Nghiên cứu xác định giới tính bằng kỹ thuật PCR đa mồi

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI
HÀ PHƯƠNG THƯ
Viện Khoa học Vật liệu
HÀ THỊ MINH THI, NGUYỄN VIẾT NHÂN,
Trường Đại học Y Dược Huế
TÓM TẮT:
Xác định giới tính đóng một vai trị quan trọng
trong di truyền y học. Để xác định giới tính, ngồi
phương pháp lập karyotype, kỹ thuật PCR đa mồi đã
được sử dụng rộng rãi nhằm xác định sự hiện diện
của gene SRY. Đề tài được thực hiện nhằm các mục
tiêu sau:
(1) Hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để khuếch
đại các đoạn gene SRY và ZFY.
(2) Đánh giá giá trị của kỹ thuật này trong việc xác
định giới tính.
Quy trình PCR đa mồi được thực hiện với 2 cặp
mồi tương ứng gene SRY và ZFX/ZFY, trong đó gene
ZFX/ZFY được dùng làm chứng nội. Các mẫu DNA
dùng trong thí nghiệm được chiết tách từ máu ngoại
vi của 30 người tình nguyện đã có con cái, gồm 15
nam và 15 nữ.
Chúng tôi rút ra các kết luận sau:
- Kỹ thuật PCR đa mồi với việc sử dụng 2 cặp
mồi tương ứng với gene SRY và ZFX/ZFY đã khuếch
đại được các đoạn DNA thích hợp.
- Kỹ thuật PCR đa mồi này đủ điều kiện để ứng
dụng trong xác định giới tính dựa trên việc đánh giá
sự hiện diện của gene SRY.
Summary:
STUDY ON THE SEX IDENTIFICATION BY

MULTIPLEX PCR TECHNIQUE
The sex identification plays an important role in
medical genetics. For sex identification, apart from
method of karyotyping, multiplex PCR technique is
often used in order to identify the presence of SRY
gene. This study is aimed at:
(1) Improving of multiplex PCR technique in order
to amplify the DNA fragments of SRY and ZFY gene.
(2) Evaluating of the value of this technique in the
sex identification.
The process of multiplex PCR was carried out by
using two primer pairs of SRY and ZFY gene.
ZFX/ZFY gene was used as an internal control. The
DNA samples used in this experiment were extracted
from peripheral blood of thirty volunteers who have
children, including fifteen men and fifteen women.
Results:
- The technique multiplex PCR with the using of
two primer pairs of SRY and ZFX/ZFY gene amplified
the corresponding DNA fragments.
- This technique has enough criteria to be used
in sex identification based on confirmation the
presence of SRY gene.

Y HỌC THỰC HÀNH (644+645) - Số 2/2009

ĐẶT VẤN ĐỀ
Xác định giới tính đóng một vai trị quan trọng
trong di truyền y học. Trước đây, việc xác định giới
tính chỉ được thực hiện bằng phương pháp di truyền

tế bào là lập karyotype, trong đó cặp nhiễm sắc thể
(NST) giới tính của nữ là XX và của nam là XY. Tuy
nhiên, trên thực tế đã có nhiều trường hợp đảo
ngược giới tính (sex reverse), đó là một người mang
kiểu hình nữ nhưng cặp NST giới tính là XY, ngược
lại một người mang kiểu hình nam nhưng cặp NST
giới tính là XX. Vì vậy, việc phối hợp thêm một
phương pháp di truyền phân tử nhằm phân tích gene
chịu trách nhiệm hình thành giới tính nam là rất cần
thiết. Hiện nay, người ta đã phát hiện ra nhiều gene
liên quan đến việc hình thành giới tính nam, trong đó
quan trọng nhất là gene SRY (sex-determining region
of Y gene) được phân lập vào năm 1990. Gene SRY
mã hoá một yếu tố phiên mã có khả năng gắn với
DNA đặc hiệu và thúc đẩy hoạt động của các gene
mã hoá các yếu tố tham gia hình thành tinh hồn.
Những người mang NST Y nhưng thiếu gen SRY sẽ
khơng hình thành tinh hồn và mang kiểu hình bên
ngồi là nữ, ngược lại những người mang NST giới
tính XX nhưng có gene SRY thì vẫn hình thành tinh
hồn và có kiểu hình bên ngồi là nam. Để xác định
sự hiện diện gene SRY trong genome, một kỹ thuật
phân tử đơn giản, nhanh và nhạy là PCR đã được sử
dụng rộng rãi. Tuy nhiên, nếu chỉ dùng một cặp mồi
nhằm khuếch đại một đoạn của gene SRY thì sẽ gặp
khó khăn khi phân tích kết quả ở người nữ, vì khi
khơng có sản phẩm PCR sẽ khơng phân biệt được
đó là do khơng có gene SRY (người nữ) hay do phản
ứng PCR khơng hiệu quả. Vì vậy, cần phải thiết kế
một kỹ thuật PCR đa mồi, trong đó ngồi cặp mồi đặc

hiệu với gene SRY, cịn phải kết hợp thêm một cặp
mồi khuếch đại một gene khác ln có mặt ở cả nam
lẫn nữ để làm chứng nội (internal control). Gene
được lựa chọn làm chứng nội trong kỹ thuật của
chúng tôi là ZFX/ZFY.
Đề tài được thực hiện nhằm các mục tiêu sau:
(1) Hồn thiện quy trình PCR đa mồi để khuếch
đại các đoạn gene SRY và ZFX/ZFY.
(2) Đánh giá giá trị của kỹ thuật này trong việc
xác định giới tính.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng nghiên cứu
DNA được chiết tách từ bạch cầu máu ngoại vi
của 30 người tình nguyện đã có con cái, gồm 15 nam
và 15 nữ.

1


2. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Chiết tách DNA từ bạch cầu máu ngoại vi
- Lấy 300 µl máu tĩnh mạch ngoại vi được chống
đông bằng EDTA.
- Chiết tách DNA theo protocol của kit AquaPure
genomic DNA (Bio-Rad).
- Đo nồng độ DNA chiết tách và đánh giá độ tinh
sạch bằng máy quang phổ kế và điện di trên gel
agarose 0,8%.
2.2. Kỹ thuật PCR đa mồi
- Mồi:

Cặp mồi khuếch đại gene SRY:
Mồi xuôi (SRY-F): 5’-GAA TAT TCC CGC TCT
CCG GA -3’
Mồi ngược (SRY-R): 5’-GCT GGT GCT CCA TTC
TTG AG -3’
Cặp mồi khuếch đại gene ZFX/ZFY:
Mồi xuôi (ZFY-F): 5’-ACC ACT GTA CTG ACT
GTG ATT ACA C -3’
Mồi ngược (ZFY-R): 5’ -GCA CCT CTT TGG TAT
CCG AGA AAG T -3’
- Thành phần phản ứng PCR:
Kit PCR: FideliTaq PCR Master Mix 2X (USB
Corporation)
Nồng độ mỗi mồi là 0,25 µM.
Lượng DNA trong mỗi phản ứng 25 µl là 200 ng.
- Điều kiện luân nhiệt:
95oC, 10 phút
30 chu kỳ: 94oC, 30 giây; 57oC, 90 giây; 72oC, 60
giây.
72oC, 10 phút
Thực hiện trên máy luân nhiệt của Bio-Rad
- Phát hiện sản phẩm:
Điện di trên gel agarose 2%, đệm TBE 1X, điện
thế 80 V, kích thước gel là 6 cm x 10 cm, thời gian 2
giờ 30 phút.
Sử dụng thang chuẩn 100 bp.
Nhuộm ethidium bromide và phân tích gel bằng
hệ thống GelDoc của Bio-Rad.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Kết quả hoàn chỉnh kỹ thuật PCR

Hình 1: Hình ảnh điện di sản
phẩm PCR trên gel agarose
1 2 3
Cột 1: Mẫu DNA người nam.
Có 2 băng với kích thước 495 và
472 bp.
Cột 2: Mẫu DNA người nữ. Chỉ
có 1 băng kích thước 495 bp.
495 bp
Cột 3: Thang chuẩn 100 bp

472 bp

2. Đánh giá giá trị của kỹ thuật PCR đa mồi
trong xác định giới tính
Bảng 1: Kết quả PCR xác định giới tính của 30

2

mẫu DNA người tình nguyện
Gene
Giới
Nam
Nữ

SRY
Số mẫu
Tỷ lệ %
PCR (+)
15

100%
0
0%

ZFX/ZFY
Số mẫu
Tỷ lệ %
PCR (+)
15
100%
15
100%

Nhận xét: Tất cả các mẫu DNA nam giới đều có
sản phẩm PCR tương ứng gene SRY và ZFX/ZFY.
Tất cả các mẫu DNA nữ giới đều có sản phẩm tương
ứng gene ZFX/ZFY nhưng khơng có sản phẩm tương
ứng gene SRY.
BÀN LUẬN
1. Hoàn chỉnh kỹ thuật PCR đa mồi
Cặp mồi ZFY-F và ZFY-R được thiết kế để
khuếch đại đoạn DNA từ vị trí 1648 đến 2142 trên
gene ZFY (GI: 33239439) của NST Y với kích thước
sản phẩm là 495 bp. Trên NST X có gene ZFX (GI:
71061445) với trình tự nucleotide khá tương đồng với
ZFY. Cặp mồi ZFY-F và ZFY-R cũng khuếch đại
được cả đoạn DNA từ vị trí 1625 đến 2119 trên gene
ZFX với kích thước sản phẩm cũng là 495 bp. Như
vậy, tất cả mọi người dù nam hay nữ đều có sản
phẩm PCR với cặp mồi ZFY-F và ZFY-R. Do đó, sản

phẩm PCR của cặp mồi này đủ điều kiện để làm
chứng nội cho phản ứng PCR đa mồi.
Cặp mồi SRY-F và SRY-R được thiết kế để
khuếch đại đoạn DNA từ vị trí 479 đến 950 của gene
SRY (GI: 36604) với kích thước sản phẩm là 472 bp.
Trên hình 1 cho thấy chỉ có mẫu DNA của nam
giới có 2 sản phẩm PCR có kích thước 495 và 472
bp, cịn mẫu DNA của nữ giới thì chỉ có 1 sản phẩm
kích thước 495 bp. Khơng có các sản phẩm PCR
không đặc hiệu. Như vậy kỹ thuật PCR đa mồi này có
thể sử dụng để xác định giới tính từ các mẫu máu.
Ngồi ra, với DNA từ các bệnh phẩm khác như chân
tóc, nước bọt, dịch cơ thể, nước ối ... đều có thể áp
dụng kỹ thuật này để xác định giới tính. Việc xác định
giới tính bằng kỹ thuật PCR đa mồi này có thể ứng
dụng để xác định giới tính của những trường hợp
chưa rõ giới tính trên lâm sàng cũng như về phương
diện tế bào học. Nó cịn có thể ứng dụng trong sàng
lọc trước sinh đối với các bệnh di truyền liên kết giới
tính như bệnh máu khó đơng, teo cơ Duchene ...
Ngồi ra, còn được ứng dụng trong ngành y học tội
phạm giúp xác định giới tính của người gây án một
cách nhanh chóng, kỹ thuật này đóng vai trị rất quan
trọng khi các mẫu máu để lại hiện trường quá ít.
2. Đánh giá giá trị của kỹ thuật PCR đa mồi
trong xác định giới tính
Chúng tơi sử dụng các mẫu DNA của 30 người
tình nguyện (15 nam và 15 nữ) để kiểm chứng kỹ
thuật. Các người này đều đã có con cái, nghĩa là giới
tính của họ đã được xác định rõ ràng, khơng có bất

thường gì về hệ sinh sản.
Kết quả ở bảng 1 cho thấy tất cả các mẫu DNA
của người nam đều có 2 sản phẩm PCR tương ứng
với 2 cặp mồi sử dụng, trong khi đó các mẫu DNA
của người nữ đều chỉ có 1 sản phẩm PCR tương ứng

Y HỌC THỰC HÀNH (644+645) - Số 2/2009


với cặp mồi ZFY mà khơng có sản phẩm với cặp mồi
SRY.
Như vậy, chúng ta có thể sử dụng kỹ thuật PCR
đa mồi này trong xác định giới tính. Đây chỉ mới là
nghiên cứu bước đầu của chúng tôi nhằm hồn chỉnh
kỹ thuật trước khi áp dụng chẩn đốn cho bệnh nhân.
Trong thời gian tới chúng tôi sẽ áp dụng chẩn đoán
cho các trường hợp bệnh lý chưa xác định được giới
tính trên lâm sàng.
KẾT LUẬN
Qua q trình nghiên cứu thử nghiệm, chúng tôi
rút ra các kết luận sau:
1. Kỹ thuật PCR đa mồi với việc sử dụng 2 cặp
mồi tương ứng với gene SRY và ZFY đã khuếch đại
được các đoạn DNA thích hợp từ gene SRY và
ZFX/ZFY, trong đó gene ZFX/ZFY được dùng làm
chứng nội.
2. Kỹ thuật PCR đa mồi này đủ điều kiện để ứng

Y HỌC THỰC HÀNH (644+645) - Số 2/2009

dụng trong xác định giới tính dựa trên việc đánh giá
sự hiện diện của gene SRY.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Erdal ME., Barlas IO. (2000), “Detection of the
SRY gene in a 46,XY phenotypic female by the PCRSSCP method”, Turk J Med Sci, 30: 501-503.
2. Mohammed F., Tayel SM. (2005), “Sex
identification of normal persons and sex reverse
cases from bloodstains using FISH and PCR”,
Journal of Clinical Forensic Medicine, 12(3): 122-127.
3. Simoni M., Bakker E., Krausz C. (2004),
“EAA/EMQN best practice guidelines for molecular
diagnosis of Y-chromosomal microdeletions. State of
the art 2004”, Internal Journal of Andrology, 27: 240249.
4. Sinclair
AH.
(1998),
“Human
Sex
determination”, The Journal of Experimental Zoology,
281: 501-505.

3