Nghiên cứu phân lập và cố định chủng vi khuẩn pseudomonas có khả năng xử lý các hợp chất chứa nitơ trong nước thải nuôi tôm

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

BÙI ANH THI

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CỐ ĐỊNH CHỦNG VI KHUẨN
PSEUDOMONAS CÓ KHẢ NĂNG XỬ LÝ CÁC HỢP CHẤT
CHỨA NITƠ TRONG NƯỚC THẢI NUÔI TÔM

ĐÀ NẴNG - Năm 2016


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

BÙI ANH THI

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CỐ ĐỊNH CHỦNG VI KHUẨN
PSEUDOMONAS CÓ KHẢ NĂNG XỬ LÝ CÁC HỢP CHẤT
CHỨA NITƠ TRONG NƯỚC THẢI NUÔI TÔM

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: ThS. NGUYỄN THỊ LAN PHƯƠNG

ĐÀ NẴNG - Năm 2016


LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi.

Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được
ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Đà Nẵng, ngày 2 tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Bùi Anh Thi


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất em xin gửi tới Ths. Nguyễn Thị Lan
Phương đã tạo điều kiện tốt nhất để cho em hồn thành khóa luận tốt nghiệp
này.
Em xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Sinh – Môi trường, trường Đại
học Sư Phạm đã hỗ trợ tận tâm, hướng dẫn và trao dồi kiến thức trong những
năm qua giúp em hồn thành khóa luận.
Do kiến thức cịn nhiều hạn chế nên sẽ khơng tránh khỏi những sai sót,
vì vậy em rất mong nhận được sự góp ý q báu từ q thầy cơ.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè và gia đình đã ln quan tâm,
giúp đỡ để em hồn thành bài khóa luận tốt nghiệp này.
Sau cùng em xin kính chúc quý thầy cô khoa Sinh – Môi Trường, Đại
học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng sức khỏe và công tác tốt.
Trân Trọng!
Đà Nẵng, ngày 2 tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Bùi Anh Thi


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1
2. Mục tiêu......................................................................................................... 2
3. Ý nghĩa .......................................................................................................... 3
3.1. Ý nghĩa khoa học ....................................................................................... 3
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4
1.1. Nghề nuôi tôm và vấn đề mơi trường trong ni tơm ............................... 4
1.1.1. Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam và trên thế giới..................................... 4
1.1.2. Các vấn đề môi trường trong nuôi tôm ................................................... 4
1.2. Thành phần các hợp chất chứa nitơ trong nước thải nuôi tôm .................. 6
1.2.1. Các chất hữu cơ ....................................................................................... 6
1.2.2. Hợp chất nitơ trong nước thải ................................................................. 6
1.2.2.1. Nitrogen (N) ......................................................................................... 7
1.2.2.2. Ammonia (NH3) và ammonium (NH4+) ............................................... 7
1.2.2.3. Nitrite (NO2-) và nitrate (NO3-) ............................................................ 8
1.3. Các phương pháp xử lý nước thải nuôi tôm............................................... 9
1.3.1. Phương pháp cơ học và hóa học ............................................................. 9
1.3.2. Phương pháp sinh học ........................................................................... 10
1.3.2.1. Ứng dụng vi sinh vật trong xử lý nước thải ao nuôi .......................... 11
1.3.2.2. Vi khuẩn Pseudomonas ...................................................................... 12
1.2.3.3. Qui trình chuyển hóa .......................................................................... 14
1.4. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về ứng dụng chủng vi khuẩn
Pseudomonas nhằm xử lý nước thải ............................................................... 15
1.4.1. Các nghiên cứu nước ngoài ................................................................... 15
1.4.2. Các nghiên cứu trong nước .................................................................. 16
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ................................................................................................................ 17
2.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................. 17

2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 17
2.3. Địa điểm nghiên cứu tại phịng thí nghiệm .............................................. 17
2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 17
2.4.1. Phương pháp thu mẫu ........................................................................... 17
2.4.2. Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Pseudomonas sp. .................... 18
2.4.3. Phương pháp nhuộm Gram ................................................................... 18
2.4.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính khử NH4+ trong nước ........................ 20
2.4.5. Phương pháp đánh giá khả năng xử lý các hợp chất của nitơ trong nước
thải thực nghiệm của các chủng vi khuẩn ....................................................... 20
2.4.6. Quy trình làm chế phẩm ........................................................................ 21
2.4.7. Phương pháp đánh giá chế phẩm .......................................................... 22
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 24
3.1. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn ...................................................... 24
3.2. Kết quả nhuộm Gram ............................................................................... 26
3.3. Kết quả đánh giá hoạt tính phân giải ammonium trong nước của các
chủng vi sinh vật ............................................................................................. 28
3.4. Kết quả đánh giá hoạt tính thực nghiệm .................................................. 29
3.5. Kết quả làm chế phẩm xử lý nước thải .................................................... 30
3.5.1. Chuẩn bị chất mang ............................................................................... 30
3.5.2. Nhân giống vi sinh vật .......................................................................... 32
3.5.3. Đưa vi sinh vật vào chất mang .............................................................. 32
3.6. Kết quả đánh giá chế phẩm ...................................................................... 32
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 39


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
VSV : Vi sinh vật
cs

: Cộng sự

VK : Vi khuẩn


DANH MỤC BẢNG, BIỂU

Danh mục bảng
Bảng Tên bảng

Trang

3.3

Đánh giá hoạt tính

26

3.4

Hiệu quả xử lý của các chủng vi sinh vật

27

3.5

Thành phần các chất mang

28

Danh mục biểu
Biểu đồ

Tên biểu đồ

Trang

3.6a

pH thay đổi theo thời gian xử lý

31

3.6b

NH4+ -N thay đổi theo thời gian xử lý

32

3.6c

N tổng thay đổi theo thời gian xử lý

32

3.6d

BOD5 và COD thay đổi theo thời gian xử lý

33

3.6e

DO thay đổi theo thời gian xử lý

34


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình

Tên hình

Trang

3.1a

Vào mẫu

22

3.1b

Các dịng khuẩn lạc

22

3.1c

Các chủng vsv phân lập được và đặc điểm

23-24

3.2

Kết quả nhuộm Gram vsv dưới kính hiển vi

25

3.3

Lượng NaOH 1N đã dùng

26

3.4a

Thùng đựng nước thải và chế phẩm

30

3.4b

Đưa chế phẩm vào nước thải

30

1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Việt Nam đang bước vào thời kỳ cơng nghiệp hóa, hiện đại hóa nền kinh
tế nhằm đạt mục tiêu chiến lược trở thành một đất nước công nghiệp tiên tiến
vào năm 2020. Song song với các hoạt động để có thể đạt được mục tiêu phát
triển đó, một trong những nhiệm vụ quan trọng khơng thể thiếu là bảo vệ môi
trường và phát triển bền vững.
Những năm gần đây, nhiều ngành công nghiệp phát triển vượt bậc, trong
đó ngành thủy sản là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn đóng góp nhiều
cho nền cơng nghiệp của nước ta. Sản lượng thủy sản không những đáp ứng
nhu cầu thực phẩm trong nước mà còn xuất khẩu sang các thị trường khác. Tuy
nhiên mặt trái của việc phát triển kinh tế nhanh là để lại nhiều ảnh hưởng xấu
đến môi trường, đặc biệt là chất lượng nguồn nước. Nếu khơng được sự quan
tâm của chính quyền cũng như người dân, môi trường sống sẽ ngày càng giảm
sút [15].
Trong công nghiệp thủy sản, ngành nuôi tôm cũng là ngành quan trọng.
Ngồi việc đóng góp tích cực thì cũng để lại nhiều mặt tiêu cực. Để tăng năng
suất và lợi nhuận người nuôi tôm đã không ngừng tăng mật độ thả giống, sử
dụng thuốc và hóa chất trong phịng và chữa bệnh, và cả lượng dư thức ăn sau
chăn nuôi, tác động xấu đến môi trường nước, gây ô nhiễm. Vì vậy phát triển
nghề ni tơm theo hướng bền vững với môi trường là vấn đề đang rất được
quan tâm [1], [20].
Sự tồn tại của dư lượng các chất sau khi nuôi là một trong những nguyên
nhân lớn gây ô nhiễm môi trường nơi tiếp nhận nguồn thải. Nước ao ni tơm
sau sử dụng thuộc nhóm nước thải đa thành phần, trong đó các hợp chất chứa
Nitơ (NH3, NH4+, NO3- và NO2-) chiếm tỉ lệ cao. NH3 là dạng khí độc cho tơm,

2

nó được hình thành từ q trình phân hủy các hợp chất hữu cơ từ thức ăn, thuốc
chữa bệnh dư, các chất bài tiết của tôm [14], [19], [27].
Trong số các công cụ sinh học phổ biến, vi sinh vật đóng vai trị quan
trọng trong việc phân hủy các hợp chất hữu cơ, cải thiện chất lượng nước,
chuyển hóa các khí độc như NH3, các hợp chất nitrit, nitrat sang các chất không
độc khác. Trong việc tuyển chọn giống hiện nay những vi khuẩn hữu ích tiềm
năng được phân lập trực tiếp từ môi trường ao nuôi thường đem lại hiệu quả xử
lý tốt [18].
Pseudomonas là chủng vi sinh vật có khả năng phân giải khơng những
các hợp chất hữu cơ mà cả các hợp chất vô cơ chứa Nitơ. Pseudomonas có khả
năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào như amylaza và proteaza, đồng thời lên
men được nhiều loại đường, tinh bột, protein, lipaza…, thành các sản phẩm có
khối lượng phân tử thấp và tạo màng nhầy [6], [22]. Pseudomonas xuất hiện ở
mọi nơi trong các môi trường như đất, nước, khơng khí… Là vi khuẩn gram
âm, di động nhờ roi ở đầu và khơng có bào tử phát triển ở điều kiện hiếu khí,
kỵ khí. Dinh dưỡng là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không
quang hợp hoặc cố định nitrogen [21], [22].
Từ những lợi ích kể trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân
lập và cố định chủng vi khuẩn Pseudomonas có khả năng xử lý các hợp
chất chứa Nitơ trong nước thải nuôi tôm”
2. Mục tiêu
Phân lập tuyển chọn các chủng VK Pseudomonas sp. có khả năng xử lý
các hợp chất chứa nitơ nhằm sản xuất chế phẩm sinh học, nghiên cứu đánh giá
khả năng ứng dụng chế phẩm vào việc xử lý nước thải hồ nuôi tôm trên địa bàn
TP. Đà Nẵng.


3

3. Ý nghĩa
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những cơ sở khoa học về các chủng vi
khuẩn Pseudomonas sp. Có khả năng xử lý các hợp chất chứa nitơ nước thải
ni tơm, từ đó làm cơ sở cho việc chế tạo các chế phẩm sinh học xử lý nước
thải trên quy mô lớn.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Dựa trên cơ sở nghiên cứu khoa học của đề tài có thể thiết lập quy trình
phân lập, sản xuất chế phẩm sinh học để xử lý nước thải nuôi tôm.


4

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nghề nuôi tôm và vấn đề mơi trường trong ni tơm
1.1.1. Tình hình ni tơm ở Việt Nam và trên thế giới
Nghề nuôi tôm trên thế giới xuất hiện cách đây nhiều thế kỷ, nhưng nuôi
tôm hiện đại chỉ mới bắt đầu vào những năm 1930 sau khi Motosaku Fujinaga
cơng bố cơng trình nghiên cứu về sản xuất tôm giống nhân tạo Nhật Bản. Cùng
với sự phát triển của khoa học công nghệ nghề tôm phát triển và bùng nổ vào
thập niên 90 [2].
Trên thế giới có hai khu vực ni tơm lớn nhất là các nước Mỹ Latinh và
các nước Nam Á và Đông Nam Á. Trong đó Thái Lan là nước đứng đầu trong
sản lượng tôm [6].
Các loại tôm được nuôi nhiều nhất là tôm chân trắng, tôm sú… Lợi nhuận
hấp dẫn và giá trị xuất khẩu cao là điều kiện để nghề nuôi tôm được mở rộng
và phát triển [13].
Ở Việt Nam, vào đầu thập niên 70, đã xuất hiện hình thức nuôi tôm canh.

Sau năm 1987 nghề nuôi tôm mới phát triển mạnh. Trong những năm gần đây
nghề nuôi tôm đã phát triển mạnh mẽ và trở thành ngành kinh tế quan trọng,
tạo công ăn việc làm tăng thu nhập cho hành triệu người ven biển và tạo nguồn
thu ngoại tệ đáng kể [20].
Tuy vậy nghề nuôi tôm ở Việt Nam đang phải đối mặt với nhiều thách
thức, ảnh hưởng đến tính bền vững của ngành. Đó là tác động kinh tế, xã hội,
môi trường của ngành nuôi tôm và gần đây là các vấn đề về rào cản chất lượng
sản phẩm và tranh chấp thương mại giữa các nước xuất khẩu và nhập khẩu.
Ngồi ra ơ nhiễm do nước thải sau khi ni tơm cũng được quan tâm. Vì vậy
một trong những giải pháp đưa ra ngành nuôi tôm phát triển bền vững là xử lý
ô nhiễm do nuôi tôm tạo ra [13], [20].
1.1.2. Các vấn đề môi trường trong nuôi tôm


5

Nuôi tôm ở quy mô bán công nghiệp phát triển rộng đã gây ảnh hưởng
nhiều đến mơi trường khí, nước… [15]. Thành phần nước thải nuôi tôm không
lớn như nước thải công nghiệp nhưng do lưu lượng thải ra quá lớn cộng thêm
lượng bùn đáy ao khiến chất lượng môi trường xung quanh bị suy giảm nhiều
[20]. Nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường trong nuôi tôm là các kỹ thuật xử
lý nước thải sau nuôi chưa tương xứng với quy mô và mức độ phát triển của
phương thức nuôi trồng thủy sản này. Nước thải nuôi tôm chứa nhiều chất hữu
cơ, chất rắn lơ lửng, NH3 được tạo ra từ q trình phân hủy chất hữu cơ [14].
Có thể gồm ba thành phần chính như sau:
- Khí: Trong quá trình ni việc sử dụng hóa chất để vệ sinh hay phịng
ngừa bệnh cho tơm đã phát thải vào mơi trường một lượng khí được phân giải
dưới tác dụng của vi khuẩn như H2S, NH3, CH4…, các chất này rất độc cho ao,
hồ. Nếu dùng nhiều lần hay quá liều sẽ dẫn đến tình trạng tồn thuốc gây ảnh
hưởng xấu đến môi trường [10], [14].

- Bùn: Chứa nhiều chất hữu cơ, kháng sinh, hóa chất, khí độc và nhiều loại
vi khuẩn gây bệnh. Bùn được thải thẳng ra đất không qua xử lý. Hầu hết các ao
ni tơm đều có lớp đất đen hay bùn thối ở lớp nước đáy và xả vào nguồn nước
xung quanh như sông, suối…sau khi thu hoạch tơm gây nên thối hóa chất
lượng nước khơng kiểm soát được dịch bệnh được. Khi lấy lớp bùn đất đen đi
xử lý đổ ra gần khu vực nuôi tơm mà khơng có quản lý tốt chất thải thì chúng
trở lại ao nuôi khi mưa lớn. [10], [14].
- Nước: Trong ni tơm sử dụng thuốc kháng sinh, hóa chất (thuốc tím,
clo) chúng sẽ có mặt trong nước thải. Nước chứa nhiều chất dinh dưỡng nên
sinh ra H2S, NH3, CH4 đồng thời nước thải cịn chứa nhiều các khí gây độc khác
nếu không được xử lý trước khi thải ra môi trường xung quanh [10], [14], [29].


6

1.2. Thành phần các hợp chất chứa nitơ trong nước thải nuôi tôm
1.2.1. Các chất hữu cơ
Dựa vào khả năng có thể phân hủy nhờ vi sinh vật có trong nước mà ta
có thể phân các chất hữu cơ thành hai nhóm:
Các chất hữu cơ dễ phân hủy: Đó là các hợp chất protein, hidratcacbon,
chất béo có nguồn gốc động vật và thực vật. Đây là các chất gây ô nhiễm chính
có trong nước thải sinh hoạt, nước thải từ các xí nghiệp chế biến thực phẩm.
Các hợp chất này chủ yếu là suy giảm oxy hoàn tan trong nước dẫn đến suy
thoái tài nguyên thủy sản và làm giảm chất lượng nước [10], [13], [26].
Các chất hữu cơ khó bị phân hủy: Các chất loại này thường là các chất
hữu cơ có vịng thơm, chất đa vịng ngưng tụ, các hợp chất clo, photpho hữu
cơ… Hầu hết chúng là các chất có độc tính đối với con người và sinh vật. Chúng
lưu tồn lâu trong môi trường hơn nữa trong nguồn nước tự nhiên, hàm lượng
các chất hữu cơ rất thấp nhưng khi bị ơ nhiễm thì hàm lượng này tăng cao gây
ảnh hưởng đến cuộc sống [10], [11], [13], [26].

1.2.2. Hợp chất nitơ trong nước thải
Thức ăn thừa, phân tơm và q trình chuyển hố dinh dưỡng là nguồn
gốc chủ yếu của các chất gây ô nhiễm ở các trại nuôi tôm quản lý kém. Kết quả
quan sát đã cho thấy rằng trong hệ thống thâm canh tôm thì chỉ có 15 – 20%
thức ăn được dùng vào phát triển mơ động vật, có tới 15% tổng lượng thức ăn
hao hụt do khơng ăn hết và thất thốt, chỉ có 40 – 45% là được sử dụng trong
quá trình chuyển hố dinh dưỡng, duy trì hoạt động sống và lột vỏ. Ô nhiễm
nitơ chiếm tỷ lệ lớn (30 – 40%) từ thức ăn thừa. Người ta ước lượng rằng, có
khoảng 63 – 78% nitơ và 76 – 80% phospho cho tơm ăn bị thất thốt vào mơi
trường. Nitơ dưới dạng protein được tôm hấp thu và bài tiết dưới dạng
ammonia. Tổng khối lượng nitơ và phospho sản sinh trên 1 ha trại ni tơm
bán thâm canh có sản lượng 2 tấn, tương ứng khoảng 113 kg và 43 kg. Ðương


7

nhiên, trong hệ thống ni thâm canh thì khối lượng này tăng gấp từ 7 – 31 lần
[6].
Lượng chất thải sinh ra có liên quan với cơng nghệ sản xuất thức ăn và
hệ thống nuôi tôm. Nitơ và photpho là những nguyên tố chủ yếu trong chất thải
bắt nguồn từ thức ăn. Việc cho thức ăn quá nhiều, tính chất nguồn nước không
ổn định, thức ăn dễ tan, thức ăn khó hấp thu và khả năng duy trì nitơ… là những
yếu tố liên quan với nước thải có chứa nhiều nitơ và phospho. Ngồi ra lượng
chất thải sinh ra cịn liên quan tới công nghệ sản xuất thức ăn và hệ thống nuôi
tôm, các chất kháng sinh, dược phẩm, thuốc trị liệu và kích thích tố.
1.2.2.1. Nitrogen (N)
Là thành phần cấu thành protein, N là một nguyên tố quan trọng đối với
đời sống sinh vật. Nó được thực vật xanh hấp thụ trước hết ở dạng ammonium
(NH4+) và dạng nitrate (NO3-), những các hợp chất này thường có ít trong các
thủy vực. Do đó, trong các thủy vực nitơ thường là nhân tố giới hạn cho đời

sống của thực vật. Sự tạo thành các hợp chất hữu cơ trong thủy vực phụ thuộc
vào hàm lượng NH4+ và NO3-. Trong các thủy vực hầu như toàn bộ nitơ được
liên kết trong các protein của cơ thể sống. Tuy nhiên, các hoạt động của động
vật thủy sinh NH4+ luôn được bài tiết ra hoặc sau khi chúng chết đi bị các loài
vi sinh vật khác phân hủy [10], [31], [34].
1.2.2.2. Ammonia (NH3) và ammonium (NH4+)
NH3 trong các thủy vực được cung cấp từ quá trình phân hủy protein (tự
nhiên hay từ thức ăn, thuốc xử lý thừa), xác bã động vật phù du, sản phẩm bài
thiết của động vật hay từ phân bón vơ cơ, hữu cơ [3].
(NH2)CO + 2H2O → (NH4)2CO3
(NH4)2CO3 → 2NH3↑ + CO2↑ + H2O
NH3 là loại khí độc đối với tôm, cá, khi được tạo thành sẽ phản ứng với
nước sinh ra ion NH4+ cho đến khi cân bằng được thiết lập. Tổng hàm lượng


8

của NH3 và NH4+ được gọi là tổng đạm amon (Total Ammonia Nitrogen –
TAN) [8], [25].
NH3 + H2O ↔ NH4+ + OH
NH3 là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến tỉ lệ sống, sinh trưởng
đối với thủy sinh vật. NH3 là khí độc đối với thủy sinh vật cịn ion NH4+ khơng
độc [25]. Độ độc của NH3 đối với một số loại giáp xác cũng được nghiên cứu,
ở nồng độ 0,09 mg/l NH3 làm giảm sự sinh trưởng của tôm càng xanh
(Macrobrachium rosenbergii), ở nồng độ 0,045 mg/L làm giảm 50% sự sinh
trưởng của các lồi tơm he [8]. Ngoài ra, LC50 – 24 giờ và LC50 – 96 giờ của
NH3 đối với tôm sú hậu ấu trùng (Penaeus monodon) là 5,71 mg/l. Nồng độ
NH3 được coi là an tồn cho ao ni là 0,13 mg/l. Do đó, việc theo dõi hàm
lượng NH3 trong ao nuôi tôm là rất cần thiết để nâng cao năng suất. NH4+ trong
nước rất cần thiết cho sự phát triển của sinh vật, là nguồn thức ăn tự nhiên,

nhưng nếu hàm lượng NH4+ quá cao sẽ làm cho thực vật phù du phát triển q
mức khơng có lợi cho tơm, cá (thiếu oxy vào sáng sớm, pH dao động,...). Theo
Boyd (1990) hàm lượng NH4+ thích hợp cho ao ni là 0,2 -2 mg/l [5], [8], [26]
1.2.2.3. Nitrite (NO2-) và nitrate (NO3-)
Nitrite: Hàm lượng nitrite trong các thủy vực được tạo thành từ quá trình
oxy hóa ammonia và ammonium nhờ hoạt động của nhóm vi khuẩn hóa tổng
hợp theo phản ứng sau:
NH4+ + 3/2 O2 → NO2- + 2H+ + H2O + 76 kcal.
Trong điều kiện khơng có oxy, nhiều lồi vi sinh vật có thể sử dụng
nitrate hoặc một số dạng oxy hóa khác của nitrogen (thay vì oxy) như một chất
nhận điện tử trong q trình hơ hấp. Q trình dị dưỡng này được gọi là khử
nitrate hay hô hấp nitrate, khi đó nitrate bị khử thành nitrite, hyponitrite,
hydroxylamine, ammonia hay N2 [8], [28], [34].
Q trình phản nitrate hóa, các hợp chất trung gian trong q trình
chuyển hóa thường là những dạng độc nên khơng có lợi cho thủy sinh vật. Khi


9

hàm lượng nitrate trong nước cao, nitrite sẽ kết hợp với hemoglobin tạo thành
methemoglobin. Trong phản ứng này, Fe của hemoglobin bị oxy hóa từ Fe2+
thành Fe3+, kết quả hemoglobin không thể kết hợp với oxy. Với lý do này, tính
độc của nitrite là làm giảm hoạt tính của hemoglobin hay có thể gọi là thiếu
máu. Máu có chứa methemoglobin thường có màu nâu nên cịn được gọi là
“bệnh máu màu nâu”. Đối với giáp xác, máu có chứa hemocyanin có Cu trong
thành phần cấu tạo thay vì Fe như hemoglobin. Nồng độ an toàn của nitrite đối
với giai đoạn hậu ấu trùng tôm sú là 4,5 mg/l. Tuy nhiên, nồng độ ammonia cao
sẽ làm tăng tính độc của nitrite đối với tôm sú. Theo Schwedler và cs (1985)
những nhân tố sau đây có ảnh hưởng đến độ độc của nitrite: hàm lượng chloride,
pH, tình trạng dinh dưỡng, sự nhiễm bệnh, hàm lượng oxy hòa tan.... [3], [9].

Nitrate: Trong thủy vực là sản phẩm của q trình nitrate hóa nhờ hoạt
động của một số lồi vi khuẩn hóa tự dưỡng theo phương trình phản ứng như
sau:
NO2- + ½ O2 → NO3- + 24kcal.
Nitrate là một trong những dạng đạm được thực vật hấp thu dễ nhất,
không độc với thủy sinh vật. Hàm lượng thích hợp cho các ao ni cá là từ 0,1
– 10 mg/l. Hàm lượng nitrate cao không gây độc cho cá nhưng có thể làm thực
vật phù du nở hoa gây những biến đổi chất lượng nước khơng có lợi cho tơm.
1.3. Các phương pháp xử lý nước thải ni tơm
1.3.1. Phương pháp cơ học và hóa học [18], [25]
Phương pháp cơ học: Được thực hiện thông qua việc cho nước chảy qua
một lớp sàng (sử dụng đá, sỏi, san hơ, than hoạt tính...), hoặc qua một miếng
bọt biển mỏng, hoặc chảy qua một miếng vải sồi (hoặc có thể kết hợp tất cả các
loại hình trên) nhằm loại bỏ các mảnh vụn đất cát, chất bẩn... ra khỏi nước.
Phương pháp hóa học: Lọc nước bằng hố chất, được thực hiện bằng
việc cho nước chảy qua các mẩu than (carbon) hoặc zô-lit (zeolite là một loại


10

đất khoáng) nhỏ, đây là những loại 14 khoáng sản tự nhiên. Than hoặc zô-lit sẽ
loại bỏ các phân tử như ammonia ra khỏi nước.
Hai loại hình lọc nước trên có ưu điểm là tạo được sự luân chuyển nước
khá lớn trên một đơn vị thời gian (kiểm soát qua việc sử dụng các máy bơm với
công suất khác nhau) nên quá trình làm trong nước nhanh, tạo oxi tốt song lại
có nhược điểm về độ ồn và khả năng kiểm soát lượng vi chất, chất thải được
lọc kém linh hoạt. Ngồi ra 2 loại hình lọc nước trên cịn có tác động khá lớn
đến kết cấu của bể, đến tính thẩm mỹ và chiếm diện tích tương đối lớn. Vì vậy
hiện nay mơ hình đang được chú ý tới là lọc sinh học bằng vi sinh vật hữu ích
và thực vật thủy sinh.

1.3.2. Phương pháp sinh học
Trong các biện pháp xử lý thì phương pháp sinh học được xem là an toàn,
mang lại hiệu quả cao và thân thiện với môi trường.
Với hàm lượng thức ăn, thuốc dư thừa nếu khơng được xử lý hiệu quả
thì sẽ là một mối nguy hại rất lớn cho môi trường và cả sức khỏe con người
[28]. Đã có nhiều biện pháp xử lý được áp dụng ở nhiều nơi tùy vào điều kiện
từng vùng.
Tại Thái Lan, Darooncho và cs (1991) khi trồng rong biển trong nước
thải nuôi tôn tại 2 tỉnh Chanthaburi và Songkhala đã cho thấy lượng ammonia
và BOD bị hấp thu bởi rong biển 100% và 39% sau 24h. Ngoài ra còn sử dụng
sò (Crassostrea sp.), rong câu (Gracillaria sp.) sau đó lọc qua các và cấp lại
cho ao ni [9], [17].
Tại Malaysia, Enander và cs (1994) đã sử dụng sò (Scappharca
imaeguivalvis) và rong biển (Gracilaria spp.) để xử lý nước thải sau khi nuôi
tôm tại tỉnh Kota Bharru cho hiệu quả giảm ammonia, tổng N, tổng P tương
ứng là 61% ,72% và 61% [17].
Tại Trung Quốc, Xiongfei và cs (2005) đã nghiên cứu xây dựng khu nuôi
tôm công nghiệp sử dụng nhuyễn thể hai vỏ để xử lý. Nước thải từ ao nuôi được


11

bơm ra kênh dẫn đến hệ thống ao nuôi nhuyễn thể và sau đó sẽ được lấy để
cung cấp cho cáo ao nuôi. Hệ thống này giảm được hàm lượng N-NO3 từ 22 24%, 19 – 64% TAN [18].
Tại Phú n đã áp dụng mơ hình ni tơm bền vững. Có hai mơ hình
chính được áp dụng mang lại hiệu quả cao [9], [18].
Mơ hình một: Trang trại có ao xử lý nước thải riêng biệt. Nước thải từ ao
nuôi tôm, xiphông (bơm) vào ao xử lý (ao nuôi cá rô phi và trồng rong). Sau
khi xử lý, nước được cấp cho hai ao nuôi tôm. Tôm khi thả nuôi 45 ngày tiến
hành xiphông đáy ao cho vào ao nuôi cá rô phi, cá sẽ xử lý các chất hữu cơ lơ

lửng có trong nước làm cho nước sạch lần một. Sau 7 ngày nước từ ao cá chuyển
sang ao rong, rong sẽ hấp thụ các chất vi lượng làm cho nước sạch lần 2 để
cung cấp cho hồ nuôi tơm. Đây là qui trình ni hạn chế sử dung hóa chất và
thuốc thú y và khép kín nguồn nước.
Mơ hình hai: Ao ni có sử dụng cá rơ phi trực tiếp: Cắm các ô nuôi cá
rô phi trực tiếp trong các ao nuôi tôm. Các chất hữu cơ lơ lửng của thức ăn tôm
dư thừa sẽ được quạt nước đẩy vào làm thức ăn cho cá. Ngoài ra lượng phân
thải tư cá thuận lợi cho sự phát triển của hệ vi sinh vật có ích.
Ngồi ra, tại Việt Nam cũng đã ứng dụng nhiều hệ thống xử lý khác như
dùng sò huyết tại Đầm Dới - Cà Mau hay sử dụng rong sụn tại Nha Trang.
1.3.2.1. Ứng dụng vi sinh vật trong xử lý nước thải ao nuôi [9]
Vi sinh vật có đặc điểm là sử dụng các chất hữu cơ và một số chất khoáng
làm nguồn dinh dưỡng và tạo năng lượng, sinh trưởng và nhờ vậy sinh khối của
chúng tăng lên. Các vi sinh vật này được sử dụng phân hủy các chất ô nhiễm
hữu cơ và vơ cơ có trong chất thải từ ni trồng thủy sản [22]. Quá trình phân
hủy này được gọi là quá trình phân hủy oxy hóa sinh hóa.
Vi khuẩn hữu ích đóng vai trị quan trọng trong ni trồng thủy sản, đặc
biệt là liên quan đến sản xuất sơ cấp, phân hủy chất hữu cơ, cải thiện chất lượng
nước trong ao. Ngồi ra vi sinh vật cịn chuyển hóa các chất độc như ammonia


12

và nhiều hợp chất nitơ khác [7]. Trong thủy vực, các vật chất hữu cơ không
ngừng bị phân hủy bởi các vi sinh vật vì chúng cần các hợp chất này để làm
thức ăn. Các chất hữu cơ được chúng hấp thụ làm tiền chất cho việc xây dựng
cấu trúc cơ thể và tạo năng lượng cho các hoạt động sống. Khi ấy, hợp chất hữu
cơ được vi sinh vật biến đổi thành các chất nghèo năng lượng và cuối cùng
trong những điều kiện thích hợp thì chuyển hóa ngược lại thành các chất vô cơ
ban đầu được gọi là q trình vơ cơ hố. Q trình này sẽ tái tạo trở lại vịng

tuần hồn trong thủy vực, tạo nên sự sinh trưởng mới của thực vật. Nếu khơng
có vi sinh vật phân hủy hữu cơ thì tồn bộ q trình chuyển hóa vật chất trong
thủy vực sẽ ngừng lại và sự sống sẽ không tồn tại được [8], [27].
Trong thành phần nước thải sau vụ nuôi, những hợp chất của Nitơ chiếm
tỷ lệ lớn. Nếu không xử lý kịp thời sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến môi trường, con
người và ảnh hưởng đến vụ nuôi tiếp theo [5], [28]. Chủng vk Pseudomonas có
khả năng phân giải khơng những các hợp chất hữu cơ mà đặc biệt là các hợp
chất vơ cơ chứa nitơ trong cả điều kiện kỵ khí và hiếu khí cho nên có thể xem
là có triển vọng trong việc ứng dụng giải quyết vấn đề môi trường này [21].
1.3.2.2. Vi khuẩn Pseudomonas [36]
- Phân loại khoa học
Ngành : Proteobacteria
Lớp : Gammaproteobacteria
Bộ
Họ

: Pseudomonadales
: Pseudomonadaceae
Chi

: Pseudomonas

- Đặc điểm và một số hoạt tính
Pseudomonas là một chi vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường.
Sự biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống
trong nhiều mơi trường khác nhau như đất, nước, trên cây hay cả trong các loài
động vật khác [5].


13

Đặc điểm hình thái chung cho Pseudomonas là gram âm, tế bào hình que,
di động nhờ roi ở đâu và khơng có bào tử [36].
Chi Pseudomonas là một trong những chi đa dạng và có ý nghĩa sinh thái
lớn trên trái đất, và giữ vai trị trong chu trình cacbon và nitrogen. Chúng có thể
khống hóa nhiều chất ơ nhiễm nguồn gốc hữu cơ và vô cơ trong điều kiện hiếu
khí lẫn kỵ khí. Đặc biệt chúng có khả năng loại bỏ nitrogen trong mơi trường
nước, nhất là oxy hóa ammonia rất nhanh [4], [5], [21].
Các chủng Pseudomonas được chọn lọc có đặc điểm hấp thu carbon cao
hơn nhiều so với những chủng thường được bắt gặp trong một hệ thống xử lý
nước thải. Thường khi sự hấp thụ carbon của chúng cao hơn (vì chúng có thể
tấn cơng một loạt các hóa chất hữu cơ), thì sự hấp thụ của nitơ tương ứng cũng
cao hơn [21], [32].
Pseudomonas có khả năng sử dụng nitrite cũng như nitrate cho mục đích
tăng trưởng nếu ammonia khơng cịn có sẵn trong hệ thống. Sự tăng trưởng vi
sinh với sản phẩm BCP655 cho kết quả trong việc loại bỏ nitơ từ nước thải, chứ
không phải là một sự chuyển đổi ammonia thành nitrate (NO3) hoặc nitrite
(NO2) [19], [33].
Quá trình phân hủy được nghiên cứu cụ thể như sau: các hợp chất chứa
hợp chất Nitơ có trong nước thải sẽ bị phân giải rất nhanh bởi các enzyme. Các
enzyme này là các enzyme ngoại bào, được tổng hợp trong tế bào và sau đó
thốt ra ngồi [7]. Q trình phân giải protein ngoại bào khơng có ý nghĩa năng
lượng nhưng có ý nghĩa về vật liệu xây dựng đối với Pseudomonas. Do đó
khơng thấy hiện tượng tăng nhiệt. Quá trình phân hủy các hợp chất
hydratcacbon tạo ra năng lượng rất lớn khi đó mơi trường sẽ thấy nhiệt độ tăng
theo q trình chuyển hóa. Trong trường hợp này tinh bột sẽ chuyển hóa thành
đường sau đó đường sẽ thấm vào bên trong tế bào vi khuẩn và tiếp tục quá trình
đường phân và tham gia vào quá trình tổng hợp vật chất cho cơ thể. Bên cạnh

14

đó Pseudomonas cịn có q trình oxi hóa khử do hệ enzyme nội bào xúc tác,
sản phẩm cuối cùng là CO2 và nước [7], [8], [27].
1.2.3.3. Qui trình chuyển hóa
Hợp chất Nitơ trong nước thải có nồng độ khác nhau trong từng loại nước
thải, chủ yếu nằm ở dạng ammonia hay các hợp chất hữu cơ dạng tan hoặc
không tan [28].
Nước thải chưa qua xử lý hoặc qua xử lý yếm khí chứa nitrate, nitrite với
nồng độ rất thấp. Một phần hợp chất hữu cơ không tan được tách ra khỏi nguồn
nước thải qua quá trình lắng sơ bộ. Trong q trình xử lý yếm khí phần lớn nitơ
ở dạng hợp chất không tan được chuyển ammonia hoặc các dạng vô cơ tan
(NO3- , NO2-). Một phần hợp chất chứa nitơ được vi sinh vật hấp thụ để xây
dựng tế bào, thành phần hợp chất nitơ trong nước thải khi qua xử lý bậc hai là
nitrate [19], [34].
Tiến hành oxy hóa ammonia, khử nitrate trong hệ thống xử lý nước thải
khi có mặt chất hữu cơ phân hủy sinh học là tổ hợp các q trình hiếu khí, thiếu
khí chi phối, khơng những bị chi phối bởi chính các q trình trên mà cịn bị
chi phối mạnh bởi sự có mặt của vi sinh vật dị dưỡng hiếu khí (oxy hóa BOD),
vi sinh vật dị dưỡng tùy nghi (khử nitrate) trong cùng một hệ. Mỗi quá trình
được thực hiện trong những điều kiện khơng giống nhau [19], [25].
Chu trình nitơ là một trong những mơ hình tuần hồn vơ hình và quan
trọng nhất đối với môi trường thủy sinh. Tôm cá và các động vật thủy sinh trong
quá trình sinh sống chúng bài tiết ra NH3, nếu ở nồng độ cao NH3 sẽ gây độc.
Chu trình nitơ, trong đó có q trình amon hóa và q trình nitrate hóa diễn ra
nhờ vào hoạt động của các vi khuẩn có ích giúp chuyển hóa các chất độc thành
những chất có ích cho đời sống của thực vật thủy sinh và giúp các động vật
thủy sinh không bị độc từ chất thải do chúng bài tiết ra.
Chu trình diễn ra các quá trình như q trình amon hóa, khử nitrite,
nitrate, phản nitrite, nitrate hóa [19].

15

Amon hóa là q trình phân hủy và chuyển hố các hợp chất hữu cơ phức
tạp thành NH3 dưới tác dụng cuả vi sinh vật. Dưới tác dụng của enzyme phân
hủy protein (enzyme proteolytic, thường gọi là enzym proteaza) làm chất xúc
tác sẽ phân hủy protein thành các chất đơn giản hơn, các chất này tiếp tục được
phân giải thành acid amin nhờ tác dụng của enzyme peptidaza ngoại bào. Một
phần nhỏ acid amin sẽ được vi sinh vật sử dụng để tổng hợp thành protein của
chúng (protein xây dựng cấu trúc cơ thể của vi sinh vật), phần còn lại được tiếp
tục phân giải tạo ra NH3, CO2, SO42- (nếu các acid amin có chứa S) và các sản
phẩm trung gian khác [19], [27]. Trong nước, NH3 sẽ được chuyển hóa thành
NH4+ theo phản ứng sau:
NH3 + H2O  NH4+ + OHSau amon hóa, NH4+ được oxy hóa để tạo thành NO2- theo phương trình:
NH4- +1,5O2  NO2- + 2H+ + H2O
NO2- tiếp tục được oxi hóa thành NO3- theo phương trình:
NO2- + 0,5O2  NO3Quá trình phản nitrat hố: Q trình phản nitrat hố cịn gọi là q trình
khử nitrat. Đây là quá trình ngược lại với quá trình nitrat hố. Vi khuẩn tham
gia thực hiện q trình này được gọi là vi khuẩn phản nitrat hoá. Quá trình phản
nitrat hố là q trình chuyển hố NO3- thành N2 nhờ vi sinh vật [19].
1.4. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về ứng dụng chủng vi khuẩn
Pseudomonas nhằm xử lý nước thải
1.4.1. Các nghiên cứu nước ngoài
Các nhà khoa học Thái Lan đã nghiên cứu sử dụng chủng Pseudomonas
trong việc xử lý nước thải ô nhiễm dầu mỡ cao, đặc biệt là nước thải nhà máy
dầu cọ và nhà máy bánh kẹo. Tác giả Orapin Bhumibhamon (2002) đã báo cáo
nghiên cứu ứng dụng Pseudomonas trong hệ thống xử lý, trong đó COD giảm
đáng kể [12], [21].

16

Theo nghiên cứu của Meltem Sarioglu (2004), tác giả chỉ ra rằng sử
d ụng chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong xử lý nước thải có thể
làm giảm hàm lượng phospho đi khoảng 20% [21].
1.4.2. Các nghiên cứu trong nước
Nguyễn Quốc Việt và cs (2004) đã nghiên cứu thành công chủng vi
khuẩn Pseudomonas KC31 để xử lý nước thải ô nhiễm dầu mỏ. Tiến sỹ Trần
Đình Mẫn (tạp chí cơng nghiệp số 7 năm 2004) cũng đã cho biết vi khuẩn
Pseudomonas có khả năng áp dụng để xử lý các hợp chất thơm mạch vòng
trong nước thải của nhà máy dệt nhuộm [21], [25].
Tại đại học Cần Thơ, nhóm tác giả Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Thị
Hoàng Nam đã nghiên cứu ứng dụng vk Pseudomonas stutzeri nhằm loại bỏ
ammonia trong nước thải từ rác hữu cơ. Kết quả cho thấy chủng vi khuẩn đã
chọn có khả năng giảm hàm lượng ammona đáng kể [5].
Ngồi ra cịn có những nghiên cứu khác về khả năng xử lý ammonium
của vi khuẩn Pseudomonas stutzeri, như Ths. Phan Trường Khanh đã nghiên
cứu phân lập và ứng dụng chủng vi khuẩn để xử lý ammonium trong qui mơ
phịng thí nghiệm. Kết quả chỉ ra tất cả các dòng VK Pseudomonas stutzeri
đều khử được NH4+. Dòng P8 có thể khử được NH4+ qua các giai đoạn NH4+
 NO3  NO2 NO  N2O- N2 và cũng có khả năng khử được NH4+ -
NO3  NO2  NH3.