Khảo sát tác động trên sự tăng sinh in vitro của tế bào đơn nhân máu ngoại vi người (pbmcs) và hoạt tính chống oxy hóa của một số dược liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
-----------------

LÊ THỊ THẢO NGUYÊN

KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG TRÊN SỰ TĂNG SINH IN VITRO CỦA TẾ
BÀO ĐƠN NHÂN MÁU NGOẠI VI NGƯỜI (PBMCs) VÀ HOẠT TÍNH
CHỐNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU

Luận văn Thạc sĩ Dược học

Thành phố Hồ Chí Minh - 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
-----------------

LÊ THỊ THẢO NGUYÊN

KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG TRÊN SỰ TĂNG SINH IN VITRO CỦA TẾ
BÀO ĐƠN NHÂN MÁU NGOẠI VI NGƯỜI (PBMCs) VÀ HOẠT TÍNH
CHỐNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU

Ngành: Dược lý và Dược lâm sàng
Mã số: 8720205

Luận văn Thạc sĩ Dược học
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Nguyễn Thị Minh Thuận

Thành phố Hồ Chí Minh – 2018


iii

LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong
luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ cơng trình nào
khác.

Lê Thị Thảo Ngun


iv

Luận văn thạc sĩ – Khóa 2016 -2018
Ngành: Dược lý và Dược lâm sàng – Mã ngành: 8720205
KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG TRÊN SỰ TĂNG SINH IN VITRO CỦA TẾ BÀO
ĐƠN NHÂN MÁU NGOẠI VI NGƯỜI (PBMCs) VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG
OXY HÓA CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU
Lê Thị Thảo Nguyên
Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Minh Thuận

Từ khóa: chiết xuất dược liệu, PBMCs, interleukin – 2, TCD3+/CD4+,
TCD3+/CD8+, độc tế bào, chống oxy hóa.
Mở đầu: Hệ miễn dịch đóng vai trò quan trọng trong bảo vệ cơ thể khỏi các tác
nhân có hại. Tuy nhiên, khi hệ miễn dịch hoạt động thấp hoặc quá mức có thể gây
ra các bệnh lý suy giảm miễn dịch, quá mẫn hoặc viêm, bệnh tự miễn. Hiện nay có
nhiều dược liệu dùng trong điều trị các bệnh liên quan đến hệ miễn dịch, tuy nhiên
cơ chế tác động còn chưa rõ. Đề tài được thực hiện nhằm khảo sát ảnh hưởng của
một vài dược liệu ở Việt Nam trên sự tăng sinh in vitro tế bào PBMCs, đồng thời
khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các dược liệu này.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Tế bào PBMCs được phân lập từ máu
toàn phần người khỏe mạnh. Thử nghiệm MTT được dùng để khảo sát tác động của
13 cao cồn 96% dược liệu và 24 cao phân đoạn trên sự tăng sinh in vitro PBMCs.
Định lượng interleukin – 2 (IL – 2) tiết ra bởi PBMCs trong mơi trường có cao phân
đoạn bằng phương pháp ELISA. Chọn cao ức chế mạnh nhất, đánh giá sự gây chết
theo chu trình (apoptosis) và thay đổi tỷ lệ TCD3+/CD4+ và TCD3+/CD8+ bằng
phương pháp đếm tế bào theo dịng. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cao toàn
phần và phân đoạn bằng thử nghiệm DPPH.
Kết quả: 6 cao toàn phần ức chế và 2 cao toàn phần kích thích tăng sinh PBMCs đã
được xác định. Các phân đoạn cao ức chế làm giảm sự tiết IL – 2, trong khi các cao
kích thích khơng làm tăng IL – 2 so với nhóm chứng. Cao sài đất phân đoạn
cloroform ức chế tăng sinh PBMCs mạnh nhất (IC50 =16,12 ppm), làm tỷ lệ
apoptosis tăng 19,1% (p < 0,05) và tỷ lệ TCD3+/CD4+ giảm 4,18% so với nhóm
chứng. Cao trầu khơng phân đoạn cloroform có tính chống oxy hóa mạnh gấp 2,1
lần (EC50 = 1,94 ppm) so với vitamin C.
Kết luận: Cao sài đất cloroform ức chế tăng sinh PBMCs mạnh nhất với IC50 =
16,12 ppm. Kết quả trong nghiên cứu này là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo để
xác định chất có hoạt tính ức chế tăng sinh PBMCs trong cây sài đất để ứng dụng
trong điều trị các bệnh lý liên quan đến miễn dịch.

v

Master’s Thesis – Acedemic course: 2016 – 2018
Specialty: Pharmacology and Clinical Pharmacy – Code: 8720205
STUDY ON THE EFFECT OF SOME MEDICINAL PLANTS ON IN VITRO
PROLIFERATION OF PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS
AND THEIR ANTIOXIDANT ACTIVITY
Thao Nguyen Le Thi
Supervisor: Dr. Minh Thuan Nguyen Thi
Keywords: plant extracts, PBMCs, Interleukine – 2, TCD3+CD4+, TCD3+CD8+,
cytotoxicity, antioxidant.
Introduction
The immune system plays an essential role in safeguarding our body from surrounding
detrimental factors in the environment. Nevertheless, when this system functions
abnormally (underactive or overactive), it can result in immune-related diseases, namely
immunodeficiency, hypersensitivity, inflammation, or autoimmune diseases. Medicinal
plants have been used widely in the treatment of immune-related diseases, yet little is
known about their mechanisms of action. Therefore, this study was conducted to study the
effect of some medicinal plants on in vitro proliferation of peripheral blood mononuclear
cells and their antioxidant activity.
Materials and methods
PBMCs isolated from whole blood of healthy donors. MTT assay was used to evaluate the
effect of thirteen extracts in 96% ethanol and twenty four fractionated extracts on PBMCs
in vitro proliferation. IL – 2 concentrations secreted by extracts – treated PBMCs were
quantitated using ELISA. The plant extract that showed the strongest inhibitory effect on
PBMCs in vitro proliferation was chosen to evaluate the apoptosis/necrosis and ratios of
TCD3+/CD4+ and TCD3+/CD8+ of PBMCs. Antioxidant activities of 96% ethanol
extracts and fractionated extracts were assessed using the DPPH method.
Results
Of the 13 ethanol 96% extracts, 6 extracts inhibited and 2 extracts stimulated the in vitro

proliferation of PBMCs. The extracts with inhibitory effects reduced the amount of IL – 2,
whilst the extracts with stimulatory effects were unable to increase the amount of IL – 2
compared to untreated cells (control). The chloroform extract of Wedelia chinesis showed
strongest inhibitory activity with an IC50 value of 16.1 ppm, exerting an increase of 19.1%
in apoptosis and a decrease of 4.18% in TCD3+/CD4+ ratio compared to untreated cells.
The chloroform extract of Piper betle showed a strong antioxydant activity with an EC50
of 1.94 ppm, as 2.1 times higher than that of vitamin C.
Conclusion
The chloroform extract of Wedelia chinensis had a potential of being used in the treatment
of autoimmune diseases. Further studies are needed to isolate and identify the compounds
that contribute to this activity.


vi

MỤC LỤC

1.1. Tổng quan về mơ hình PBMCs in vitro ...............................................................3
1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm tế bào PBMCs ............................................................3
1.1.1.

Cách phân lập PBMCs ...................................................................................4

1.1.2.

Ứng dụng của PBMCs trong nghiên cứu khoa học .......................................4

1.1.2. Các phương pháp đo lường sự tăng sinh in vitro PBMCs ................................6
1.2. Stress oxy hóa ......................................................................................................8
1.3. Một số hợp chất có tính chống oxy hóa ...............................................................9

1.4. Các phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa in vitro ............................10
1.5. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .....................................................................10
1.5.1. Ứng dụng y học cổ truyền trong điều trị bệnh lý miễn dịch ...........................10
1.5.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ..................................................................15

2.1. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................21


vii

2.2. Hóa chất, thuốc thử, nguyên vật liệu..................................................................22
2.2.1. Các dược liệu khảo sát ....................................................................................22
2.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất - thuốc thử ..............................................................23
2.3.1. Thiết bị ............................................................................................................23
2.3.2. Dụng cụ ...........................................................................................................24
2.3.3. Hóa chất – thuốc thử .......................................................................................24
2.4. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ...............................................................25
2.4.1. Quy trình điều chế cao tồn phần ethanol 96% ..............................................25
2.4.2. Phân lập PBMCs .............................................................................................27
2.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của dung môi DMSO lên sự tăng sinh in vitro PBMCs
bằng thử nghiệm MTT ..............................................................................................27
2.4.4. Khảo sát ảnh hưởng của các cao toàn phần ethanol trên sự tăng sinh in vitro
PBMCs bằng thử nghiệm MTT.................................................................................28
2.4.5. Khảo sát ảnh hưởng của các cao chiết phân đoạn trên sự tăng sinh in vitro
PBMCs bằng thử nghiệm MTT.................................................................................30
2.4.6. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cao dược liệu tồn phần và phân đoạn
bằng thử nghiệm DPPH ............................................................................................31
2.4.7. Đánh giá tác động của cao chiết phân đoạn trên quá trình apoptosis/necrosis
của PBMCs bằng phương pháp nhuộm Annexin V và Propidium iodide (PI). ........32
2.4.8. Đánh giá tác động của các cao chiết phân đoạn trên sự sản xuất Interleukin –

2 của PBMCs.............................................................................................................33
2.4.9. Đánh giá sự thay đổi tỷ lệ TCD3+/CD4+ và TCD3+/CD8+ trong các tế bào
lympho T dưới tác động của cao chiết phân đoạn ức chế mạnh nhất sự tăng sinh tế
bào PBMCs ...............................................................................................................34
2.4.10. Phân tích thống kê .........................................................................................35


viii

3.1. Dược liệu ............................................................................................................36
3.1.1. Độ ẩm và độ tro toàn phần ..............................................................................36
3.1.2. Chiết cao cồn toàn phần ..................................................................................37
3.2. Khảo sát độc tính của DMSO trên PBMCs........................................................38
3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các cao chiết dược liệu toàn phần trên sự tăng
sinh in vitro PBMCs ..................................................................................................40
3.4. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật các dược liệu có hoạt tính trên sự tăng
sinh in vitro PBMCs ..................................................................................................50
3.5. Quy trình chiết các cao phân đoạn bằng phương pháp lắc phân bố lỏng – lỏng51
3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các cao chiết phân đoạn trên sự tăng sinh in
vitro PBMCs..............................................................................................................52
3.6.1. Nhóm cao có hoạt tính kích thích tăng sinh in vitro PBMCs .........................52
3.6.2. Nhóm cao có hoạt tính ức chế tăng sinh in vitro PBMCs ...............................54
3.7. Phân tích sơ bộ các thành phần trong cao phân đoạn ........................................61
3.7.1. Nhóm cao có hoạt tính kích thích tăng sinh in vitro PBMCs .........................61
3.7.2. Nhóm cao có hoạt tính ức chế tăng sinh in vitro PBMCs ...............................62
3.8. Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cao dược liệu toàn phần và phân
đoạn bằng thử nghiệm DPPH ....................................................................................63
3.9. Đánh giá tác động gây độc của cao chiết phân đoạn lên tế bào PBMCs bằng
phương pháp nhuộm Annexin V và Propidium iodide (PI) ......................................65
3.10. Kết quả đánh giá tác động của các cao chiết phân đoạn trên sự sản xuất IL – 2

của PBMCs................................................................................................................66


ix

3.11. Kết quả đánh giá sự thay đổi tỷ lệ TCD3+/CD4+ và TCD3+/CD8+ trong các
tế bào lympho T dưới tác động của cao chiết phân đoạn ức chế mạnh nhất sự tăng
sinh tế bào PBMCs ....................................................................................................67

4.1. Độc tính của DMSO trên PBMCs ......................................................................69
4.2. Thử nghiệm MTT để đánh giá tác động của các cao chiết trên sự tăng sinh in
vitro PBMCs..............................................................................................................70
4.2.1. Khả năng chống oxy hóa của cao dược liệu toàn phần và các cao phân đoạn71
4.3. Mối liên quan giữa khả năng chống oxy hóa và khả năng chống tăng sinh
PBMCs in vitro .........................................................................................................72
4.4. Đánh giá về phân đoạn cao có hoạt tính ức chế tăng sinh in vitro PBMCs .......72
4.5. Ảnh hưởng của các cao chiết phân đoạn lên sự sản xuất IL – 2 của PBMCs ....73
4.6. Đánh giá tác động gây độc của cao chiết phân đoạn lên tế bào PBMCs bằng
phương pháp nhuộm Annexin V và PI......................................................................74
4.7. Đánh giá sự thay đổi tỷ lệ TCD3+/CD4+ và TCD3+/CD8+ trong các tế bào
lympho T dưới tác động của cao chiết phân đoạn ức chế mạnh nhất sự tăng sinh tế
bào PBMCs ...............................................................................................................75


x

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Chữ tắt

Từ nguyên

ADN

Acid deoxyribonucleic

CL

Chloroform

DĐVN V

Ý nghĩa tiếng Việt

Cloroform
Dược điển Việt Nam V

DPPH

1,1 – diphenyl – 2 –picrylhydrazyl

EA

Ethyl acetate

Ethyl acetat

EC50

Effective concentration of 50%

Nồng độ hiệu quả 50%

IC50

Inhibition concentration of 50%

Nồng độ ức chế 50%

IFN - γ

Interferon gamma

IL – 2

Interleukin – 2

IL – 12

Interleukin -12

LSC

Liquid scintillation counting

Máy đếm phóng xạ

MHC

Major Histocompatibility Complex

Phức hợp phù hợp mơ
chính

Mơi trường ni cấy
hoàn chỉnh

MTNCHC
MTT

dye 3 – [4,5 – dimethylthiazol – 2 –yl]
– 2, 5 – diphenyl tetrazolium bromide

NK cells

Natural Killer cells

Các tế bào giết tự nhiên

OD

Optical density

Mật độ quang

PBMCs

Peripheral blood mononuclear cells

Tế bào đơn nhân máu
ngoại biên

xi

PGE2

Prostaglandin E2

PI

Propidium iodide

PHA

Phytohemagglutinin

ROS

Reactive Oxygen Species

Các gốc oxy phản ứng

RPMI – 1640

Roswell Park Memorial Institute
medium 1640

Môi trường RPMI - 1640

Te

Effector T cell

Tế bào T hiệu ứng

TP

Toàn phần


xii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1-1. Máu ngoại vi sau khi chiết với mơi trường tách tỷ trọng ...........................4
Hình 2-1. Ngun tắc của thử nghiệm DPPH ...........................................................31
Hình 3-1. Độc tính của DMSO trên PBMCs. ...........................................................39
Hình 3-2. Ảnh hưởng của cao cam thảo bắc tồn phần lên sự tăng sinh PBMCs ....40
Hình 3-3. Ảnh hưởng của cao muồng trâu toàn phần lên sự tăng sinh PBMCs .......41
Hình 3-4. Ảnh hưởng của cao sài đất tồn phần lên sự tăng sinh PBMCs ...............42
Hình 3-5. Ảnh hưởng của cao hoàng kỳ toàn phần lên sự tăng sinh PBMCs ...........42
Hình 3-6. Ảnh hưởng của cao trầu khơng tồn phần lên sự tăng sinh PBMCs ........43
Hình 3-7. Ảnh hưởng của cao tơ mộc tồn phần lên sự tăng sinh PBMCs ..............44
Hình 3-8. Ảnh hưởng của cao trà xanh tồn phần lên sự tăng sinh PBMCs ............44
Hình 3-9. Ảnh hưởng của cao kim ngân hoa toàn phần lên sự tăng sinh PBMCs....45
Hình 3-10. Ảnh hưởng của cao ngũ gia bì chân chim tồn phần lên sự tăng sinh
PBMCs ......................................................................................................................46
Hình 3-11. Ảnh hưởng của cao vàng đắng tồn phần lên sự tăng sinh PBMCs .......46
Hình 3-12. Ảnh hưởng của cao đương quy toàn phần lên sự tăng sinh PBMCs ......47
Hình 3-13. Ảnh hưởng của cao ngưu tất nam tồn phần lên sự tăng sinh PBMCs ..48
Hình 3-14. Ảnh hưởng của cao thảo quyết minh toàn phần lên sự tăng sinh PBMCs

...................................................................................................................................48
Hình 3-15. Ảnh hưởng của các phân đoạn cao hồng kỳ lên sự tăng sinh PBMCs .52
Hình 3-16. Ảnh hưởng của các phân đoạn cao cam thảo bắc lên sự tăng sinh
PBMCs ......................................................................................................................53
Hình 3-17. Ảnh hưởng của các phân đoạn sài đất lên sự tăng sinh PBMCs ............54
Hình 3-18. Ảnh hưởng của các phân đoạn tô mộc lên sự tăng sinh PBMCs ............55


xiii

Hình 3-19. Ảnh hưởng của các phân đoạn ngũ gia bì chân chim lên sự tăng sinh
PBMCs ......................................................................................................................56
Hình 3-20. Ảnh hưởng của các phân đoạn muồng trâu lên sự tăng sinh PBMCs ....57
Hình 3-21. Ảnh hưởng của các phân đoạn kim ngân hoa lên sự tăng sinh PBMCs .58
Hình 3-22. Ảnh hưởng của các phân đoạn trầu không lên sự tăng sinh PBMCs .....59
Hình 3-23. Tế bào PBMCs cụm lại trong mẫu có PHA (A) và khơng có PHA (B) .65
Hình 3-24. Tỷ lệ tế bào apoptosis ở nhóm chứng (A) và ở nhóm thử với cao sài đất
phân đoạn cloroform ở nồng độ IC50 16,12 ppm (B) ................................................66


xiv

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1-1. Một số dược liệu có hoạt tính ức chế miễn dịch ......................................11
Bảng 1-2. Một số dược liệu có hoạt tính tăng sinh miễn dịch ..................................12
Bảng 1-3. Một số dược liệu có hoạt tính chống oxy hóa ..........................................14
Bảng 1-4. Thành phần hóa học và tác dụng dược lý của các dược liệu trong nghiên
cứu .............................................................................................................................16
Bảng 2-1. Đặc điểm người tình nguyện cho máu .....................................................21
Bảng 2-2. Danh mục các dược liệu được sử dụng trong nghiên cứu ........................22

Bảng 2-3. Danh sách dược liệu khảo sát được cung cấp bởi khoa Dược, Đại học Lạc
Hồng ..........................................................................................................................25
Bảng 2-4. Danh sách dược liệu thu hái tại tỉnh Đồng Nai tháng 09/2017 ................26
Bảng 3-1. Kết quả thử độ ẩm của các mẫu bột dược liệu .........................................36
Bảng 3-2. Kết quả thử độ tro toàn phần của các mẫu bột dược liệu .........................37
Bảng 3-3. Hiệu suất chiết cao cồn toàn phần ............................................................38
Bảng 3-4. Độc tính của DMSO trên PBMCs ............................................................39
Bảng 3-5. Phân nhóm tác động cao cồn toàn phần các dược liệu lên sự tăng sinh in
vitro PBMCs theo kết quả thử nghiệm MTT ............................................................49
Bảng 3-6. Kết quả hóa sơ bộ thành phần hóa thực vật của các cây dược liệu ..........50
Bảng 3-7. Bảng tổng kết các giá trị IC50 hoặc EC50 của các cao phân đoạn trên sự
tăng sinh in vitro PBMCs ..........................................................................................60
Bảng 3-8. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của các phân đoạn dược
liệu kích thích ............................................................................................................61
Bảng 3-9. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của các phân đoạn cao
dược liệu ức chế PBMCs...........................................................................................62


xv

Bảng 3-10. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của các phân đoạn cao
dược liệu ức chế PBMCs...........................................................................................63
Bảng 3-11. Khả năng chống oxy hóa của các cao toàn phần và phân đoạn bằng thử
nghiệm DPPH............................................................................................................64
Bảng 3-12. Ảnh hưởng của các cao chiết phân đoạn lên sự sản xuất IL – 2 của
PBMCs ......................................................................................................................66
Bảng 3-13. Sự thay đổi tỷ lệ TCD3+/CD4+ và TCD3+/CD8+ của mẫu thử với cao
sài đất cloroform và mẫu chứng ................................................................................68

1

MỞ ĐẦU
Các bệnh lý liên quan đến rối loạn hệ miễn dịch ngày càng phổ biến. Nguyên nhân
có thể do tình trạng suy giảm miễn dịch hoặc do đáp ứng miễn dịch quá mức cần
thiết. Trong trường hợp sức đề kháng của cơ thể giảm, cơ thể dễ bị tấn cơng bởi các
tác nhân gây bệnh bên ngồi như virus, vi khuẩn, nấm,… và dễ mắc các bệnh lý
nhiễm trùng, viêm nhiễm, ung thư… Mặt khác, nếu đáp ứng miễn dịch trở nên quá
mạnh, trong một số trường hợp chống lại chính cơ thể, gây ra các bệnh lý tự miễn
(autoimmune diseases) như viêm khớp dạng thấp, thấp khớp, lupus, vảy nến, hen
suyễn…[83]. Hiện nay, việc điều trị các bệnh lý suy giảm miễn dịch và bệnh tự
miễn chủ yếu sử dụng các thuốc Tây Y. Tuy nhiên, việc sử dụng kéo dài các thuốc
này cũng đem đến những bất lợi đáng kể cho bệnh nhân do những tác dụng phụ của
thuốc, hơn nữa có thể làm tăng chi phí điều trị dài hạn. Trong dân gian, rất nhiều bài
thuốc y học cổ truyền được người dân sử dụng từ hàng ngàn năm qua trong điều trị
các bệnh lý liên quan đến bất thường hệ miễn dịch. Việc sử dụng các dược liệu
trong y học cổ truyền mang lại những lợi ích nhất định cho bệnh nhân như giảm các
tác dụng phụ khi sử dụng thuốc một cách đáng kể khi so sánh với dùng thuốc Tân
dược. Điều này mở ra một hướng nghiên cứu mới đầy tiềm năng cho Dược học hiện
đại bởi sự đa dạng và có sẵn của nguồn nguyên liệu dược liệu.
Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu nhằm tìm hiểu, đánh giá tính hiệu
quả của các dược liệu trong điều trị các bệnh liên quan đến hệ thống miễn dịch. Các
nghiên cứu này có quy mơ từ in vitro cho đến in vivo, được thực hiện nhằm đánh
giá hiệu quả của các dược liệu có nguồn gốc tự nhiên trong sự tăng sinh, hoạt hóa
các tế bào miễn dịch cho đến ức chế, giảm hoạt tính của chúng
[4],[16],[28],[38],[41],[78]. Một trong những mơ hình được sử dụng rộng rãi là mơ
hình in vitro nuôi cấy tế bào miễn dịch đơn nhân phân lập từ máu ngoại vi người
(PBMCs) để thử hoạt tính làm tăng sinh hoặc ức chế miễn dịch của dược liệu.

2

Với mong muốn tìm kiếm ra dược liệu có khả năng kích thích hoặc ức chế sự tăng
sinh tế bào lympho miễn dịch để ứng dụng trong điều trị, chúng tôi thực hiện đề tài
“Khảo sát tác động trên sự tăng sinh in vitro của tế bào đơn nhân máu ngoại vi
người (PBMCs) và hoạt tính chống oxy hóa của một số dược liệu” với các mục
tiêu cụ thể sau:
1.

Khảo sát tác động của các cao chiết toàn phần dược liệu trên sự tăng sinh in

vitro tế bào đơn nhân được phân lập từ máu ngoại vi người (PBMCs) bằng phương
pháp MTT
2.

Khảo sát tác động của các cao chiết phân đoạn dược liệu trên sự tăng sinh in

vitro PBMCs bằng phương pháp MTT
3.

Đánh giá tác động của các cao chiết phân đoạn trên sự sản xuất IL–2 của

PBMCs.
4.

Đánh giá tác động chống oxy hóa của các cao chiết phân đoạn dược liệu

bằng phương pháp DPPH
5.

Đánh giá tác động gây độc của cao chiết phân đoạn ức chế mạnh nhất sự tăng

sinh tế bào PBMCs bằng phương pháp dùng Annexin V/PI
6.

Đánh giá sự thay đổi tỷ lệ T CD3+/CD4+ và T CD3+/CD8+ trong các tế bào

lympho T dưới tác động của cao chiết phân đoạn ức chế mạnh nhất sự tăng sinh tế
bào PBMCs


3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về mơ hình PBMCs in vitro
1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm tế bào PBMCs
Các tế bào đơn nhân máu ngoại biên người (human peripheral blood mononuclear
cells – PBMCs) là tế bào máu có một nhân trịn (ví dụ lymphocytes, monocytes,
natural killer cells (NK cells) hoặc dendritic cells). Phần tế bào tương ứng với hồng
cầu và tế bào đa nhân (neutrophiles, basophils, và eosinophils) được loại bỏ khỏi
máu toàn phần nhờ ly tâm chênh lệch tỷ trọng. Dung dịch Ficoll với tỷ trọng 1,077
g/mL tách máu toàn phần thành 2 phần; PBMCs chiếm phần tế bào nằm ở phân
đoạn tỳ trọng thấp hơn 1,077 (lớp trên), trong khi hồng cầu và tế bào đa nhân có tỷ
trọng cao hơn và được tìm thấy ở lớp dưới.
PBMCs là một hỗn hợp các tế bào bao gồm tế bào lympho (lympho T, lympho B và
tế bào NK), monocyte và tế bào dendritic. Tần suất các tế bào này biến động giữa cá
nhân nhưng thông thường tế bào lympho (lymphocyte) sẽ trong khoảng 70 – 90%,
monocyte từ 10 – 20%, tế bào dendritic khá hiếm chiếm khoảng 1 – 2%. Tần suất
các loại tế bào trong dân số lymphocyte bao gồm 70 – 85% T CD3+, 5 – 10%
lympho B CD19+, khoảng 5 – 20% tế bào NK CD3-CD16+CD56+ . T CD3+ bao

gồm T CD3+CD4+ (25 – 60% PBMCs) và T CD3+CD8+ (5 – 30% PBMCs) với tỷ
lệ khồng 2:1. T CD4+ hay cịn gọi là tế bào T giúp đỡ có thể được chia ra thành
các subtype chức năng dựa trên biểu hiện cytokines, marker bề mặt hoặc yếu tố
phiên mã. Sau khi được hoạt hóa, T CD4+ có thể biệt hóa thành các tế bào hiệu ứng
thuộc tiểu quần thể tế bào T (subset effector cell) bao gồm Th1, Th2, Th17, Th9,
Th22, tế bào nang và các loại Treg khác nhau. T CD4+ đóng vai trị quan trọng trong
đáp ứng miễn dịch và viêm.
Nhiều yếu tố sinh lý như tình trạng dinh dưỡng, nồng độ hormon và tình trạng
nhiễm trùng hay viêm sẽ ảnh hưởng đến mức độ hoạt động của các tế bào miễn
dịch. Vì thế, các thành phần của PBMCs sẽ phụ thuộc vào người cho và tình trạng
sinh lý của người cho. So với việc dùng các dịng tế bào, điều này có thể dẫn tới dao


4

động giữa các thí nghiệm khi người cho máu khác nhau. Tuy có sự chênh lệch dữ
liệu thu được khi các người tình nguyện cho máu khác nhau, kết quả thu được sẽ
phản ánh tính khái quát và đại diện trong dân số nói chung [55].
1.1.1. Cách phân lập PBMCs
PBMCs được phân lập từ máu toàn phần hoặc máu đã tách huyết tương được bổ
sung chất chống đông như heparin, EDTA, citrat, ADC – A hoặc citrat phosphat
dextrose (CPB). Máu được pha loãng với PBS pH ~ 7,2 theo tỷ tệ 1:1 hoặc 1:2. Độ
tinh khiết của PBMCs càng cao khi máu được pha loãng càng nhiều. Cho 10 mL
dung dịch tỷ trọng d = 1,077 g/mL vào đáy ống nghiệm, ly tâm ở 400×g ở 20 oC
trong 25 phút. Sau ly tâm, PBMCs sẽ là lớp nằm ở bề mặt phân cách giữa dung dịch
tỷ trọng và huyết tương. Thu PBMCs và rửa với PBS 2 lần để loại bỏ dung dịch tỷ
trọng và tiểu cầu. Tế bào thu được có thể dùng cho phân tích ngay hoặc bảo quản và
trữ trong nitơ lỏng [55].

Hình 1-1. Máu ngoại vi sau khi chiết với môi trường tách tỷ trọng

1.1.2. Ứng dụng của PBMCs trong nghiên cứu khoa học
1.1.2.1.

Mơ hình in vitro sàng lọc thuốc mới trên hệ miễn dịch

PBMCs được dùng để sàng lọc, nghiên cứu các thuốc, hợp chất tiềm năng với khả
năng điều hịa miễn dịch có ứng dụng trong điều trị các bệnh lý miễn dịch theo
hướng là ức chế miễn dịch, kích thích miễn dịch hoặc kháng viêm. Các hướng
nghiên cứu này thường đo lường sự thay đổi về mức độ tăng sinh in vitro của tế bào
PBMCs, sự thay đổi trong sản xuất các cytokin, thay đổi trong biểu hiện gen, thay


5

đổi hình thái học tế bào, các dấu ấn bề mặt, các tế bào nhóm dưới trong quần thể
PBMCs [70].
1.1.2.2.

Đánh giá độc tính của thuốc mới

Đây có thể coi là ứng dụng quan trọng nhất của PBMCs trong nghiên cứu, giúp
đánh giá độc tính của các hợp chất thuốc mới tiềm năng trên hệ miễn dịch. Độc tính
của thuốc trên PBMCs có thể gây ra nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng, thậm chí đe
dọa tính mạng của bệnh nhân, bao gồm ức chế và độc trên hệ miễn dịch. PBMCs là
công cụ quan trọng trong các nghiên cứu tiền lâm sàng giúp xác định giới hạn liều
của các thuốc mới [70]. Nhiều nghiên cứu trên các thuốc hoặc chất điều trị ung thư
thường sử dụng PBMCs như tế bào thường để đánh giá độc tính chọn lọc của thuốc
hoặc hợp chất trên tế bào ung thư và ít hoặc khơng gây độc tính trên tế bào thường.
Thơng số để đánh giá là chỉ số chọn lọc (Selectivity Index – SI) được biểu diễn
bằng tỷ số của IC50 của tế bào thường và IC50 của tế bào ung thư. Chỉ số SI càng

lớn, chất hoặc thuốc càng chọn lọc trên tế bào ung thư [19].
1.1.2.3.

Nghiên cứu so sánh song song

Các nhà nghiên cứu cần tế bào PBMCs bình thường và tế bào PBMCs có bệnh lý để
so sánh trong nghiên cứu song song nhằm tìm hiểu cơ chế ở mức độ phân tử của
một đáp ứng có hại cụ thể, từ đó giúp q trình nghiên cứu thuốc mới tiến triển
nhanh hơn với hiệu quả cao hơn và độc tính trên hệ miễn dịch thấp [70].
1.1.2.4.

Liệu pháp tái sinh

Các tế bào tiền thân đa năng (multipotent progenitor cells) được xác định là một
thành phần của PBMCs, các tế bào này có thể biệt hóa thành tế bào khác mặc dù
khả năng kém hơn tế bào gốc [86]. Bên cạnh đó, PBMCs có thể có hiệu ứng tái sinh
thơng qua tương tác với các dân số tế bào khác và có thể được tái lập trình thành tế
bào vạn năng với khả năng biệt hóa thành bất kỳ loại tế bào nào [32].
1.1.2.5.

Liệu pháp miễn dịch ung thư

Năm 2018, hiệp hội ung thư lâm sàng Hoa Kỳ đã trao giải cho một liệu pháp mới
điều trị ung thư dựa trên PBMCs. Đối với liệu pháp này, còn gọi là liệu pháp CAR
T-cell (Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell), tế bào T được phân lập từ bệnh


6

nhân ung thư và được biến đổi di truyền ex vivo sau đó truyền lại vào bệnh nhân.

Các biến đổi này giúp tế bào T nhắm vào và tiêu diệt tế bào ung thư. Liệu pháp
CAR T – cell có tính cách mạng vì nó kích thích và làm mạnh hệ miễn dịch của
bệnh nhân để chống lại tế bào ung thư một cách đặc hiệu. Ngược lại, nhiều trị liệu
trong ung thư bao gồm ly giải cả tế bào ung thư và tế bào khỏe mạnh và không sinh
ra đáp ứng miễn dịch có lợi [20]. Các liệu pháp kích thích miễn dịch, nhắm khối u
đang được phát triển với tế bào NK [9].
1.1.2. Các phương pháp đo lường sự tăng sinh in vitro PBMCs
Để đo lường sự tăng sinh của PBMCs, có 4 phương pháp chính như sau: dựa trên sự
tổng hợp ADN, dựa trên hoạt tính chuyển hóa của tế bào, dựa trên các chất nhuộm
tích hợp màng tế bào, và dựa trên các protein đặc hiệu chỉ có ở tế bào đang nhân đơi
mà khơng có ở tế bào ở trạng thái nghỉ [76].
1.1.2.1. Đo lường sự tăng sinh dựa trên tổng hợp ADN
Nguyên tắc: các tế bào trong quá trình phân chia cần tổng hợp ADN ở phase S của
chu trình tế bào để có thể phân chia thành 2 tế bào con trong phase M. Trong quá
trình tổng hợp ADN, các base nitơ (purin và pyrimidin) được tích hợp vào chuỗi
ADN mới, và vì vậy đo lường mức độ tích hợp base nitơ sẽ phản ánh được sự tăng
sinh của tế bào. Đây là phương pháp chính xác nhất và đáng tin cậy, phản ánh đúng
sự tăng sinh tế bào[63].
Các thử nghiệm thơng dụng
• Đo sự tích hợp [3H] – TdR: Thơng thường, nucleoside có gắn phóng xạ như
tritiated thymidine ([3H] – TdR) thường được dùng. Lượng [3H] – TdR được
tích hợp vào ADN tế bào được đo bằng máy LSC. Tuy nhiên, nhược điểm là
tác nhân phóng xạ gây nguy hiểm cho người thao tác và mơi trường.
•

Đo sự tích hợp BrdU: Một thử nghiệm thay thế cho [3H] – TdR là sử dụng 5
– bromo – 2’ – deoxy – uridine (BrdU). Đây là một đồng dạng của


7

thymidine, vì thế được tích hợp vào ADN như thymidin. Lượng BrdU tích
hợp được phát hiện bằng kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho BrdU [76].
1.1.2.2. Đo lường sự tăng sinh dựa trên hoạt tính chuyển hóa của tế bào
Ngun tắc: Các tế bào có hoạt tính chuyển hóa khử các muối tetrazolium hoặc
resazurin thành sản phẩm có màu. Hoạt tính này do enzym ty thể succinate
dehydrogenase tăng lên trong q trình tăng sinh tế bào [76].
Các thử nghiệm thơng dụng
• Muối tetrazolium
-

MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) có
màu vàng bị khử thành formazan màu tím khơng tan trong nước, được hịa
tan trong dung mơi thích hợp, thường là DMSO hoặc isopropanol (độc với tế
bào). Vì vậy, MTT chủ yếu là thử nghiệm điểm cuối.

-

XTT, MTS và WST – 1: tương tự MTT nhưng sản phẩm formazan tạo ra tan
được trong nước, vì thế khơng cần hịa tan trong dung mơi.

• Resazurin: bị khử thành resorufin có màu hồng và phát huỳnh quang bởi các
tế bào sống. Ưu điểm là tan được trong mơi trường, khơng độc với tế bào, vì
vậy có thể theo dõi động học của tăng sinh tế bào theo thời gian.
1.1.2.3. Đo lường sự tăng sinh dựa trên các chất nhuộm tích hợp tế bào chất
Nguyên tắc: các chất nhuộm tích hợp tế bào chất là các chất phát huỳnh quang có
thể thấm qua màng tế bào và gắn cộng hóa trị với thành phần tế bào chất. Sau mỗi
lần nhân đôi, chất nhuộm được phân chia đều cho 2 tế bào con, vì vậy cường độ
huỳnh quang bằng một nửa của tế bào mẹ. Phương pháp này áp dụng trên máy flow
cytometry, dùng được cho thử nghiệm in vivo và in vitro [76].

Các thử nghiệm thông dụng
Carboxyfluorescein diacetat succinimdyl ester (CFSE): đây là chất nhuộm có màu
xanh, thường được dùng trong phân tích tăng sinh lympho T, có thể phát hiện trên 7
vòng tăng sinh.


8

1.1.2.4. Đo lường sự tăng sinh dựa trên các protein đặc hiệu chỉ có ở tế bào đang
nhân đơi
Ngun tắc: khi tế bào đi vào chu trình tế bào, các protein đặc hiệu cho phase được
tạo ra và có thể phát hiện nhờ kháng thể [76].
Các thử nghiệm thơng dụng
• Protein Ki – 67: đây là protein được dùng nhiều nhất, có mặt ở phase G1, S,
G2 nhưng khơng có ở phase nghỉ G0
• Protein PCNA (proliferating cell nuclear antigen – PCNA): tăng lên trong
pha trễ G1 và đạt đỉnh ở phase S
• Topoisomerase II – α: biểu hiện ở phase S trễ và đạt đỉnh ở phase G2 và
phase M
• Phosphorylated – histone H3: chỉ có ở phase M.
1.2. Stress oxy hóa
Stress oxy hóa là sự xuất hiện của gốc tự do (free radicals) và gốc có chứa oxy phản
ứng (Reactive Oxygen Species – ROS) được tạo ra trong điều kiện sinh lý bình
thường, tuy nhiên sẽ gây hại cho cơ thể nếu không được loại bỏ kịp thời và tích lũy.
Thực tế, stress oxy hóa xảy ra do mất cân bằng giữa quá trình tạo ra ROS và hệ
thống chống oxy hóa nội sinh của cơ thể, nhất là trong tình trạng stress. Các ROS
kích hoạt sự oxy hóa in vivo và in vitro, gây ra tình trạng stress oxy hóa, dẫn tới các
rối loạn và bệnh tật như ung thư, bệnh tim mạch, rối loạn thần kinh, bệnh Alzeimer,
suy giảm nhận thức, Parkinson, viêm loét kết tràng, xơ vữa mạch máu,... Các ROS
như superoxyd anion, gốc hydroxyl và hydrogen peroxyd là những chất gây độc và

tổn thương tế bào. Sự tích lũy quá mức lượng ROS gây hại cho cơ thể do kích hoạt
oxy hóa các phân tử sinh học có chức năng và làm chết tế bào, gây stress oxy hóa.
Ngồi ra, stress oxy hóa cịn gây kích hoạt enzym tự động và oxy hóa tổn thương hệ
thống tế bào [37],[50].
Trong cơ thể, các ROS có từ 2 nguồn: nguồn gốc nội sinh như quá trình chuyển hóa
trong cơ thể, hệ thống vận chuyển điện tử ty thể, β oxy hóa acid béo, q trình lão


9

hóa,… và nguồn gốc ngoại sinh bao gồm hút thuốc lá, tiếp xúc tia UV, bức xạ điện
từ, phơi nhiễm phóng xạ, ơ nhiễm khơng khí, dung mơi hữu cơ, thuốc trừ
sâu,…[48],[58].
Các tế bào trong cơ thể có các cơ chế khác nhau để chống lại ROS và duy trì cân
bằng oxy hóa khử nội mơ. Ví dụ, các enzym chống oxy hóa như superoxyd
dismutase (SOD), catalase (CAT) và glutathione peroxydase (GPx) đóng vai trị
quan trọng trong loại bỏ các gốc tự do và ngăn ngừa tổn thương tế bào. Các phân tử
như vitamin C và vitamin E, carotenoid, glutathion và flavonoid ức chế peroxyd hóa
lipid màng tế bào. Khi cơ chế bảo vệ chống oxy hóa trở nên mất cân bằng, bổ sung
chất chống oxy hóa có thể được sử dụng để giảm tổn hại do oxy hóa [62].
Trong những năm gần đây, ROS đã được chứng minh có liên quan đến sự hoạt hóa,
apoptosis hóa hay giảm đáp ứng của tế bào lympho T [6].
1.3. Một số hợp chất có tính chống oxy hóa
Chất chống oxy hóa là các chất có khả năng làm chậm hoặc ngăn chặn sự oxy hóa
của các phân tử khác. Phản ứng oxy hóa là phản ứng có sự vận chuyển electron từ
một chất khử tới tác nhân oxy hóa. Phản ứng oxy hóa có thể tạo ra gốc tự do khơi
mào chuỗi phản ứng phá hủy tế bào.
Chất chống oxy hóa chấm dứt chuỗi phản ứng phá hủy tế bào lympho bằng cách
loại bỏ các gốc tự do, ức chế các tác nhân oxy hóa khác.
Phân loại chất chống oxy hóa như sau.

Dựa trên tính tan: chất chống oxy hóa thân nước – tan được trong nước, phản ứng
với chất oxy hóa trong máu và tế bào chất; chất chống oxy hóa kỵ nước – tan trong
lipid, bảo vệ màng tế bào khỏi sự peroxyd hóa lipid.
Dựa trên tuyến bảo vệ
-

Bảo vệ đầu tiên (ngăn ngừa oxy hóa): các enzym như superoxyd dismutase
(SOD), catalase (CAT), glutathione peroxydase (GTx), glutathion reductase,
kim loại như Se, Mn, Cu,…SOD chuyển superoxyd (O2) thành H2O2,
catalase thủy phân H2O2 thành oxy và nước, GTx khử H2O2 và các peroxyd
tạo ra từ peroxyd hóa lipid thành nước.


10

-

Bảo vệ thứ hai (dọn dẹp gốc tự do): glutathion, vitamin C, uric acid, albumin,
bilirubin, vitamin E, carotenoid, flavonoid,…

-

Bảo vệ thứ ba (enzym sửa chữa và tái tạo): hệ thống enzym phức tạp sửa
chữa ADN, protein, lipid bị oxy hóa bị hư hỏng; ngưng kéo dài chuỗi phản
ứng oxy hóa. Những enzym này sửa chữa các phân tử sinh học bị hư hại,
đồng thời khôi phục màng tế bào [68].

1.4. Các phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa in vitro
Để đánh giá khả năng chống oxy hóa của một chất, nhiều mơ hình chống oxy in
vitro khác nhau được phát triển và sử dụng. Các mơ hình in vitro chia làm 2 nhóm

chính:
• Phản ứng chuyển ngun tử hyrogen, bao gồm: Oxygen Radical
Absorbance Capacity (ORAC), Total radical trapping antioxydant potential
(TRAP) và β carotene linoleic acid bleaching assay.
• Phản ứng chuyển electron, bao gồm: trolox equivalent antioxydant capacity
(TEAC), Ferric reducing antioxydant power (FRAP), α, α – diphenyl – β –
picryl – hydrazyl radical scavenging assay (DPPH), Superoxyd anion
radical scavenging assay, định lượng loại gốc hydroxyl, định lượng loại gốc
nitric oxyd, định lượng tổng phenol.
1.5. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
1.5.1. Ứng dụng y học cổ truyền trong điều trị bệnh lý miễn dịch
Thuốc từ dược liệu đã được sử dụng hàng thế kỷ trong điều trị các bệnh khác nhau,
nhưng chỉ có giới hạn số lượng trong số chúng được nghiên cứu tồn diện và vẫn
cịn rất nhiều thảo dược cần được nghiên cứu kỹ về hiệu quả trong điều trị bệnh và
làm tiền đề cho việc sản xuất các thuốc có nguồn gốc tự nhiên [40].
Nhiều sản phẩm thảo dược đang được sử dụng trong điều trị các bệnh do rối loạn
qua trung gian miễn dịch bao gồm bệnh tự miễn và đào thải cơ quan cấy ghép. Các
thảo dược trị bệnh này có hoạt tính sinh học và dược lý hữu ích, bao gồm hiệu ứng