So sánh hiệu quả phương pháp nhuộm hematoxylin eosin khi thay thế dung dịch có hợp chất hoạt động bề mặt sodium linear alkylbenzene sulfonate

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ Y TẾ

-----------------

TRẦN THỊ KHUÊ NỮ

SO SÁNH HIỆU QUẢ PHƯƠNG PHÁP NHUỘM
HEMATOXYLIN EOSIN KHI THAY THẾ DUNG DỊCH
CÓ HỢP CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT
SODIUM LINEAR ALKYLBENZENE SULFONATE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2019
.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ Y TẾ

-----------------

TRẦN THỊ KHUÊ NỮ

SO SÁNH HIỆU QUẢ PHƯƠNG PHÁP NHUỘM
HEMATOXYLIN EOSIN KHI THAY THẾ DUNG DỊCH
CÓ HỢP CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT
SODIUM LINEAR ALKYLBENZENE SULFONATE

Ngành: Kỹ thuật xét nghiệm y học
Mã số : 8720601

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN VĂN THẮNG
PGS.TS. TRẦN ANH TUẤN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2019
.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan các tài liệu trích dẫn, số liệu, kết quả nêu trong luận văn là
hoàn toàn trung thực, được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 05 năm
2018 đến tháng 06 năm 2019 dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Nguyễn
Văn Thắng và PGS.TS. Trần Anh Tuấn. Đề tài nghiên cứu này là duy nhất và
chưa từng được ai công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào.

Tác giả luận văn

Trần Thị Khuê Nữ

.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT – ANH ................................................... i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................... ii
DANH MỤC BẢNG .................................................................................... iii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ ............................................................................... iv
DANH MỤC SƠ ĐỒ .................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................... vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 4
1.1. Vài nét về lịch sử phát triển của kỹ thuật hiển vi học ............................... 4
1.2. Các bước tiến hành kỹ thuật mơ học ........................................................ 4
1.3. Hóa chất thay thế clear-rite 3 ................................................................. 29
1.4. Dung dịch có thành phần LAS nồng độ 1,7% ........................................ 32
1.5. Các nghiên cứu ngoài nước ................................................................... 33
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 37
2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 37
2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 38
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................. 50
3.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu ............................................................. 50
3.2. Chất lượng nhuộm nhân và tế bào chất của 2 phương pháp nhuộm ....... 54
3.3. Độ trong, tương phản và đồng nhất của 2 phương pháp nhuộm HE ....... 55

3.4. Hiệu quả của nhuộm HE thường quy và nhuộm HE cải tiến .................. 62
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN .......................................................................... 68
4.1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu ...................................................... 68
4.2. Chất lượng nhuộm nhân và nhuộm tế bào chất ...................................... 68
4.3. Độ trong, tương phản và đồng nhất của phương pháp nhuộm HE .......... 72
4.4. Hiệu quả của nhuộm HE thường quy và nhuộm HE cải tiến .................. 77

.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

KẾT LUẬN ................................................................................................. 82
KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 83
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

i

ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT – ANH

TIẾNG VIỆT

TIẾNG ANH

Bảng dữ liệu an tồn hóa chất

Material Safety Data Sheet

Chất liệu di truyền

Deoxyribonucleic Axit

Cơ quan Quản lý An toàn và

Occupational Safety and

Sức khỏe Nghề nghiệp

Health Administration

Dung dịch rửa chén (bát)

Dish washing liquid

Điểm số nhuộm nhân

The parameter of nuclear stain

Độ đồng nhất

Uniformity of stainning

Độ trong rõ

Clarity of stainning

Độ tương phản, sắc nét

Crispness of stainning

Hệ thống hài hoà toàn cầu về

Globally Harmonized System of

phân loại và ghi nhãn hoá chất

Classification and Labeling of Chemicals

Khối mô đúc parafin

Block

Nhuộm tế bào chất

Cytoplasmaic stainning

Thơng tin di truyền

Ribonucleic Axit

Tế bào hình đài

Goblet cell

.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TÊN VIẾT TẮT TÊN ĐẦY ĐỦ
BV

Bệnh viện

DNA

Deoxyribonucleic Axit

GHS

Hệ thống hài hoà tồn cầu về phân loại và ghi nhãn
hóa chất

GPB

Giải phẫu bệnh

HE

Heamatoxylin-Eosin

LAS

Chất hoạt động bề mặt
Sodium Linear Alkybenzene Sulfonate

MSDS

Bảng dữ liệu an tồn hóa chất

OSHA

Cơ quan Quản lý An tồn và Sức khỏe Nghề nghiệp

RNA

Ribonucleic Axit

.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

iii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Quy trình nhuộm HE với dung dịch Toluen/ Xylen ...................... 14
Bảng 1.2: Phân tích kết quả nhuộm HE ........................................................ 23
Bảng 1.3: Màu sắc các thành phần tế bào của nhuộm HE ............................. 24

Bảng 1.4: Những lỗi thường gặp trong phương pháp nhuộm HE .................. 28
Bảng 1.5: Tóm tắt cỡ mẫu nghiên cứu nhuộm HE với LAS .......................... 36
Bảng 2.1: Quy trình nhuộm HE thường quy ................................................. 43
Bảng 2.2: Quy trình nhuộm HE cải tiến........................................................ 44
Bảng 2.3: Hóa chất sử dụng cho phương pháp nhuộm HE cải tiến ............... 49
Bảng 3.1: Thời gian cố định (giờ)................................................................. 52
Bảng 3.2: Độ trong rõ ở tiêu bản của 2 phương pháp nhuộm ........................ 55
Bảng 3.3: Tỉ lệ độ đồng nhất ........................................................................ 56
Bảng 3.4: Điểm số của tiêu bản ở 2 phương pháp nhuộm ............................. 62
Bảng 3.5: Thời gian nhuộm .......................................................................... 64
Bảng 3.6: Cơ cấu giá tiêu bản ....................................................................... 64
Bảng 3.7: So sánh ưu và khuyết điểm của clear-rite 3 và LAS 1,7% ............ 65
Bảng 3.8: So sánh hiệu quả của nhuộm HE thường quy và HE cải tiến ........ 66

.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

iv

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 1.1: So sánh kết quả nhuộm HE với xylen và HE LAS 1,7%........... 35
Biểu đồ 3.1: Phân bố người bệnh theo tuổi ................................................... 50
Biểu đồ 3.2: Tỉ lệ loại bệnh phẩm ................................................................. 51
Biểu đồ 3.3: Bệnh phẩm cố định .................................................................. 52
Biểu đồ 3.4: Bệnh phẩm xử lý ...................................................................... 53
Biểu đồ 3.5: Tỉ lệ tiêu bản tẩy parafin........................................................... 53
Biểu đồ 3.6: Tỉ lệ nhuộm nhân ..................................................................... 54
Biểu đồ 3.7: Tỉ lệ nhuộm tế bào chất ............................................................ 54

Biểu đồ 3.8: Tỉ lệ độ tương phản .................................................................. 55
Biểu đồ 3.9: Tổng hợp các tỉ lệ nhuộm ......................................................... 56
Biểu đồ 3.10: Tỉ lệ tiêu bản nhuộm HE thường quy và HE cải tiến .............. 63

.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

v

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1: Các bước tiến hành nghiên cứu ................................................... 40

.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Ký hiệu tượng hình của dung dịch xylen ...................................... 16
Hình 1.2: Sự oxid của Hematoxylin ............................................................. 18
Hình 1.3: Cấu trúc Eosin .............................................................................. 22
Hình 1.4: Nhuộm Hematoxylin Eosin trên mơ gan ....................................... 23
Hình 1.5: Dữ liệu an tồn hóa chất clear-rite 3 ............................................. 31
Hình 3.1: Chất lượng nhuộm nhân trên tiêu bản mơ túi mật ......................... 57
Hình 3.2: Nhuộm tế bào chất trên tiêu bản mơ túi mật.................................. 57
Hình 3.3: Chất lượng độ trong, rõ trên tiêu bản mơ túi mật .......................... 58

Hình 3.4: Chất lượng độ tương phản trên tiêu bản mô túi mật ...................... 58
Hình 3.5: Chất lượng đồng nhất trên tiêu bản mơ túi mật ............................. 59
Hình 3.6: Khơng đạt nhuộm nhân trên tiêu bản mơ ruột ............................... 60
Hình 3.7: Không đạt nhuộm tế bào chất trên tiêu bản mô tuyến tiền liệt ....... 60
Hình 3.8: Tiêu bản khơng đạt độ trong rõ ..................................................... 60
Hình 3.9: Tiêu bản khơng đạt độ tương phản ................................................ 61
Hình 3.10: Khơng đạt độ đồng nhất trên tiêu bản mơ thận ............................ 61
Hình 3.11: Tiêu bản khơng đủ tiêu chuẩn chẩn đốn ..... .............................. 61

.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhuộm Hematoxylin-Eosin (HE) là một phương pháp nhuộm thường quy
trong xét nghiệm mô bệnh học, được sử dụng rộng rãi nhất và là tiêu chuẩn
trong chẩn đốn mơ bệnh học [27], [29]. Để chẩn đốn được mơ bệnh, các bệnh
phẩm sau khi được cắt lọc/ phẫu tích thành những mảnh mơ có kích thước phù
hợp, mô được xử lý qua các bước như: khử nước (được máy xử lý mô tự động
thực hiện), đúc (vùi) mơ, cắt lát mảnh 3-4µ𝑚, nhuộm và cuối cùng được bác sĩ
giải phẫu bệnh (GPB) - tế bào bệnh học dịch (đọc) tổn thương [2]. Để quan sát
được thành phần cấu trúc của mô, các mảnh cắt phải được nhuộm màu tương
phản của cấu trúc nhân và thành phần tế bào chất. Trên tiêu bản nhuộm, bác sĩ
GPB có thể quan sát cấu trúc màng nhân, hạt nhân, chất nhiễm sắc cũng như
sự bắt màu của thành phần tế bào chất, chất nền: sợi colagen, hồng cầu, sợi
chun. Trong phương pháp nhuộm HE phải đi qua nhiều bước như: tẩy parafin,
khử nước, nhuộm nhân, nhuộm tế bào chất. Trong đó, bước dùng hóa chất xylen

hay toluen để tẩy parafin trong mô là quan trọng, quyết định nhiều đến chất
lượng nhuộm tiêu bản. Tuy nhiên xylen, toluen độc hại đối với con người và
môi trường [3], [22], [37], [47]. Một số hóa chất thay thế xylen được sản xuất.
Các chất thay thế có thể là hóa chất hydrocacbon béo, hydrocacbon thơm, dầu
dừa, ... Các hóa chất đó có chức năng tương tự như toluen, xylen: làm trong
sáng mô, tẩy parafin trong phương pháp nhuộm HE. Hiện nay các phòng xét
nghiệm GPB đang sử dụng hóa chất clear-rite 3 [49] để thay thế hóa chất toluen,
xylen. Các bệnh viện (BV) như: BV Chợ Rẫy, BV Nhân dân Gia Định, Đại học
Y Dược, BV Bình Dân, BV Nhi Đồng I, BV Ung Bướu thành phố Hồ Chí Minh,
BV Ung Bướu Cần Thơ, BV Vimec. Tuy nhiên hầu hết các sản phẩm thay
xylen, toluen có giá thành cao và khơng phải là ít nguy hiểm hơn [12], [38].
Theo phân loại của cơ quan Quản lý An toàn và Sức khỏe Nghề nghiệp

.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

2

(Occupational Safety and Health Administration - OSHA) [22], thành phần hóa
chất clear-rite 3 được phân loại lớp 1B nguy cơ gây ung thư, hóa chất dễ cháy
loại 2 [43], [49], cũng có ảnh hưởng đến cơ quan đích là gan và thận khi tiếp
xúc hóa chất lâu dài hoặc thường xuyên, nguy cơ đột biến tế bào mầm và nguy
cơ gây ung thư, có nguy hiểm về đường hơ hấp và có thể gây tổn thương các
cơ quan do phơi nhiễm kéo dài hoặc tiếp xúc thường xuyên.
Các nghiên cứu dùng nước chanh của tác giả Ananthaneni Anuradha và cộng
sự [8] hay dùng dầu bách hương/ tuyết tùng để thay thế xylen trong phương
pháp nhuộm HE [24], tuy nhiên giá thành cao.
Một số tác giả sử dụng dung dịch có chứa thành phần LAS nồng độ 1,7% để

thay thế dung dịch toluen, xylen, có thể xem là thân thiện với môi trường hơn.
Falkeholm và cộng sự [18], lần đầu tiên đã nghiên cứu dung dịch có chứa thành
phần LAS 1,7 % để thay thế dung dịch xylen và alcool trong quy trình nhuộm
HE, với chi phí rẻ tiền và ít độc hại hơn. Nghiên cứu của Madhuri R Ankle và
cộng sự [9], cũng dùng dung dịch có chứa thành phần LAS nồng độ 1,7% tẩy
parafin, khử nước và làm trong mô, nghiên cứu cho thấy kết quả dùng dung
dịch có chứa thành phần LAS nồng độ 1,7% ngang bằng với dung dịch xylen
và alcool trong giai đoạn tẩy parafin. Ngoài ra một số tác giả sử dụng dung dịch
có chứa thành phần LAS dao động từ 1,5%-2,0% [8], [42].
Vì hóa chất clear-rite 3 ảnh hưởng đến sức khỏe khi tiếp xúc thường xuyên.
Với mong muốn môi trường phịng xét nghiệm GPB an tồn ít độc hại hơn.
Chúng tôi tiến hành nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm HE với dung
dịch chứa chất hoạt động bề mặt Sodium Linear Alkylbenzene Sulfonate (LAS)
- dung dịch tẩy rửa thông thường, thay thế hóa chất clear-rite 3 hiện đang sử
dụng. Ở nghiên cứu này chúng tôi sử dụng dung dịch chất tẩy rửa sunlight pha

Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.
Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

3

lỗng 1,7%, do hãng Unilever sản xuất (dựa vào hầu hết các NC trước đây sử
dụng nồng độ 1,7%) nhằm:
MỤC TIÊU
1. So sánh chất lượng nhuộm nhân, nhuộm tế bào chất của phương pháp
nhuộm HE với hóa chất clear-rite 3 và alcool (HE thường quy) và phương pháp
nhuộm HE sử dụng dung dịch có thành phần LAS 1,7% (HE cải tiến).

2. So sánh độ trong rõ, tương phản và đồng nhất của phương pháp nhuộm
HE thường quy và phương pháp nhuộm HE cải tiến.
3. So sánh hiệu quả của phương pháp nhuộm HE thường quy và phương pháp
nhuộm HE cải tiến.

Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.
Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Vài nét về lịch sử phát triển của kỹ thuật hiển vi học
Kỹ thuật khám nghiệm đại thể giúp cho chúng ta quan sát một cách có hệ
thống tồn diện các phủ tạng hoặc mối liên quan giữa chúng với nhau cũng như
mối liên quan của các tổ chức trong cùng một phủ tạng, hoặc chức phận của
chúng một cách khái quát, nhưng các kỹ thuật nghiên cứu tế bào và tổ chức
phát hiện cho chúng ta những cấu trúc tinh tế nhất không những ở phạm vi tế
bào mà còn đi sâu tới những tiểu phần của tế bào [2].
Do hầu hết các tổ chức và phủ tạng đều q dày nên khơng thể soi trực tiếp
dưới kính hiển vi, nên các nhà tổ chức học đầu tiên đã quan sát những màng
mỏng hoặc các vật liệu đã bị tước hoặc ép. Do đó, các sự liên quan cấu trúc đã
bị phá vỡ và tế bào chết rất nhanh chóng đưa đến những nhận định sai lệch,
khơng chính xác [2].
Cuối của thế kỷ XIX, không những người ta đã tìm hiểu về các tế bào sống
hoặc sống sót mà còn chú ý đến những tế bào chết được bảo quản theo nhiều
cách cắt mỏng rồi nhuộm với nhiều loại phẩm nhuộm. Kính hiển vi được cải

tiến, máy cắt mỏng ra đời, hàng loạt các kỹ thuật cố định ra đời và nhuộm sáng
tạo [2] với mục đích biểu hiện hình ảnh cấu trúc và làm tăng độ tương phản cấu
trúc, dễ dàng quan sát dưới kính hiển vi như kỹ thuật nhuộm HE, kỹ thuật
nhuộm papanicolaou (PAP), kỹ thuật nhuộm Pariodic axit schiff (PAS), được
dùng trong chẩn đoán GPB.
1.2. Các bước tiến hành kỹ thuật mô học
1.2.1. Cố định
Cố định là làm bất động những cấu trúc của tổ chức cũng như tế bào nhưng
vẫn tôn trọng mức tối đa hình thái của chúng. Nói cách khác, cố định một tổ
chức là giết những thành phần của tổ chức đó nhưng vẫn bảo quản chúng trong

Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.
Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

5

một tình trạng gần với lúc sống nhất [2]. Cố định mơ bệnh phẩm thích hợp để
xét nghiệm là trung tâm của tất cả các xét nghiệm mô học [13], [17].
1.2.1.1. Dung dịch cố định
Việc dùng dung dịch cố định mô bệnh phẩm phù hợp để xét nghiệm mô học
là vô cùng quan trọng, là trọng tâm của tất cả các xét nghiệm mô học, một số
dung dịch cố định đóng vai trị là chất gắn màu cho các quá trình nhuộm màu
cụ thể [14], [15]. Ngược lại, chất cố định đôi khi ức chế một số kỹ thuật nhuộm.
Vì cố định là bước đầu tiên trong kỹ thuật mô học, kỹ thuật nhuộm được thực
hiện sau khi cố định và những kỹ thuật tiếp theo, nên cần phải dùng dung dịch
cố định phù hợp [34]. Nếu khơng chú ý đến q trình này, một loạt các xét
nghiệm được thực hiện trong phịng thí nghiệm mơ bệnh học sẽ khơng hiệu quả

và thực tế là có thể không thể khắc phục được mô bệnh phẩm [47]. Khi chọn
một dung dịch cố định nên có sự cân bằng giữa những lợi ích và bất lợi mà mỗi
loại dung dịch cố định có. Chúng bao gồm những thay đổi hoặc mất mát phân
tử từ các mô cố định, gây sưng hoặc co rút các mô, sự thay đổi chất lượng của
nhuộm hóa mơ miễn dịch, ảnh hưởng đến phân tích sinh hóa và khả năng duy
trì cấu trúc của các bào quan tế bào. Mục tiêu chính của sự cố định các loại mơ
là duy trì các đặc điểm hình thái rõ ràng và nhất quán [47]. Để quan sát hình
ảnh vi thể của các tiêu bản nhuộm màu, các mối liên quan vi thể ban đầu giữa
các tế bào, các thành phần tế bào (ví dụ như tế bào chất và nhân), thành phần
ngoại bào phải được duy trì. Thành phần hóa học của mơ cũng phải được duy
trì. Nhiều thành phần hóa học trong mơ có thể hịa tan trong dung dịch nước
hoặc mơi trường chất lỏng khác, do đó các thành phần hịa tan khơng được mất
trong q trình cố định và xử lý mơ. Giảm thiểu sự mất mát của các thành phần
tế bào bao gồm protein, nhân và lipid, ngăn chặn sự phá hủy các cấu trúc phân
tử như màng tế bào chất, mạng lưới nội chất trơn, mạng lưới nội chất thô, màng
tế bào hạt nhân, màng nhân. Nếu các thành phần hòa tan trong tế bào chất mất,

Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.
Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

6

nhuộm màu bị giảm hoặc thay đổi các hình ảnh vi thể của mơ, ví dụ ty thể bị
mất hoặc bị phá hủy [47].
Trong chẩn đoán GPB, sự lựa chọn dung dịch cố định cho hầu hết các nhà
GPB là dung dịch formaldehyde đệm trung tính 10% [2]. Formaldehyde đệm
trung tính 10% là dung dịch thường được sử dụng nhất vì là chất có sẵn trên thị

trường, chi phí thấp, khơng cháy nổ, giết vi khuẩn nhanh chóng [4], khơng kết
tủa protein nhưng cố định hồn tồn bằng cách làm cho chúng khơng hồ tan,
cố định các lipid phức tạp kể cả ty lạp thể (mitochondrion) và bộ Golgi, tuy
không tác dụng trực tiếp lên lipid nhưng vẫn bảo tồn được chúng [2]. Khơng
làm co mơ nhưng gây cứng mơ. Cấu trúc tế bào bảo tồn tốt. Nhược điểm của
dung dịch formaldehyde đệm trung tính 10% là phản ứng với hematin tạo nên
sắc tố màu nâu hay kết tủa đen. Hơi formaldehyde độc nên cần đậy kín bình [2]
sau mỗi lần sử dụng.
Dung dịch formaldehyde đệm trung tính 10%, hoạt động hiệu quả, có thể sử
dụng với hầu hết các loại mô, môi trường đệm trung tính giúp ổn định mơi
trường khơng ảnh hưởng đến thành phần cấu trúc của mô. Nếu dung dịch cố
định không được đệm, ở độ pH khác có thể gây ra co rút hạt nhân, cường độ
nhuộm tế bào chất thay đổi [48].
Q trình cố định formaldehyde khơng tạo ra "sự cố định quá mức", nghĩa là
các mô không bị cứng lại một cách quá mức [20], tạo điều kiện thuận tiện cho
parafin ngấm vào mơ. Thành phần methylene hydrate có trong dung dịch
formaldehyde đệm trung tính 10%, phản ứng với một số chuỗi bên của protein
để tạo thành các nhóm bên hydroxymethyl, sự hình thành chuỗi bên
hydroxymethyl là phản ứng chính, đặc trưng và hình thành các liên kết ngang.
Formaldehyde cũng phản ứng với protein hạt nhân và axit nucleic (Kok &
Boon, 2003, Leong, 2005). Nó thâm nhập giữa axit nucleic và protein, ổn định

Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.
Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

7

axit nucleic, cố định nucleotide bằng cách phản ứng với các nhóm amin tự do
như với protein. Trong Deoxyribonucleic axit (DNA) các phản ứng liên kết
ngang được bắt đầu tại các vùng giàu adenine - thymidine và tăng liên kết ngang
khi nhiệt độ tăng. Các nhóm phản ứng có thể kết hợp với các nhóm hydro hoặc
với nhau để tạo thành cầu metylen. Formaldehyde chủ yếu bảo tồn các liên kết
peptide-protein và cấu trúc chung của các bào quan tế bào. Formaldehyde có
thể tương tác với axit nucleic nhưng ít ảnh hưởng đến carbohydrate và bảo quản
lipit nếu các dung dịch có chứa canxi (Bayliss High & Lake, 1996) [17]. Bệnh
phẩm lấy ra khỏi cơ thể cố định ngay (không quá 30 phút kể từ khi bệnh phẩm
được lấy ra khỏi cơ thể) trong formaldehyde trung đệm tính 10%, do các khoa,
phịng lâm sàng gửi tới [1].
1.2.1.2. Thể tích cố định
Thể tích và nồng độ dung dịch cố định có tác động rõ rệt đến vận tốc xuyên
thấm và vận tốc cố định [2], do đó phải dùng tối thiểu thể tích dung dịch cố
định ≥ 10 lần thể tích bệnh phẩm, để cố định tối ưu và nhanh chóng [47], là
lượng dung dịch cần thiết đủ cố định mẫu bệnh phẩm. Những bệnh phẩm lớn,
nên cắt lát có độ dày 1,5cm để dung dịch cố định có thể xun qua mơ được dễ
dàng [13]. Phần lớn thể tích mơ xác định khối lượng dung dịch cố định cần
thiết, độ dày sẽ quyết định tốc độ cố định [16], [41].
1.2.1.3. Thời gian cố định
Thời gian cố định phụ thuộc vào loại bệnh phẩm, độ dày bệnh phẩm, vận tốc
xuyên thấm và vận tốc cố định của dung dịch cố định, nồng độ dung dịch cố
định, nhiệt độ [2].
Theo luật khuyếch tán nó giảm dần từ lúc ngâm bệnh phẩm vào dung dịch
Cơng thức tính: e =d√𝑡
Trong đó, e = độ ngấm sâu vào, tính theo milimet

Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.
Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

8

d = hệ số xuyên thấm
t = thời gian hoạt động của dung dịch tính theo giờ.
Như vậy, hệ số d sẽ bằng bề dày của tổ chức mơ được một dung dịch có nồng
độ đã biết đi qua trong một giờ.
Vận tốc cố định là hiện tượng hóa học: nó tương ứng với thời gian cần thiết
cho việc kết tủa hoặc làm cho các thành phần tế bào khơng bị hịa tan.
Như vậy, nếu vận tốc xuyên thấm chậm nhưng vận tốc cố định nhanh thì cần
lấy bệnh phẩm nhỏ, cắt mỏng và khơng ngâm lâu trong dung dịch cố định. Trái
lai, nếu vận tốc xuyên thấm nhanh, vận tốc cố định chậm có thể cắt bệnh phẩm
tương đối to và dày nhưng cần ngâm lâu trong dung dịch cố định [2].
Tương tự tài liệu [47], thời gian cố định xấp xỉ bằng bình phương độ sâu mà
dung dịch cố định phải thâm nhập và hầu hết các dung dịch cố định, chẳng hạn
như formaldehyde đệm trung tính 10% sẽ thâm nhập mơ đến độ sâu khoảng
1mm trong một giờ. Điều quan trọng cần lưu ý là các thành phần của chất cố
định sẽ thâm nhập vào các mô ở các mức độ khác nhau, vì vậy sẽ tốt hơn nếu
các chất cố định này được sử dụng với các mẫu bệnh phẩm cắt mỏng hay nếu
mẫu bệnh phẩm lớn thì hãy thực hiện cắt thành những lát có độ dày 1,5cm để
dung dịch cố định có thể xun qua mơ dễ dàng [15]. Ngồi ra, protein làm bất
hoạt các chất cố định, đặc biệt là trong máu hoặc chất lỏng có máu, vì vậy
những mẫu bệnh phẩm phải được rửa bằng nước muối trước khi đưa vào dung
dịch cố định [48].
1.2.1.4. Bệnh phẩm cố định đạt
Là bệnh phẩm khơng bị “sống” hoặc “q chín” [2].
Bệnh phẩm “sống” thường mềm, vẫn còn thấy màu hồng đỏ của tổ chức mơ
bị thối hóa, hoại tử. Nó dễ sinh ra các tổn thương và hình ảnh giả tạo. Khi

nhuộm hình ảnh bắt màu khơng đẹp.

Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.
Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

9

Nguyên nhân gây bệnh phẩm “sống” có thể là bệnh phẩm cắt quá dày, thời
gian ngâm bệnh phẩm quá ngắn, thể tích dung dịch cố định khơng đủ, nồng độ
dung dịch khơng đủ.
Bệnh phẩm “q chín”, mơ khá cứng chắc, giịn khi cắt. Dù cẩn thận, khi cắt
mảnh, mô vẫn bị vỡ, nát vụn và khi nhuộm tính bắt màu bị giảm rõ, nhân tế bào
dễ bị nhăn nhúm.
Nguyên nhân bệnh phẩm “quá chín” do thời gian cố định quá dài.
Nếu mô cố định không được đầy đủ, có thể dẫn đến hình thái thay đổi và ảnh
hưởng đến đặc tính nhuộm màu của mơ [47]. Sau cố định, bệnh phẩm được
thực hiện qua khâu kỹ thuật sau:
1.2.2. Khử nước
Bệnh phẩm sau khi cố định đủ thời gian và đạt yêu cầu, được bác sĩ GPB cắt
lọc bệnh phẩm ở vị trí cần xét nghiệm với kích thước theo quy định, mơ được
xử lý bằng máy chuyển mô chuyên dụng. Xử lý mô được thiết kế để loại bỏ tất
cả nước có thể ra khỏi mơ, thay thế nó bằng mơi trường hỗ trợ cung cấp đủ độ
cứng để cho phép cắt mảnh mô mà không làm tổn thương nhu mô hoặc biến
dạng [47].
Bệnh phẩm sau xử lý đạt là bệnh phẩm trong, bóng [1], vừa đủ cứng, không
quá mềm cũng không quá cứng, mô không bị đục. Để bệnh phẩm đạt sau xử lý,
điều quan trọng là trong tất cả các lần nhúng, ngâm mô vào các loại hóa chất

như forrmaldehyde 10% pH 7,2, alcool, clear-rite 3, parafin của q trình xử lý
mơ phải tn thủ đúng thời gian, nồng độ là cần thiết, thời gian ngâm mơ trong
các loại hóa chất khơng q ít hoặc quá nhiều [13]. Bất kỳ giai đoạn ngâm mô
trong xử lý mô mà dung dịch không được đẩy hết ra khỏi các mô, parafin không
thể xâm nhập vào mô hoặc thời gian ngâm mô trong parafin không đủ, các mô
sẽ không được xử lý tốt [47].

Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.
Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

10

Mặt khác, ở nhiệt độ parafin nóng chảy giúp tăng tỉ lệ trao đổi chất lỏng và
tỉ lệ thâm nhập vào mô, nhưng thời gian ngâm mô trong parafin phải phù hợp
để giảm khả năng tạo ra hình thái giả. Mơ tiếp xúc lâu với nhiệt có thể gây ra
sự co rút và cứng mơ, ảnh hưởng xấu đến nhuộm màu và hóa mơ miễn dịch,
gây khó khăn trong kỹ thuật cắt mỏng [47]. Do đó, ở nhiệt độ 56-58oC nếu mô
ngâm trong parafin kéo dài mô bị co rút và bị cứng.
1.2.3. Vùi parafin
Cố định mới chỉ giết chết tế bào và giữ cho các thành phần của chúng đựơc
bất động ở trạng thái tĩnh. Nếu đem cắt ngay thành các lát cắt mỏng, mối liên
quan giữa các tế bào cũng như cấu trúc mô bị biến đổi, thậm chí đảo lộn do tác
động cơ học. Giải quyết vấn đề này cần có một chất làm nền cho bệnh phẩm,
có tác dụng như một khn giữ vững bệnh phẩm, đồng thời thâm nhập được
vào bên trong tế bào, giữ cho các tế bào yên vị khi cắt mảnh. Đây chính là
nguyên lý của vùi bệnh phẩm. Chất vùi bệnh phẩm phải đạt các yêu cầu sau:
mềm, dễ ngấm, dễ cắt, nhiệt độ nóng chảy thấp, dễ loại bỏ. Parafin là chất thỏa

mãn tất cả các yêu cầu trên [1].
1.2.4. Đúc khối parafin
Đúc khối là làm cho parafin ở xung quanh cũng như ở bên trong bệnh phẩm
đặc lại thành một khối thuần nhất. Để đạt được điều này, người ta dùng những
khuôn bằng kim loại để dẫn nhiệt và nước lạnh có đá. Đúc bệnh phẩm phải thao
tác nhanh sao cho nhiệt độ của parafin và bệnh phẩm không chênh lệch nhiều.
Nếu nhiệt độ parafin hay bệnh phẩm quá chênh lệch, sẽ tạo ra một viền trắng
quanh bệnh phẩm, khi khối parafin nguội hay khi cắt, bệnh phẩm có thể bật ra
khỏi khối. Mặt khác, bệnh phẩm phải được đặt đúng hướng để các mảnh cắt có
đầy đủ các thành phần của mơ cần khảo sát [1].

Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.
Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

11

1.2.5. Cắt và dán mảnh cắt
Sau khi cắt mảnh, các tiêu bản được tẩy parafin. Sau khi nhuộm, các tiêu bản
được khử nước hoàn toàn, sau đó nhỏ dung dịch keo dán và phủ lamelle để bảo
vệ tiêu bản [13].
1.2.5.1. Tẩy parafin
Để kết quả nhuộm HE chất lượng, giai đoạn tẩy parafin là quyết định, tẩy
parafin là bước đầu tiên của quy trình nhuộm. Các tiêu bản mơ chứa parafin sẽ
khơng thấm các thuốc nhuộm, vì parafin khơng tan trong nước [13]. Do đó, bắt
buộc phải loại bỏ tất cả parafin trên tiêu bản trước khi tiến hành nhuộm [19].
Parafin là hỗn hợp hydrocarbon (với công thức chung CnH2n

+ 2),

thường

khơng màu hoặc màu trắng, có nguồn gốc từ than đá hoặc dầu thô, thường được
sử dụng trong làm nến hoặc các ứng dụng khác như cách điện hoặc bôi trơn.
Parafin ra đời từ những năm 1850. Tốc độ hòa tan của parafin trong xylen được
tăng lên rất nhiều [47]. Đặc tính của parafin rất đa dạng tùy thuộc vào điểm
nóng chảy được sử dụng, dao động từ 47oC đến 64oC. Parafin thấm vào mô ở
dạng lỏng và đông cứng nhanh khi được làm lạnh. Các mô được ngâm tẩm
trong parafin, tạo thành chất nền, ngăn ngừa sự biến dạng của cấu trúc mơ trong
q trình thực hiện cắt mảnh. Điều rất quan trọng là parafin có một loạt các
điểm nóng chảy, để sử dụng ở các vùng khí hậu khác nhau trên thế giới. Để
thúc đẩy tạo dải ruy băng mong muốn trong quá trình cắt mảnh, nên chọn
parafin có độ cứng phù hợp ở nhiệt độ phịng, ở nhiệt độ cao tính chất của
parafin thay đổi [17].
Có thể tẩy parafin bằng một số phương pháp:
1. Dung môi parafin - dung môi phổ quát tốt nhất là vật liệu gốc xylen với ít
nhất 20% xylen chất lượng cao. Toluen cũng tốt nhưng nhiệt độ bốc cháy 4oC
là một mối nguy hiểm.

Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.
Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

12

2. Dung mơi Asphaltene - nếu parafin chứa một lượng đáng kể asphaltene

một dung môi với xylen để làm sạch hồn tồn. Một dung mơi chấp nhận được
với mơi trường là Lemonoil nhưng nó kém hiệu quả hơn nhiều so với xylen.
3. Chất phân tán - một số chất hoạt động bề mặt (chất phân tán, xà phịng,
chất tẩy rửa, chất tẩy nhờn, v.v.) có hiệu quả nhưng chỉ trên một số parafin và
ở điều kiện cụ thể.
4. Nước nóng - nước nóng có chất phân tán đã được sử dụng và được coi là
thành công, tuy nhiên, duy trì nhiệt độ là một tiêu chí để ngăn chặn sự tái định
bám. Phải giữ nhiệt độ trên 130oF/ 54oC. (Fahrenheit: F, Celsius: C).
1.2.5.2. Khử nước sau nhuộm
Nước phải được loại bỏ hoàn toàn trên tiêu bản nhuộm, vì sau nhuộm tiêu
bản phải qua giai đoạn làm trong dung dịch làm trong như dung môi toluen,
xylen hoặc clear-rite 3 [14], [47] ở phương pháp nhuộm HE thường quy và
được trải chất keo dán lá kính để bảo vệ [13] ở hai phương pháp. Nhưng dung
môi làm trong mô hay dung dịch keo dán không tan trong nước. Do đó nếu phủ
lamelle trên tiêu bản chưa khơ nước hồn tồn, sẽ gây nên hiện tượng hình ảnh
bị mờ, nhòe trên tiêu bản [40].
1.2.6. Tổng quan về phương pháp nhuộm HE
Phương pháp nhuộm HE được Bohmer và Fischer giới thiệu vào năm 1865
và 1875 là công cụ tồn tại với thời gian. Ngày nay, sau hơn 150 năm, phương
pháp nhuộm HE vẫn là phương pháp nhuộm được sử dụng rộng rãi nhất trong
phòng xét nghiệm GPB [29], [47]. Phương pháp nhuộm rất đơn giản, sử dụng
thuận tiện, thể hiện các cấu trúc mô khác nhau một cách dễ dàng, đầy đủ các
đặc điểm cấu trúc chung [19].
Trong phương pháp nhuộm HE, Hematoxylin nhuộm màu nhân tạo màu
xanh tím hoặc tím, thấy chi tiết chất nhiễm sắc rõ ràng, trong khi Eosin nhuộm

Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.
Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

13

tế bào chất tế bào và hầu hết các sợi mô liên kết ở các sắc thái và cường độ khác
nhau [47] của màu hồng, đỏ cam. Là phương pháp nhuộm đầu tiên được các
bác sĩ GPB dùng xét nghiệm cho các mẫu bệnh phẩm phẫu thuật.

Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.
Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

14

Bảng 1.1: Quy trình nhuộm HE với dung dịch Toluen/ Xylen [1]
Các giai đoạn

Hóa chất

Thời gian

Tẩy parafin

1. Toluen/ Xylen

5 phút

2. Toluen/ Xylen

5 phút

3. Toluen/ Xylen

5 phút

4. Alcool 100o

1 phút

5. Alcool 95o

1 phút

6. Alcool 80o

1 phút

7. Alcool 70o

1 phút

8. Rửa trong nước

5 phút

9. Hematoxylin Harris

5 phút

10. Rửa với nước

5-10 phút

11. Rửa axit alcool 1%

1 nhúng

12. Rửa trong nước

1 phút

Nhuộm nhân

Tẩy axit

Kiềm hóa

13. Dung dịch Thilium carbonate 1% 1 phút
14. Rửa trong nước

2 phút

15. Alcool 700

1 phút

Nhuộm tế bào chất

16. Eosin

3-5 phút

Biệt hóa, làm trong

17. Alcool 90o

1 phút

18. Alcool 100o

1 phút

19. Alcool 100o

1 phút

20. Toluen/ Xylen

15 nhúng

21. Toluen/ Xylen

15 nhúng

22. Toluen/ Xylen

5 phút

1.2.6.1. Xylen hoặc Toluen
Xylen là chất lỏng khơng màu, có mùi thơm. Khơng tan trong nước. Nhiệt
độ nóng chảy từ 25oC, nhiệt độ sơi 136-145oC. Là chất lỏng dễ cháy, nhiệt độ

Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.
Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn.