Xác định hàm lượng Anthocyanin trong một số loại rau bằng phương pháp sắc kí

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (395.46 KB, 16 trang )

(1)<div class='page_container' data-page=1>

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN 
---

VŨ THỊ HƢƠNG QUỲNH

XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG ANTHOCYANIN TRONG MỘT SỐ LOẠI

RAU BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÍ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

</div>
(2)<div class='page_container' data-page=2>

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN 
---

VŨ THỊ HƢƠNG QUỲNH

XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG ANTHOCYANIN TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU 
BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÍ

Chuyên ngành: Hóa phân tích 
Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
 PGS.TS. NGUYỄN XUÂN TRUNG

</div>
(3)<div class='page_container' data-page=3>

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến
PGS.TS. Nguyễn Xuân Trung, NCS Vũ Thị Trang đã giao đề tài, chỉ dẫn tận tình và
tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn.

Tơi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm
An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia , các anh chị trong Khoa chất lượng phụ gia và
chất hỗ trợ chế biến thực phẩm - Viê ̣n Kiểm nghiê ̣m an toàn vê ̣ sinh thực phẩm
Quốc gia đã quan tâm , giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu
trong môi trường hiện đại.

Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn tới các thầy cơ giảng dạy tại khoa Hố, đặc biệt là
các thầy cơ trong bộ mơn Hố Phân tích đã cho tơi những kiến thức quý giá trong
quá trình học tập và thực hiện đề tài này.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình , bạn bè đã luôn bên
cạnh chia sẻ khó khăn , đô ̣ng viên và giúp đỡ tôi trong ho ̣c tâ ̣p cũng như trong cuộc
sống.

Do thời gian thực hiê ̣n đề tài có ha ̣n nên không tránh những thiếu sót , rất
mong nhâ ̣n được ý kiến đóng góp của thầy cô và các ba ̣n để luận văn này được hoàn
thiện hơn.

Hà Nội, ngày 30 tháng 11 năm 2015
Học viên

</div>
(4)<div class='page_container' data-page=4>

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ... 7

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
1.1. Giới thiệu chung về anthocyanin ... Error! Bookmark not defined. 
1.1.1. Cấu trúc hóa học của anthocyanin ... Error! Bookmark not defined. 
1.1.2. Tính chất của anthocyanin ... Error! Bookmark not defined. 
1.1.3. Tác dụng của anthocyanin ... Error! Bookmark not defined. 
1.1.4. Sự phân bố của anthocyanin ... Error! Bookmark not defined. 
1.2. Một số phƣơng pháp xác định anthocyanin ... Error! Bookmark not defined. 
1.2.1. Phương pháp pH vi sai ... Error! Bookmark not defined. 
1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ... Error! Bookmark not
defined.

CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM ... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
2.1. Mục tiêu ... Error! Bookmark not defined. 
2.2. Nội dung nghiên cứu ... Error! Bookmark not defined. 
2.3. Đối tƣợng nghiên cứu ... Error! Bookmark not defined. 
2.4. Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị ... Error! Bookmark not defined. 
2.4.1. Chất chuẩn ... Error! Bookmark not defined. 
2.4.2. Hoá chất ... Error! Bookmark not defined. 
2.4.3. Thiết bị ... Error! Bookmark not defined. 
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu ... Error! Bookmark not defined. 
2.6. Thẩm định phƣơng pháp ... Error! Bookmark not defined. 
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... ERROR! BOOKMARK NOT
DEFINED.

3.1. Tối ƣu các điều kiện xác định anthocyanin trên hệ thống HPLC ... Error!
Bookmark not defined.

</div>
(5)<div class='page_container' data-page=5>

3.1.4. Chọn thể tích bơm mẫu ... Error! Bookmark not defined. 
3.1.5. Khảo sát thành phần pha động ... Error! Bookmark not defined. 
3.1.6. Khảo sát nồng độ axit trong pha động ... Error! Bookmark not defined.

3.1.7. Khảo sát chương trình rửa giải ... Error! Bookmark not defined. 
3.1.8. Khảo sát tốc độ pha động ... Error! Bookmark not defined. 
3.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu ... Error! Bookmark not defined. 
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân ... Error! 
Bookmark not defined.

3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân ... Error! 
Bookmark not defined.

3.2.3. Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết mẫu ... Error! Bookmark not defined. 
3.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích ... Error! Bookmark not defined. 
3.3.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc ... Error! Bookmark not defined. 
3.3.2. Khoảng tuyến tính ... Error! Bookmark not defined. 
3.3.3. Độ lặp lại ... Error! Bookmark not defined. 
3.3.4. Độ thu hồi ... Error! Bookmark not defined. 
3.4. Ứng dụng phƣơng pháp xác định anthocyanin trong một số rau củ ... Error!
Bookmark not defined.

</div>
(6)<div class='page_container' data-page=6>

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Cấu trúc của 6 chất phổ biến nhất trong nhóm anthocyanin ... Error! 
Bookmark not defined.

Bảng 1.2: Thông tin chung về 3 chất nghiên cứu ... Error! Bookmark not defined. 
Bảng 1.3: Hàm lượng Anthocyanin tổng có trong một số mẫu thực vật tại Việt Nam
[7] ... Error! Bookmark not defined. 
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của cột tách đến độ rộng đáy pic (W) và thời gian lưu (tR)
... Error! Bookmark not defined. 
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của thành phần pha động đến độ rộng đáy pic (W), thời gian
lưu (tR), độ phân giải (RS) của del, cya, pel. ... Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.3: Rửa giải chất phân tích theo chế độ đẳng dịng ... Error! Bookmark not
defined.

Bảng 3.4: Chương trình gradient 1 ... Error! Bookmark not defined. 
Bảng 3.5: Chương trình gradient 2 ... Error! Bookmark not defined. 
Bảng 3.6: Chương trình gradient 3 ... Error! Bookmark not defined. 
Bảng 3.7: Chương trình gradient 4 ... Error! Bookmark not defined. 
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của chương trình gradient đến hệ số đối xứng pic ... Error! 
Bookmark not defined.

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến thơi gian lưu và chiều cao pic ... Error! 
Bookmark not defined.

Bảng 3.10: Hàm lượng các chất theo thời gian thủy phân ... Error! Bookmark not
defined.

Bảng 3.11: Hàm lượng các chất tại các nhiệt độ thủy phân khác nhau ... Error! 
Bookmark not defined.

Bảng 3.12: Hàm lượng các chất tại các tỷ lệ dung môi chiết khác nhau ... Error! 
Bookmark not defined.

Bảng 3.13: Nồng độ và diện tích pic trung bình của các chất. Error! Bookmark not
defined.

</div>
(7)<div class='page_container' data-page=7>

Bảng 3.18: Độ thu hồi trên nền mẫu củ dền ... Error! Bookmark not defined. 
Bảng 3.19: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các chất phân tích Error! 
Bookmark not defined.

</div>
(8)<div class='page_container' data-page=8>

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Cấu trúc cơ bản aglycon của anthocyanin Error! Bookmark not defined.
Hình 1.2: Sự phụ thuộc cấu trúc anthocyanin vào pH ... Error! Bookmark not
defined.

Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC ... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.1: Phổ hấp thụ của delphinidin ... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.2: Phổ hấp thụ của cyanidin ... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.3: Phổ hấp thụ của pelargonidin ... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.4: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn 3 chất với cột sắc kí 1 .. Error! Bookmark 
not defined.

Hình 3.5: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn 3 chất với cột sắc kí 2 .. Error! Bookmark 
not defined.

Hình 3.6: Sắc ký đồ rửa giải các anthocyanin với thành phần pha động là nước và
ACN ... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.7: Sắc ký đồ del, cya tại các nồng độ axit trifloaxetic khác nhau ... Error! 
Bookmark not defined.

Hình 3.8: Sắc ký đồ của hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient 1
... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.9: Sắc ký đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient 2 ... Error! 
Bookmark not defined.

Hình 3.10: Sắc ký đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient 3 .. Error! 
Bookmark not defined.

Hình 3.11: Sắc ký đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient 4 .. Error! 
Bookmark not defined.

Hình 3.12: Hàm lượng các chất khi thủy phân trong thời gian khác nhau (60, 90,
120, 150 phút). ... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.13: Hàm lượng các chất tại nhiệt độ thủy phân khác nhau Error! Bookmark
not defined.

</div>
(9)<div class='page_container' data-page=9>

Hình 3.16: Sắc ký đồ của mẫu rau khơng chứa anthocyanin .. Error! Bookmark not
defined.

Hình 3.17: Sắc ký đồ của mẫu rau không chứa anthocyanin được thêm chuẩn hỗn
hợp ... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.18: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ

delphinidin ... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.19: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ

cyanidin ... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.20: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ

pelargonidin ... Error! Bookmark not defined.

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt

ACN Acetonitrile Acetonitril

AOAC Association of Official Analytical
Community

Hiệp hội cộng đồng phân

tích chính thức

CYA Cyanidin Cyanidin

DEL Delphinidin Delphinidin

HPLC High performance liquid

chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPTLC High performance thin layer
chromatography

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng
cao

LC-MS/MS

Liquid chromatography tandem mass
spectrometry

Sắc ký lỏng ghép khối phổ
hai lần

LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng

MeOH Methanol Metanol

PDA Photodiod array Detector mảng đi-ốt quang

</div>
(10)<div class='page_container' data-page=10>

ppm Parts per million Phần triệu

R Relative coefficient Hệ số tương quan

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn

S/N Signal to noise ratio Tỷ lệ tín hiệu chia cho

nhiễu

TFA Trifloroacetic acid Axit Trifloaxetic

</div>
(11)<div class='page_container' data-page=11>

MỞ ĐẦU

Ngày nay, do ảnh hưởng của điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng
ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng các thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa đã tạo
điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng oxy hoạt
động. Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bất lợi, tổn thương
cho cơ thể và là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nan y. Những nghiên cứu tìm hiểu
về các chất có khả năng chống oxy hóa mang lại những tác dụng tốt, có lợi cho sức
khỏe con người đang ngày càng phát triển.

Chất chống oxy hóa là những “chiến binh tốt” chống lại các chất độc hại - các
gốc tự do. Chúng được hình thành một cách tự nhiên như là một sản phẩm phụ của
quá trình sống liên quan tới oxy. Các chất chống oxy hóa có khả năng giải phóng ra

những điện tử, chúng vơ hiệu hóa khả năng oxy hóa của các gốc tự do và ngăn chặn
chúng tấn công các tế bào khỏe mạnh. Để bảo vệ chính mình, cơ thể ln tự sản
sinh ra các cơ chế chống oxy hóa thiết yếu, nhưng với thời gian chúng dần trở nên
kém hiệu quả theo tuổi tác. Đây là lý do tại sao mà việc sử dụng các chất chống oxy
hóa cũng như các thực phẩm chứa chất chống oxy hóa là rất quan trọng [3], [11].

Ngày nay, thức ăn không chỉ đảm bảo đủ calo, ngon, sạch, mà còn phải chứa
các hoạt chất sinh học tự nhiên cần cho sức khoẻ và sắc đẹp, không chỉ điều khiển
được các chức năng hoạt động của từng bộ phận trong cơ thể, tạo cho con người khả
năng miễn dịch cao, chống sự lão hoá, tăng tuổi thọ, mà còn giúp phòng chống
được một số bệnh, kể cả ung thư. Theo các nghiên cứu thì các hợp chất anthocyanin
có các hoạt tính rất tốt như: chống viêm, chống xơ vữa động mạch, ức chế đơng tụ
tiểu cầu, chống ung thư, thúc đẩy hình thành cytokin điều hịa phản ứng miễn dịch,
có hoạt tính chống oxy hóa rất mạnh [21], [22], [28].

</div>
(12)<div class='page_container' data-page=12>

phân tích này xác định anthocyanin tổng bằng phương pháp UV-VIS có độ chính
xác khơng cao. Việc phân tích riêng lẻ từng hợp chất trong nhóm anthocyanin trong
đối tượng mẫu thực vật là cơ sở để đánh giá hoạt tính chống oxy hố của từng chất
trong nhóm, đề xuất nguồn nguyên liệu cho chế biến thực phẩm chức năng. Xuất
phát từ thực tiễn trên, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu đề tài:

“Xác định hàm lượng Anthocyanin trong một số loại rau bằng phương 
pháp sắc ký”

Với các mục tiêu sau đây:

1. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Anthocyanin 
trong một số loại rau bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.

</div>
(13)<div class='page_container' data-page=13>

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Trần Tử An (2007), Hóa phân tích - tập 2 - Phân tích dụng cụ, Nhà xuất bản Y
học, Hà Nội.

2. Huỳnh Thị Kim Cúc, và cộng sự (2004), "Xác định hàm lượng Anthocyanin
trong một số nguyên liệu rau quả bằng phương pháp pH vi sai", Tạp Chí Khoa

Học và Cơng Nghệ, Đại Học Đà Nẵng, 3(7), 47-54.

3. Lại Thị Ngọc Hà và Vũ Thị Thư (2009), "Stress oxy hóa và các chất chống oxy
hóa tự nhiên", Tạp chí Khoa học và Phát triển, 7(5), 667-677.

4. Trần Từ Hiếu và cộng sự (2003), Hố học phân tích, Nhà xuất bản đại học quốc
gia Hà Nội, Hà Nội.

5. Nguyễn Thị Hiển, Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn Thị Loan (2012), “Nghiên
cứu chiết tách Anthocyanin từ đài hoa Hibiscus sabdariffa” - Ứng dụng để sản
xuất giấy chỉ thị phát hiện nhanh hàn the trong thực phẩm, Tạp chí Khoa học và

phát triển 2012, 10(5), 738-746.

6. Nguyễn Thị Lan và Lê Thị Lạc Quyên (2006), "Nghiên cứu ảnh hưởng của hệ
dung môi đến khả năng chiết tách chất màu Anthocyanin có độ màu cao từ quả
dâu Hội An", Tạp Chí Khoa Học và Cơng Nghệ, Đại Học Đà Nẵng, 44, 71-76.
7. Phạm Thị Thanh Nhàn, Nguyễn Hữu Cường và Lê Trần Bình (2011), "Tách

chiết và phân tích hàm lượng Anthocyanin trong các mẫu thực vật khác nhau",

Tạp chí Sinh Học, 33(4), 79-85.

8. Nguyễn Văn Ri (2009), Các phương pháp tách, Bài giảng Đại học Khoa học Tự
Nhiên – ĐHQGHN.

9. Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học & vi

sinh vật, Nxb Khoa Học và Kỹ Thuật.

Tiếng Anh

</div>
(14)<div class='page_container' data-page=14>

11. Betteridge D. J. (February, 2000), "What is oxidative stress?", Metabolism,
49(2), 3-8.

12. Bhornchai Harakotr., et al (2014), "Anthocyanins and antioxidant acitivity in
coloured waxy corn at different maturation stages", Journal of functional foods,

9, 109-118.

13. Bridle P. and Timberlake C.F. (1996), "Anthocyanins as natural food
colors-selected aspects", Food Chemistry, 58, 103-109.

14. Cheynier V., Gómez C. and Ageorges A. (2012), "Flavonoids: Anthocyanins",
In Fidel Toldra Leo M.L. Nollet, editor, Handbook of Analysis of Active

Compounds in Functional Foods, 379-397.

15. Cretu G.C. and Morlock G.E. (1 March 2014), "Analysis of Anthocyanins in
powdered berry extracts by planar chromatography linked with bioassay and
mass spectrometry", Food Chemistry, 146, 104-112.

16. Korte G. Dreiseitel A., Schreier P., et al (2009), "Berry Anthocyanins and their
aglycons inhibit monoamine oxidases A and B", Pharmacol Res, 59(5), 306-311.
17. Durst R.W. and Wrolstad R.E. (2001), "Separation and Characterization of

Anthocyanins by HPLC", Current Protocols in Food Analytical Chemistry,
F1.3.1-F1.3.13.

18. Francesca Leri., et al, (2012), "Simultaneous determination of Anthocyanins,
coumarins and phenolicaxits in fruits, kernels and liqueur of Prunus mahaleb
L", Food Chemistry, 135, 2157-2162.

19. Fossen T. and Andersen M. (2000), "Anthocyanins from tubers and shoots of
the purple potato, Solanum tuberosum", J. Ilort Sci. Biotech, 75, 360-363.

20. Hybertson B.M., et al (2011), "Oxidative stress in health and disease: The
therapeutic potential of Nrf2 activation", Molecular Aspects of Medicine, 32,
234–246.

21. Lakshmi S.V.V., Padmaja G. and Kutala V. K., Kuppusamy P. (December,
2009), "Oxidative Stress in Cardiovascular Disease", Indian Journal of

</div>
(15)<div class='page_container' data-page=15>

22. Lila M.A (2004), "Anthocyanins and Human Health: An In Vitro Investigative
Approach", Journal of Biomedicine and Biotechnology, 5, 306-313.

23. Longo L. and Vasapollo G. (2006), "Extraction and identification of
Anthocyanins from Smilax aspera L. berries", Food Chemistry, 94, 226-231.
24. Marco P.H. and Scarminio I.S. (2007), "Q-mode curve resolution of UV–vis

spectra for structural transformation studies of Anthocyanins inaxitic

solutions", Analytica Chimica Acta, 583, 138-146.

25. Meng L. Lozano Y., Bombarda I., Gaydou E. and Li B. (2006), "Anthocyanin
and flavonoid production from Perilla frutescens: Pilot plant scale processing
including cross-flow microfiltration and reverse osmosis", J. Agric. Food 
Chem, 54, 4297-4303.

26. Merken H.M. and G.R. Beecher (2000), "Liquid chromatographic method for
the separation and quantification of prominent flavonoid aglycones", Journal of

Chromatography A, 897, 177-184.

27. Miguel M. G (2011), "Anthocyanins: Antioxidant and/or anti-inflammatory
activities", Journal of Applied Pharmaceutical Science, 01(06), 07-15.

28. Nantz M.P. Percival S.S., Rowe C.A. and Nieves Jr. C. (2006), "Immunity and
Antioxidant Capacity in Humans Is Enhanced by Consumption of a Dried,
Encapsulated Fruit and Vegetable Juice Concentrate", The Journal of Nutrition,
136, 2606-2610.

29. Nafiz Oncu Can., et al (2012), "Rapid determination of free Anthocyanins in
foodstuff using high performance liquid chromatography". Food Chemistry,
130, 1082-1089.

30. Ovando A.C., et al (2009), "Chemical studies of Anthocyanins: A review",

Food Chemistry, 113, 859 - 871.

</div>
(16)<div class='page_container' data-page=16>

incana Cultivars (Brassicaceae)", J. Japan. Soc. Hort. Sci, 81(1), 91-100.

33. Timberlake C. F. and Bridle P. (1982), "Distribution of Anthocyanins in Food Plants",
In Pericles Markakis, editor, Anthocyanins as Food Colors, Academic Press.

34. Truong V.D. Deighton N., Thompson R.T., et al (2010), "Characterization of
Anthocyanins and Anthocyanidins in Purple-Fleshed Sweetpotatoes by
HPLC-DAD/ESI-MS/MS", J. Agric. Food Chem, 58, 404-410.

35. Wu X. (2005), "Identification and characterization of Anthocyanins by
HPLC-ESI-MS/MS in common foods in the United States: Vegetables, nuts,
and grains", J Agric Food Chem, 53(8), 3101-3113.

36. Xu Z. and Howard L.R. (2012), "Analysis Methods of Anthocyanins", Analysis of

Antioxidant-RichPhytochemicals, 5, 945-978.

37. Yafang Shao., et al (2014), "Phenolicaxits, Anthocyanins, and antioxidant
capacity in rice (Oryzasativa L.) grains at four stages of development after
flowering", Food Chemistry, 143, 90–96.

38. Zhang Z. et al (2004), "Comparison of HPLC Methods for Determination of
Anthocyanins and Anthocyanidins in Bilberry Extracts", J. Agric. Food Chem,

</div>