Đánh giá tính đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh tại đà nẵng bằng chỉ thị phân tử

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

NGUYỄN TẤN PHÁT

ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC CHỦNG
VI KHUẨN Ralstonia solanacearum Smith GÂY BỆNH HÉO
XANH TẠI ĐÀ NẴNG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÀ NẴNG, NĂM 2018


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

NGUYỄN TẤN PHÁT

ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC CHỦNG
VI KHUẨN Ralstonia solanacearum Smith GÂY BỆNH HÉO
XANH TẠI ĐÀ NẴNG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ

Ngành : Cơng nghệ sinh học

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

Giáo viên hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN MINH LÝ

ĐÀ NẴNG, NĂM 2018

LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng
bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Tác giả

Nguyễn Tấn Phát


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các quý thầy, cô khoa Sinh – Môi Trƣờng,
trƣờng Đại Học Sƣ Phạm Đại Học Đà Nẵng đã hƣớng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận
lợi cho em trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và thực hiện khóa luận.
Em xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn Minh Lý
ngƣời thầy tâm huyết đã tận tình hƣớng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian
trao đổi và định hƣớng cho em trong suốt q trình thực hiện khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể bạn bè, đồng nghiệp đã luôn động viên tinh
thần cho tôi trong suốt thời gian học tập và hồn thành khóa luận.


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU
DANH MỤC HÌNH ẢNH
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................................... 1
2. Mục tiêu đề tài .............................................................................................................. 2

3. Ý nghĩa khoa học của đề tài ......................................................................................... 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 4
1.1. Tổng quan về vi khuẩn .............................................................................................. 4
1.1.1. Phân loại vi khuẩn .............................................................................................. 4
1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh thái của vi khuẩn Ralstonia solanacearum . 6
a. Đặc điểm hình thái, cấu tạo Vi khuẩn R. solanacearum. ...................................... 6
b. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn R. solanacearum ................................................. 7
c. Phương thức tồn tại, xâm nhập và lan truyền của vi khuẩn R. solanacearum. .... 7
d. Ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh đến sự phát sinh, phát triển của bệnh héo
xanh vi khuẩn hại lạc................................................................................................. 8
e. Chuẩn đoán bệnh héo xanh vi khuẩn và phân lập vi khuẩn gây bệnh. ................. 9
1.1.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn R. solanacearum................................ 10
a. Biovar và nòi của vi khuẩn R. solanacearum...................................................... 10
b. Chủng .................................................................................................................. 11
c. Loài phức ............................................................................................................. 12
d. Kiểu gây bệnh ...................................................................................................... 12
e. Kiểu quan hệ phả hệ ............................................................................................ 12
1.1.4. Tình hình nghiên cứu bệnh héo xanh ở Việt Nam và trên Thế giới ................. 13
a. Nghiên cứu bệnh héo xanh trên thế giới ............................................................. 13


b. Nghiên cứu bệnh héo xanh ở Việt Nam ............................................................... 13
1.2. Tổng quan về kỹ thuật RAPD ................................................................................. 14
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 17
2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................. 17
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 18
2.3. Địa điểm, thời gian và phạm vi nghiên cứu ............................................................ 18
2.3.1. Địa điểm nghiên cứu ......................................................................................... 18
2.3.2. Thời gian nghiên cứu: từ tháng 04/2017 đến 04/2018...................................... 18
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu......................................................................................... 18

2.4.1. Phƣơng pháp thu mẫu ....................................................................................... 18
2.4.2. Phƣơng pháp phân lập ...................................................................................... 18
a. Mẫu đất ................................................................................................................ 18
b. Mẫu cây bệnh ...................................................................................................... 19
2.4.3. Phƣơng pháp xác định biovar của dòng vi khuẩn phân lập .............................. 19
2.4.4. Phƣơng pháp phân tích DNA............................................................................ 21
a. Phương pháp tách chiết DNA từ vi khuẩn .......................................................... 21
2.4.5. Kỹ thuật PCR: ................................................................................................... 21
2.4.6. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose ............................................................... 21
2.4.7. Nghiên cứu đa dạng di truyền một số chủng vi khuẩn R. solanacearum bằng
phân tích DNA ............................................................................................................ 22
2.4.8. Phƣơng pháp bảo quản giống vi sinh vật.......................................................... 22
Bảo quản trên môi trường thạch bằng, định kỳ kiểm tra cấy truyền ...................... 22
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.................................................................... 24
3.1. Phân lập vi khuẩn héo xanh tại địa bàn Đà Nẵng ................................................ 24
3.2. Xác định biovar của các chủng vi khuẩn R. solanacearum ................................. 27
3.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền một số chủng vi khuẩn R. solanacearum bằng
phân tích DNA ............................................................................................................ 29
3.3.1. Kết quả tách chiết DNA vi khuẩn R. solanacearum ..................................... 29


3.3.2. Kết quả phân tích các chủng vi khuẩn với các mồi RAPD ........................... 29
3.3.3. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa các chủng VKHX................. 30
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................................ 34
1. Kết luận ............................................................................................................... 34
2. Kiến nghị ............................................................................................................. 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 35
Tiếng việt ................................................................................................................. 35
Tiếng Anh ................................................................................................................ 36

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
FAO

Food and Agriculture Organization of the United Nations

HXVK
TZC

Héo xanh vi khuẩn
Tetrazolium chloride

SPA
PCR

Sucrose peptone agar
Polymerase chain reaction

bp
DNA

Base pair
Deoxyribonucleic acid

µg
µL

Microgram
Microliter

AP-PCR
DAF
RAPD
TAE
Kb
mg
mL

Arbitrary primed polymerase chain reaction
DNA amplification fingerprinting
Randomly amplified polymorphic DNA
Tris-Acetic acid-EDTA
Kilobase
Milligram
Millilite

mM
cs

Millimol
Cộng sự

CTAB
EDTA

cetyltrimethyl-ammonium bromide
ethylene diamine tetraacetic acid


DANH MỤC BẢNG BIỂU

Số hiệu

Tên bảng

Trang

Bảng 2.1

Tọa độ các địa điểm lấy mẫu

17

Bảng 2.2

Danh sách 5 đoạn mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu

17

Bảng 2.3

Phản ứng xác định Biovar vi khuẩn R.solanacearum

20

Bảng 3.1

Các chủngVKHX đƣợc phân lập

24

Bảng 3.2

Đƣờng kính khuẩn lạc trên môi trƣờng TZC sau 24h và
48h nuôi cấy

25

Bảng 3.3

Kết quả xác định biovar của 23 chủng vi khuẩn R.
solanacearum gây bệnh héo xanh

27

Bảng 3.4

Mức độ đa hình của 5 mồi RAPD ngẫu nhiên khi phân
tích với 5 chủng vi khuẩn R. solanacearum

28

Bảng 3.5

Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các chủng vi khuẩn
héo xanh

30

bảng

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Số hiệu hình

Tên hình

Trang

Hình 1.1

Hình thái vi khuẩn Ralstonia
solanacearum Smith dƣới kính hiển vi

4

Hình thái các loại kiểu hình của vi
Hình 3.1

khuẩn trên mơi trƣờng TZC đƣợc sử
dụng trong nghiên cứu

25

Hình 3.2

Kết quả tách chiết DNA một số chủng vi
khuẩn R. solanacearum

28

Hình 3.3

Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định
tính đặc hiệu của quy trình phát hiện R.
solanacearum sử dụng DNA chiết tách
từ các loài vi khuẩn đã phân lập đƣợc.

29

Hình 3.4

Quan hệ di truyền giữa các chủng vi
khuẩn héo xanh

30


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây ra bệnh héo xanh, và có nguồn
gốc trong đất, đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên các cây thuộc họ Cà ở Mỹ vào n m
1896. Cho đến nay bệnh phổ biến rất rộng ở hầu hết các nƣớc châu Á, Phi, Mỹ, Úc.
Bệnh bắt đầu xuất hiện ở Châu Âu nhƣng gây hại nghiêm trọng chủ yếu ở các nƣớc
vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới có khí hậu nóng, ẩm.
Bệnh này đƣợc coi là một trong n m loại bệnh cây trồng thuộc đối tƣợng quan
tâm nhất của chƣơng trình phịng trừ sâu bệnh tổng hợp của FAO (1992) và chịu sự
kiểm soát chặt chẽ của kiểm dịch Quốc tế, nhất là các nƣớc thuộc cộng đồng châu Âu
[5]. Đây là loại vi khuẩn có khả n ng gây hại trên 200 loài cây cỏ, đặc biệt gây hại nặng
trên cây họ cà nhƣ cà chua, cà tím, khoai tây, thuốc lá và các cây khác họ nhƣ đậu
phụng, gừng chuối, chúng có khả n ng sống rất lâu trong đất và lây lan rất nhanh, di

chuyển từ nơi này sang nơi khác. Vi khuẩn gây thiệt hại kinh tế lớn đối với các cây
trồng có ý nghĩa kinh tế nhƣ lạc, cà chua, khoai tây, và có thể làm giảm đáng kể đến
n ng suất và chất lƣợng của nông sản từ 5-100% tùy theo loài cây, giống cây, vùng địa
lý
Việt nam là một nƣớc có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, thuộc vùng phân bố chính
của lồi vi khuẩn Ralstonia solanacearum , bệnh héo xanh vi khuẩn (HXVK) đƣợc coi
là bệnh hại phổ biến ở nhiều tỉnh trong cả nƣớc nhƣ: Bắc Giang, Bắc Ninh, Ninh Bình,
Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Long An, Tây Ninh... [15, 16]. Bệnh gây hại nghiêm
trọng ở một số vùng trọng điểm ở tỉnh Nghệ An và Thanh Hóa với tỷ lệ bệnh dao động
trong khoảng 15% đến 35% và ở tỉnh Long An và Tây Ninh là từ 20% đến 30%.
Đặc biệt, trên địa bàn thành phố Đà Nẵng do sự tồn tại của vi khuẩn gây bệnh
héo xanh, nên quá trình sản xuất các loại cây họ cà gặp rất nhiều khó kh n. Trong đó,
cà chua và lạc cho n ng suất thấp và hầu nhƣ không thể trồng đƣợc trên các cánh đồng
(đối với cà chua).
Trong thực tế sản xuất, phòng chống bệnh HXVK là vấn đề rất khó kh n, đã có
nhiều nghiên cứu về canh tác và chọn giống cây trồng, sử dụng thuốc hóa học cũng
nhƣ các chế phẩm sinh học có khả n ng ức chế và làm giảm tính độc của R.
solanacearum[17]. Tuy nhiên, các biện pháp đó cịn nhiều hạn chế, bệnh HXVK vẫn
luôn hiện diện, gây hại và luôn là mối lo ngại đối với ngƣời sản xuất.
1


Chọn tạo giống mang gen kháng bệnh đƣợc xem là biện pháp ƣu việt và hiệu
quả nhất[13]. Nhƣng tính kháng của giống phụ thuộc rất nhiều vào độc tính của các
chủng vi khuẩn [1, 14]. Và để tạo ra đƣợc giống kháng bền vững phải hiểu đƣợc đặc
điểm di truyền cũng nhƣ độ độc tính của các chủng vi khuẩn ở các vùng sinh thái khác
nhau.
Chính vì những lý do trên, chúng tôi đã đề xuất thực hiện đề tài “Đánh giá tính
đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh
héo xanh tại Đà Nẵng bằng chỉ thị phân tử”.

2. Mục tiêu đề tài
Phân lập và đánh giá đƣợc tính đa dạng di truyền bằng phƣơng pháp sinh học
phân tử các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh tại các vùng
sản xuất nông nghiệp của thành phố Đà Nẵng, .

2


3. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Cung cấp dẫn liệu khoa học về sự đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn
Ralstonia solacearum đƣợc phân lập tại Đà Nẵng.
Cung cấp các chủng phục vụ trong việc đánh giá tính kháng bệnh bằng phƣơng
pháp gây bệnh nhân tạo.

3


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về vi khuẩn
1.1.1. Phân loại vi khuẩn
Bệnh héo xanh vi khuẩn (HXVK) đƣợc gây ra bởi vi khuẩn Ralstonia
solanacearum , mà trƣớc đây đƣợc gọi là Pseudomonas solanacearum do E.F.Smith
nghiên cứu n m 1896, đƣợc cho là đã gây bệnh ở khoai tây gây tổn hại nhất, đứng thứ
hai sau bệnh bạc lá ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (CGIAR 2005). Chúng gây
bệnh cho khoảng 30 loài cây trồng cả cây một lá mầm và cây hai lá mầm (Smith et al.,
2003), trong đó cây dễ bị nhất là khoai tây, cà chua, ớt, cà tím, và lạc. Nghiên cứu đã
chỉ ra rằng có 5 chủng và 5 biovars của Ralstonia [13].

Hình 1.1: Hình thái vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith dưới kính hiển vi[18]
Các nghiên cứu trên thế giới cho biết: đầu tiên vi khuẩn đƣợc Smith đặt tên là

Bacillus solanacearum. Tiếp theo, vi khuẩn đƣợc đổi tên là Pseudomonas
solanacearum (Smith, 1896). Các nghiên cứu phân loại gần đây về các vi khuẩn
Pseudomonas không tạo sắc tố huỳnh quang đã tạo ra một chi mới là Burkholderia. Vi
khuẩn P. solanacearum đã đƣợc phân loại lại thành Burkholderia solanacearum
(Yabuuchi et al., 1992). Các nghiên cứu phân loại sau đó đã chứng minh rằng B.
solanacearum khác hoàn toàn các vi khuẩn Burkholderia khác và thuộc một chi mới là
Ralstonia. Dựa trên các nghiên cứu phân loại mới này, B. solanacearum đã đƣợc đổi
4


tên lại là R. solanacearum(Yabuuchi et al., 1995). Sau Hội nghị Quốc tế lần thứ 2 về vi
khuẩn n m 1997, đa số các tác giả gọi vi khuẩn là Ralstonia solanacearum . Hiện nay
phân loại chính thức của vi khuẩn héo xanh là:
Giới (Kingdom): Bacteria
Ngành (Phylum): Proteobacteria
Lớp (Class): Beta Proteobacteria
Bộ (Order): Burkholderiales
Họ (Family): Ralstoniaceae
Chi (Genus): Ralstonia
Loài: Ralstonia solanacearum (Smith, 1896) (Yabuuchi et al., 1995; Yabuuchi
et al., 1996; Tahat và Sijam, 2010).
Ngồi ra, vi khuẩn cịn có các tên đồng nghĩa khác là Pseudomonas ricini
(Archibald) (Robbs, 1954); Pseudomonas batatae (Cheng và Faan, 1962, Yabuuchi et
al., 1995; Yabuuchi et al., 1996; Tahat và Sijam, 2010).
Ngoài gây hại trên cây lạc (Arachis hypogaea L.), vi khuẩn R. solanacearum
còn gây hại trên 450 loài cây thuộc 54 họ thực vật khác nhau. Vi khuẩn R.
solanacearum gây bệnh trên một số cây khác nhƣ Ageratum conyzoides, Amaranthus
spp., Artemisia pallens, Artemisia sp., Beta vulgaris var. cicla, Capsicum annuum,
Casuarina cunninghamiana, Casuarina equisetifolia, Casuarina glauca, Cereus
peruvianus, Coleus forskohlii, Coleus sp., Colocasia esculenta, Commelina communis,

Cucumis melo, Cucumis sativus, Cucurbita moschata, Cucurbita pepo, Curcuma
longa, Cynara cardunculus var. scolymus, Emilia sonchifolia sp., Eucalyptus sp.,
Galinsoga parviflora sp., Gossypium sp., Heliconia sp., Heliconia caribaea, Hevea
brasiliensis, Hibiscus sabdariffa, Ipomoea batatas, Justicia adhatoda, Maranta
arundinacea, Musa sp., Musa x paradisiaca, Nicotiana tabacum, Olea europaea subsp.
europaea, Pelargonium sp., Platostoma chinensis, Plectranthus barbatus, Pogostemon
cablin, Polygonum capitatum, Portulaca oleracea, Ricinus communis, Siraitia
grosvenorii, Solanum cinereum, Solanum lycopersicum, Solanum melongena, Solanum
nigrum, Solanum tuberosum, Talinum fruticosum, Tectona grandis, Urtica dioica,
Washingtonia filifera, Zingiber officinale,... [25]. Tuy nhiên, loài vi khuẩn R.
solanacearum rất dễ bị biến dị và phân hố hình thành nhiều nòi và biovar khác hẳn

5


nhau về tính chun hố ký chủ, tính gây bệnh và tính độc, phân bố khác nhau ở các
vùng địa lý sinh thái.
Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Ly và Phan Bích Thu (1993) đã xác định vi khuẩn R.
solanacearum là nguyên nhân gây bệnh héo xanh. Theo Nguyễn Xuân Hồng và cs.
(1993) vi khuẩn R. solanacearum là nguyên nhân gây bệnh héo xanh lạc và một số cây
trồng khác. Đỗ Tấn Dũng (1995) cho rằng bệnh HXVK phát sinh, phát triển và gây hại
nghiêm trọng trên cây cà chua, khoai tây, lạc. Đoàn Thị Thanh và cs. (1995) cho biết vi
khuẩn R. solanacearum không những gây hại trên cây khoai tây mà còn ký sinh và gây
hại trên cây cà chua, thuốc lá, lạc, cây cà. Tác giả còn cho rằng đây là lồi vi khuẩn đa
thực, có phạm vi ký chủ rộng, gây hại chủ yếu trên các cây trồng thuộc họ cà
(Solanaceae), họ đậu (Leguminaseae). N m 1977, Lê Lƣơng Tề (1997a) đã xác định vi
khuẩn R. solanacearum là nguyên nhân gây bệnh héo xanh lạc và một số cây trồng
khác nhƣ cà chua, khoai tây, thuốc lá, cây cà, vừng, ớt và đay.
1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh thái của vi khuẩn Ralstonia solanacearum
a. Đặc điểm hình thái, cấu tạo Vi khuẩn R. solanacearum.

Ralstonia solanacearum (Smith 1896) Yabuuchi et al. Tế bào lồi R.
solanacearum có hình oval ngắn, gram âm, trịn ở hai đầu, thƣờng ở dạng đơn, ghép
đơi hoặc ghép 4, ít khi kết thành chuỗi. Tuy có sự dao động đáng kể nhƣng kích thƣớc
của chúng khoảng 0,5-0,7 x 1,5-2,0 mm trong kích thƣớc. Nó là rất nhạy cảm với khơ
hạn và bị ức chế trong mơi trƣờng có nồng độ natri clorua (NaCl) thấp (2%). Đối với
hầu hết các chủng, nhiệt độ t ng trƣởng tối ƣu là 24-370C ; Tuy nhiên một số chủng có
nhiệt độ thấp hơn tối ƣu 20-22,50C. (Patrice G. Champoiseau và Timur M. Momol của
Đại học Florida). Hầu nhƣ chúng ln chuyển động, có một đến vài tiên mao ở một cực
của tế bào, bề mặt khuẩn lạc thƣờng nhẵn, đôi khi gồ ghề, chảy hoặc không chảy, màu
trắng đục hoặc phớt hồng, hoặc trắng. Cả chủng có tính độc cao và tính độc thấp đều có
các lơng nhỏ ở rìa [Mehan V. K., và Liao B, S., 1994].
Vi khuẩn R. solanacearum có cấu tạo đơn bào. Cấu trúc của tế bào vi khuẩn
gồm có: vỏ tế bào chiếm 15% đến 30% trọng lƣợng khô của tế bào có tác dụng bảo vệ
và giữ cho vi khuẩn có hình dạng xác định. Tế bào gồm chất ngun sinh, chất này
chứa bào tƣơng, chất nhân (nucleus) và các hạt trịn nhỏ khác nhau trong có chứa chất
dinh dƣỡng dự trữ.Bào tƣơng giàu RNA còn nhân giàu DNA. Bằng kính hiển vi điện tử
có thể phân biệt đƣợc các cấu trúc đại phân tử với đƣờng kính khoảng 200 Ao
6


(Angstron), các cấu trúc này là tổng thể của RNA-Protein, là những ribosome. Các
phân tử ribosome chứa nhiều men cần cho sự tổng hợp protein. Trong tế bào vi khuẩn
không thể hiện rõ nhân nhƣ trong tế bào của các cây trồng bậc cao và động vật, nhƣng
trong bào tƣơng thƣờng có thể phân biệt đƣợc “những nhiễm sắc thể” mà thƣờng đƣợc
xem nhƣ tƣơng ứng với nhân. Tế bào chất nằm trong màng bào tƣơng, ngoài màng bào
tƣơng lại có một lớp vỏ tế bào rắn hơn bao bọc, nhờ đó tế bào có hình dạng nhất định.
Thức n vào tế bào qua màng nửa thẩm thấu và những chất trao đổi hình thành trong
bào tƣơng cũng qua màng đó mà bị thải ra ngồi (Kinaly và cs., 1983; Izrainxki, 1988;
Mehan et al., 1994).
b. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn R. solanacearum

Vi khuẩn R. solanacearum là vi khuẩn hiếu khí, khơng hình thành bào tử và
nhuộm gram âm. Vi khuẩn này có khả n ng tổng hợp poly-B hydroxybutyrate nhƣ là
nguồn các bon dự trữ. Vi khuẩn R. solanacearum khơng hóa lỏng gelatin, khơng thủy
phân tinh bột, khơng có khả n ng tạo indol và khơng sử dụng arginin. Tuy nhiên, lồi
vi khuẩn này có khả n ng tạo ra H2S, khử nitrat, có khả n ng thủy phân Tween 80,
phản ứng dƣơng tính Le-van, phân giải đối với sữa limut, có phản ứng oxidase và
catalase, urê, pectin, ôxi hóa acetat, malonate và gluconate. Vi khuẩn R. solanacearum
chịu đựng kém với muối NaCl. Các chủng của vi khuẩn R. solanacearum không thể
phát triển trên môi trƣờng chứa 2% NaCl và bị kìm hãm ở mơi trƣờng có 0,5% đến
1,5% NaCl (Hayward, 1964; He et al., 1983; Ryan et al., 2008).
c. Phương thức tồn tại, xâm nhập và lan truyền của vi khuẩn R. solanacearum.
Vi khuẩn R. solanacearum tồn tại trong đất, trong tàn dƣ thực vật. Nhiều loài cỏ
dại cịn là ký chủ phụ của lồi vi khuẩn này, là cầu nối giữa nguồn bệnh với cây trồng.
Vi khuẩn còn tồn tại trong hạt giống, trên vỏ hạt, vỏ lụa và trong phôi hạt (Middleton
và Hayward, 1990; Machmud, 1993; Anitha et al., 2003).
R. solanacearum sinh sống trong các mơ mạch của vật chủ của nó. Vi khuẩn
thƣờng xâm nhập vào rễ cây từ đất thông qua vết thƣơng hoặc các lỗ tự nhiên nơi rễ
phụ nổi lên, xâm nhập khoang gian bào của vỏ rễ và nhu mô mạch, và cuối cùng đi vào
các mạch xylem và lan lên thân cây và lá cây, nơi mật độ tế bào mầm bệnh thƣờng
vƣợt 10-9 CFU / g mô vật chủ. Sau R. solanacearum đã xâm chiếm các xylem, số lƣợng
lớn các tế bào vi khuẩn đƣợc đổ ra từ rễ, cung cấp một con đƣờng cho vi khuẩn trở lại

7


đất và bắt đầu lây nhiễm mới ,vật chủ bị ảnh hƣởng bị úa, còi cọc, héo, và thƣờng chết
nhanh chóng. [12]
Bệnh lây lan chủ yếu qua đất. Trong số các vi khuẩn hại cây trồng thì vi khuẩn
R. solanacearum bền vững nhất trong đất. Vi khuẩn R. solanacearum có thể sống sót
trong đất bỏ hoang vài n m thậm chí cả khi khơng có cây trồng trên đất đó. Vi khuẩn

R. solanacearum có thể sống qua đơng trong đất, đất bị nhiễm bệnh là nguồn bệnh ban
đầu quan trọng nhất. Vi khuẩn tồn tại lâu trong đất khi trồng liên tục cây ký chủ nhiễm
bệnh hoặc có sự kết hợp với cây ký chủ khác xen kẽ trên đồng ruộng. Vi khuẩn tồn tại
tốt ở đất đủ ẩm, thoáng khí, nhƣng bị kìm hãm ở đất khơ và đất bị ngập nƣớc. Vi khuẩn
R. solanacearum lây lan chủ yếu qua đất nhƣng cũng dễ dàng truyền lan theo nguồn
nƣớc, qua mƣa gió và qua những vết thƣơng cơ giới, qua dụng cụ sản xuất của con
ngƣời, cũng có thể qua vết thƣơng ở rễ do côn trùng và tuyến trùng gây ra (Middleton
và Hayward, 1990).
d. Ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh đến sự phát sinh, phát triển của bệnh héo
xanh vi khuẩn hại lạc
Sự phát sinh, phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc có liên quan chặt chẽ
với các yếu tố thời tiết khí hậu nhƣ nhiệt độ, độ ẩm, mƣa, gió, độ pH đất,... Từ lúc xâm
nhiễm tới khi xuất hiện triệu chứng đầu tiên của bệnh phải trải qua một khoảng thời
gian nhất định. Thời gian đó phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện ngoại cảnh.
Bệnh phát triển mạnh, thuận lợi trong điều kiện thời tiết nóng ẩm nhất là ở nhiệt
độ từ 250C đến 350C nên bệnh gây hại chủ yếu là ở vùng nhiệt đới. Đất có độ ẩm cao
>60% và độ pH 5 - 6,8 thích hợp cho sự sinh trƣởng của vi khuẩn (Anitha et al., 2003).
Bệnh hại nặng hơn trên đất cát pha, thịt nhẹ, trên ruộng nghèo chất hữu cơ, độc canh
cây ký chủ… Bệnh phát triển kém, mức độ nhiễm bệnh nhẹ hơn trên các ruộng ln
canh lạc với lúa nƣớc, các lồi cây khơng phải là ký chủ và trên đất kiềm hoặc bón vơi.
Ở Việt Nam, Nguyễn Xuân Hồng và cs. (1995) cho rằng bệnh HXVK hại lạc là
một trong những bệnh phổ biến phát sinh, phát triển thuận lợi trong điều kiện nhiệt độ
và ẩm độ tƣơng đối cao. Theo Lê Lƣơng Tề (1997b), bệnh HXVK hại lạc thƣờng phát
sinh ở cả hai thời vụ trồng là lạc Xuân và lạc Thu. Trong điều kiện nhiệt độ tƣơng đối
cao, ẩm ƣớt, cây sinh trƣởng kém, đất cát, nhất là trên đất trồng độc canh cây lạc, bệnh
gây hại nặng. Khi nghiên cứu về mối liên quan giữa bệnh HXVK hại lạc với các yếu tố
sinh thái, kỹ thuật, Lê Lƣơng Tề (1997b) cho rằng bệnh có thể phát sinh ở các giai
8

đoạn sinh trƣởng của cây, cao điểm của bệnh là thời kỳ cây ra hoa đến quả non, sau đó
bệnh giảm ở giai đoạn quả già. Về ảnh hƣởng của phân bón thì vơi và kali có tác dụng
hạn chế tác hại của bệnh, cho n ng suất lạc cao hơn so với đối chứng. Chế độ luân canh
có ảnh hƣởng tới sự phát triển của bệnh, chu kỳ luân canh càng dài, mức độ gây hại
của bệnh càng giảm. Ở công thức luân canh lúa - lạc - lúa và mía - lạc thì tỷ lệ bệnh
HXVK thấp hơn so với công thức luân canh lạc Xuân - lạc Thu hoặc lúa - khoai tây lạc. Nguyễn Xuân Hồng và cs. (1997) cho rằng ở phía bắc Việt Nam, bệnh HXVK phát
sinh và gây hại nặng trên vùng đất đồi, đất bãi ven sơng, cịn trên đất ln canh với lúa
nƣớc thì mức độ nhiễm bệnh nhẹ hơn. Đỗ Tấn Dũng (1999) nghiên cứu bệnh HXVK
hại lạc ở vùng Đơng Anh, Hà Nội có nhận xét bệnh phát sinh và gây hại nặng từ giai
đoạn cây lạc ra hoa rộ đến quả non.
Nguyễn V n Viết và Phan Duy Hải (2010) nghiên cứu mối tƣơng quan giữa
bệnh và biện pháp canh tác đã cho rằng trồng lạc liên tục trên đất gò đồi và đất dốc
miền núi làm gia t ng tích lũy nguồn bệnh và làm t ng tỷ lệ bệnh các n m tiếp theo.
e. Chuẩn đoán bệnh héo xanh vi khuẩn và phân lập vi khuẩn gây bệnh.
Trên đồng ruộng có thể xác định bệnh nhanh bằng cách cắt một đoạn thân ngắn
khoảng 3 cm gần gốc thân cây bị bệnh, ngâm vào cốc nƣớc, sau một thời gian xuất
hiện dòng dịch vi khuẩn màu trắng đục chảy ra từ vết cắt. Cắt dọc theo thân cây, dễ
dàng nhận thấy mạch dẫn bị chuyển màu thành nâu sẫm hoặc nâu nhạt (Wang và Hou,
1983). Phƣơng pháp chẩn đoán này cũng đã đƣợc áp dụng tại Việt Nam (Burgess et al.,
2009; Nguyễn Tất Thắng và Đỗ Tấn Dũng, 2010).
Có nhiều phƣơng pháp để xác định vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo
xanh hại lạc nhƣ phân lập trên môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo, phƣơng pháp huyết
thanh, phƣơng pháp phân tích PCR (Mehan và Mc. Donald, 1995).
Theo Mehan (1995), môi trƣờng tetrazolium chloride agar (TZC) phù hợp để
phân lập vi khuẩn R. solanacearum, cịn mơi trƣờng sucrose peptone agar (SPA) phù
hợp để nhân vi khuẩn R. solanacearum. Trên mơi trƣờng TZC khuẩn lạc vi khuẩn R.
solanacearum có hình trịn, nhầy, màu trắng kem, rìa mép nhẵn, ở giữa có màu phớt
hồng, cịn trên mơi trƣờng SPA, khuẩn lạc của vi khuẩn R. solanacearum có hình dạng
trịn, nhẵn bóng, màu trắng sữa.
Nhiều cơng trình nghiên cứu về phƣơng pháp và ứng dụng kỹ thuật PCR

(polymerase chain reaction) trong chẩn đoán bệnh trên cây trồng và các ứng dụng khác
9


trong bệnh học thực vật đã đƣợc công bố. Phƣơng pháp PCR có nhiều lợi thế hơn hẳn
so với các phƣơng pháp chẩn đốn truyền thống nhờ có độ nhạy cao, tốc độ nhanh.
Bằng phƣơng pháp ứng dụng PCR, chỉ một vài giờ, từ một đoạn DNA ban đầu và đoạn
mồi có thể nhân lên hàng tr m triệu lần sau đó đi sâu phân tích kiểu gen, xác định,
nhận biết một cách chính xác nịi, biovar vi khuẩn R. solanacearum ở trong mẫu cây
bệnh cũng nhƣ trong đất nhiễm bệnh. Theo kết quả nghiên cứu của các phịng thí
nghiệm tham gia mạng lƣới nghiên cứu vi khuẩn héo xanh ở các nƣớc và vùng lãnh thổ
châu Á, Thái Bình Dƣơng nhƣ: Australasia, Đài Loan, Philippines,… thì sản phẩm
PCR của các mẫu phân lập thuộc loài R. solanacearum sử dụng với chỉ thị 759/760 có
kích thƣớc khơng đổi là 281 cặp bazơ (base pair-bp) và chỉ có các chủng cho sản phẩm
PCR có kích thƣớc nhƣ vậy mới có tính độc (Opina et al., 1997).
1.1.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn R. solanacearum.
a. Biovar và nòi của vi khuẩn R. solanacearum
Trong hơn 40 n m qua, nhiều tác giả sử dụng khái niệm nòi và biovar để phân
biệt đặc tính gây bệnh của vi khuẩn R. solanacearum. Biovar của vi khuẩn R.
solanacearum đƣợc xác định dựa trên khả n ng chuyển hóa cacbon hydrat, cụ thể là
khả n ng ơ xy hóa 3 đƣờng đơi (cellobiose, lactose, maltose) và 3 rƣợu Hexo - cacbon
(dulcitol, manitol, sorbitol) [25]. Hiện nay, 5 biovar của vi khuẩn R. solanacearum đã
đƣợc ghi nhận bao gồm:
- Biovar 1: khơng oxy hóa cacbon hydrat.
- Biovar 2: oxy hóa đƣờng nhƣng khơng oxy hóa rƣợu.
- Biovar 3: oxy hóa tất cả cacbon hydrat.
- Biovar 4: chỉ oxy hóa rƣợu.
- Biovar 5: oxy hóa lactose, maltose, cellobiose và manitol nhƣng khơng oxy hóa
sorbitol, dulcitol.
Các mẫu R. solanacearum thuộc biovar 2 phân lập từ vùng Amazon (châu Mỹ)

có đặc tính sinh hóa khá khác biệt (dựa trên khả n ng sử dụng đƣờng ribose và đƣờng
trehalose).Nhóm này đƣợc đặt tên là biovar 2-T (hoặc N2) còn biovar 2 gốc đƣợc đổi
thành biovar 2-A (Hayward, 1995b).
Biovar 1, biovar 3 và biovar 4 gây hại cho lạc còn biovar 2 và biovar 5 không
gây bệnh cho lạc. Biovar 1 gây bệnh trên lạc ở Mỹ, còn hầu hết các chủng gây bệnh
trên cây lạc ở các nƣớc châu Á, châu Phi chủ yếu là biovar 3, biovar 4 và thuộc nòi 1.
10


Theo Wu et al. (2013), 11 chủng của vi khuẩn R. solanacearum thu thập từ các tỉnh
khác nhau của Trung Quốc thuộc biovar 3.
Buddenhahem và Kelman (1964), Hayward (1964), He et al. (1983) đã phân
chia các chủng vi khuẩn R. solanacearum thành 5 nòi (race) dựa trên phổ ký chủ. N m
nịi của R. solanacearum gồm:
Nịi 1 (race 1): Có phạm vi ký chủ rộng, lây nhiễm các cây họ cà (Solanaceae)
và một số cây họ đậu (Leguminoseae), phân bố chủ yếu ở vùng đất thấp của vùng nhiệt
đới và cận nhiệt đới. Nòi 1 gồm biovar 1, biovar 3 và biovar 4.
Nòi 2 (race 2): Gây bệnh trên chuối (Heliconia spp.) ở miền Trung và Nam Mỹ
gồm biovar 2 và biovar 3.
Nòi 3 (race 3): Phạm vi ký chủ hẹp gây bệnh chủ yếu cho khoai tây, cà chua và
đƣợc tìm thấy ở vùng ơn đới vĩ độ cao và ở những vùng nhiệt đới cao. Nòi 3 chỉ có
biovar 2.
Nịi 4 (race 4): Gây hại trên gừng, tìm thấy chủ yếu ở Philippines. Nịi 4 chỉ có
biovar 4.
Nịi 5 (race 5): Gây hại trên cây dâu tằm, lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở Trung
Quốc. Nòi 5 chỉ có biovar 5.
Ở Việt Nam, Nguyễn Xuân Hồng và cs. (1997) cho rằng các nguồn vi khuẩn R.
solanacearum phân lập đƣợc kiểm tra đều có tính độc cao đối với cây lạc và một số
cây ký chủ khác, các mẫu phân lập đƣợc đều thuộc nòi 1, biovar 3 và biovar 4.
Đỗ Tấn Dũng (1999) cho rằng, tác nhân gây ra bệnh HXVK trên cây cà chua, cà

pháo, lạc, khoai tây ở tỉnh Ninh Bình đều do lồi vi khuẩn R. solanacearum Smith,
thuộc nòi 1, biovar 3. Các chủng vi khuẩn gây bệnh héo xanh phân lập từ các cây ký
chủ đều có khả n ng lây bệnh chéo cho nhau, mức độ nhiễm bệnh khác nhau, điều đó
thể hiện tính độc, tính gây bệnh giữa các chủng vi khuẩn cũng khác nhau.
Qua một số kết quả nghiên cứu công bố gần đây cho thấy ở nƣớc ta vi khuẩn
gây bênh héo xanh ở cây và chua thuộc division Châu Á (Lê Lƣơng Tề, 2002), Race 1,
biovar 3 và 4 (Nguyễn Thị Yến, 2002).
b. Chủng
Cho tới nay, khơng có một định nghĩa chính thức về chủng (strain) của vi khuẩn
R. solanacearum. Các tác giả trên thế giới thƣờng sử dụng thuật ngữ chủng để chỉ các

11


mẫu vi khuẩn R. solanacearum khác nhau về bất cứ đặc điểm nào nhƣ nguồn gốc phân
lập, hình thái, sinh học, sinh thái và di truyền.
Chủng của vi khuẩn R. solanacearum khác nhau tùy thuộc vào cây ký chủ, phân
bố, độc tính, mối quan hệ dịch tễ và đặc tính sinh lý của vi khuẩn (Buddenhagen và
Kelman, 1964). Bên cạnh phƣơng pháp truyền thống xác định nòi dựa vào phạm vi ký
chủ và xác định biovar dựa vào phản ứng sinh hóa, nhờ thành tựu của sinh học phân tử,
ngày nay phân tích DNA trở thành phƣơng pháp chính xác và phù hợp để xác định
chủng nhiều loại ký sinh.
Nguyễn V n Tuất và cs. (2007) đã phân tích tính đa hình của 25 chủng vi khuẩn
với 10 mồi ngẫu nhiên cho thấy có sự sai khác về mặt di truyền của chúng và phân chia
thành 2 nhóm gồm nhóm I và nhóm II.
c. Lồi phức
Khi phân tích đa dạng vi khuẩn gây bệnh héo xanh, Gillings và Fahy (1993) đã
nhận thấy vi khuẩn R. solanacearum rất đa dạng và gợi ý rằng vi khuẩn này có lẽ là
một lồi phức (complex species). Theo Fegan và Prior (2005) “loài phức” là một tập
hợp các cá thể có quan hệ gần gũi nhƣng thuộc các loài khác nhau. Các nghiên cứu đa

dạng vi khuẩn dựa trên lai DNA cho thấy vi khuẩn héo xanh cực kỳ đa dạng với mức
độ tƣơng đồng DNA của các mẫu vi khuẩn thƣờng < 70% (là ngƣỡng thƣờng đƣợc sử
dụng để phân biệt vi khuẩn ở mức lồi). Hiện nay, vi khuẩn R. solanacearum chính
thức đƣợc xem là một loài phức (Meng, 2013).
d. Kiểu gây bệnh
Các chủng vi khuẩn héo xanh còn đƣợc phân biệt thành các kiểu gây bệnh
(pathotype) dựa trên phản ứng đối với một loại cây trồng nào đó. Theo Tan et al.
(1994), 36 mẫu vi khuẩn R. solanacearum thu thập từ 6 tỉnh của Trung Quốc đã đƣợc
xếp thành 7 kiểu gây bệnh khác nhau cụ thể dựa trên độc tính của chúng đối với 6
giống lạc chỉ thị (Xiekangking, Taishan sanlirou, Huangchuan zhigan, Lukang qing,
Fuhua Sheng, Ehua 1).
e. Kiểu quan hệ phả hệ
Gần đây, một hệ thống phân loại nữa gọi là kiểu quan hệ phả hệ (phylotype) 20
đã đƣợc áp dụng nhằm đánh giá đa dạng vi khuẩn R. solanacearum. Cách phân loại
này dựa trên phân tích trình tự các gen mã hóa nhƣ gen 16S RNA ribosome, gen egl,
gen hrpB, và gen mutS (Poussier et al., 2000; Allen et al., 2005; Prior và Fegan, 2005).
12


Có 4 phylotype (Denny, 2006) đã đƣợc ghi nhận và phân tích cho thấy các phylotype
tƣơng quan với nguồn gốc địa lý của các chủng: phylotype I gồm các chủng chủ yếu từ
châu Á, phylotype II từ châu Mỹ, phylotype III từ châu Phi và các đảo thuộc Ấn Độ
Dƣơng và phylotype IV từ Indonesia (Remenant et al., 2011). Nhìn chung, phylotype là
hệ thống phân loại rất ổn định và có ý nghĩa về mặt tiến hóa đối với phức hợp lồi vi
khuẩn R. solanacearum (Meng, 2013).
1.1.4. Tình hình nghiên cứu bệnh héo xanh ở Việt Nam và trên Thế giới
a. Nghiên cứu bệnh héo xanh trên thế giới
Vi khuẩn gây bệnh héo xanh phân bố rộng rãi khắp các nƣớc trên thế giới. Đã từ
lâu vi khuẩn Ralstonia solanacearum đƣợc nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm,
nhiều cơng trình nghiên cứu về vi khuẩn Ralstonia solanacearum đã đƣợc cơng bố và

đƣa ra những kết quả rất có ý nghĩa khoa học kỹ thuật và trong sản xuất nông nghiệp.
Tại Đài Loan bằng phƣơng pháp PCR với cặp primer PS-IS đặc hiệu với vi
khuẩn Ralstonia solanacearum thuộc race 1, kết quả cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn
Ralstonia solanacearum thu thập trên cà chua, khoai tây, ớt, lạc, cà tím và nhiều loại
cây trồng khác đều thuộc race 1 (Yung-An Lee, 2001).
Phân tích trên 120 dịng vi khuẩn Ralstonia solanacearum phân lập trên cà
chua, khoai tây, cà tím, ớt và nhiều loại cây trồng khác từ Châu Á, Mỹ, Âu, Phi và
châu Đại Dƣơng cho thấy vi khuẩn Ralstonia solanacearum thuộc division Châu Á
thƣờng bao gồm biovar 3 và 4, divison Châu Mỹ thƣờng bao gồm biovar 1 và 2.
Tác giả đã phân lập vi khuẩn Ralstonia solanacearum từ cây cà chua có triệu
chứng héo xanh, nƣớc tƣới và đất. Phân tích gen gây bệnh thu đƣợc cặp mồi (Hrp_rs
2F:
5'-AGAGGTCGACGCGATACAGT-3'
và
Hrp_rs
2R:
5'CATGAGCAAGGACGAAGTCA-3') để khuếch đại bộ gen của vi khuẩn. DNA của 27
mẫu vi khuẩn R. solanacearum thuộc nòi 1 biovar 3 và 4 . Độ đặc hiệu của mồi đã
đƣợc thử nghiệm trên 13 chủng R. solanacearum so sánh vs nhóm vi khuẩn khác nhƣ
Xanthomonas oryzae pv. oryzae, X. campestris pv. campestris, và X. citri subsp. citri.
Sản phẩm của đoạn mồi khuếch đại gen của R. solanacearum tại 323 bp.[32]
b. Nghiên cứu bệnh héo xanh ở Việt Nam
Vi khuẩn Ralstonia solanacearum cũng đƣợc nhiều nhà nghiên cứu tại Việt
Nam điều tra và nghiên cứu.

13


Trƣơng Thị Hồng Hải và cs, 2016 “nghiên cứu đa dạng di truyền của các chủng
vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith ở một số tỉnh miền Bắc bằng chỉ thị RAPD”.

Đề tài đƣợc thực hiện nhằm đánh giá đa dạng di truyền của 26 chủng vi khuẩn
Ralstonia solanacearum Smith đƣợc thu thập ở các vùng trồng cây họ cà và bầu bí ở
miền bắc bằng chỉ thị phân tử RADP. Tổng số 100 chỉ thị phân tử RADP đƣợc dùng để
đáng giá kiểu gen của một số chủng vi khuẩn đại diện cho cây họ cà và bầu bí , trong
đó có 44 chỉ thị biểu hiện đa hình. Tuy nhiên , trong số các chỉ thị đa hình chỉ có 21 chỉ
thị phân tử RADP khuếch đại các đoạn DNA rõ nét và ổn định và đƣợc chọn để đánh
giá kiểu gen của 26 chủng vi khuẩn. Sản phẩm PCR của chỉ thị RADP đƣợc phân tích
bằng phần mềm NTSYSpc2.1. Kết quả cho thấy 26 chuẩn vi khuẩn đƣợc chia thành 6
nhóm chính.
Ngồi ra, bà và cs đã nghiên cứu thêm ở một số tỉnh miền Nam. Trong nghiên
cứu này , đã sử dụng 24 chỉ thị RADP để nghiên cứu đa dạng di truyền của 19 chủng vi
khuẩn Ralstonia solanacearum Smith đại diện cho một số vùng sinh thái khác nhau ở
Miền Nam đã thu đƣợc tổng số 923 b ng DNA. Dựa vào mức độ tƣơng đồng về hệ số
di truyền , 19 chủng vi khuẩn đƣợc chia thành 5 nhóm chính. Nhƣ vậy, các chuẩn vi
khuẩn Ralstonia solanacearum đƣợc thu thập trên các kí chủ khác nhau có sự khác
biệt về di truyền cao hơn so với các chủng ở các vùng sinh thái khác nhau.
Ngọ V n Ngôn và cs đã nghiên cứu và sử dụng 10 đoạn mồi RAPD để đánh giá
đa dạng di truyền của một số chủng vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại
lạc bao gồm: OPAB5, OPAL8, OPAK14, OPB7, OPC2, OPC15, OPE17, OPE18,
OPE19 và OPE20. Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các
phân đoạn DNA khi so sánh giữa các chủng với nhau trong cùng 1 mồi. Số phân đoạn
DNA nhân bản dao động từ 8 đến 30 phân đoạn tùy thuộc vào từng loại mồi RAPD
khác nhau. Kết quả ghi nhận đƣợc cho thấy tất cả 10 mồi nghiên cứu đều cho đa hình.
Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn DNA khi
so sánh giữa các chủng với nhau trong cùng một mồi.[13]
1.2. Tổng quan về kỹ thuật RAPD
Cơ sở của kỹ thuật RAPD là sự nhân bản DNA genome bằng phản ứng PCR với
các mồi ngẫu nhiên để tạo ra sự đa hình DNA do sự tái sắp xếp hoặc mất nucleotide ở
vị trí bắt mồi [17].

14


Cùng với sự phát minh ra phản ứng chuỗi mở rộng (PCR-polymerase chain
reaction) bởi Mullis n m 1983 và việc đƣa vào sử dụng enzyme DNA polymerase chịu
nhiệt n m 1988, kĩ thuật in dấu DNA (fingerprinting) đã đƣợc cách mạng hóa để tạo ra
một số lƣợng lớn các chỉ thị trong thời gian ngắn, với DNA khuôn mẫu ở lƣợng
nanogram, tự động hóa trong hoạt động cho hiệu quả cao, mạnh và những phân tích
đáng tin cậy. Mặc dù có nhiều tiến bộ to lớn trong các chỉ thị phân tử để có đƣợc các
thơng tin di truyền nhƣng RAPD vẫn đƣợc sử dụng bởi một số lý do. Phƣơng pháp này
có những thuận lợi đáng kể so với các phƣơng pháp khác bởi vì nó nhanh, u cầu
lƣợng DNA ít, phù hợp khi làm việc trên genome chƣa từng biết trƣớc, có tính kinh tế,
khơng liên quan đến các thủ tục phức tạp liên quan đến xác định trình tự DNA, chỉ u
cầu một phịng thí nghiệm đơn giản với phƣơng tiện tối thiểu cho thực hiện PCR, và có
thể phát hiện đa hình trong bất kì loại trình tự nào [6], [14].
Mồi sử dụng cho kỹ thuật RAPD là các mồi ngẫu nhiên, thƣờng là 10 nucleotide
và có nhiệt độ kéo dài mồi thấp (34-37oC). Mặc dù trình tự mồi RAPD là ngẫu nhiên
nhƣng phải đạt đƣợc hai tiêu chí là: tỷ lệ GC tối thiểu phải là 40% (thƣờng là 50-80%)
và khơng có trình tự bazơ đầu xuôi và ngƣợc giống nhau. Sản phẩm PCR-RAPD
thƣờng đƣợc phân tách trên gel agarose 1,5-2,0%.
Kỹ thuật RAPD không cần thông tin về genome của đối tƣợng nghiên cứu và có
thể ứng dụng cho các lồi khác nhau với các mồi chung. Hơn nữa, kỹ thuật RAPD đơn
giản và dễ thực hiện. Nhƣng kỹ thuật RADP có hạn chế là sản phẩm PCR không ổn
định do mồi ngắn, nhiệt độ bắt mồi thấp; Hầu nhƣ tất cả các marker RAPD là maker
trội. Nó khơng có khả n ng phân biệt đoạn DNA đƣợc khuếch đại từ một locus là đồng
hợp (2 bản sao) hay dị hợp (1 bản sao). Hiếm khi có marker RAPD đồng trội nhận biết
đƣợc kích thƣớc khác nhau của đoạn DNA khuếch đại từ cùng một locus. Sự đa hình
các đoạn khuếch đại chủ yếu là do thay thế hay mất bazơ trong vị trí gắn mồi, sự chèn
làm cho các vị trí gắn mồi quá xa để mà có thể khuếch đại thành cơng hay sự thêm/mất
bazơ có thể làm thay đổi kích thƣớc của đoạn đƣợc khuếch đại. Mặc dù số lƣợng đoạn

khuếch đại khơng phụ thuộc vào kích thƣớc genome và mức đa bội thể nhƣng phản
ứng khuếch đại đƣợc xác định một phần bởi sự cạnh tranh vị trí gắn mồi trong genome.
Mồi sẽ bám tốt hơn khi mức độ tƣơng đồng cao hơn [6], [14]. RADP sử dụng nhiều
trong nghiên cứu đa dạng di truyền giữa các loài [1, 12, 13, 14, 19, 22, 23, 24], trong

15