Xây dựng quy trình định lượng đồng thời piracetam và cinnarizin trong chế phẩm đa thành phần bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

.

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI PIRACETAM VÀ CINNARIZIN
TRONG CHẾ PHẨM ĐA THÀNH PHẦN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Mã số:

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Phan Thanh Dũng

Tp. Hồ Chí Minh, 09/2018

.


.

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI PIRACETAM VÀ CINNARIZIN
TRONG CHẾ PHẨM ĐA THÀNH PHẦN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Mã số:
Chủ nhiệm đề tài
(ký, họ tên)

Tp. Hồ Chí Minh, 09/2018

.


.

DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA
PGS.TS Vĩnh Định
Ds. Lâm Hoàng Lệ Vân

.


.

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 6
TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC ........................ 6
Mục tiêu đề tài ....................................................................................................................... 7
Tóm tắt nội dung đề tài .......................................................................................................... 8

ĐỐI TƯỢNG – TRANG THIẾT BỊ - DUNG MƠI – HĨA CHẤT...................................... 9
Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................................ 9
Chất chuẩn đối chiếu.............................................................................................................. 9
Dung mơi hóa chất ................................................................................................................. 9
Trang thiết bị và dụng cụ ....................................................................................................... 9
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 10
1. 

Xây dựng quy trình định lượng đồng thời piracetam và cinnarizin .................. 10

2. 

Thẩm định quy trình định lượng đồng thời piracetam và cinnarizin ................ 11

các KẾT Qủa nghiên cứu đạt được ...................................................................................... 19
1. 

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PIRACETAM VÀ

CINNARIZIN ...................................................................................................................... 19
4.1.1. 

Khảo sát điều kiện phân tích ............................................................................. 19

2. 

Thẩm định quy trình định lượng ....................................................................... 24

4.2.2. 

Khoảng xác định ............................................................................................... 37

4.2.3. 

Độ thơ ............................................................................................................... 37

3. 

dỰ THẢO QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PIRACETAM VÀ

CINNARIZIN ...................................................................................................................... 44
4.3.1. 

Thuốc thử .......................................................................................................... 44

4.3.2. 

Điều kiện sắc ký ................................................................................................ 44

4.3.3. 

Tiến hành .......................................................................................................... 44

4. 

ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PIRACETAM VÀ

CINNARIZIN ...................................................................................................................... 46
5. 

BÀN LUẬN ...................................................................................................... 47

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................................. 49
1. 

KẾT LUẬN....................................................................................................... 49

2. 

ĐỀ NGHỊ .......................................................................................................... 49

.


.

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Tên tiếng Anh

Tên Tiếng Việt

ACN

Acetonitrile

Acetonitril

Cinn

Cinnarizine

Cinnarizin

DĐVN

Dược điển Việt Nam

ĐL

Định lượng

HPLC

High performance

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

liquid chromatography
HLN

Hàm lượng nhãn

HLTB

Hàm lượng trung bình

IR

Infrared

Hồng ngoại

Pira

Piracetam

Piracetam

PDA

Photo diode array detector

RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Standard deviation

Độ lệch chuẩn

TB

Trung bình

TĐPP

Thẩm định phương pháp

VKN

Viện kiểm nghiệm

.


.

DANH MỤC HÌNH
Hình 4.8.  Sắc kí đồ điều kiện 1.a ...................................................................................... 19
Hình 4.9.  Sắc kí đồ điều kiện 1.b ...................................................................................... 20
Hình 4.10. Sắc kí đồ điều kiện 1.c ...................................................................................... 20
Hình 4.11. Sắc kí đồ điều kiện 2 ......................................................................................... 21
Hình 4.12. Sắc kí đồ điều kiện 3.a ...................................................................................... 22
Hình 4.13. Sắc kí đồ điều kiện 3.b ...................................................................................... 23
Hình 4.14. Sắc kí đồ điều kiện 4 ......................................................................................... 24
Hình 4.15. Sắc ký đồ của mẫu trắng ................................................................................... 25
Hình 4.16. Sắc ký đồ của mẫu tá dược ............................................................................... 26
Hình 4.17. Sắc kí đồ của mẫu tá dược thêm chuẩn piracetam ............................................ 26
Hình 4.18. Sắc kí đồ của mẫu tá dược thêm chuẩn cinnarizin ............................................ 27
Hình 4.19. Sắc ký đồ của chuẩn piracetam ......................................................................... 27
Hình 4.20. Sắc ký đồ của chuẩn cinnarizin......................................................................... 28
Hình 4.21. Sắc kí đồ chuẩn hỗn hợp ................................................................................... 28
Hình 4.22. Sắc kí đồ mẫu thử ............................................................................................. 29
Hình 4.23. Sắc kí đồ mẫu thử thêm chuẩn .......................................................................... 29

Hình 4.24. Phổ UV-Vis của piracetam trong mẫu chuẩn ................................................... 30
Hình 4.25. Phổ UV-Vis của piracetam trong mẫu thử ........................................................ 30
Hình 4.26. Phổ UV-Vis của cinnarizin trong mẫu chuẩn ................................................... 31
Hình 4.27. Phổ UV-Vis của cinnarizin trong mẫu thử ....................................................... 31

.


.

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1.  Danh mục chất chuẩn đối chiếu .......................................................................... 9
Bảng 3.2.  Danh mục hóa chất thuốc thử ............................................................................. 9
Bảng 3.3.  Danh mục trang thiết bị và dụng cụ .................................................................... 9
Bảng 3.4.  Các điều kiện khảo sát ...................................................................................... 11
Bảng 3.5.  Công thức mẫu tá dược ..................................................................................... 12
Bảng 3.6.  Nồng độ các dung dịch tính tuyến tính ............................................................. 14
Bảng 4.8.  Tương quan giữa nồng độ và diện tích pic ....................................................... 31
Bảng 4.9.  Kết quả xử lý thống kê ...................................................................................... 32
Bảng 4.10.  Kết quả khảo sát độ đúng của piracetam .......................................................... 32
Bảng 4.11.  Kết quả khảo sát độ đúng của cinnarizin .......................................................... 33
Bảng 4.12.  Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống của piracetam .................................. 34
Bảng 4.13.  Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của cinnarizin .................................... 34
Bảng 4.14.  Kết quả khảo sát độ lặp lại ................................................................................ 35
Bảng 4.15.  Kết quả độ chính xác trung gian của piracetam ................................................ 35
Bảng 4.16.  Kết quả độ chính xác trung gian của cinnarizin ................................................ 36
Bảng 4.17.  Kết quả thực nghiệm 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn ở tốc độ dòng 0,7 ml/phút
38
Bảng 4.18.  Kết quả thực nghiệm 6 lần tiêm lặp lại dung dịch thử ở tốc độ dòng 0,7 ml/phút
38

Bảng 4.19.  Kết quả thực nghiệm 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn ở tốc độ dòng 0,9 ml/phút
39
Bảng 4.20.  Kết quả thực nghiệm 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn ở tỷ lệ pha động ACN –
đệm 55:45 40
Bảng 4.21.  Kết quả thực nghiệm 6 lần tiêm lặp lại dung dịch thử ở tỷ lệ pha động ACN –
đệm 55:45 40
Bảng 4.22.  Kết quả thực nghiệm 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn ở tỷ lệ pha động ACN –
đệm 65:35 41
Bảng 4.23.  Kết quả thực nghiệm 6 lần tiêm lặp lại dung dịch thử ở tỷ lệ pha động ACN –
đệm 65:35 41
Bảng 4.24.  Kết quả thực nghiệm 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn ở đệm pH 4,25 ......... 42

.


.

Bảng 4.25.  Kết quả thực nghiệm 6 lần tiêm lặp lại dung dịch thử ở đệm pH 4,25 ............. 42
Bảng 4.26.  Kết quả thực nghiệm 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn ở đệm pH 4,75 ......... 43
Bảng 4.27.  Kết quả thực nghiệm 6 lần tiêm lặp lại dung dịch thử ở đệm pH 4,75 ............. 43
Bảng 4.28.  Kết quả định lượng trên 3 lô của piracetam ...................................................... 46
Bảng 4.29.  Kết quả định lượng trên 3 lô của cinnarizin...................................................... 46

.


.

Báo cáo tổng kết

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
- Piracetam (2-(2-oxopyrrolidin-1 -yl)acetamid) là một dẫn xuất vịng của acid gamma
amino-butyric (GABA). Thuốc có tác động lên một số chất dẫn truyền thần kinh như
acetylcholin, noradrenalin, dopamin…, làm tăng hoạt động của vùng Đoan não (vùng não
tham gia vào cơ chế nhận thức, học tập, trí nhớ, sự tỉnh táo và ý thức), nên có tác dụng hưng
trí hay cải thiện khả năng học tập, trí nhớ; ngồi ra thuốc có tác dụng bảo vệ chống lại những
rối loạn chuyển hóa do thiếu máu não cục bộ nhờ làm tăng đề kháng của não đối với tình
trạng thiếu oxy. Chỉ định điều trị triệu chứng chóng mặt; suy giảm trí nhớ, kém tập trung,
hoặc thiếu tỉnh táo, rối loạn hành vi, sa sút trí tuệ do nhồi máu não nhiều ổ ở người cao tuổi;
điều trị hỗ trợ chứng khó đọc ở trẻ em; bổ trợ trong điều trị giật rung cơ có nguồn gốc vỏ
não.
- Cinnarizin ((E)-l-(diphenylmethyl)-4-(3-phenylprop-2 -enyl)piperazin) là thuốc kháng
histamin (H1) có tác dụng ngăn chặn thụ thể ở cơ quan tận cùng của tiền đình, ức chế quá
trình tiết histamin và acetylcholin. Cinarizin cịn là chất đối kháng calci có chọn lọc, ức chế
sự co tế bào cơ trơn mạch máu nên làm giãn mạch máu não, làm tăng lưu lượng máu đến
các vùng, giảm tình trạng thiếu oxy não. Chỉ định phịng say tàu xe; rối loạn tiền đình như
chóng mặt, ù tai, buồn nôn, nôn trong bệnh Ménière.
- Viên phối hợp ngồi cho tác động hưng trí của piracetam, tác động kháng histamin của
cinnarizin còn làm cho tác động cải thiện tuần hoàn não của cả hai hoạt chất tăng lên so với
chế phẩm đơn thành phần.
- Công ty Cổ Phần Dược phẩm Boston Việt nam hiện đang nghiên cứu sản xuất viên nang
cứng chứa 2 hoạt chất này và chưa xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm này. Vì vậy,
chúng tơi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời piracetam và cinnarizin
trong viên nang cứng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA”. Để
xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho chế phẩm này.

.

.

Báo cáo tổng kết

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Xây dựng quy trình định lượng đồng thời piracetam và cinnarizin bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA.
Thăm dò các điều kiện phân tích như:
- Lựa chọn pha động
- pH pha động
- Tỉ lệ pha động
- Tốc độ dòng
- Bước sóng phát hiện
Đưa ra qui trình định lượng đồng thời piracetam và cinnarizin

.


.

Báo cáo tổng kết

CHƯƠNG 2: TÓM TẮT NỘI DUNG ĐỀ TÀI
- Xây dựng qui trình định lượng đồng thời piracetam và cinnarizin bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao. Khảo sát điều kiện tối ưu của quy trình định lượng 2 hoạt chất trên.
- Thẩm định qui trình phân tích để ứng dụng vào việc định lượng đồng thời piracetam và
cinnarizin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
 Tính thích hợp hệ thống
 Tính đặc hiệu
 Tính tuyến tính

 Độ chính xác
 Độ đúng
 Khoảng xác định của phương pháp
 Độ thô

.


.

Báo cáo tổng kết

CHƯƠNG 3: ĐỐI TƯỢNG – TRANG THIẾT BỊ - DUNG MƠI – HĨA
CHẤT
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Chế phẩm: BosPhezam
Thành phần và hàm lượng:
Mỗi viên nang chứa:
Piracetam

400 mg

Cinnarizin

25 mg

Tá dược vừa đủ

1 viên

(Tá dược: Lactose monohydrat, aerosil, magnesium stearat)
Nguồn gốc: Phịng nghiên cứu phát triển – Cơng ty cổ phần dược phẩm Boston Việt Nam
Số lô: 010517 RD, 020517 RD, 030517 RD.

3.2. Chất chuẩn đối chiếu
Bảng 3.1.

Danh mục chất chuẩn đối chiếu

Hoạt chất

Số lô

Piracetam

PIR0040417

Nguồn gốc

Chất chuẩn làm việc
Chuẩn viện kiểm
QT082 060916
nghiệm Tp.Hồ Chí Minh

Cinnarizin

Hàm lượng tính trên
nguyên trạng (%)
99.48
99.70

3.3. Dung mơi hóa chất
Bảng 3.2.
STT
1
2
3
4
5

Danh mục hóa chất thuốc thử
Tên hóa chất

Tiêu chuẩn

Nguồn gốc

Acetonitril
Triethylamin
Acid phosphoric đậm đặc
Kali dihydrophosphat
Acid hydrocloric

HPLC
HPLC
HPLC
HPLC
Phân tích

Merck - Đức

Scharlau - Tây Ban Nha
Merck - Đức
Scharlau - Tây Ban Nha
Merck - Đức

3.4. Trang thiết bị và dụng cụ
Bảng 3.3.
STT

Danh mục trang thiết bị và dụng cụ
Thiết bị

.

Mã hiệu

Nguồn gốc


0.
Báo cáo tổng kết

1

Máy sắc ký lỏng

HPLC Shimadzu CBM 20 Alite, đầu

hiệu năng cao

dò PDA
Eclipse XDB C18 (250  4,6 mm; 5

Nhật

2

Cột sắc kí

3

Máy đo pH

Scott lab 850

Mỹ

4

Bể siêu âm

VWR

Mỹ

5

Cân phân tích

Sartorius, độ chính xác 0,01 mg

Đức

6

Cân phân tích

AX-200, độ chính xác 0,1 mg

Nhật

7

Cân kĩ thuật

Ohaus SPS 602

Mỹ

8

Máy Độ hịa tan

Lanbindia DS 14000

Ấn Độ

9
10

μm) - Agilent

Mỹ

Hệ thống lọc chân
không
Các dụng cụ thủy
tinh phân tích
Màng lọc

11

Cellulose Acetate
0,45 μm

12

Màng lọc Nylon
Syringe 0,45 μm

3.5. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Xây dựng quy trình định lượng đồng thời piracetam và cinnarizin
Dựa vào cấu trúc và tính chất hóa học của hai chất cần phân tích thì piracetam có độ phân
cực cao cịn cinnarizin có độ phân cực thấp, đồng thời tham khảo các chuyên luận của BP
2014, EP 8.0, DĐVN IV và các tài liệu khác thì kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo với hệ dung
môi phân cực được lựa chọn cho quy trình định lượng đồng thời piracetam và cinnarizin.
Dự thảo quy trình định lượng ban đầu như sau:
- Cột C8 (250 × 4,6 mm; 5 μm).

.

1.
Báo cáo tổng kết

- Đầu dị PDA với bước sóng 227 nm.
- Pha động: ACN-đệm phosphat pH 6,0 (50:50)
(Đệm phosphat pH 6,0: Hòa tan 6,8 g natri dihydrophosphat vào 1000 ml nước vừa đủ, điều
chỉnh về pH 6,0 bằng natri hydroxyd 10 M)
- Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút
- Thể tích tiêm: 20 μl.
- Nhiệt độ cột: Nhiệt độ phòng
Bảng 3.4.
STT

Cột

1

C8

2

C18

3

C18

4

C18

Các điều kiện khảo sát
Pha động
Đệm pH phosphat pH 6,0 và ACN,
chạy đẳng dòng
Đệm pH phosphat pH 6,0 và ACN,
chạy đẳng dòng
Đệm phosphat pH 4,5 và ACN,
chạy đẳng dòng
Đệm phosphat pH 4,5 và ACN,
chạy đẳng dòng

Tốc độ dòng

Nhiệt độ cột

1 ml/phút

Nhiệt độ phòng

1 ml/phút

Nhiệt độ phòng

1 ml/phút

Nhiệt độ phòng

0,8 ml/phút

45 oC

3.5.2. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời piracetam và cinnarizin
Quy trình được thẩm định theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013, phụ lục 8.,Quyết định
của Cục trưởng Cục Quản lý Dược, Bộ Y tế số 07/QĐ-QLD ngày 11 tháng 01 năm 2013 và
có tham khảo “Thơng tư số 44/2014/TT-BYT ngày 25 tháng 11 năm 2014, Quy định việc
đăng ký thuốc, phụ lục 1”. [3], [4]

3.5.2.1. Tính đặc hiệu
Mục đích: Đảm bảo kết quả xác định hàm lượng chất cần phân tích trong mẫu là chính xác,
tránh ảnh hưởng của các thành phần khác có trong mẫu.
Dung mơi pha mẫu: ACN-nước (50:50)
Mẫu trắng: Hỗn hợp dung môi: ACN–nước (50:50)
Chuẩn bị mẫu chuẩn:
- Dung dịch chuẩn gốc cinnarizin: cân chính xác khoảng 23,5 mg chuẩn cinnarizin vào bình
định mức 50 ml, thêm khoảng 20 ml dung môi pha mẫu, lắc đều, siêu âm đến tan hồn tồn,
thêm dung mơi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều. Dung dịch này có nồng độ 470 µg/ml.

.


2.
Báo cáo tổng kết

- Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp: cân chính xác khoảng 75 mg chuẩn piracetam cho vào bình
định mức 100 ml, hút chính xác 10 ml dung dịch chuẩn gốc cinnarizin vào bình trên và thêm
khoảng 70 ml dung môi pha mẫu, lắc đều siêu âm đến tan hồn tồn, thêm dung mơi pha
mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều. Dung dịch này chứa nồng độ piracetam là 750 µg/ml và

cinnarizin là 47,0 µg/ml.
- Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Hút chính xác 10 ml dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp vào bình
định mức 25 ml, thêm khoảng 7 ml dung môi pha mẫu, lắc đều siêu âm đến tan hồn tồn,
thêm dung mơi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm. Siêu âm đuổi
khí. Dung dịch hỗn hợp này có nồng độ 300 µg/ml piracetam và 18,75 µg/ml cinnarizin.
Chuẩn bị mẫu thử:
Cân 20 nang, xác định khối lượng trung bình bột thuốc trong nang, nghiền thành bột mịn.
Cân chính xác khoảng một lượng thuốc bột tương đương với 75 mg piracetam vào bình định
mức 100 ml. Thêm khoảng 70 ml dung môi pha mẫu, lắc và siêu âm khoảng 15 phút, đề
nguội, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua giấy lọc thô, loại bỏ 20
ml dịch lọc đầu được dung dịch thử đậm đặc. Hút chính xác 10 ml dịch thử đậm đặc và pha
lỗng thành 25 ml với dung môi pha mẫu. Lọc qua màng lọc 0,45 μm. Siêu âm đuổi khí.
Mẫu thử thêm chuẩn:
Hút chính xác 10,0 ml dịch thử đậm đặc và 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp vào bình
định mức 25 ml, bổ sung dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm.
Siêu âm đuổi khí.
Chuẩn bị các mẫu tá dược:
- Mẫu tá dược:
Bảng 3.5.

Công thức mẫu tá dược
STT
1
2
3

Tá dược
Lactose monohydrat
Aerosil
Magnesium stearat

Tổng

Khối lượng trong 1 viên
55 mg
5 mg
15 mg
75 mg

Dung dịch mẫu tá dược: Cân chính xác khoảng 14,1 mg mẫu placebo vào bình định mức
100 ml. Thêm khoảng 70 ml dung môi pha mẫu, lắc và siêu âm khoảng 15 phút, để nguội.
Thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua giấy lọc thô, loại bỏ 10 ml dịch

.


3.
Báo cáo tổng kết

lọc đầu. Hút chính xác 10 ml dịch lọc và pha loãng thành 25 ml với dung môi pha mẫu. Lọc
qua màng lọc 0,45 μm. Siêu âm đuổi khí.
- Mẫu tá dược thêm chuẩn piracetam:
Cân chính xác khoảng 75 mg piracetam và 14,1 mg mẫu placebo vào bình định mức 100 ml.
Thêm khoảng 70 ml dung mơi pha mẫu, lắc và siêu âm khoảng 15 phút, để nguội. Thêm
dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua giấy lọc thô, loại bỏ 20 ml dịch lọc
đầu. Hút chính xác 10 ml dịch lọc và pha lỗng thành 25 ml với dung mơi pha mẫu. Lọc qua
màng lọc 0,45 μm. Siêu âm đuổi khí.
- Mẫu tá dược thêm chuẩn cinnarizin:
Cân chính xác khoảng 4,7 mg cinnarizin và 14,1 mg mẫu placebo vào bình định mức 100
ml. Thêm khoảng 70 ml dung môi pha mẫu, lắc và siêu âm khoảng 15 phút, để nguội. Thêm
dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua giấy lọc thô, loại bỏ 20 ml dịch lọc

đầu. Hút chính xác 10 ml dịch lọc và pha lỗng thành 25 ml với dung môi pha mẫu. Lọc qua
màng lọc 0,45 μm. Siêu âm đuổi khí.
Tiến hành:
Lần lượt tiêm vào hệ thống sắc kí: mẫu trắng, dung dịch mẫu tá dược, dung dịch mẫu tá dược
thêm chuẩn piracetam, dung dịch mẫu ta1 dược thêm chuẩn cinnarizin, dung dịch chuẩn
piracetam, dung dịch chuẩn cinnarizin, dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp, dung dịch mẫu thử,
dung dịch mẫu thử thêm chuẩn. Ghi nhận các sắc kí đồ.
Yêu cầu:
- Sắc kí đồ của mẫu trắng và mẫu tá dược không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu
tương ứng thời gian lưu của các pic piracetam và cinnarizin.
- Sắc kí đồ của mẫu tá dược thêm chuẩn piracetam không xuất hiện pic ở trong khoảng thời
gian lưu tương ứng thời gian lưu của cinnarizin. Sắc kí đồ của mẫu tá dược thêm chuẩn
cinnarizin không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng thời gian lưu của
piracetam.
- Sắc kí đồ dung dịch thử cho pic có thời gian lưu tương tự với pic của piracetam và cinnarizin
trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn.
- Khi thêm một lượng chất chuẩn vào mẫu thử, chiều cao và diện tích pic của piracetam và
cinnarizin tăng lên so với trước khi thêm chuẩn.
- Phổ UV tại thời gian lưu của piracetam và cinnarizin trong dung dịch thử phải phù hợp với
phổ UV tại thời gian lưu của pic tương ứng trong dung dịch chuẩn.

.


4.
Báo cáo tổng kết

- Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết cho thấy pic piracetam và cinnarizin không có
các thành phần khác trong tất cả các mẫu.

3.5.2.2. Khoảng tuyến tính
Mục đích: Khả năng suy ra các kết quả của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ
thuộc giữa độ đáp ứng của đại lượng đo được (y) và nồng độ (x).
Tiến hành:
- Chuẩn bị 5 dung dịch chuẩn có nồng độ 60%, 80%, 100%, 120% và 140% so với nồng độ
định lượng của các hoạt chất từ dung dịch chuẩn gốc ở mục 3.2.2.1.
- Lần lượt hút chính xác 6,0 ml; 8,0 ml; 10 ml; 12 ml; 14 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình
định mức 25 ml riêng biệt, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng
lọc 0,45 μm. Siêu âm đuổi khí.
Bảng 3.6.

Nồng độ các dung dịch tính tuyến tính

Mức nồng độ
Dung dịch chuẩn gốc (ml)

60%
6,0

80%
8,0

Bình định mức (ml)

25

25

Nồng độ piracetam (μg/
ml

Nồng độ cinnarizin (μg/
ml

100%
10,0

120%
12,0

140%
14,0

25

25

25

180,0

240,0

300,0

360,0

420,0

11,25

15

18,75

22,5

26,25

- Tiến hành tiêm các mẫu vào hệ thống sắc kí (mỗi mẫu tiêm 1 lần), ghi lại sắc kí đồ và xác
định đáp ứng của pic.
- Với mỗi hoạt chất, xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính
giữa nồng độ chất chuẩn có trong các dung dịch chuẩn (x) và diện tích pic (y) thu được trên
các sắc kí đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu.
+ Thiết lập phương trình hồi quy tuyến tính dạng:

= ax + b. Hệ số tương quan tuyến tính:

(r).
+ Sử dụng trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi qui.
+ Sử dụng trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi qui.
Yêu cầu: Với mỗi hoạt chất, hệ số tương quan tuyến tính (r) phải ≥ 0,999.

.


5.
Báo cáo tổng kết

3.5.2.3. Độ đúng
Mục đích: Biểu thị mức độ sát gần của giá trị tìm thấy so với giá trị thực.

Xác định độ đúng của phương pháp theo cơng thức:
Tỷ lệ thu hồi (%) =

ượ
ượ



ạ


ạ

ấ ì ạ đượ
ấ

à

x 100%

Tiến hành:
- Cân khoảng 75 mg tá dược cho vào bình vào bình định mức 200 ml. Tiến hành với 9 bình
cho độ đúng 80% (3 mẫu), 100% (3 mẫu), 120% (3 mẫu).
- Mức nồng độ 80%: Cân chính xác khoảng 320 mg chuẩn piracetam và 20 mg chuẩn
cinnarizin cho vào bình định mức 200 ml có sẵn tá dược. Thêm khoảng 150 ml dung mơi
pha mẫu, lắc siêu âm đến tan hoàn toàn, để nguội và bổ sung dung môi pha mẫu vừa đủ đến
vạch, lắc đều. Lọc qua giấy lọc thô, lọc bỏ 20 ml dịch lọc đầu, hút chính xác 3,0 ml dịch lọc
vào bình định mức 20 ml, bổ sung dung mơi pha mẫu đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc
0,45 µm. Siêu âm đuổi khí. Dung dịch thử này có nồng độ piracetam khoảng 240 µg/ml và
cinnarizin khoảng 15 µg/ml.

- Mức nồng độ 100%: Cân chính xác khoảng 400 mg chuẩn piracetam và 25 mg chuẩn
cinnarizin cho vào bình định mức 200 ml có sẵn tá dược. Thêm khoảng 150 ml dung mơi
pha mẫu, lắc siêu âm đến tan hồn tồn, để nguội và bổ sung dung mơi pha mẫu vừa đủ đến
vạch, lắc đều. Lọc qua giấy lọc thô, lọc bỏ 20 ml dịch lọc đầu, hút chính xác 3,0 ml dịch lọc
vào bình định mức 20 ml, bổ sung dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc
0,45 µm. Siêu âm đuổi khí. Dung dịch thử này có nồng độ piracetam khoảng 300 µg/ml và
cinnarizin khoảng 18,75 µg/ml.
- Mức nồng độ 120%: Cân chính xác khoảng 480 mg chuẩn piracetam và 30 mg chuẩn
cinnarizin cho vào bình định mức 200 ml có sẵn tá dược. Thêm khoảng 150 ml dung môi
pha mẫu, lắc siêu âm đến tan hoàn toàn, để nguội và bổ sung dung môi pha mẫu vừa đủ đến
vạch, lắc đều. Lọc qua giấy lọc, lọc bỏ 20 ml dịch lọc đầu, hút chính xác 3,0 ml dịch lọc vào
bình định mức 20 ml, bổ sung dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45
µm. Siêu âm đuổi khí. Dung dịch thử này có nồng độ piracetam khoảng 360 µg/ml và
cinnarizin khoảng 22,5 µg/ml.

.


6.
Báo cáo tổng kết

Yêu cầu: Tỷ lệ thu hồi ở các mức nồng độ phải đạt trong khoảng: 98,0-102,0% và RSD của
tỷ lệ thu hồi phải ≤ 2,0%.

3.5.2.4. Độ chính xác
a. Độ lặp lại
- Tính thích hợp hệ thống
Mục đích:
Nhằm đánh giá tính thích hợp của tồn hệ thống phân tích được cấu thành bởi các yếu tố
như máy móc thiết bị, hệ thống điện, cách tiến hành phân tích, mẫu thử… Được đánh giá

trước khi tiến hành phân tích để đảm bảo tồn bộ hệ thống có hiệu năng phù hợp.
Kiểm tra dựa trên các thơng số sắc kí: Diện tích pic (S), thời gian lưu (tR), hệ số bất đối (T),
số đĩa lý thuyết (N), độ phân giải (RS).
Tiến hành:
Dung dịch chuẩn được chuẩn bị như mục 3.2.2.1. Tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp mẫu chuẩn hỗn
hợp, ghi lại các sắc ký đồ và các giá trị thời gian lưu (tR), diện tích pic (S), hệ số bất đối (T),
số đĩa lý thuyết (N), độ phân giải (RS).. của các pic piracetam và cinnarizin. Tính giá trị trung
bình và RSD các thơng số của các lần tiêm lặp lại.
Yêu cầu:
Với mỗi hoạt chất, giá trị RSD của các thông số ≤ 2,0 %; 0,8 ≤ T ≤ 1,2; N > 2000; RS ≥ 2.
- Độ lặp lại
Mục đích:
Biểu thị độ chính xác của quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm và trong
khoảng thời gian ngắn.
Tiến hành:
Chuẩn bị 6 dung dịch thử như mục 3.2.2.1. Tiến hành sắc ký theo điều kiện sắc ký đã chọn.
Mỗi mẫu tiến hành tiêm 1 lần. Xác định diện tích pic, từ đó suy ra hàm lượng phần trăm tính
trên nhãn của mỗi hoạt chất trong mẫu thử.
Yêu cầu: RSD của hàm lượng phần trăm tính trên nhãn của mỗi hoạt chất phải ≤ 2,0%.
b. Độ chính xác trung gian
Mục đích:
Biểu thị mức dao động của kết quả trong cùng một phịng thí nghiệm được thực hiện tại
nhiều ngày khác nhau, kiểm nghiệm viên khác nhau và các trang thiết bị khác nhau.

.


7.
Báo cáo tổng kết

Tiến hành:
- Kiểm nghiệm viên thứ hai tiến hành trên một ngày khác nhau và trên một máy sắc kí lỏng
khác. Chuẩn bị mẫu chuẩn hỗn hợp như trong mục 3.2.2.1. Tiêm lặp lại 6 lần. Chuẩn bị 6
mẫu thử như trong mục 3.2.2.1. Mỗi mẫu thử tiêm 1 lần.
- Xác định giá trị trung bình và giá trị RSD (%) của các kết quả xác định hàm lượng piracetam
và cinnarizin có trong mẫu thử do mỗi kiểm nghiệm viên thử nghiệm và giữ hai kiểm nghiệm
viên thử nghiệm.
Yêu cầu:
- Giá trị RSD (%) kết quả định lượng cuả mỗi kiểm nghiệm thử nghiệm (n=6) phải ≤ 2,0%
và của cả hai kiểm nghiệm viên thử nghiệm (n=12) phải ≤ 2,0%.
- Độ sai khác kết quả định lượng giữa 2 kiểm nghiệm viên ≤ 2,0%.

3.5.2.5. Khoảng xác định
Được xác lập từ khoảng tuyến tính và độ đúng.

3.5.2.6. Độ thơ
Mục đích:
Nhằm đánh giá khả năng duy trì của quy trình phân tích khơng bị ảnh hưởng bởi những biến
đổi nhỏ nhưng có tính chủ định trong các thơng số của phương pháp và chỉ ra mức tin cậy
của qui trình trong điều kiện sử dụng bình thường. Các thay đổi thường gặp: pH trong pha
động, tỷ lệ thành phần pha động, tốc độ dịng, nhiệt độ, cột sắc kí…
Thay đổi tốc độ dòng
Khảo sát thay đổi: tăng/ giảm 10% tốc độ dòng.
Thay đổi tỷ lệ pha động
Khảo sát thay đổi: tăng/ giảm 10% thành phần dung môi hữu cơ.
Thay đổi pH
Khảo sát thay đổi: tăng/ giảm giá trị pH 0,25
Tiến hành
Chuẩn bị mẫu chuẫn hỗn hợp và mẫu thử như mục 3.2.2.1. Với mỗi điều kiện khảo sát thay
đổi, tiêm lặp lại liên tiếp 6 lần mẫu chuẩn hỗn hợp và 6 lần lặp lại liên tiếp mẫu thử. Ghi

nhận các sắc kí đồ và các giá trị thời gian lưu (tR), diện tích pic (S), hệ số bất đối (T), số đĩa

.


8.
Báo cáo tổng kết

lý thuyết (N), độ phân giải (RS) của pic piracetam và cinnarizin. Tính giá trị trung bình và
RSD các thông số các lần tiêm lặp lại.
Yêu cầu: Ở mỗi điều kiện khảo sát, mỗi hoạt chất, giá trị RSD các thông số ≤ 2,0%; 0,8 ≤
T ≤ 1,2; N > 2000; RS ≥ 2.

.


9.
Báo cáo tổng kết

CHƯƠNG IV: CÁC KẾT QỦA NGHIÊN CỨU ĐẠT ĐƯỢC
4.1.

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
PIRACETAM VÀ CINNARIZIN

Khảo sát điều kiện phân tích
Điều kiện 1:
- Cột sắc kớ: Ct C8 (150 ì 4,6 mm; 5 àm)
- u dị PDA (Bước sóng phát hiện 227 nm)
- Thể tích tiêm: 20 µl.

- Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút
- Nhiệt độ cột : Nhiệt độ phòng
- Pha động: ACN – đệm phosphat pH 6,0, chạy đẳng dòng.
(Đệm phosphat pH 6,0: Hòa tan 6,8 g natri dihydrophosphat vào 1000 ml nước vừa đủ, điều
chỉnh về pH 6,0 bằng natri hydroxyd 10 M).
a. Khảo sát dung mơi pha mẫu methanol (pha lỗng pha động), tỷ lệ pha động 50:50.

Hình 4.8. Sắc kí đồ điều kiện 1.a
Nhận xét: Ở tỷ lệ pha động ACN – đệm là 50:50, pic piracetam ra quá sớm (1,491 phút), lẫn
với pic dung môi, đáp ứng pic âm; hai pic tách khá xa nhau (cinnarizin 19,787 phút).
b. Khảo sát dung mơi pha mẫu Acetonitril (pha lỗng pha động), tỷ lệ pha động 50:50

.


0.
Báo cáo tổng kết

Hình 4.9. Sắc kí đồ điều kiện 1.b
Nhận xét: Ở tỷ lệ pha động ACN – đệm là 50:50, dung môi pha mẫu là ACN, đáp ứng pic
tốt hơn so với điệu kiện 1.a. Tuy nhiên, pic piracetam ra quá sớm (1,466 phút) trong khi
cinnarizin rửa giải khá chậm (19,967 phút). Vì vậy tăng tỷ lệ ACN – đệm trong pha động
lên 60:40 nhằm rút ngắn thời gian rửa giải cinnarizin.
c. Khảo sát dung môi pha mẫu Acetonitril (pha lỗng pha động), tỷ lệ pha động 60:40.

Hình 4.10. Sắc kí đồ điều kiện 1.c

.

1.
Báo cáo tổng kết

Nhận xét: Khi gia tăng tỷ lệ ACN - đệm lên 60:40, cải thiện được độ phân giải của pic
cinnarizin nhưng vẫn còn khá lớn; pic piracetam ra rất sớm, ngay sát pic dung môi và cả hai
pic có hệ số bất đối lớn (T pira = 1,63; T cinna = 1,89).
Như vậy, đối với điều kiện 1 dùng cột pha tĩnh C8 và pH 6,0, khi tỷ lệ đệm trong pha động
không thể điều chỉnh lớn hơn 40%, nghĩa là ở mức rửa giải yếu nhất có thể mà thời gian lưu
của piracetam vẫn rất sớm, dễ lẫn pic dung mơi, khơng thích hợp cho quy trình sắc kí. Do
đó, tiến hành khảo sát điều kiện 2 trên cột chứa hạt nhồi với lực lưu chất phân tích mạnh hơn
là C18.
Điều kiện 2:
- Cột sắc kí: Ct C18 (250 ì 4,6 mm, 5 àm)
- u dũ PDA (Bước sóng phát hiện 227 nm)
- Thể tích tiêm: 20 µl
- Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút
- Nhiệt độ cột : Nhiệt độ phòng
- Pha động: ACN – Đệm phosphat pH 6,0 (60:40)
(Đệm phosphat pH 6,0: Hòa tan 6,8 g natri dihydrophosphat vào 1000 ml nước vừa đủ, điều
chỉnh về pH 6,0 bằng natri hydroxyd 10 M).

Hình 4.11. Sắc kí đồ điều kiện 2
Nhận xét: Ở điều kiện 2, thời gian rửa giải của piracetam không quá sớm, hai pic phân tách
rõ, nhưng thời gian phân tách giữa hai pic cịn xa nhau. Vì vậy, tiến hành giảm pH của pha
động để rút ngắn thời gian rửa giải của cinnarizin.

.


2.

Báo cáo tổng kết

Điều kiện 3:
- Cột sắc kí: Cột C18 (250 ì 4,6 mm, 5 àm)
- u dũ PDA (Bước sóng phát hiện 227 nm)
- Thể tích tiêm: 20 µl
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Nhiệt độ cột: Nhiệt độ phòng
- Pha động: ACN – Đệm phosphat pH 4,5 (60:40)
(Đệm phosphat pH 4,5: Hòa tan 6,8 g kali dihydrophosphat vào 1000 ml nước vừa đủ, thêm
3 ml triethylamin, điều chỉnh về pH 4,5 bằng acid phosphoric đậm đặc).
a. Khảo sát dung mơi pha mẫu methanol (pha lỗng pha động)

Hình 4.12. Sắc kí đồ điều kiện 3.a
Nhận xét: Ở pH 4,5 và dung môi pha mẫu methanol, pic piracetam ngay sát pic dung môi,
đường nền dưới chân pic không ổn định.

.