Luận văn tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát khả năng thủy phân bã mía và carboxymethyl Cellulose của vi khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu (Ovis aries)
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.28 MB, 85 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN BÃ MÍA VÀ
CARBOXYMETHYL CELLULOSE CỦA VI KHUẨN
ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ DẠ CỎ CỪU (Ovis aries)
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
ThS. Võ Văn Song Toàn
SINH VIÊN THỰC HIỆN
Phan Thị Mỹ Dung
MSSV:3082499
LỚP:CNSH K34
TS. Trần Nhân Dũng
Cần Thơ, Tháng 5/2012
1
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
SINH VIÊN THỰC HIỆN
ThS. Võ Văn Song Toàn
Phan Thị Mỹ Dung
TS. Trần Nhân Dũng
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
.........................................................................................................................
Cần Thơ, ngày
tháng
năm 2012
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp
2
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
LỜI CẢM TẠ
š› & •œ
Đề tài luận văn được hồn thành khơng chỉ với q trình làm việc, học tập và nghiên
cứu của tơi, mà cịn có sự quan tâm giúp đỡ của rất nhiều người. Tôi xin ghi nhớ và gửi
lời cảm ơn chân thành đến:
-
Gia đình, đã giúp đỡ tôi về mặt vật chất, và ủng hộ về mặt tinh thần trong suốt q
trình tơi học đại học.
-
Thạc sĩ Võ Văn Song Tồn đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ cho tôi rất nhiều.
-
Tiến sĩ Trần Nhân Dũng, đã quan tâm và cho tôi nhiều lời khuyên bổ ích để thực
hiện tốt đề tài.
-
Các thầy cơ và anh chị cán bộ ở các phịng thí nghiệm Vi sinh Vật, thực phẩm…
đã tạo điều kiên và giúp đỡ tơi trong suốt q trình học việc và làm đề tài.
-
Các anh chị lớp Cơng nghệ Sinh học khóa 32TT và 33 đã tận tình chỉ dẫn tơi giúp
tơi nắm được những kiến thức căn bản trong phịng thí nghiệm.
-
Các bạn và các em sinh viên trong Viện đã giúp đỡ tơi trong q trình thực hiện đề
tài.
-
Thầy cơ đã tận tình truyền dạy những kiến thức trong suốt quá trình học tập của
tơi, để tơi có thể nắm vững và vận dụng tốt trong quá trình thực hiện đề tài cũng
như trong công việc sau này.
Xin chân thành cảm ơn tất cả!
¶¶¶
3
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
TÓM LƯỢC
Đề tài “Khảo sát khả năng thủy phân bã mía và carboxymethyl cellulose của vi
khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu” được tiến hành nhằm khảo sát và tuyển chọn các
dòng vi khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu có khả năng thủy phân mạnh cơ chất bã
mía và CMC trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Kết quả phân lập được 46 dịng vi
khuẩn trên cơ chất bã mía, trong đó có 21 dịng vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí và
25 dịng vi khuẩn trong điều kiện kỵ khí, kết quả khảo sát đường kính thủy phân cho
thấy 4 dịng vi khuẩn CD 22, CD 26, CD 11 và CD 15 có khả năng thủy phân mạnh cơ
chất CMC và cơ chất bã mía. Đặc biệt, dịng vi khuẩn hiếu khí CD 22 có hiệu suất
thủy phân CMC và bã mía sau 5 ngày cao nhất trong nhóm hiếu khí, lần lượt là
21,581%, 9, 3147%, dịng vi khuẩn kỵ khí CD 11 có hiệu suất thủy phân CMC và
dịng CD 15 có hiệu suất thủy phân bã mía cao nhất lần lượt là 30,049% và 8,8867%.
Tiến hành định danh bằng phương pháp sinh hóa các dòng vi khuẩn tuyển chọn, cho
thấy, dòng CD 22 tương đồng ở mức 99% với dòng vi khuẩn Pediococcus pentosaceus
và dòng CD 26 tương đồng ở mức 73% với dịng Clavibacter agropygi
(Corynebacterium).
Từ khóa: Clavibacter agropygi (Corynebacterium), Pediococcus pentosaceus, dạ cỏ
cừu, thủy phân cellulose,...
i
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT ........................................................................................................
LỜI CẢM TẠ ................................................................................................................
TÓM LƯỢC ................................................................................................................. i
MỤC LỤC ................................................................................................................... ii
DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................. v
DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................. vi
CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................................... viii
CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU ........................................................................................ 1
1.1.
Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1
1.2.
Mục tiêu đề tài..................................................................................................... 2
CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................................. 3
2.1. Tổng quan về cellulose, CMC, bã mía ................................................................. 3
2.1.1. Cellulose .................................................................................................. 3
2.1.2. CMC......................................................................................................... 5
2.1.3. Bã mía ...................................................................................................... 6
2.2. Hệ enzyme cellulase ............................................................................................. 7
2.2.1. Phân loại.................................................................................................. 7
2.2.2. Cơ chế tác động thủy phân cellulose ....................................................... 9
2.2.3. Nguồn enzyme cellulase .......................................................................... 9
2.2.4. Ứng dụng enzyme cellulase .................................................................. 10
2.3. Tổng quan về dạ cỏ cừu ...................................................................................... 10
2.3.1.
Cấu tạo chung dạ cỏ cừu ....................................................................... 10
2.3.2.
Vi sinh vật phân hủy cellulose trong dạ cỏ .......................................... 12
2.4. Các phương pháp vi sinh ..................................................................................... 13
2.4.1. Phân lập vi khuẩn....................................................................................... 13
2.4.2. Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập ......................................... 13
2.4.3. Phương pháp kiểm tra catalase .................................................................. 14
2.4.4. Phương pháp xác định đường kính vịng trịn thủy phân .......................... 15
ii
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
2.5. Tình hình nghiên cứu ......................................................................................... 15
2.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ......................................................... 15
2.5.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ...................................................... 16
CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 17
3.1. Địa điểm, thời gian, hóa chất, phương tiện nghiên cứu ...................................... 17
3.1.1.
Địa điểm, thời gian, hóa chất và thiết bị ............................................... 17
3.1.2.
Vật liệu thí nghiệm .............................................................................. 18
3.1.2.1.
Bã mía ....................................................................................... 18
3.1.2.2.
Dạ cỏ cừu ................................................................................... 18
3.1.3.
Thành phần mơi trường nuôi cấy vi sinh vật ........................................ 18
3.1.3.1.
Môi trường đặc Delafield (2002) cải tiến .................................. 18
3.1.3.2.
Môi trường lỏng Delafield (2002) cải tiến ................................ 19
3.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 19
3.2.1.
Thí nghiệm 1: Khảo sát thành phần bã mía .......................................... 19
a. Khảo sát hàm lượng cellulose bột bã mía........................................... 19
b. Khảo sát hàm ẩm trong bã mía .......................................................... 20
c. Khảo sát hàm lượng tro tổng số trong bột bã mía ............................. 20
3.2.2.
Thí nghiệm 2: Phân lập vi khuẩn từ dạ cỏ cừu ..................................... 21
3.2.3.
Thí nghiệm 3: Khảo sát hoạt tính thủy phân CMC................................ 22
3.2.4.
Thí nghiệm 4: Khảo sát hoạt tính thủy phân bã mía.............................. 22
3.2.5.
Thí nghiệm 5: Khảo sát hiệu suất thủy phân CMC ............................... 23
3.2.6.
Thí nghiệm 6: Khảo sát hiệu suất thủy phân bã mía.............................. 23
3.2.7.
Thí nghiệm 7: Định danh vi khuẩn ........................................................ 24
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 25
4.1.
Kết quả khảo sát thành phần bã mía ................................................................ 25
4.2.
Kết quả phân lập vi khuẩn từ dạ cỏ cừu............................................................ 27
4.2.1. Kết quả mô tả đặc điểm khuẩn lạc............................................................ 27
4.2.2. Kết quả mô tả đặc điểm vi khuẩn ............................................................. 30
4.3.
Kết quả khảo sát sơ bộ hoạt tính vi khuẩn trên môi trường cơ chất CMC ....... 33
4.4.
Kết quả khảo sát sơ bộ hoạt tính vi khuẩn trên mơi trường cơ chất bã mía ..... 36
iii
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
4.5.
Kết quả khảo sát hiệu suất thủy phân cơ chất CMC của một số dòng
vi khuẩn được tuyển chọn ................................................................................. 39
4.6.
Kết quả khảo sát hiệu suất thủy phân cơ chất bã mía của một số dịng
vi khuẩn được tuyển chọn ................................................................................. 41
4.7.
Kết quả định danh một số dòng vi khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp
định danh sinh hóa ............................................................................................ 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 47
PHỤ LỤC
iv
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1: Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu phổ biến................. 4
Bảng 2: Môi trường đặc Delafield (2002) cải tiến (M1).............................................. 18
Bảng 3: Môi trường lỏng Delafield (2002) cải tiến (M2) ............................................ 19
Bảng 4: Bảng bố trí thí nghiệm 3 ................................................................................. 22
Bảng 5: Bảng bố trí thí nghiệm 4 ................................................................................. 23
Bảng 6: Kết quả khảo sát thành phần bã mía sau xử lý ............................................... 25
Bảng 7: Kết quả phân lập vi khuẩn hiếu khí từ dạ cỏ cừu ........................................... 27
Bảng 8: Kết quả phân lập vi khuẩn kỵ khí từ dạ cỏ cừu .............................................. 27
Bảng 9: Kết quả mơ tả đặc điểm hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí.................... 28
Bảng 10: Kết quả mơ tả đặc điểm hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn kỵ khí .................... 29
Bảng 11: Kết quả mơ tả một số đặc điểm vi khuẩn hiếu khí ....................................... 30
Bảng 12: Kết quả mô tả một số đặc điểm vi khuẩn kỵ khí .......................................... 32
Bảng 13: Hiệu suất thủy phân các dịng vi khuẩn tuyển chọn định danh .................... 43
Bảng 14: Tóm tắt giai đoạn nhuộm Gram vi khuẩn ......................................... phụ lục 1
Bảng 15: Kết quả khảo sát thành phần ẩm độ và khống của bã mía
ngun liệu ....................................................................................... phụ lục 2
Bảng 16: Kết quả phân tích xơ bã mía.............................................................. phụ lục 2
Bảng 17: Kết quả đường kính thủy phân trên CMC của vi khuẩn hiếu khí ..... phụ lục 2
Bảng 18: Kết quả đường kính thủy phân trên CMC của vi khuẩn kỵ khí ........ phụ lục 2
Bảng 19: Kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân bã mía của vi khuẩn
hiếu khí ............................................................................................. phụ lục 2
Bảng 20: Kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân bã mía của vi khuẩn kỵ khí.... phụ lục 2
Bảng 21: Kết quả đo độ nhớt của dịch ni vi khuẩn kỵ khí sau 5 ngày ......... phụ lục 2
Bảng 22: Kết quả đo độ nhớt của dịch ni vi khuẩn hiếu khí sau 5 ngày....... phụ lục 2
Bảng 23: Kết quả phần trăm CMC cịn lại trong dịch ni vi khuẩn
hiếu khí ............................................................................................ phụ lục 2
Bảng 24: Kết quả phần trăm CMC còn lại trong dịch ni vi khuẩn kỵ khí .... phụ lục 2
Bảng 25: Hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn kỵ khí ................................ phụ lục 2
v
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Bảng 26: Hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn hiếu khí.............................. phụ lục 2
Bảng 27: Số liệu khảo sát hiệu suất thủy phân bã mía các dịng vi khuẩn
tuyển chọn ........................................................................................ phụ lục 2
Bảng 28: Kết quả phân tích thống kê đường kính vịng trịn thủy phân
của vi khuẩn hiếu khí trên cơ chất CMC............................................. phụ lục 3
Bảng 29: Kết quả phân tích thống kê đường kính vịng trịn thủy phân của
vi khuẩn kỵ khí trên cơ chất CMC .................................................................... phụ lục 3
Bảng 30: Kết quả phân tích thống kê đường kính vịng trịn thủy phân của
vi khuẩn hiếu khí trên cơ chất bã mía ............................................................... phụ lục 3
Bảng 31: Kết quả phân tích thống kê đường kính vịng trịn thủy phân của
vi khuẩn kỵ khí trên cơ chất bã mía .................................................... phụ lục 3
Bảng 32: Kết quả thống kê hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn hiếu khí .. phụ lục 3
Bảng 33: Kết quả thống kê hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn kỵ khí..... phụ lục 3
Bảng 34: Kết quả phân tích thống kê hiệu suất thủy phân bã mía của vi khuẩn
hiếu khí sau 5 ngày.............................................................................. phụ lục 3
Bảng 35: Kết quả phân tích thống kê hiệu suất thủy phân bã mía của vi khuẩn
kỵ khí sau 5 ngày................................................................................. phụ lục 3
vi
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1: Cấu trúc cellulose.............................................................................................. 3
Hình 2: Cấu trúc CMC ................................................................................................... 6
Hình 3: Cấu trúc nhóm enzyme cellulase ...................................................................... 7
Hình 4: Tác dụng của từng enzyme trong hệ enzyme cellulase ở vi sinh vật
hiếu khí (A) và vi khuẩn kỵ khí (B) ................................................................. 8
Hình 5: Cấu trúc dạ dày cừu ........................................................................................ 11
Hình 6: Một số thiết bị sử dụng ................................................................................... 17
Hình 7: Bã mía thơ và bột bã mía trước và sau xử lý .................................................. 26
Hình 8: Khuẩn lạc dòng vi khuẩn CD 22 và CD 28 .................................................... 28
Hình 9: Hình chụp nhuộm Gram một số dịng vi khuẩn.............................................. 31
Hình 10: Hoạt tính thủy phân CMC của nhóm vi khuẩn hiếu khí ............................... 34
Hình 11: Đường kính thủy phân trên cơ chất CMC của dòng CD 20 và CD 26 ......... 35
Hình 12: Hoạt tính thủy phân CMC của nhóm vi khuẩn kỵ khí .................................. 35
Hình 13: Đường kính thủy phân trên cơ chất CMC của dịng CD 23 và CD 37 ......... 36
Hình 14: Hoạt tính thủy phân bã mía của nhóm vi khuẩn hiếu khí ........................... 36
Hình 15: Hoạt tính thủy phân bã mía của nhóm vi khuẩn kỵ khí ................................ 37
Hình 16: Hoạt tính thủy phân bã mía của một số dịng vi khuẩn................................. 38
Hình 17: Hiệu suất thủy phân CMC của các dòng vi khuẩn hiếu khí tuyển chọn ....... 39
Hình 18: Hiệu suất thủy phân CMC của các dịng vi khuẩn kỵ khí tuyển chọn.......... 40
Hình 19:Hiệu suất thủy phân cơ chất bã mía của một số dịng vi khuẩn kỵ khí
được tuyển chọn ............................................................................................. 41
Hình 20: Hiệu suất thủy phân cơ chất bã mía của một số dịng vi khuẩn hiếu khí
được tuyển chọn ............................................................................................. 42
Hình 21: Kết quả định danh sinh hóa dịng vi khuẩn CD 22 ....................................... 44
Hình 22: Kết quả định danh sinh hóa dịng vi khuẩn CD 26 ....................................... 45
Hình 23: Phương pháp pha lỗng mẫu.............................................................. phụ lục 1
Hình 24: Đường chuẩn phần trăm CMC theo độ nhớt của môi trường ............ phụ lục 2
vii
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
viii
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
CÁC TỪ VIẾT TẮT
nm: nanomete
CMC: carboxymethyl cellulose
m: meter
mm: milimete
g: gram
FAO: Food anh Agriculture Organization
ml:mililite
EM: Effective Microorganisms
UV: Untra violet
Đktp: đường kính thủy phân
đvC: đơn vị cacbon
CFU: colony forming unit
VSV : vi sinh vật
ix
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012
CHƯƠNG I.
1.1.
Trường ĐHCT
GIỚI THIỆU
Đặt vấn đề
Tình hình ơ nhiễm mơi trường đang là vấn đề nóng trên các diễn đàn trong
nước và thế giới. Trong các nguyên nhân dẫn đến ô nhiễm, thì nguyên nhân do các
chất hữu cơ thực vật dễ xử lý và ít nguy hại nhất. Tuy nhiên, việc làm thế nào để xử lý
nhanh chóng và hiệu quả các chất thải hữu cơ thực vật đồng thời có thể tận dụng sản
phẩm sau xử lý phục vụ cho nền nông nghiệp sạch và năng lượng xanh là vấn đề quan
trọng đối với những nước có nền sản xuất nông nghiệp như nước ta.
Trong tế bào thực vật, cellulose là thành phần chiếm tỉ lệ cao nhất, ở các loại
cây gỗ nói chung, hàm lượng cellulose khoảng 40-50% riêng ở cây bông, hàm lượng
cellulose lên đến 90%. Hàng năm, có đến hàng tỉ tấn cellulose được tích lũy lại trong
đất dưới dạng rác thải hữu cơ thực vật, hoặc do chính thực vật thải ra trong q trình
sinh trưởng phát triển. Nếu lượng cellulose này không được xử lý thì trong thời gian
khơng lâu, tồn bộ nguồn cacbon trong khơng khí sẽ được chuyển hóa thành cellulose.
Tuy nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học rất phức
tạp, tốn kém và gây độc hại cho mơi trường. Trong khi đó, việc xử lý các chất thải hữu
cơ chứa cellulose bằng công nghệ sinh học, đặc biệt là sử dụng các enzyme cellulase
ngoại bào từ vi sinh vật (VSV) sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và môi
trường. Mặt khác, việc ứng dụng enzyme cellulase để xử lý các sản phẩm thải thực vật,
đồng thời tạo ra các sản phẩm phụ như thức ăn gia súc, cồn sinh học, biogas… đang là
hướng phát triển tiềm năng của công nghệ sinh học.
Số lượng các loài VSV tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase có trong điều
kiện tự nhiên rất phong phú như nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn… đặc biệt, khu hệ VSV
cộng sinh với các loài động vật ăn cỏ, là đối tượng VSV thủy phân cellulose được chú
ý nhất. Các nhà khoa học đã phân lập được trên 200 loài vi khuẩn có khả năng thủy
phân cellulose từ dạ cỏ các loài động vật nhai lại (Theodorou và France, 1993).
Nhằm phân lập và tuyển chọn những dịng vi khuẩn có hoạt tính cellulase cao ,
đề tài: “Khảo sát khả năng thủy phân bã mía và carboxymethyl cellulose của vi
khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu” được thực hiện, góp phần cung cấp nguồn giống
vi khuẩn phân hủy cellulose có hoạt tính cao để phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
-1-
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012
1.2.
Trường ĐHCT
Mục tiêu đề tài
Phân lập và tuyển chọn được một số dịng vi khuẩn có hoạt tính cellulase cao trên
cơ chất CMC và bã mía.
Chun ngành Cơng nghệ Sinh học
-2-
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012
CHƯƠNG II.
Trường ĐHCT
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.6. Tổng quan về cellulose
2.1.1. Cellulose
Cellulose là một chất xơ khơng hịa tan và là một trong những thành phần chủ
yếu của thành tế bào thực vật, chúng được cấu tạo bởi nhiều gốc β-glucose, liên kết
với nhau nhờ cầu nối β 1,4-glucan có cơng thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay
[C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000.
Hình 1: Cấu trúc cellulose
(Nguồn: />Ngày 15/03/2012 )
Cellulose là glucan khơng phân nhánh, đó chính là sự khác biệt giữa cellulose
và các phân tử carbohydrate phức tạp khác. Các chuỗi cellulose này xếp đối song song
tạo thành các vi sợi cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm. Các vi sợi lại liên kết với
nhau tạo thành vi sợi lớn hay cịn gọi là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi
trong mixen có những khoảng trống lớn. Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa
đầy nước, ở tế bào già thì chứa đầy lignin và hemicellulose.
Khối lượng phân tử cellulose thay đổi khác nhau phụ thuộc vào từng loại thực
vật và tùy phương pháp xác định (khi xác định bằng phương pháp siêu li tâm, người ta
nhận thấy rằng khối lượng phân tử của cellulose ở bơng là 150.000-500.000 đvC cịn ở
gai là 1.840.000 đvC), (Nguyễn Lân Dũng, 2008).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
-3-
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012
Trường ĐHCT
Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết van
Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vơ định hình. Trong vùng
tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn cơng bởi
enzyme cũng như hóa chất. Ngược lại, trong vùng vơ định hình, cellulose liên kết
khơng chặt với nhau nên dễ bị tấn công.
Bảng 1: Thành phần Lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu phổ biến
Nguồn lignocellulose
Cellulose (%)
Hemicellulose (%) Lignin (%)
Thân gỗ cứng
40-55
24-40
18-25
Thân gỗ mềm
45-50
25-35
25-35
Vỏ lạc
25-30
25-30
30-40
Lõi ngô
45
35
15
Giấy
85-99
0
0-15
Vỏ trấu
32.1
24
18
Vỏ trấu của lúa mì
30
50
15
Rác đã phân loại
60
20
20
Lá cây
15-20
80-85
0
Hạt bơng
80-95
5-20
0
Giấy báo
40-55
25-40
18-30
Giấy thải từ bột giấy hóa học
60-70
10-20
5-10
Chất rắn nước thải ban đầu
8-15
-
24-29
Chất thải của lợn
6
28
-
Phân bón gia súc
1,6-4,7
1,4-3,3
2,7-5,7
Cỏ ở bờ biển Bermuda
25
35,7
6,4
Cỏ mềm
45
31,4
12,0
Các loại cỏ (trị số trung bình
cho các loại)
25-40
25-50
10-30
Bã thơ
33,4
30,0
18,9
(Nguồn: Nguyễn Vũ Minh Hạnh, 2011)
Có hai mơ hình cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả vùng tinh thể
và vơ định hình.
- Trong mơ hình Fringed Fibrillar: phân tử cellulose được kéo thẳng và định
hướng theo chiều sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500 Å và xếp xen kẽ với vùng vơ
định hình.
Chun ngành Cơng nghệ Sinh học
-4-
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012
Trường ĐHCT
- Trong mơ hình chuỗi gập: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi. Mỗi đơn
vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000. Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ
vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân. Đối với các đơn vị lặp lại,
hai đầu là vùng vơ định hình, càng vào giữa, tính chất kết tinh càng cao. Trong vùng
vơ định hình, các liên kết β 1,4 - glycoside giữa các monomer bị thay đổi góc liên kết,
ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân tử monomer sắp xếp tạo sự thay đổi 180o cho tồn
mạch. Vùng vơ định hình dễ bị tấn cơng bởi các tác nhân thủy phân hơn vùng tinh thể
vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β 1,4 - glycoside) sẽ làm giảm
độ bền của liên kết, đồng thời vị trí này khơng tạo được liên kết hydro.
Cellulose có cấu trúc rất bền, khơng tan trong nước, chỉ bị trương phồng do hút
nước, và khó bị thủy phân, chỉ bị phân hủy do đun nóng với kềm hay acid hay do các
enzyme gọi chung là cellulase. Người và động vật khơng có enzyme phân hủy
cellulose (cellulase) nên khơng tiêu hóa được cellulose, vì vậy cellulose khơng có giá
trị dinh dưỡng. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy cellulose có thể có vai trị điều
hịa hoạt động của hệ thống tiêu hóa. Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật
nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân hủy
cellulose. Nấm đất cũng có thể phân hủy cellulose. Vì vậy chúng có thể sử dụng
cellulose làm thức ăn.
Trong xác thực vật (nhất là trong thành phần của thân và rễ) thì thành phần hữu
cơ chiếm tỉ lệ cao nhất bao giờ cũng là cellulose. Hàm lượng cellulose trong xác thực
vật thường thay đổi trong khoảng 50-80% (tính theo khối lượng khô), trong sợi bông,
hàm lượng này thường vượt quá 90%. Có người đã tính rằng tổng lượng cellulose trên
Trái Đất là vào khoảng 3500 tỉ tấn. Nếu khơng có q trình phân hủy cellulose thì số
lượng này sẽ tăng lên rất nhanh và chẳng bao lâu, tât cả CO2 trong khơng khí sẽ
chuyển hóa hết thành cellulose, sự sống sẽ không tồn tại được nữa. (Nguyễn Lân
Dũng, 2004)
2.1.2. Carboxymethyl cellulose (CMC)
CMC còn được gọi là carboxymethyl cellulose, là một dẫn suất của cellulose,
được tạo thành từ phản ứng với kiềm và acid chloroacetic có độ nhớt cao và tan trong
nước.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
-5-
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012
Trường ĐHCT
Chế phẩm CMC khác nhau phụ thuộc vào mức độ thay thế gốc hydroxyl bằng
gốc carboxy methyl trong chuỗi cellulose. Thông thường, mức độ thay thế ở khoảng
6-9.5 dẫn xuất trên 1 monomer.
CMC có tác dụng ổn định hệ huyền phù, nên được sử dụng để bảo vệ hệ bùn
trong khai thác mỏ và dầu khí, trong cơng nghiệp dùng CMC để hồ vải. (Hồ Sĩ Tráng,
2003).
Hình 2: Cấu trúc CMC
(Nguồn: ngày 15/03/2012)
2.1.3. Bã mía
Mía, Saccharum officinarum, là lồi thân thảo, cao 1-4m, đường kính có thể tới
40 – 60 mm.
Sau khi ép tách đường, bã mía cịn chứa khoảng 50% ẩm và 1 -2 % đường.
Về thành phần hóa học, bã mía chứa 40 – 50% cellulose, 18 – 23 % lignin và 20
– 25% hemincellulose. (Hồ Sĩ Tráng, 2003)
Các thống kê cho thấy hơn 300 triệu tấn bã mía và củ cải đường được thải ra
mỗi năm, tập trung hầu hết ở các nhà máy đường. Các số liệu của FAO cho thấy
khoảng 1.248 tấn mía được thu hoạch vào năm 1997, trong đó là 25% bã mía ép (312
triệu tấn). Năng lượng của 1 tấn bã mía ép (độ ẩm 50%) là 2,85 GJ/tấn. Đó là chưa kể
các phần thừa (bã bỏ, phần ngọn và lá) và phần thải trong q trình thu hoạch mía. Các
phần này lại chiếm một tiềm năng năng lượng cao hơn cả (55%), thế nhưng hiện nay
phần lớn vẫn chỉ bị đốt bỏ hoặc để phân rã ngồi đồng. Nói cách khác, tiềm năng lớn
này hầu hết vẫn đang bị bỏ phí. Cho đến năm 1999, Châu Á vẫn dẫn đầu về sản lượng
bã mía (131 triệu tấn), sau đó là đến Nam Mỹ (89 triệu tấn). Các nhà máy sản xuất
đường đã có truyền thống tái sử dụng bã mía để đốt tạo hơi nước từ nhiều thế kỷ qua,
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
-6-
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012
Trường ĐHCT
nhưng hiệu suất vẫn còn rất thấp. Cho đến gần đây, do sức ép kinh tế, các nhà máy
đường đã phải tìm các giải pháp khác hoặc cải thiện hiệu suất tái tạo năng lượng, một
số nhà máy thậm chí còn bán điện thừa, đặc biệt là tại Brazil, Ấn Độ, Thái Lan... (Đỗ
Văn Chương và Nguyễn Thị Hồng Anh, 2007).
2.7. Hệ enzyme cellulase
2.7.1.
Phân loại
Hình 3: Cấu trúc nhóm enzyme cellulase
(Nguồn: ngày 15/03/2012)
Liên kết chủ yếu trong cấu trúc của cellulose là β-(1à4) glucoside. Nói chung,
để phá hủy hồn tồn cấu trúc của polysaccharide này cần có các enzyme cellulase với
những tác động đặc trưng riêng biệt.
Cellulase là một phức hệ enzyme gồm:
+ Exocellulase (1,4 β-glucan cellobiohydrolase) (EC.3.2.1.91): cắt từ đầu
không khử của chuỗi polymer cho sản phẩm là các gốc đường đôi cellobiose, không
phân hủy cellulose kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của phân tử, giúp cho
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
-7-
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012
Trường ĐHCT
enzyme endocellulase phân hủy chúng tốt hơn. Ngoài ra exocellulase cịn có các tên
khác như: cellobiohydrolase (CBH), exoglucanase, cellobiosidase, avicellase.
+ Endocellulase (1,4 β-D-glucan 4 glucanohydrolase) (EC.3.2.1.4): phân hủy
liên kết β-1,4 glucoside trong vùng vơ định hình của cellulose thành: cellodextrin,
cellobiose, glucose. Tác động yếu lên vùng cellulose kết tinh. Các tên gọi khác như:
endoglucanase, endo 1,4 β-glucanase, C-cellulase.
+ β-D glucoside glucohydrolase (EC.3.2.1.21): phân hủy các gốc đường đôi
cellobiose thành glucose. Khơng có khả năng phân hủy cellulose ngun thủy. Các tên
gọi khác như: β-glucosidase hay cellobiase. (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Hình 4: Tác dụng của từng enzyme trong hệ enzyme cellulase ở VSV hiếu khí (A)
và vi khuẩn kỵ khí (B)
(Nguồn: Lee R. Lynd, et al. 2002)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
-8-
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012
Trường ĐHCT
2.7.2.
Cơ chế tác động thủy phân cellulose
¶
Cơ chế q trình oxy hóa cellulose ( phân hủy hiếu khí)
Q trình oxy hóa xảy ra bắt đầu bằng sự thủy phân sau đó chuyển hóa thành
CO2 và H2O.
Cơ chế q trình oxy hóa cellulose có thể qua hai giai đoạn:
Giai đoạn thứ nhất: là sự thủy phân cellulose thành cellulobiose dưới tác dụng
của nhóm cellulase. Ngồi ra cịn tạo thành một lượng đường glucose.
Giai đọan thứ hai: là giai đoạn oxy hóa những đường đơn giản. Q trình này có
qua nhiều sản phẩm trung gian loại oxi axit và cuối cùng tạo thành CO2 và H2O
(Nguyễn Đức Lượng, 2004)
¶
Cơ chế của quá trình phân hủy cellulose trong điều kiện kỵ khí
Q trình phân hủy kỵ khí khi các chất cellulose được tiến hành qua hai giai
đọan. Giai đoạn thủy phân cellulose thành glucose và sau đó lên men glucose theo kiểu
lên men butyric. Có hai dạng lên men là lên men dạng hydro và lên men dạng methan.
Theo như Omelanskin thì lên men kiểu methan sản phẩm khi tạo ra bằng nửa
trọng lượng cellulose cịn theo kiểu hydro thì khi tạo ra bằng 1/3. (Nguyễn Đức
Lượng, 2004)
2.7.3.
Nguồn enzyme cellulase
Trong tự nhiên có nhiều loại VSV có khả năng sinh ra các enzyme xúc tác quá
trình phân hủy cellulose. Những VSV này được gọi chung là VSV phân hủy cellulose.
Chúng có nghĩa rất lớn đối với việc thực hiện vịng tuần hồn cacbon trong tự nhiên,
góp phần rất quan trọng trong việc nâng cao độ phì cho đất cũng như vào việc tiêu hóa
thức ăn ở các lồi động vật nhai lại.
Trong điều kiện hiếu khí thì cellulose có thể được phân hủy dưới tác dụng của
nhiều loại VSV hiếu khí (vi khuẩn, niêm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, nấm túi...).
Các loài VSV có khả năng sinh cellulase thuộc về các chi sau: Achromobacter,
Pseudomonas,
Myxococcus,
Cellulomonas,
Cytophaga...
Vibrio,
Fusarium,
Cellviribrio,
Chaetomium,
Bacillus,
Chondromyces,
Aspergillus,
Penicilium,
Trichoderma, Meralius, Fomes.....
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
-9-
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012
Trường ĐHCT
Ngồi các VSV hiếu khí cịn có một số vi khuẩn kỵ khí có khả năng tham gia
tích cực vào q trình phân hủy cellulose. Người ta cịn gọi q trình phân hủy
cellulose kỵ khí là q trình “lên men cellulose”.
Cịn một nhóm VSV đặc biệt nữa có khả năng phân hủy cellulose một cách
mạnh mẽ trong điều kiện kỵ khí hồn tồn, là nhóm VSV phát triển trong dạ cỏ của
trâu bò và các động vật nhai lại khác. Trâu bị sẽ khơng thể nào tiêu hóa được cỏ rơm
rạ nếu khơng có sự cộng sinh với một khu hệ đông đúc các VSV trong dạ cỏ của
chúng. Nhiều nghiên cứu cho thấy trong mỗi ml các chất lấy từ dạ cỏ bị có khoảng 109
– 1010 tế bào vi khuẩn. Sinh khối vi khuẩn chứa đến 5 – 10% so với lượng chất khơ
của tồn bộ chất chứa trong dạ cỏ của trâu bị. Ngồi vi khuẩn ra, trong mỗi ml các
chất lấy từ dạ cỏ cịn có khoảng vài triệu cơ thể động vật nguyên sinh (6 – 10% khối
lượng khô dạ cỏ).
Khu hệ vi khuẩn trong dạ cỏ động vật nhai lại có thể kể đến một vài lồi có khả
năng phân hủy mạnh mẽ nhất là: Ruminococcus flavefeciens, ruminococcus albus,
Ruminobacter
parvum,
Bacteroides
succunogenes,
Butyrivibrio
fibrisolven,
Clostridium cellobioparum, Cillobacterium cellulosolvens.... (Nguyễn Đức Lượng,
2003)
2.7.4.
Một số ứng dụng cellulase
Theo Nguyễn Đức Lượng (2003), cellulase có một số ứng dụng như sau:
- Phá vỡ thành tế bào (cellwall) thực vật để nuôi cấy các tế bào trần, để lai tạo
chúng với nhau nhằm tạo giống thực vật.
- Sản xuất đường glucose thực phẩm, nguyên liệu công nghiệp hoặc nuôi cấy
nấm men gia súc.
- Lên men đường chuyển hóa (tạo thành bởi sự thủy phân cellulose do enzyme)
thành etanol nguyên liệu động cơ đốt trong.
- Tách tinh bột ra khỏi hạt và củ bằng cách dùng các enzyme tách tế bào
- Sản xuất tổ hợp EM trong xử lý rác thải.
2.8. Tổng quan về dạ cỏ cừu
2.8.1.
Cấu tạo chung dạ cỏ cừu
Cừu (Ovis aries) là động vật có vú thuộc họ trâu bị, chúng có cơ quan tiêu hóa
đặc trưng của nhóm động vật nhai lại.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
- 10 -
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012
Trường ĐHCT
Hình 5: Cấu trúc dạ dày cừu
(Nguồn: o/cud.html ngày 25/11/2011)
Trong dạ dày cừu cũng như dạ cỏ của các loài động vật nhai lại, dạ cỏ là túi lớn
nhất, chiếm hầu hết nửa trái của xoang bụng, từ cơ hoành đến xương chậu. Dạ cỏ
chiếm 85 – 90% dung tích dạ dày, 75% dung tích đường tiêu hóa, có tác dụng tích trữ,
nhào lộn và lên men phân hủy thức ăn. Thức ăn sau khi ăn được nuốt xuống dạ cỏ,
phần lớn được lên men bởi hệ VSV cộng sinh ở đây. Chất chứa trong dạ cỏ trung bình
có khoảng 850 – 930g nước/kg, nhưng tồn tại ở hai tầng: tầng lỏng ở dưới chứa nhiều
tiểu phần thức ăn mịn lơ lửng trong đó và phần trên khơ hơn, chứa nhiều thức ăn kích
thước lớn. Ngồi chức năng lên men, dạ cỏ cịn có vai trị hấp thu qua vách dạ cỏ
(cũng như dạ tổ ong và dạ lá sách) vào máu và trở thành nguồn năng lượng cho vật
chủ. Sinh khối VSV cùng với những tiểu phần thức ăn có kích thước nhỏ (<1mm) sẽ đi
xuống dạ múi khế và ruột để được tiêu hóa tiếp bởi men của đường tiêu hóa.
Chất chứa dạ cỏ là một hỗn hợp gồm thức ăn vào, VSV dạ cỏ, các sản phẩm
trao đổi trung gian, nước bọt và các chất chế tiết vào qua vách dạ cỏ. Đây là một hệ
sinh thái rất phức hợp trong đó liên tục có sự tương tác giữa thức ăn, hệ VSV và vật
chủ. Dạ cỏ có mơi trường thuận lợi cho VSV kỵ khí phát triển. Đáp lại, VSV dạ cỏ
đóng góp vai trị rất quan trọng vào q trình tiêu hóa thức ăn của vật chủ.
Ngồi dinh dưỡng, mơi trường dạ cỏ có những đặc điểm thiết yếu cho sự lên
men cuả VSV cộng sinh như sau: độ ẩm cao (85 – 90%), pH trong khoảng 6,4 – 7,0,
nhiệt độ khá ổn định (38 – 42oC), áp suất thẩm thấu ổn định và môi trường kỵ khí
(nồng độ oxi < 1%). Có một cơ chế để đảm bảo duy trì ổn định các điều kiện của môi
trường lên men liên tục này. Nước bọt đổ vào dạ cỏ liên tục giúp duy trì độ ẩm của
môi trường lên men. Muối photphat và cacbonat tiết qua nước bọt có tác dụng đệm
đồng thời với sự hấp thu nhanh chóng axit béo bay hơi và amoniac qua vách dạ cỏ
làm cho pH dịch dạ cỏ ổn định. Khí oxi nuốt vào thức ăn nhanh chóng được sử dụng,
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
- 11 -
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012
Trường ĐHCT
nên mơi trường kỵ khí ln ln được duy trì. Áp suất thẩm thấu dạ cỏ được duy trì
tương tự như áp suất thẩm thấu của máu nhờ có sự trao đổi ion qua vách của dạ cỏ.
Các chất khí (chủ yếu là CO2 và CH4) là phụ phẩm trao đổi cuối cùng của quá trình lên
men dạ cỏ cũng được thải ra ngồi thơng qua q trình ợ hơi. Thời gian thức ăn lưu
trong dạ cỏ kéo dài tạo điều kiện cho VSV công phá. (Nguyễn Xuân Trạch et al. 2008)
2.8.2.
Vi sinh vật phân hủy cellulose trong dạ cỏ
Hệ VSV cộng sinh trong dạ cỏ và dạ tổ ong rất phức tạp và thường gọi chung là
vi sinh vật dạ cỏ. Hệ VSV dạ cỏ gồm có 3 nhóm chính là vi khuẩn (Bacteria), động
vật nguyên sinh (Protozoa) và nấm (Fungi); ngồi ta cịn có mycoplasma, các loại
virus và thể thực khuẩn khơng đóng vai trị quan trọng trong tiêu hóa thức ăn. Quần
thể VSV dạ cỏ có sự biến đổi theo thời gian và phụ thuộc vào tính chất của khẩu phần
ăn. Hệ VSV dạ cỏ đều là VSV kỵ khí và sống chủ yếu bằng năng lượng sinh ra từ quá
trình lên men các chất dinh dưỡng.
Vi khuẩn xuất hiện trong dạ cỏ loài nhai lại trong lứa tuổi cịn non, mặc dù
chúng được ni cách biệt cùng với cha mẹ chúng. Thông thường vi khuẩn chiếm số
lượng lớn nhất trong VSV dạ cỏ và là tác nhân chính trong q trình tiêu hóa chất xơ.
Tính từ năm 1941 là năm Hungate cơng bố những cơng trình nghiên cứu đầu tiên về
VSV dạ cỏ đến nay đã có tới 200 lồi VSV dạ cỏ được mơ tả (Theodorou và France,
1993). Tổng số vi khuẩn có trong dạ cỏ thường vào khoảng 109-1010 tế bào/g chất chứa
dạ cỏ. Trong dạ cỏ vi khuẩn ở thể tự do chiếm khoản 25-%, số còn lại bám vào các
mẫu thức ăn, trú ngụ ở các nếp gấp biểu mô và bám vào protozoa.
Sự phân loại vi khuẩn dạ cỏ có thể tiến hành dựa vào cơ chất mà vi khuẩn sử
dụng hay sản phẩm lên men cuối cùng của chúng. Vi khuẩn phân hủy cellulose: đây là
nhóm có số lượng rất lớn trong dạ cỏ của những loài gia súc sử dụng khẩu phần giàu
cellulose. Những loài vi khuẩn phân hủy cellulose quan trọng nhất là Bacteroides
succinogenes, Butyrivibrio fibrisolven, Ruminoccocus flavefaciens, Ruminococcus
albus, Cillobacterium cellulosolvens. (Nguyễn Xuân Trạch et al. 2008)
2.9. Các phương pháp vi sinh
2.4.1. Phân lập vi khuẩn
Phân lập VSV là q trình tách riêng các lồi VSV từ quần thể ban đầu và đưa
về dạng thuần khiết.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
- 12 -
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012
Trường ĐHCT
Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng
vi sinh vật.
Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật đươc tạo ra từ 1 tế bào ban
đầu.
Trong thiên nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn
tại ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau. Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý,
lý hố hoặc sử dụng vào thực tiễn một lồi nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng
thuần khiết.
Nguyên tắc: Tách rời các tế bào VSV; Nuôi cấy các tế bào trên trong môi
trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau.
¶ Một số phương pháp phân lập vi khuẩn phân hủy cellulose:
Phân lập trên môi trường với nguồn carbon là CMC: Cân 1g mẫu đất trồng lúa
pha loãng với 100ml nước cất khử trùng, lắc 15 phút, sau đó hút 20µl trải đều trên mơi
trường CMC. Ủ môi trường 2 – 3 ngày ở 30oC, tách ròng từng khuẩn lạc thu được
những dòng vi khuẩn riêng biệt. Môi trường CMC gồm 1g (NH4)2SO4, 1g K2HPO4,
0,5g MgSO4.7H2O, 0,001g NaCl, 10g CMC, 2g Agar, thêm nước đến thể tích 1lít và
điều chỉnh pH7.
Phân lập trên mơi trường với nguồn carbon là giấy photocopy: Cân 1g mẫu đất
trồng lúa hoặc dịch dạ cỏ bị pha lỗng với 100ml nước cất khử trùng, lắc 15 phút, hút
20µl dung dịch này trải đều trên mơi trường M, sau đó dùng giấy photocopy (được
khử trùng và cắt trịn có đường kính bằng với đường kính bề mặt đĩa mơi trường) áp
sát trên bề mặt môi trường, ủ môi trường 5-10 ngày ở 30oC cho đến khi khuẩn lạc phát
triển trên bề mặt giấy, tiến hành tách ròng từng khuẩn lạc trên môi trường CMC (Võ
Văn Phước Quệ và Cao Ngọc Điệp, 2011).
2.4.2. Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập
Có nhiều cách kiểm tra:
Ø
Kiểm tra vết cấy:
Quan sát sự sinh trưởng của VSV qua vết cấy trên môi trường đặc.
+ Nếu vết cấy có bề mặt và màu sắc đồng đều, thuần nhất chứng tỏ giống mới
phân lập tinh khiết thì giữ lại.
+ Nếu vết cấy khơng thuần nhất thì loại bỏ.
Ø
Kiểm tra lại độ thuần chủng của các loại khuẩn lạc:
+ Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch nghiêng.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
- 13 -
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Viện NC & PT Công nghệ sinh học
