Đường kính vịng ức chế vi sinh vật của cao tồn phần (mm) ............................... 40
Bảng 10. Đường kính vịng ức chế vi sinh vật của các phân đoạn sau khi sắc ký cột chân
không (mm) ......................................................................................................................... 41

.

v


.

DANH MỤC HÌNH

Hình 1. Các dạng tản địa y cơ bản ......................................................................................... 9
Hình 2. Axit protolichesterinic (1) và axit lichesterinic (2)................................................. 11
Hình 3. Axit pulvinic (3); methyl ester của axit pulvinic (4); calycin (5) và pulvinamid (6)
............................................................................................................................................. 11
Hình 4. Methyl paraben (7), methyl orsellinate (8), methyl β-orsellinate (9) và methyl
hematommate (10) ............................................................................................................... 12
Hình 5. Axit orsellinic (11), axit confluentic (12), atranorin (13) và axit diffractaic (14) .. 12
Hình 6. Axit physodic (15), axit norlobaric (16), axit salazinic (17) và axit parellic (18) .. 13
Hình 7. Usnic acid ............................................................................................................... 13
Hình 8. Anthraquinon (21), hypericin (22) và naphthazarin (23) ........................................ 14
Hình 9. Địa điểm thu hái mẫu địa y Dirinaria applanata ................................................... 23
Hình 10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ......................................................................................... 26
Hình 11. Tản địa y Dirinaria applanata trên thân dừa thu hái tại Giồng Trôm, Bến Tre, vào
tháng 02 năm 2018, thanh kích thước tương ứng 1 cm. ...................................................... 31
Hình 12. Tản địa y dưới kính hiển vi soi nổi; các thuỳ xếp sát nhau, gấp nếp lông chim từ
tâm ra (B), mỗi thuỳ có kích thước từ 0,4-2,0 mm (C). Khu vực chính giữa tản thường là nơi
tập trung cơ quan sinh sản dạng bào tử phấn (A). Thanh kích thước tương ứng 1 mm. ..... 32
Hình 13. Mặt cắt ngang tản địa y dưới kính hiển vi soi nổi. (A) Lớp vỏ trên; (B) Bào tử phấn;
(C) Lớp tảo; (D) Lớp tuỷ; (E) Lớp vỏ dưới. ........................................................................ 32
Hình 14. Bào tử túi có 1 vách ngăn và túi bào tử chứa tối đa 8 bào tử................................ 33
Hình 15. Kết quả hoá định danh tại chỗ, mũi tên chỉ dấu vùng tuỷ..................................... 33
Hình 16. Tinh thể đặc trưng khi kết tinh dịch chiết aceton, quan sát dưới kính hiển vi quang
học vật kính x40 (C, D, E, F), vật kính x10 (A, B). Thanh kích thước chỉ thị 100 µm. ...... 34
Hình 17. Tản địa y phát huỳnh quang dưới UV 365 nm (bên trái). Tản địa y dưới ánh sáng
trắng (bên phải). (A) Tản địa y non: tắt quang dưới UV 365 nm, chỉ có một số điểm phát
quang, tương ứng vị trí xuất hiện bào tử phấn. (B) Bào tử phấn phát quang dưới UV 365 nm.
(C) Tản già đã thối hố. (D) vị trí bào tử phấn phát quang trên một tản tuổi trung bình kích
thước 5 cm. .......................................................................................................................... 35
Hình 18. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng cao methanol toàn phần chiết từ địa y ...................... 38
Hình 19. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng các phân đoạn cao n-hexan (H), cloroform (C1, C2,

C3), đối chứng cao tồn phần (CTP). .................................................................................. 39
Hình 20. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng các phân đoạn ethyl acetat (E1, E2, E3); đối chứng cao
tồn phần (CTP). .................................................................................................................. 39
Hình 21. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng các phân đoạn methanol (M1, M2, M3, M4, M5, M6);
đối chứng cao toàn phần (CTP). .......................................................................................... 40
Hình 22. Kết quả tự sinh đồ E2 trên chủng MRSA ............................................................. 42
Hình 23. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng phân đoạn D .............................................................. 43
Hình 24. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng ba hệ dung mơi ......................................................... 45
Hình 25. Tinh thể axit divaricatic [4] .................................................................................. 46

.

vi


.

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT Viết tắt

Viết đầy đủ

1

DMSO

Dimethyl Sulfoxide

2

EA

Ethyl acetat

3

MeOH

Methanol

4

MHA

Mueller Hinton Agar

5

MIC

Minimal Inhibitory Concentration

6

SDA

Sabouraud Dextrose Agar

7

TSA

Tryptic Soy Agar

.

vii


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp trường

.

Mở đầu

MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Đề kháng kháng sinh đã trở thành mối lo ngại của toàn thế giới trong nhiều năm trở
lại đây. Nhiều trường hợp vi khuẩn đề kháng với những kháng sinh thuộc nhóm để
dành như tigercyclin và colistin. Trước tình đó Hiệp hội bệnh nhiễm Hoa Kỳ (IDSA)
đã khởi động dự án 10 x 20 nhằm huy động các viện nghiên cứu và các hiệp hội phát
triển 10 kháng sinh mới vào năm 2020 [1].
Hầu hết các kháng sinh hiện nay được tổng hợp bởi xạ khuẩn và vi nấm, tuy nhiên
hoạt động sàng lọc kháng sinh mới từ nhóm vi sinh vật này ngày càng khó khăn do
số lượng nghiên cứu đã ở mức bão hoà. Địa y là hệ cộng sinh giữa hai vi sinh vật,
nấm và tảo, có tiềm năng cao về các chất chuyển hố thứ cấp có hoạt tính sinh học
như chống oxi hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng ung thư, hấp phụ
tia UV-B, kháng viêm [2].
Dirinaria applanata là loài địa y phổ biến ở vùng nhiệt đới nhưng chưa được nghiên
cứu đầy đủ về các chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt là tại Việt Nam. Trong đề tài

này, chúng tơi tiến hành “Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của cao chiết
methanol từ địa y Dirinaria applanata” với những mục tiêu như sau:
1. Khảo sát đặc điểm thực vật học và định danh địa y thu hái từ thân Dừa, huyện
Giồng Trôm, tỉnh Bến Tre.
2. Chiết xuất và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của cao methanol.
3. Phân tách phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm từ cao này.
4. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của chất phân lập được.

2. TỔNG QUAN
TỔNG QUAN VỀ ĐỊA Y
Khái niệm và phân loại
Địa y là kết quả cộng sinh giữa vi nấm (mycobiont) và một bộ phận quang hợp
(photobiont hoặc phycobiont) thường là tảo đôi khi là vi khuẩn lam (cyanobacterium).
Tảo cung cấp các chất từ q trình quang hợp, nấm có tác dụng bảo vệ và cung cấp
các hợp chất tự nhiên cho tảo. Sự cộng sinh đó giúp chúng tồn tại và phát triển [3].

.

8


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp trường

.

Mở đầu

Sự sắp xếp của tảo và hệ sợi nấm tạo thành cấu trúc tản đặc trưng với ba dạng cơ bản
gồm:
Địa y khảm (crustose lichen) có bề dày tản cực kỳ mỏng và bám chặt vào giá thể bằng

các sợi nấm của vùng tuỷ (Error! Reference source not found.-I)
Địa y phiến (foliose lichen) có tản dạng phiến lá, mặt trên và dưới khác biệt rõ rệt.
Tản bám lỏng lẻo trên bề mặt giá thể bằng các rễ giả (Error! Reference source not
found.-II).
Địa y sợi (fruticose lichen) có tản dạng sợi giống như bụi cây nhỏ, đứng trên bề mặt
giá thể và xõa xuống (Error! Reference source not found.-III).

Hình 1. Các dạng tản địa y cơ bản
Vai trị và cơng dụng
Từ lâu đời, các quốc gia Châu Âu sử dụng địa y làm thực phẩm, phẩm nhuộm, nguyên
liệu thô trong sản xuất nước hoa và trị liệu trong y học cổ truyền.
Khoảng 700 tấn địa y Evernia prunastri và Pseudevernia furfuracea (gọi là oakmoss)
được khai thác hàng năm ở Pháp cho ngành công nghiệp nước hoa.
Y học cổ truyền Trung quốc đã sử dụng 71 loài địa y thuộc 17 chi (9 họ) với mục
đích làm thuốc chữa bệnh. Địa y thuộc họ Parmeliaceae, Usneaceae, Cladionaceae
được sử dụng nhiều hơn hết. Một vài loại cao điều chế từ địa y được sử dụng để trị
các bệnh khác nhau như Lobaria pulmonaria trị bệnh về hô hấp, Xanthoria parientina
điều trị vàng da, Usnea spp. để dưỡng tóc, Cetraria islandica (được gọi là Ireland
moss) trị tiêu chảy.

.

9


.

Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp trường

Mở đầu

Một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ địa y
Từ lâu các hợp chất từ địa y được nghiên cứu khá hệ thống ở các quốc gia Châu Âu,
với nhiều hoạt tính sinh học đa dạng [4]:
- Kháng sinh: depside, depsidone và axit usnic có khả năng kháng vi khuẩn Gram
dương.
- Kháng ung thư: axit usnic, protolichesterinic, axit nephrosteranic, polyporic và dẫn
xuất, axit physodalic, các glucan và các dẫn xuất lichenin.
- Kháng HIV: muối sulfate của acetyl glucan từ loài địa y Umbilicaria esculenta
(Miyoshi) Mink. có khả năng ngăn chặn sự phá hoại tế bào của virus HIV trong ống
nghiệm.
- Ngồi ra, một số hợp chất cịn có tác dụng trợ tim (axit pulvinic), giảm đau, hạ sốt
(axit usnic và axit diffractaic), ức chế enzym (axit lecanoric, axit usnic…) và ức chế
sự phát triển của thực vật (axit psoromic, axit virensic, axit usnic…).
Thành phần hóa học của địa y
Có nhiều hệ thống phân loại các hợp chất hóa học từ địa y, trong đó hệ thống phân
loại được sử dụng nhiều nhất là hệ thống phân loại do Shibata và cộng sự đề ra [5].
Các hợp chất hóa học trong địa y được chia làm ba nhóm chính dựa theo nguồn gốc
sinh tổng hợp của chúng.
Nguồn gốc acid shikimic: terphenylquinone và dẫn xuất của acid tetronic.
Nguồn gốc acid mevalonic: terpenoid, steroid
Nguồn gốc polyketide: depside, depsidone, quinones, xanthones, chromones, acid
aliphatic
Các chất chuyển hóa thứ cấp hiện diện với lượng lớn trong địa y và thường dựa vào
chúng để phân loại, do địa y khó phân biệt về mặt hình thái học [4]. Sau đây là một
số nhóm hợp chất thường gặp trong địa y.

.

10

Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp trường

.

Mở đầu

Acid béo
Ngoài các acid béo thường thấy trong thực vật như axit caproic, axit caprylic, axit
linoleic… địa y cịn tích lũy các axit béo mạch nhánh có 17, 19 hoặc 20 carbon. Các
acid béo khơng bão hịa như axit arachidonic cũng hiện diện trong địa y. Các axit
monobasic đều khởi nguồn từ axit protolichesterinic, một α-methylene butyrolactone.
Axit protolichesterinic có cấu trúc kém bền, dễ dàng sắp xếp lại tạo thành dạng
tautomeric, gọi là axit lichesterinic [5].

1

2

Hình 2. Axit protolichesterinic (1) và axit lichesterinic (2)

Dẫn xuất axit pulvinic
Nhiều địa y chứa sắc tố vàng hoặc cam cấu tạo bởi hai đơn vị phenylpropan, mà các
đơn vị 3 carbon của những axit từ địa y này thường là isopropyl. Axit vulpinic, một
methyl ester của axit pulvinic cho thấy tác dụng kháng khuẩn chống lại sinh vật hiếu
khí và kị khí [5]. Ngồi ra cịn có calycin, pulvinamide,… [4].

5

6

Hình 3. Axit pulvinic (3); methyl ester của axit pulvinic (4); calycin (5) và
pulvinamid (6)

Dẫn xuất axit hydroxybenzoic
Ester của axit 4-hydroxybenzoic như methylparaben được dùng làm chất bảo quản
trong dược phẩm, nhanh chóng bị thủy phân trong cơ thể thành axit và bị đào thải
nên độc tính thấp. Do đó, các hợp chất đơn vịng phenol dẫn xuất paraben như methyl
orsellinate, methyl β-orsellinate và methyl hematommate là các hợp chất bảo quản
sát khuẩn tiềm năng [5].

.

11


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp trường

7

.

8

Mở đầu

9

10

Hình 4. Methyl paraben (7), methyl orsellinate (8), methyl β-orsellinate (9) và
methyl hematommate (10)

Depside
Depside là nhóm hợp chất tạo thành do sự ngưng tụ của hai hoặc nhiều axit
hydroxybenzoic, trong đó nhóm carboxyl của phân tử thứ nhất ester hóa với nhóm
hydroxyl phenol của phân tử thứ hai. Có hai loại depside, loại chứa nhóm chức orcinol
như orsellinic, axit confluentic và loại chứa nhóm chức β-orcinol như atranorin, axit
diffractaic [5]…

11

12

13

14

Hình 5. Axit orsellinic (11), axit confluentic (12), atranorin (13) và axit
diffractaic (14)

Depsidone
Depsidone có thêm liên kết ether so với depside chỉ có liên kết ester, tạo thành cấu
trúc vòng cứng nhắc. Các depsidone đều dựa trên cấu trúc vòng 11H-dibenzo[ b,e] [
1,4] dioxepi -11-one. Depsidone cũng có hai loại như depside: orcinol depsidone như
physodic acid, norlobaric acid… và β-orcinol depsidone như salazinic acid, parellic
acid [5].

.

12


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp trường

15

.

16

Mở đầu

17

19

Hình 6. Axit physodic (15), axit norlobaric (16), axit salazinic (17) và axit
parellic (18)

Dẫn xuất của dibenzofuran
Trong nhóm này, những hợp chất phân tử khối nhỏ có cấu trúc usnic acid được nghiên
cứu nhiều nhất. Usnic acid là hợp chất thể hiện hoạt tính kháng sinh có tiềm lực nhất
trong các hợp chất từ địa y, có tác dụng trên rất nhiều chủng vi khuẩn. Ngồi ra nó
cịn kháng ung thư, ngăn cản sự phân bào, có tác dụng hạ sốt và giảm đau [5].

20

Hình 7. Usnic acid

Hợp chất anthraquinon, naphthoquinon và dẫn xuất
Hợp chất chứa nhân anthraquinon phân bố rộng trong tự nhiên, hiện diện nổi bật trong
thực vật bậc cao và nấm nhưng cũng là thành phần quan trọng trong địa y. Các hợp
chất anthraquinone là tác nhân kháng virus, kể cả HIV, đặc biệt là hypericin kháng
virus phiên mã ngược [5].

.

13


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp trường

.

Mở đầu

Napthoquinon là nhóm hợp chất có nguồn gốc từ naphthalen. Đáng chú ý có
naphthazarin có hoạt tính gây độc đối với tế bào ung thư biểu mơ [5].

21

22

23

Hình 8. Anthraquinon (21), hypericin (22) và naphthazarin (23)

Terpenoid, steroid và carotenoid [4]

Như những loài thực vật khác, địa y cũng chứa các hợp chất terpenoid, steroid và
carotenoid quen thuộc trong hóa học hợp chất thiên nhiên. Terpenoid gồm có
monoterpenoid (camphor, limonen, pinen…), diterpenoid (phytol, manol…),
triterpenoid (amyrin, lupeol, pyxinol…).
Steroid như cholesterol, ergosterol, lichesterol… Carotenoid như caroten, lutein,
neoxanthin…
TỔNG QUAN VỂ ĐỊA Y DIRINARIA APPLANATA
Danh pháp
Dirinaria applanata (Fée) D.D.Awasthi là tên chính thức được cơng bố trên tạp chí
Journal of the Indian Botanical Society (1970) bởi Dharani Dhar Awasthi.
Danh pháp khác
Dirinaria consimilis var. ochracea D. D. Awasthi
Lecanora flavostraminea (Müll. Arg.) Zahlbr.
Parmelia applanata Fée
Parmelia redacta Stirt.
Physcia applanata (Fée) Zahlbr.
Physcia flavostramineum Müll. Arg.

.

14


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp trường

.

Mở đầu

Vị trí phân loại

Giới

Fungi

Ngành Ascomycota
Lớp

Lecanoromycetes

Bộ

Teloschistales

Họ

Physciaceae

Chi/Giống
Loài

Dirinaria

Dirinaria applanata

Phân bố
Vùng nhiệt đới châu Á, Âu, Phi (Madagascar), Bắc Mỹ (Mexico), Nam và Trung Mỹ,
Úc, các quần đảo ở Thái Bình Dương (Melanesia, Micronesia, Polynesia).
Mơ tả thực vật [6]
Dirinaria applanata (Fée) D. D. Awasthi là loài địa y dạng phiến thuộc chi Dirinaria,
một chi rất phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt với 36 loài trên thế giới. Tên chi

Dirinaria xuất phát từ chi Dirina Fr. (Roccellaceae) và hậu tố Latin -arius chỉ sự liên
tục của tản địa y, một đặc trưng của các lồi thuộc chi này.
Dirinaria applanata phát triển với kích thước tản khoảng 5-10 cm. Các thùy rộng
0,5-2 mm, dạng lông chim kế tiếp nhau, gấp nếp theo chiều dọc. Bề mặt trên có màu
xám, xám xanh, xám vàng hoặc trắng nhạt, có thể có phủ phấn trắng, sinh sản bằng
các bộ phận dạng chồi vảy phát tán bào tử phấn gọi là “soredia”, có cấu trúc sợi nấm
bao quanh tế bào tảo. Mặt dưới có màu đen ở giữa, rìa màu đen hoặc nâu. Thành phần
hoá học đặc trưng của loài là sự hiện diện của divaricatic acid, một chất kết tinh trong
methanol : nước : glycerol (1:1:1) cho tinh thể có cấu trúc đặc trưng. Thể quả đĩa
(apothecia) rất hiếm gặp, rộng 0,5-1,5 mm, thường gặp màu đen, hiếm khi phủ bột
màu xám. Bào tử túi kích thước 15-22 x 6-8 μm.

.

15


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp trường

.

Mở đầu

Dirinaria applanata được phân biệt với các loài khác cùng chi bởi các thuỳ liên tiếp
xếp sát nhau, gấp nếp theo chiều dọc, đầu thuỳ hình quạt, sinh sản chủ yếu bằng bào
tử phấn (farinose soredia), và có hiện diện acid divaricatic.
PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH ĐỊA Y
Hình thái
Hình thái học: nghiên cứu hình thái học địa y được thực hiện bởi Erik Acharius, ông
được coi là cha đẻ của ngành địa y học [3]. Các nghiên cứu về cấu trúc địa y bắt đầu

hơn một thế kỷ trước khi mà kính hiển vi quang học trở nên phổ biến. Trước 1860,
Schwendener đã mô tả cấu trúc bên trong của một số địa y dạng bụi (fruticose) [7].
Để định danh địa y về bằng hình thái học, người ta sử dụng các thơng số cần thiết sau
đây:
Dạng phát triển: hình thái địa y thường được xác định bằng cách sắp xếp của hệ sợi
nấm. Phần sợi sinh dưỡng của chúng gọi là tản (thallus). Tản là phần nổi của địa y
thường được phân theo nhóm gồm ba dạng cơ bản: dạng khảm (bám chặt vào cơ
chất), dạng phiến (cấu trúc như phiến lá), dạng bụi (như bụi cây). Đại địa y, macrolichen, là địa y thuộc dạng bụi hoặc dạng phiến; tất cả địa y khác gọi là vi địa y,
micro-lichen. Ở đây, thuật ngữ macro và micro khơng liên quan đến kích thước mà
muốn nói đến dạng phát triển [8].
Mặc dù dạng phát triển của địa y rất đa dạng, tuy nhiên hình thái cấu trúc bên trong
của chúng tương tự nhau. Các sợi nấm bao phủ mặt ngoài, tiếp xúc với môi trường,
đan xen chặt chẽ với nhau gọi là vỏ (cortex). Lớp vỏ dày, bện chặt giúp giữ các thành
phần khác bên trong, giảm cường độ ánh sáng tác động xấu đến tế bào tảo. Tế bào vi
tảo phân bố ngay dưới lớp vỏ thành một lớp. Lớp tuỷ (các sợi nấm phân bố thành một
lớp lỏng lẻo) nằm bên dưới lớp tảo. Trong địa y phiến có một lớp vỏ thứ hai ngay
dưới lớp tuỷ, nhưng trong địa y khảm thì các sợi tuỷ gắn trực tiếp vào cơ chất [8].
Phần sinh dưỡng: địa y được xác định bằng một phổ cấu trúc đa dạng về các mô sinh
dưỡng; như rễ giả (rhizine), tomentum, cilia đã được biết đến ở nấm. Các cấu trúc
soredia, isidia, hormocyst, lobule, cyphellae và pseudocyphellae và cephalodia

.

16


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp trường

.

Mở đầu

chuyên biệt cho nấm địa y. Pycnidia và conidia là những bộ phận sinh sản không
cộng sinh (non-symbiotic reproduction parts) [7].
Các nghiên cứu về bề mặt địa y có thể được quan sát bằng mắt thường hoặc kính hiển
vi soi nổi nhằm xác định các đặc điểm dùng trong định danh.
Sinh sản hữu tính: chu trình sinh sản hữu tính thực hiện bởi các nấm túi Ascomycota,
theo các nghiên cứu cơ quan sinh sản hữu tính trên bề mặt tản, địa y có thể được định
danh theo đặc điểm này. Các cơ quan sinh sản gồm mazaedia và apothecia gặp ở các
loài thuộc chi Lecanorine, Lecideine, Biatorine, Zeorin và perithecia gặp ở
Hysterothecia và Pseudothecia [3, 4, 7, 8, 9].
Hóa định danh địa y
Phản ứng tại chỗ (spot test): các phản ứng này được thực hiện nhanh chóng, giúp
định danh lồi địa y. Có bốn thử nghiệm thường quy sử dụng trong địa y học gồm C,
K, KC (Nylander 1866) và PD (Asahina 1934). Phản ứng màu được thực hiện tại chỗ
trên những mảnh địa y mỏng. Lớp vỏ và tuỷ nên được thử nghiệm riêng. Sự thay đổi
màu tại chỗ với các thuốc thử này là chỉ thị cho sự hiện diễn của các thành phần hoá
thực vật nhất định. Trong các khoá định danh [4, 8, 9] kết quả phản ứng tại chỗ được
xem là một tiêu chí quan trọng [7].
Các thành phần hoá học trong địa y thường đặc trưng cho một nhóm lồi nhất định,
do đó chúng được sử dụng cho việc định danh địa y. Những phản ứng nhận biết các
nhóm chất trong địa y thường được thực hiện ngay trên tản gọi là “spot test”, sử dụng
các thuốc thử cho phản ứng tạo màu gồm KOH 10% (K test); Ca(OCl)2 hoặc NaClO
(C test); KOH 10% sau đó là Ca(OCl)2 hoặc NaClO (KC test); p-phenylenediamine
5% trong ethanol (PD test) [8].
Đối với Dirinaria applanata, khi thử nghiệm ở lớp vỏ K + (vàng); C -, KC -, P +
(vàng); lớp tuỷ K -, C -, KC -, P -. Lồi địa y này có thành phần chủ yếu là axit
divaricatic, và lượng nhỏ atranorin, cloroatranorin, 3β-acetoxy-hopane-1β, 22-diol.
Kết tinh tinh thể: năm 1936, Asahina giới thiệu phương pháp này lần đầu tiên để áp
dụng cho việc định danh địa y trên quy mô nhỏ. Phương pháp này được sử dụng rộng

.

17


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp trường

.

Mở đầu

rãi trong nghiên cứu hoá học và phân loại địa y. Tái kết tinh các chất chiết được từ
địa y và quan sát tinh thể của chúng dưới kính hiển vi soi nổi có thể phân biệt các
chất một các chính xác hơn [7].
Sắc ký lớp mỏng: Stahl và Schorn (1961) lần đầu tiên báo cáo về phương pháp này
năm 1961 trong việc tách các hợp chất từ địa y [10]. Nó là một phương pháp vi hoá
học tốt nhất cho các nhà phân loại thực vật nhờ độ nhạy, nhanh chóng, đơn giản, dễ
áp dụng thường quy. Quy trình dựa trên sắc ký bản mỏng dịch chiết địa y và khai
triển bằng hệ dung môi phù hợp, các vết hiển thị bằng thuốc thử hiện màu, UV cho
thấy các nhóm hợp chất khác nhau. Bằng cách đánh giá Rf của mỗi băng và so sánh
với tài liệu tham chiếu, xác định các hợp chất trong địa y, sau đó xác định lồi [7].
Khố phân loại địa y: Các khố được sử dụng để định danh địa y thường có đơi chút
khác nhau, do các tác giả mô tả nghiên cứu địa y ở các vùng khác nhau. Cũng vì vậy
mà khố định danh thường mang tên cụ thể cho địa y của một vùng nhất định. Một
vài khoá định danh thường dùng như Keys to Lichens of North America (Brodo và
Sharnoff (2001) [11], Macrolichens of the Pacific Northwest của B. McCune và
Geiser (1997) [12], Key to the genera of Australian macrolichens của McCarthy và
Malcolm (2004) [13], Lichen flora of the United States của B. Fink (1935) [9] Đặc
biệt hầu hết các địa y được mơ tả trong khố A key to the Macrolichens of India and

Nepal của Awasthi (1988)[14], “A Compendium of the Macrolichens from India,
Nepal and Sri Lanka” của Awasthi (2007) [15], “A key to michrolichens of India,
Nepal and Sri Lanka” của Awasthi (1991) [16]. Một vài khoá phân loại khác được
xuất bản trên website của Bảo tàng thực vật học, Đức (Botanischer Garten und
Botanisches Museum).
PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT [17]
Ngâm là một phương pháp chiết gián đoạn trong đó tồn bộ lượng dung mơi được
tiếp xúc đồng thời với tồn bộ lượng dược liệu trong những dụng cụ thích hợp. Quá
trình chiết xuất xảy ra ở mọi điểm trong thiết bị chiết là như nhau và dịch chiết rút ra
khỏi thiết bị cùng một lúc. Q trình ngâm này có thể lập lại thêm 1 hay vài lần để

.

18


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp trường

.

Mở đầu

chiết kiệt hoạt chất trong dược liệu. sự khuấy trộn, các yếu tố phụ trợ như nhiệt độ,
siêu âm, vi sóng, chất diện hoạt. . .có thể sử dụng để gia tăng q trình chiết. Có nhiều
phương pháp ngâm: ngâm lạnh, ngâm nóng, Soxhlet và Kumagawa, chiết bằng dung
mơi ở nhiệt độ cao.
Ngâm lạnh: dược liệu được ngâm với dung môi ở nhiệt độ phịng, thời gian ngâm
khơng dưới 12 giờ đối với dược liệu mỏng manh hay dược liệu đã xay nhỏ để đảm
bảo q trình chiết được căn bản hồn tất. Trong thời gian này cân bằng về nồng độ
hoạt chất giữa bên trong và bên ngoài thành tế bào được thiết lập và quá trình thẩm

thấu sẽ kết thúc. Thời gian ngâm có thể kéo dài hơn, từ một đến nhiều ngày, tùy theo
dược liệu, loại dung môi và yêu cầu chiết xuất.
PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH
Sắc ký cột chân khơng [17]
Sắc ký cột chân là một kỹ thuật thay đổi từ sắc ký cột cổ điển, cũng có thể xem là sắc
ký cột nhanh khơng tiêu chuẩn, sắc ký cột nhanh là một dạng hấp phụ trên cột pha
thuận khai triển với tốc độ nhanh, về khả năng tách chỉ đạt khả năng tách trung bình.
Ưu điểm: sắc ký cột chân khơng thực hiện nhanh, nạp được nhiều mẫu, ít hao tốn
dung mơi do ít phân đoạn và do thể tích mỗi phân đoạn lớn.
Ứng dụng của sắc ký cột chân không
Tách một hỗn hợp thành vài phân đoạn có độ phân cực khác nhau, thành phần của
các phân đoạn này thì đơn giản. Từ các phân đoạn đơn giản này có thể dễ dàng phân
lập tiếp bằng sắc ký cột cổ điển một cách hiệu quả hơn.
Cung cấp các phân đoạn có khối lượng khá lớn cho các thử nghiệm sinh học nhằm
hướng việc phân lập các hoạt chất một cách tập trung hơn, ít lãng phí công sức, thời
gian và dung môi.
Đôi khi nếu khéo léo điều chỉnh dung mơi, có thể thu được các chất tinh khiết ngay
từ các phân đoạn hứng, nhất là khi mẫu ban đầu là một hỗn hợp đơn giản hoặc có các
vết cách nhau khá xa.

.

19


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp trường

.

Mở đầu

Sắc ký cột cổ điển [17]
Sắc ký cột là loại sắc ký trong đó pha tĩnh được nhồi trong một cột bằng thủy tinh
hay thép không gỉ. Sắc ký cột nhằm mục đích phân lập nhiều hợp chất tinh khiết với
khối lượng lớn từ hỗn hợp nhiều thành phần.
Nguyên tắc của sắc ký cột như sau: Một mẫu thử được nạp lên trên đầu cột chứa chất
chấp phụ (thường là silicagel, nhôm oxid). Cột chứa chất hấp phụ này đóng vai trị là
pha tĩnh. Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo cột sẽ làm di chuyễn
các cấu tử của mẫu thử. Do các cấu tử này có độ phân cực khác nhau nên ái lực của
chúng với pha tĩnh cũng khác nhau, vì vậy chúng sẽ bị dung môi giải hấp và đẩy đi
với các vận tốc khác nhau, tạo thành các băng có vị trí khác nhau, ra khỏi cột tại các
các thời điểm khác nhau.
Các cơ chế thông dụng trong sắc ký cột bao gồm hấp phụ và phân bố.
Hấp phụ là một hiện tượng xảy ra khi mẫu ở dạng pha lỏng hay khí bị giữ lại trên bề
mặt của một pha rắn. Sắc ký hấp phụ là quá trình sắc ký dựa vào sự khác nhau về lực
hấp phụ giữa bề mặt pha tĩnh và cấu tử, lực giải hấp phụ của pha động với các cấu tử.
Quá trình giải hấp phụ sẽ xảy ra đối với cấu tử A khi lực giải hấp phụ Fm của pha
động lớn hơn tổng số lực tương tác của pha tĩnh và của cấu tử. Trong phân tích và
phân lập các hợp chất tự nhiên từ thực vật, thường sử dụng nhất là các kỹ thuật sắc
ký hấp phụ trên cột và lớp mỏng với chất hấp phụ là silica gel pha thuận hay nhôm
oxyd.
Phân bố là một hiện tượng vật lý theo đó mẫu thử được phân bố đồng thời vào hai
pha lỏng không tan trong nhau. Trong sắc ký phân bố, hai pha lỏng này là pha tĩnh
và pha động. Cơ chế phân bố còn được gọi là cơ chế tách lỏng - lỏng. Pha lỏng thứ
nhất là pha tĩnh được tẩm lên bề mặt hoặc được hút vào các xoang của một giá xốp
(ví dụ silicagel RP – 18, giấy sắc ký, bột cellulose…). Pha lỏng thứ hai là pha động
được cho chảy xuyên qua hệ thống giá và pha tĩnh. Nếu mẫu thử tan nhiều trong pha
động hơn thì nó sẽ bị pha động kéo đi nhanh hơn. Ngược lại, nếu mẫu thử tan nhiều
trong pha tĩnh hơn thì nó sẽ bị giữ lại lâu hơn.

.

20


.

Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp trường

Mở đầu

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TÁC DỤNG KHÁNG VI SINH VẬT
Phương pháp khuếch tán
Phương pháp này dựa vào sự khuếch tán của chất thử từ giếng đổ đầy dung dịch chất
thử hoặc từ đĩa giấy đã tẩm chất thử vào môi trường. Nếu chất thử có tác dụng sẽ ức
chế sự phát triển của vi nấm hoặc vi khuẩn tạo thành vòng ức chế xung quanh đĩa
hoặc giếng. Từ đường kính vịng ức chế có thể sơ bộ đánh giá mức độ tác động của
chất thử.
Phương pháp pha loãng
Chất thử được pha loãng (bằng phương pháp hòa tan hay phân tán) trong dung mơi
thích hợp rồi trộn chung vào mơi trường ni cấy vi sinh vật (môi trường thạch) thành
một dãy nồng độ từ cao đến thấp.
Dịch vi sinh vật được chấm trực tiếp lên bề mặt đĩa thạch. Sau thời gian ủ, sự có mặt
của các khóm vi sinh thể hiện sự phát triển của chúng.
Hoạt lực kháng vi sinh vật của chất thử được xác định dựa vào nồng độ tối thiểu của
chất thử ức chế sự phát triển của vi sinh vật thử nghiệm (MIC). Trị số MIC càng thấp,
chất thử có tác dụng càng mạnh. Kết quả của phương pháp này cũng mang ý nghĩa
định lượng.
Phương pháp hiện hình sinh học (Bioautography) [18]
Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào phương pháp khuếch tán trên thạch. Hiện nay

có 2 kỹ thuật hiện hình sinh học được sử dụng:
Kỹ thuật hiện hình sinh học tiếp xúc (contact bioautography): Các bản sắc ký sau khi
khai triển bằng hệ dung mơi thích hợp được đặt trên bề mặt thạch đã cấy vi sinh vật
để chất thử khuếch tán. Các vết cho hoạt tính kháng vi sinh vật trên bản SKLM sẽ
cho vòng ức chế vi sinh vật trên đĩa thạch.
Kỹ thuật hiện hình sinh học trực tiếp: Kỹ thuật này phủ vi sinh vật trực tiếp lên bản
thạch, tiến hành ủ trong thời gian thích hợp sau đó phát hiện bằng cách phun thuốc
thử tetrazolium để hiện màu tại những vị trí vi khuẩn không bị ức chế. Vùng sáng là
vùng vi khuẩn bị ức chế.

.

21


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp trường

.

Mở đầu

Kỹ thuật hiện hình sinh học ngâm (agar - overley bioautography): Bản SKLM sẽ
được ngâm hoặc che phủ bằng môi trường thạch, sau đó vi sinh vật thử nghiệm được
cấy lên tấm sắc ký và đem đi ủ. Sau thời gian thích hợp, vi sinh vật sẽ phát triển trên
mặt bản SKLM tại vị trí khơng có chất ức chế.
TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
Trên thế giới, địa y đã được nghiên cứu từ lâu, đặc biệt là các quốc gia vùng ôn đới,
cực lạnh, nơi mà địa y rất phát triển.
Địa y tại Việt Nam từ lâu ít được quan tâm nghiên cứu. Trong 5 năm gần đây, về mặt
thành phần hố học, nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Kim Phi Phụng và cộng

sự đã tiến hành khá đầy đủ và hệ thống trên một số loài địa y nhiệt đới thuộc chi
Parmotrema và Roccella [19, 20, 21]. Các tác giả đã phát hiện được 15 hợp chất mới,
11 hợp chất lần đầu tiên biết đến trên hai chi này; hợp chất parmoether B có hoạt tính
độc tế bào mức độ trung bình với giá trị IC50 36,53 ± 2,35; 22,36 ± 3,61; 44,80 ±
7,34 μM lần lượt đối với ba dòng tế bào ung thư NCI-H460, MCF-7, và HepG2.
Thành phần hố học của lồi Dirinaria applanata thu hái tại Đại học Cần Thơ đã
được nghiên cứu bởi Nguyễn Trọng Tuân và cộng sự nhưng chưa có các cơng bố
chính thức.
Về địa y ni cấy, Lê Hồng Duy đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy thành phần vi
nấm của một số địa y thu hái ở Việt Nam, tuy nhiên đề tài này được thực hiện tại Hàn
Quốc [22, 23, 24, 25, 26].
3. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Địa y Dirinaria applanata được thu hái trên thân dừa Cocos nucifera tại huyện Giồng
Trơm, tỉnh Bến Tre trong bán kính 1 km quanh vị trí tọa độ 10,14 Bắc, 106,52 Đông.

.

22


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp trường

.

Mở đầu

Hình 9. Địa điểm thu hái mẫu địa y Dirinaria applanata
Vi sinh vật thử nghiệm
Vi khuẩn chỉ thị trong các thử nghiệm kháng khuẩn, kháng nấm là các chủng ATCC

và từ bệnh phẩm được lưu chủng cấp 2 ở điều kiện -35 °C tại Bộ môn Vi sinh – Ký
sinh, Khoa Dược, Đại học Y Dược (BMVKS). Chủng được cấy chuyền ít nhất hai
lần sau khi rã đông từ ống chủng cấp 2.
Bảng 1. Các chủng vi sinh vật dùng trong thử nghiệm
TÊN VI SINH VẬT

MÃ SỐ

Methicillin susceptible Staphylococcus aureus

ATCC 29213

LƯU TRỮ
BMVKS

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

ATCC 43300

BMVKS

Streptococcus faecalis

ATCC 29212

BMVKS

Klebsiella pneumoniae

ATCC 35657

BMVKS

Pseudomonas aeruginosa

ATCC 27853

BMVKS

Escherichia coli

ATCC 25922

BMVKS

Candida albicans

ATCC 10231

BMVKS

.

23


.

Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp trường

Mở đầu

TÊN VI SINH VẬT

MÃ SỐ

Candida glablata

ND31

LƯU TRỮ
BMVKS

Candida tropicalis

PNT20

BMVKS

Trichophyton rubrum

DL01

BMVKS

Microporum canis

VB2

BMVKS

Dụng cụ và thiết bị
Các thiết bị sử dụng trong đề tài được trình bày trong Error! Reference source not
found..
Bảng 2. Các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong đề tài
TÊN THIẾT BỊ

NHÃN HIỆU

NGUỒN GỐC

Nồi hấp

Hirayama

Nhật

Tủ sấy

Memmert

Đức

Cân phân tích

Precisa XB 220A

Thụy Sĩ

Tủ cấy

AVC – 4A1

Mỹ

Tủ ấm

RI 28 -2

Mỹ

Máy vortex

3412EU

Đức

Máy đo quang

Simadzu

Nhật

Bếp cách thủy

Memmert WB – 14

Đức

Máy cơ quay

IKA-RV

Nhật

Máy đo độ ẩm

Ohaus MB45

Mỹ

Ngồi ra cịn các thiết bị, dụng cụ như: kính hiển vi, bếp điện, bếp cách thủy, đèn UV,
ống nghiệm các loại, que cấy, đĩa petri, thước đo vịng vơ khuẩn, kẹp vơ trùng, pipet,
micropipet, đầu típ các loại.

.

24


Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp trường

.

Mở đầu

Hóa chất, dung mơi
Bảng 3. Hóa chất và dung mơi
STT

HĨA CHẤT

NGUỒN GỐC

1

n-hexan

Việt Nam

2

Cloroform

Việt Nam

3

Ethyl acetat

Trung Quốc

4

Methanol

Trung Quốc

5

Ethanol

Trung Quốc

6

Dimethyl sulfoxide

Merck

7

Silicagel cỡ vừa

Ấn Độ

.

25