Nghiên cứu tổng hợp hạt nano enzyme glucose oxidase fe3o4 từ tính

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA HÓA HỌC
−−−−−−

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HẠT NANO ENZYME
GLUCOSE OXIDASE – Fe3O4 TỪ TÍNH

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN SƢ PHẠM

Đà Nẵng, tháng 4 năm 2015


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA HÓA HỌC
−−−−−−

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HẠT NANO ENZYME
GLUCOSE OXIDASE – Fe3O4 TỪ TÍNH
(Khóa luận tốt nghiệp cử nhân sư phạm)

Sinh viên thực hiện

: NGÔ LỮ THANH

Lớp

: 11SHH

Giảng viên hƣớng dẫn : TS. NGUYỄN BÁ TRUNG

Đà Nẵng, tháng 4 năm 2015


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐHSP
KHOA HĨA
−−−−−−

CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
−−−−−−

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên
Lớp
1. Tên đề tài

: NGÔ LỮ THANH
: 11SHH
: Nghiên cứu tổng hợp hạt nano enzyme glucose – Fe3O4
từ tính

2. Nguyên liệu, dụng cụ và thiết bị
 Nguyên liệu

: FeCl2.4H2O, FeCl3.6H2O, dung dịch NH3, dung dịch đệm

photphat, enzyme glucose oxidase, dung dịch glutaraldehyde, dung dịch
glucose 5%.
 Dụng cụ
: Bình tam giác 250ml, cốc thủy tinh 100ml, ống sinh hàn
thẳng, giá sắt, đũa thủy tinh.
 Thiết bị

: Máy khuấy từ gia nhiệt.

3. Nội dung nghiên cứu
 Tổng hợp hạt nano oxit sắt từ
 Cố định enzyme glucose oxidase lên hạt nano oxit sắt từ
 Khảo sát đặc trƣng sản phẩm bằng phƣơng pháp vật lý
 Thử hoạt tính của enzyme cố định.
4. Giáo viên hƣớng dẫn : TS. Nguyễn Bá Trung
5. Ngày giao đề tài
: 27/4/2014
6. Ngày hoàn thành
: 21/4/2015
Giáo viên hƣớng dẫn
(Ký và ghi rõ họ, tên)

Chủ nhiệm Khoa
(Ký và ghi rõ họ, tên)

Sinh viên đã hoàn thành và nộp báo cáo cho Khoa ngày…...tháng..…năm......
Kết quả điểm đánh giá:
Ngày…..tháng..…năm......

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(Ký và ghi rõ họ tên)


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt bốn năm học tập và rèn luyện dƣới giảng đƣờng Trƣờng Đại học Sƣ
phạm – ĐHĐN, với lòng yêu nghề, sự tận tâm, hết lòng truyền đạt của thầy cơ, tơi
đã tích lũy đƣợc nhiều kiến thức cũng nhƣ các kỹ năng cần thiết trong cuộc sống.
Lời đầu tiên, tơi xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn đến TS. Nguyễn Bá Trung đã
tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện để tơi hồn thành tốt khóa luận này.
Tiếp theo, tơi xin cảm ơn các thầy, cơ khoa Hóa học đã tạo điều kiện thuận lợi,
động viên, giúp đỡ tơi trong thời gian làm khóa luận.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn tất cả bạn bè, những ngƣời đã quan tâm, giúp đỡ tơi
trong q trình học tập cũng nhƣ đã giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp.
Nguồn kiến thức là vơ tận và thời gian thực hiện khóa luận cịn hạn chế nên
trong q trình thực hiện sẽ khơng tránh khỏi thiếu xót, tơi xin chân thành cảm ơn
những góp ý vơ cùng quý giá và chân thành của Quý Thầy Cô.
Đà Nẵng, ngày 21 tháng 4 năm 2015
Sinh viên thực hiện

Ngô Lữ Thanh


MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU .............................................................................................................4
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................5
1.1. Tổng quan về hạt nano oxit sắt từ (Fe3O4-NPs) ............................................5
1.1.1. Các phƣơng pháp điều chế hạt nano Fe3O4 ...............................................5
1.1.2. Các ứng dụng của hạt nano Fe3O4 .............................................................8
1.2. Tổng quan về enzyme glucose oxidase ..........................................................14

1.2.1. Giới thiệu về enzyme glucose oxidase ....................................................14
1.2.2. Ứng dụng của GOx ..................................................................................17
1.3. Tổng quan về enzyme cố định ........................................................................18
1.3.1. Định nghĩa[7].............................................................................................18
1.3.2. Đặc điểm của enzyme cố định[7] ..............................................................19
1.3.3. Ƣu – nhƣợc điểm của enzyme cố định[7] .................................................20
1.3.4. Phƣơng pháp cố định enzyme ..................................................................20
1.3.5. Ứng dụng của enzyme cố định ................................................................27
Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..................................................32
2.1. Hóa chất nghiên cứu .......................................................................................32
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................32
2.2.1. Điều chế hạt nano oxit sắt từ (Fe3O4 – NPs)............................................32
2.2.2. Phân tích các đặc trƣng vật lý của hạt nano oxit sắt từ ............................33
2.2.3. Cố định enzyme glucose oxidase (GOx) lên hạt nano oxit sắt từ ............33
2.2.4. Phân tích các đặc trƣng của hạt nano GOx – Fe3O4 ................................34
2.2.5. Đánh giá hoạt tính của enzyme cố định ...................................................34

1


2.2.6. Sơ đồ quy trình thực hiện.........................................................................35
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................36
3.1. Tổng hợp hạt nano oxit sắt từ .........................................................................36
3.2. Cố định enzyme GOx lên hạt nano oxit sắt từ................................................36
3.2. Kết quả phân tích các đặc trƣng vật lý của hạt nano oxit sắt từ và hạt nano
GOx – Fe3O4 ..........................................................................................................37
3.2.1. Ảnh chụp bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) ..........................37
3.2.2. Kết quả phổ nhiễu xạ tia X (XRD) ..........................................................38
3.2.3. Kết quả đo đƣờng cong từ hóa .................................................................39
3.2.4. Phổ hồng ngoại FT – IR ...........................................................................40

3.5. Đánh giá hoạt tính enzyme cố định ................................................................41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................42
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................43

2


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Ngun tắc phân tách tế bào bằng từ trường .............................................9
Hình 1.2: Ngun lí dẫn truyền thuốc dùng hạt nano từ tính ...................................11
Hình 1.3: Cấu trúc khơng giang của GOx ................................................................15
Hình 1.4: Cấu trúc phân nửa FAD và trung tâm hoạt động chính của GOx thu nhận
từ Penicillium amagaskinense ...................................................................................15
Hình 1.5: Sơ đồ hấp phụ enzyme lên chất mang khơng có và có điện tích ...............21
Hình 1.6: Cố định enzyme bằng cách nhốt enzyme trong chất mang .......................21
Hình 1.7: Tạo liên kết giữa enzyme và chất mang ....................................................21
Hình 1.8: Cố định bằng cách tạo liên kết ngang với các enzyme .............................21
Hình 1.9: Nhốt enzyme trong gel ..............................................................................23
Hình 1.10: Nhốt enzyme trong sợi có lỗ nhỏ.............................................................23
Hình 1.11: Nhốt enzyme trong sợi mảnh...................................................................23
Hình 1.12: Quy trình nhốt enzyme trong microcapsule ............................................24
Hình 3.1: (a) Dung dịch hỗn hợp 2 muối Fe3+ và Fe2+ và (b) Dung dịch sau khi cho
tác dụng với ddNH3 ..................................................................................................36
Hình 3.2: Kết quả chụp TEM của các hạt nano oxit sắt từ .......................................37
Hình 3.3: Kết quả đo đường cong từ hóa .................................................................39
Hình 3.4: Kết quả phổ hồng ngoại FT – IR: (a) Fe3O4 và (b) GOx–Fe3O4 ..............40

3

LỜI MỞ ĐẦU
Trong vài thập kỷ trở lại đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ
sinh học, các chế phẩm enzyme đƣợc sản xuất ngày càng nhiều và đƣợc sử dụng
hầu hết trong các lĩnh vực kinh tế. Enzyme đã dần từng bƣớc làm thay đổi và nâng
cao hiệu quả của một số q trình cơng nghệ trong chế biến thực phẩm, nông
nghiệp, chăn nuôi, y tế…đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của xã hội.
Enzyme glucose oxidase (GOx), nằm trong nhóm các enzyme xúc tác cho q
trình oxy hóa - khử, đƣợc chiết xuất từ nấm mốc Aspergillus niger, xúc tác cho q
trình oxy hóa glucose thành axit gluconic với sự tham gia của oxy nhƣ chất oxy hóa,
đồng thời giải phóng H2O2.
GOx đƣợc biết đến từ những năm 1950, đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc xác
định hàm lƣợng glucose tự do trong dịch cơ thể, trong nguyên liệu thực vật và trong
công nghiệp thực phẩm. Ngày nay, GOx còn đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực
khác nhau: y dƣợc, hóa học lâm sàn, cơng nghiệp dệt, công nghệ sinh học,…
Sử dụng enzyme tự do có một số hạn chế nhƣ: giá thành cao, độ ổn định
thấp,… nên cố định enzyme lên một vật liệu hỗ trợ là một cách hợp lý. Các hạt nano
của kim loại Co, Ni, Fe có từ tính cao hơn oxit kim loại nhƣng chúng có độ hoạt
động và tính độc hại cao, không phù hợp cho các ứng dụng trong y sinh. Các hạt
nano sắt từ có tính oxi hóa ổn định, khả năng tƣơng thích trong hệ khơng nƣớc,
không độc hại. Cố định enzyme GOx lên các hạt nano sắt từ có nhiều thuận lợi đáng
chú ý: dễ dàng tách enzyme ra khỏi dung dịch phản ứng bằng từ trƣờng, có thể tái
sử dụng enzyme trong thời gian lâu hơn, ….
Nghiên cứu về enzyme nano từ tính là một hƣớng mới, cho đến nay ở nƣớc ta
chƣa có nhiều cơng trình nghiên cứu về quy trình cố định enzyme GOx lên các hạt
nano oxit sắt từ. Chính vì vậy, tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp hạt nano
enzyme Glucose oxidase – Fe3O4 từ tính”.

4

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về hạt nano oxit sắt từ (Fe3O4-NPs)
Cuối thập niên 80, công nghệ nano bắt đầu phát triển và thu đƣợc những thành
tựu to lớn khơng chỉ trong nghiên cứu mà cịn ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Việc
ứng dụng các hạt nano oxit sắt siêu thuận từ vào chẩn đoán và trị bệnh có nhiều
thành quả và triển vọng cao. Hai loại oxit sắt dùng nhiều trong y sinh học là
maghemite (Fe2O3 –γ) và magnetite (Fe3O4). Trong đó, magnetite là vật liệu đƣợc sử
dụng phổ biến hơn.[12]
Fe3O4 là oxit hỗn hợp FeO.Fe2O3 có cấu trúc spinel nghịch, thuộc nhóm ceramic
từ, đƣợc gọi là ferit (cơng thức chung là MO.Fe2O3, trong đó M có thể là Fe, Co,
Mn, Ni,…).[5] Khi ở kích thƣớc nano, chúng đƣợc xem là các hạt đơmen và có tính
siêu thuận từ. Các hạt siêu thuận từ này đã mở ra tiềm năng lớn cho các ứng dụng
trong y sinh: làm tác nhân tăng độ tƣơng phản trong máy cộng hƣởng từ hạt nhân,
phân tách và chọn lọc tế bào, hiệu ứng đốt nhiệt và phân phát thuốc,…[12]
1.1.1. Các phương pháp điều chế hạt nano Fe3O4
Hạt nano có thể điều chế theo 2 nguyên tắc:
 Vật liệu khối đƣợc nghiền nhỏ đến kích thƣớc nano (top – down) gồm các
phƣơng pháp nghiền, biến dạng nhƣ nghiền hành tinh, nghiền rung.
 Hình thành hạt nano từ các nguyên tử (bottom – up) gồm phƣơng pháp vật lý
(phún xạ, bốc bay,…) và phƣơng pháp hóa học (đồng kết tủa từ dung dịch và kết
tủa từ khí hơi,…).[5]
1.1.1.1. Phương pháp nghiền
Phƣơng pháp nghiền đƣợc phát triển từ rất sớm để chế tạo hạt nano từ tính dùng
cho các ứng dụng vật lý nhƣ truyền động từ mơi trƣờng khơng khí vào buồng chân
không, làm chất dẫn nhiệt trong các toa áp suất cao,… Trong những nghiên cứu đầu
tiên về vật liệu từ, vật liệu từ tính oxit sắt Fe3O4, đƣợc nghiền cùng với chất hoạt
hóa bề mặt (axit Oleic) và dung mơi (dầu, hexane). Chất hoạt hóa bề mặt giúp cho

5

quá trình nghiền đƣợc dễ dàng và đồng thời tránh các hạt kết tụ với nhau. Sau khi
nghiền, sản phẩm phải trải qua một quá trình phân tách hạt rất phức tạp để có đƣợc
các hạt tƣơng đối đồng nhất. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là đơn giản và tạo đƣợc
vật liệu với khối lƣợng lớn. Việc thay đổi chất hoạt động bề mặt và dung môi không
làm ảnh hƣởng nhiều đến quá trình điều chế. Tuy nhiên, phƣơng pháp này tạo ra các
hạt nano có tính đồng nhất khơng cao vì khó có thể khống chế q trình hình thành
hạt nano.[11]
1.1.1.2. Phương pháp đồng kết tủa
Đây là phƣơng pháp thƣờng dùng để tạo ra các hạt oxit sắt. Có 2 cách để tạo ra
oxit này đó là hydroxit sắt bị oxy hóa một phần bằng một chất oxy hóa nào đó và
già hóa hỗn hợp dung dịch có tỷ phần hợp phức Fe2+ và Fe3+ trong dung môi nƣớc.
Phƣơng pháp thứ nhất có thể thu đƣợc hạt nano có kích thƣớc từ 30nm – 100nm.
Phƣơng pháp thứ 2 có thể tạo hạt nano có kích thƣớc từ 4nm – 15nm. Bằng cách
thay đổi độ pH và nồng độ các ion trong dung dịch mà ngƣời ta có thể thu đƣợc hạt
nano với kích thƣớc mong muốn đồng thời làm thay đổi điện tích bề mặt của hạt đã
hình thành.
Cơ chế tổng hợp hạt nano Fe3O4 nhƣ sau: với tỷ lệ hợp phần Fe3+/Fe2+ = 2, trong
mơi trƣờng có pH = 9 – 14 và điều kiện thiếu oxy
Fe3+ + H2O  Fe(OH)x3-x (thơng qua q trình mất proton)
Fe2+ + H2O  Fe(OH)y2-y (thơng qua q trình mất proton)
Fe(OH)x3-x + Fe(OH)y2-y Fe3O4
(thơng qua q trình dehydrat hóa, pH > 9, nhiệt độ khoảng 60oC).
Tổng hợp các phƣơng trình trên ta có phƣơng trình sau:
Fe3+ + Fe2+ + OH- Fe3O4 + H2O
Mặc dù phƣơng pháp đồng kết tủa là phƣơng pháp đơn giản nhƣng khi các hạt
nano hình thành chúng kết tụ rất mạnh. Các hạt kết tụ làm hạn chế khả năng ứng

6

dụng tiếp theo, do đó phải địi hỏi có sự biến đổi bề mặt. Sự biến đổi này cho phép
sự có mặt của các chất tƣơng thích sinh học.[11]
1.1.1.3. Phương pháp vi nhũ tương
Vi nhũ tƣơng (microemulsion) cũng là một phƣơng pháp đƣợc dùng khá phổ
biến để tạo hạt nano. Với nhũ tƣơng “nƣớc-trong-dầu”, các giọt dung dịch nƣớc bị
bẫy bởi các phân tử chất hoạt hóa bề mặt trong dầu (các mixen). Đây là một dung
dịch ở trạng thái cân bằng nhiệt động trong suốt, đẳng hƣớng. Do sự giới hạn về
không gian của các phân tử chất hoạt hóa bề mặt, sự hình thành, phát triển các hạt
nano bị hạn chế và tạo nên các hạt nano rất đồng nhất. Kích thƣớc hạt có thể từ 4 –
12nm với độ sai khác khoảng 0.2 - 0.3nm. Ví dụ, dodecyl sulfate sắt, Fe(DS)2, đƣợc
dùng trong phƣơng pháp vi nhũ tƣơng để tạo hạt nano từ tính với kích thƣớc có thể
đƣợc điều khiển bằng nồng độ chất hoạt hóa bề mặt là AOT và nhiệt độ.[4]
1.1.1.4. Phương pháp hóa siêu âm
Phƣơng pháp hóa siêu âm là các phản ứng hóa học đƣợc hỗ trợ bởi sóng siêu âm
cũng đƣợc dùng để tạo hạt nano oxit sắt.
Hạt nano từ tính dựa trên oxit sắt đã đƣợc chế tạo bằng hóa siêu âm. Đây là
phƣơng pháp rất đơn giản để tạo hạt nano từ tính với từ độ bão hịa rất cao. Muối sắt
(II) acetate đƣợc cho vào trong nƣớc cất hai lần rồi cho chiếu xạ siêu âm với công
suất khoảng 200W/2h trong mơi trƣờng bảo vệ. Sóng siêu âm đƣợc tác dụng dƣới
dạng xung để tránh hiện tƣợng quá nhiệt do siêu âm tạo ra. Khi tác dụng siêu âm,
trong dung dịch sẽ xuất hiện các chất có tính khử và tính oxy hóa nhƣ H2, H2O2.
Các sản phẩm trung gian năng lƣợng cao có thể là HO2 (superoxide), hydro nguyên
tử, hydroxyl và điện tử. Các chất này sẽ oxy hóa muối sắt và biến chúng thành
magnetite Fe3O4 . Sau khi phản ứng xảy ra ta thu đƣợc hạt nano Fe3O4 với từ độ bão
hịa có thể đến 80 emu/g, cao gần bằng giá trị của Fe3O4 ở dạng khối.[4]
Khi chiếu xạ siêu âm dung dịch chứa muối sắt (II) acetate thì xuất hiện các phản
ứng sau:
H2O  H· + OH·

7


H· + H ·  H 2
OH· + OH·  H2O2
Fe(CH3COO)2  Fe2+ + 2(CH3COO)Chất oxy hóa mạnh hydrogen peroxide sẽ oxy hóa Fe2+ thành Fe3+ theo phản
ứng sau:
2Fe2+ + H2O2  2Fe3+ + 2OHCác ion Fe2+ và Fe3+ kết hợp với nhau để tạo thành magnetite. Tốc độ hình thành
các gốc hydroxyl đƣợc ƣớc lƣợng là 25 mM/phút dƣới khí Ar. Bằng cách điều khiển
nhiệt độ mà chúng tơi có thể tạo các hạt Fe3O4 với các hình dạng khác nhau.[3]
1.1.1.5. Phương pháp điện hóa
Phƣơng pháp điện hóa cũng đƣợc dùng để chế tạo hạt nano oxit sắt từ
tính. Dung dịch điện hóa là dung dịch hữu cơ. Kích thƣớc của hạt nano từ 3 – 8 nm
đƣợc điều khiển bằng mật độ dòng điện phân. Sự phân tán của các hạt nano nhờ vào
các chất hoạt hóa bề mặt dƣơng. Phƣơng pháp này phức tạp và hiệu suất khơng cao
nhƣ các phƣơng pháp khác nên ít đƣợc nghiên cứu.[4]
1.1.2. Các ứng dụng của hạt nano Fe3O4
1.1.2.1. Ứng dụng trong y sinh
Các ứng dụng của hạt nano từ trong y sinh học đƣợc chia làm hai loại: ứng dụng
ngoài cơ thể và trong cơ thể. Phân tách và chọn lọc tế bào là ứng dụng ngoài cơ thể
nhằm tách những tế bào cần nghiên cứu ra khỏi các tế bào khác. Các ứng dụng
trong cơ thể gồm: dẫn thuốc, nung nóng cục bộ và tăng độ tƣơng phản trong ảnh
cộng hƣởng từ.[8]
a) Phân tách và chọn lọc tế bào
Trong y sinh, ngƣời ta thƣờng tách một loại thực thể sinh học nào đó ra khỏi mơi
trƣờng của chúng để làm tăng nồng độ khi phân tích hoặc cho các mục đích khác.
Phân tách tế bào sử dụng các hạt nano từ tính là phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng.

8

Quá trình phân tách chia làm 2 giai đoạn: đánh dấu thực thể sinh học cần nghiên
cứu và tách các thực thể đƣợc đánh dấu ra ngồi mơi trƣờng bằng từ trƣờng. Việc
đánh dấu đƣợc thực hiện thông qua các hạt nano từ tính, thƣờng dùng là nano oxit
sắt. Các hạt này đƣợc bao phủ bởi một loại hợp chất có tính tƣơng thích sinh học
nhƣ: dextran, polivinyl ancohol,… Các hợp chất bao phủ có thể tạo liên kết với một
vị trí nào đó trên bề mặt tế bào hoặc phân tử mà còn giúp các hạt nano phân tán tốt
hơn trong dung mơi, tăng tính ổn định của chất lỏng từ.[5]
Giống nhƣ trong hệ miễn dịch, vị trí liên kết đặt biệt trên bề mặt tế bào sẽ đƣợc
kháng thể hoặc các phân tử khác nhƣ các hooc-môn, axit folic tìm thấy. Các kháng
thể sẽ liên kết với các kháng nguyên. Đây là cách rất hiệu quả để đánh dấu tế bào.
Các hạt từ tính đƣợc bao phủ bởi chất hoạt hóa tƣơng tự các phân tử trong hệ miễn
dịch để có thể tạo ra các liên kết với các tế bào hồng cầu, tế bào ung thƣ phổi, vi
khuẩn, tế bào ung thƣ đƣờng tiết niệu và thể golgi. Đối với các tế bào lớn, kích thƣớc
của các hạt từ tính cũng cần phải lớn, có thể đạt kích thƣớc vài trăm nano mét.[8]
Q trình phân tách đƣợc thực hiện nhờ một gradient từ trƣờng ngoài. Từ trƣờng
ngoài tạo một lực hút các hạt từ tính mang tế bào đƣợc đánh dấu. Các tế bào không
đƣợc đánh dấu sẽ khơng bị giữ lại và thốt ra ngồi.[5]

Hình 1.1: Nguyên tắc phân tách tế bào bằng từ trường

9


Tách tế bào bằng từ trƣờng đã đƣợc ứng dụng thành công trong y sinh. Đây là
một trƣờng những phƣơng pháp rất nhạy cảm để tách tế bào ung thƣ từ máu, đặc
biệt khi tế bào ung thƣ rất thấp, khó có thể tìm thấy bằng các phƣơng pháp khác.
Ngƣời ta có thể phát hiện ký sinh trùng sốt rét trong máu bằng cách đo từ tính của
ký sinh trùng đánh dấu từ hoặc đánh dấu các tế bào hồng cầu bằng chất lỏng từ tính.
Ngồi ra, trong phản ứng PCR trong sinh học nhằm khuếch đại DNA nào đó, quá

trình làm giàu DNA ban đầu cũng đƣợc thực hiện nhờ các hạt nano từ tính.[8]
b) Dẫn truyền thuốc
Việc dùng các hạt nano từ tính nhƣ là hạt mang thuốc nên nơi cần thiết trên cơ
thể (thông thƣờng dùng để điều trị các khối u ung thƣ) đã đƣợc nghiên cứu từ
những năm 1970, những ứng dụng này đƣợc gọi là dẫn truyền thuốc bằng hạt từ
tính. Phƣơng pháp này có 2 lợi ích cơ bản: (i) thu hẹp phạm vi phân bố thuốc trong
cơ thể nên làm giảm tác dụng phụ của thuốc và (ii) giảm lƣợng thuốc điều trị. Hạt
nano từ tính có tính tƣơng hợp sinh học đƣợc gắn kết với thuốc điều trị. Lúc này hạt
nano có tác dụng nhƣ một hạt mang. Thơng thƣờng hệ thuốc/hạt tạo ra một chất
lỏng từ và đi vào cơ thể thơng qua hệ tuần hồn. Khi các hạt đi vào mạch máu,
ngƣời ta sẽ dùng một gradient từ trƣờng ngoài rất mạnh để tập trung các hạt vào
một vị trí nào đó trên cơ thể. Một khi hệ thuốc/hạt tập trung vào một vị trí cần thiết
thì q trình nhả thuốc có thể diễn ra theo cơ chế hoạt động của enzyme hoặc các
tính chất sinh lý học do tế bào ung thƣ gây ra nhƣ độ pH, quá trình khuếch tán và sự
thay đổi nhiệt độ. Quá trình vật lý trong dẫn truyền thuốc tƣơng tự nhƣ trong phân
tách tế bào. Hiệu quả của dẫn truyền thuốc phụ thuộc vào cƣờng độ từ trƣờng,
gradient từ trƣờng, thể tích và tính chất hạt nano. Các chất mang thƣờng đi vào các
tĩnh mạch hoặc động mạch nên các thông số thủy lực nhƣ thông lƣợng máu, nồng
độ chất lỏng từ, thời gian tuần hồn đóng vai trị quan trọng nhƣ các thông số sinh
lý học nhƣ khoảng cách từ vị trí của thuốc đến nguồn từ trƣờng, mức độ liên kết
thuốc/hạt và thể tích của khối u.[8]

10


Hình 1.2: Ngun lí dẫn truyền thuốc dùng hạt nano từ tính
Các hạt nano từ tính thƣờng dùng là oxit sắt (magnetite Fe3O4, maghemite γFe2O3) bao phủ xung quanh bởi một hợp chất cao phân tử có tính tƣơng hợp sinh
học nhƣ PVA, detran hoặc silica. Chất bao phủ có tác dụng chức năng hóa bề mặt
để có thể liên kết với các phân tử khác nhƣ nhóm chức carboxyl, biotin, avidin,
carbodiimide,… Nghiên cứu dẫn truyền thuốc đã đƣợc thử nghiệm rất thành công

trên động vật, đặc biệt nhất là dùng để điều trị u não. Việc dẫn truyền thuốc đến các
u não rất khó khăn vì thuốc cần phải vƣợt qua hàng rào băng cách giữa não và máu,
nhờ có trợ giúp của hạt nano từ có kích thƣớc 10-20 nm, việc dẫn truyền thuốc có
hiệu quả hơn rất nhiều. Việc áp dụng phƣơng pháp này đối với ngƣời tuy đã có một
số thành cơng, nhƣng cịn rất khiêm tốn.[8]
Ngƣời ta đã thành công trong việc hƣơng thuốc doxorubicin đến tế bào u bƣớu ở
đuôi chuột. Phƣơng pháp này đƣợc mở rộng sang một số loại động vật khác và kết
quả cũng tƣơng tự. Việc ứng dụng phƣơng pháp này trên ngƣời còn nhiều hạn chế
nhƣng các kết quả ban đầu rất khả quan.[8]
c) Tăng nhiệt cục bộ
Phƣơng pháp đốt các tế bào ung thƣ bằng từ trƣờng ngoài mà khơng ảnh hƣởng
đến các tế bào bình thƣờng là một trong những ứng dụng quan trọng khác của hạt
nano từ tính. Một trong những nghiên cứu đầu tiên về đốt nhiệt từ xuất hiện từ năm
1957. Nguyên tắc hoạt động là các hạt nano từ tính có kích thƣớc từ 20-100 nm
đƣợc phân tán trong các mô mong muốn sau đó tác dụng một từ trƣờng xoay chiều
11


với tần số 1.2 MHz bên ngoài đủ lớn về cƣờng độ và tần số để làm cho các hạt nano
hƣởng ứng mà tạo ra nhiệt nung nóng những vùng xung quanh. Nhiệt độ khoảng
42oC trong khoảng 30 phút có thể đủ để giết chết các tế bào ung thƣ trong khi các tế
bào thƣờng vẫn an toàn.[8]
Nghiên cứu về kĩ thuật tăng thân nhiệt cục bộ đƣợc phát triển từ rất lâu và có rất
nhiều cơng trình đề cập đến kĩ thuật này nhƣng chƣa có cơng bố nào thành cơng
trên ngƣời. Khó khăn chủ yếu đó là việc dẫn truyền lƣợng hạt nano phù hợp để tạo
ra đủ nhiệt lƣợng khi có sự có mặt của từ trƣờng ngoài mạnh trong phạm vi điều trị
cho phép. Các yếu tố ảnh hƣởng đến q trình nung nóng cục bộ là lƣu lƣợng máu
và phân bố của các mô.[5]
Vật liệu dùng để làm hạt nano thƣờng là magnetite và maghemite và có thể có
tính sắt từ hoặc siêu thuận từ.[8]

d) Tăng độ tƣơng phản cho cộng hƣởng từ
Hạt nano oxit sắt đƣợc bao phủ dextran có tính tƣơng hợp sinh học và có thể đƣợc
đào thải qua gan sau khi sử dụng. Các hạt nano này đƣợc phát hiện bởi màng lƣới nội
mô của cơ thể. Độ tƣơng phản trong ảnh cộng hƣởng từ hạt nhân dựa trên hiện tƣợng
các mơ khác nhau sẽ hấp thu khác nhau. Ví dụ các hạt nano có đƣờng kính 30 nm có
thể nhanh chóng đi vào gan và tì trong khi những cơ quan khác thì chậm hơn. Nhƣ
vậy, mật độ hạt nano ở các cơ quan là khác nhau, dẫn đến sự nhiễu loạn từ trƣờng địa
phƣơng cũng khác nhau làm tăng độ tƣơng phản trong ảnh cộng hƣởng từ do thời
gian hồi phục bị thay đổi khi đi từ mô này đến mơ khác. Những hạt có kích thƣớc nhỏ
sẽ có thời gian tồn tại trong cơ thể lâu hơn vì màng lƣới nội mơ nhận biết chúng khó
hơn. Các hạt nano nhƣ là một chất tƣơng phản MRI có thể đi đến tủy xƣơng, mạch
máu, hệ thần kinh. Màng lƣới nội mô của các tế bào ung thƣ hoạt động không hiệu
quả nhƣ các tế bào khỏe mạnh thông thƣờng. Do đó, thời gian hồi phục của các
proton trong các tế bào ung không bị ảnh hƣởng nhiều. Dựa trên điều này ngƣời ta
xác định đƣợc các hạch bạch huyết, ung thƣ gan và ung thƣ não.[8]

12


e) Yêu cầu hạt nano từ tính ứng dụng trong y sinh
Hạt nano từ tính ứng dụng trong y sinh phải thỏa mãn 3 điều kiện sau:
 Tính đồng nhất của các hạt cao
 Từ độ bão hòa lớn
 Vật liệu có tính tƣơng thích sinh học (khơng độc hại)
Tính đồng nhất về kích thƣớc và tính chất liên quan nhiều đến phƣơng pháp chế
tạo còn từ độ bão hòa và tính tƣơng thích sinh học liên quan đến bản chất của vật liệu.
Trong tự nhiên, sắt (Fe) có từ độ bão hịa lớn nhất ở nhiệt độ phịng, khơng độc đối
với cơ thể con ngƣời và tính ổn định khi làm việc trong mơi trƣờng khơng khí nên các
vật liệu nhƣ oxit sắt Fe3O4 đƣợc nghiên cứu rất nhiều để làm hạt nano từ tính.[3]
1.1.2.2 Ứng dụng trong mơi trường

Nano từ lỏng đƣợc ứng dụng để xử lý nƣớc bị nhiễm bẩn. Để làm sạch nƣớc bẩn
có nhiều phƣơng pháp vật lý, hóa học. Các phƣơng pháp này thƣờng phức tạp, tốn
kém, mất nhiều thời gian, nhƣng đôi khi hiệu quả không cao, không tách lọc triệt để
các tạp chất trongnƣớc bẩn. Gần đây với việc chế tạo ra chất lỏng từ ferit ứng dụng
để lắng đọng nƣớc bẩn bằng cơ chế tĩnh điện và hấp phụ, có thể làm sạch nƣớc triệt
để,nhanh chóng, hiệu quả.[7]
Mới đây một nhà khoa học Nhật Bản có sáng kiến sử dụng hạt nano từ tính lọc
nƣớc bằng cách cho một lồi vi khuẩn chuyên ăn các chất bẩn lơ lửng trong nƣớc
bẩn có hịa tan thêm các hạt nano từ tính. Bình thƣờng các vi khuẩn có tác dụng thu
gom các chất bẩn. Khi đã ăn no chúng tự chìm xuống đáy (theo tác dụng của trọng
lực) và mang theo các chất bẩn đã thu gom. Do vậy, làm cho nƣớc trở nên trong.
Nếu trong nƣớc có các hạt nano từ tính thì các vi khuẩn sẽ gom vào mình các chất
bẩn thơng thƣờng và cả hạt nano từ tính. Khi đó có thể dùng một nam châm hút các
vi khuẩn này làm cho chúng chìm nhanh hơn và nƣớc sẽ trong nhanh hơn.[8]
Xuất phát từ ý tƣởng đó các nhà khoa học nƣớc ta đã kết hợp sử dụng nano từ
tính Fe3O4 với Al2(SO4)3 để lọc nƣớc. Al2(SO4)3 khi tan trong nƣớc sẽ thủy phân tạo

13


ra tạo ra kết tủa Al(OH)3 dạng keo. Kết tủa này có tác dụng nhƣ một tâm lƣới. Khi
nó lắng đọng thì các chất bẩn mắc vào nó cũng bị kéo theo xuống, kết quả là nƣớc
trong hơn. Khi đã kết hợp hạt nano từ tính Fe3O4 với Al(OH)3, dƣới tác dụng của từ
trƣờng các hạt nano từ tính Fe3O4 bị hút xuống dƣới đồng thời kéo theo tấm lƣới
Al(OH)3 chuyển động theo. Khi đó, Al(OH)3 sẽ lắng động nhanh hơn hàng chục lần
so với khi không dùng hạt nano từ tính.[8]
1.2. Tổng quan về enzyme glucose oxidase
1.2.1. Giới thiệu về enzyme glucose oxidase
Glucose oxidase (GOx) là enzyme xúc tác cho q trình oxi hóa  - D – glucose
thành axit gluconic bằng cách sử dụng oxy làm chất nhận điện tử, đồng thời sinh ra

hydropeoxit (H2O2). Gần đây, enzyme GOx nhận đƣợc sự quan tâm trong việc ứng
dụng rộng rãi trong hóa học, thực phẩm, dƣợc phẩm, hóa học lâm sàng, công nghệ
sinh học và một số lĩnh vực khác. Ứng dụng mới của GOx là sử dụng trong các thiết
bị cảm biến sinh học đã làm tăng nhu cầu về enzyme này trong những năm gần đây.
Hiện nay, quy trình sản xuất, thu nhận, cố định và ứng dụng của GOx đang đƣợc
xem xét và nghiên cứu sâu hơn, mở ra các hƣớng ứng dụng mới của GOx vào các
lĩnh vực khác nhau.[14]
GOx là một phân tử oxy hóa khử. Với trọng lƣợng phân tử 130.000 175.000g/mol. GOx là một protein lƣỡng phân hình thành từ 2 tiểu đơn vị giống
nhau. Mỗi tiểu đơn vị hoặc monomer, cuộn vào trong 2 domain: một domain gắn với
cơ chất,  - D – glucose, trong khi đó domain khác liên kết khơng 6 đồng hóa trị với
một nhân tố phụ, flavin adenine dinucleotide (FAD), mà nó sử dụng nhƣ một tác nhân
oxy hóa mạnh. FAD là một thành phần phổ biến trong các phản ứng oxy hóa khử sinh
học, nó nhận và cho các điện tử từ một phân tử. Trong glucose oxidase, FAD hoạt
động nhƣ một chất nhận điện tử mà làm cho nó bị khử thành FADH2; FADH2 sau đó
bị oxy hóa bởi chất nhận điện tử cuối cùng, phân tử oxy sẽ bị khử thành hydrogen
peroxide (H2O2). Vị trí hoạt động của glucose oxidase chứa 3 amino acid quan trọng
liên quan đến sự xúc tác: His 516 và Glu412 mà liên kết hydro với His559.[10]

14


Hình 1.3: Cấu trúc khơng giang của GOx
Glucose oxidase đƣợc tiết ra bởi nấm mốc, chủ yếu là Aspergillus niger hay
Penicillium amagaskinense. Nó đƣợc phân bố giữa dịch ngoại bào, vách tế bào và
trong chất dịch nhầy của nấm mốc. Q trình tổng hợp gucose oxidase có thể đƣợc
kích thích bởi các chất khác nhau, bao gồm phân tử oxy, mà nó kích thích sự dịch
mã enzyme.[10]

Hình 1.4: Cấu trúc phân nửa FAD và trung tâm hoạt động chính của GOx thu nhận
từ Penicillium amagaskinense

Glucose Oxidase bản thân nó khơng hoạt động, nhƣng với sự hiện diện của
những cơ chất đặc trƣng, enzyme đƣợc sử dụng để oxy hóa trực tiếp phân tử

15


glucose hoặc oxygen. Nhóm ngoại của enzyme này là FAD. Các sản phẩm của phản
ứng này là gluconic acid và hydrogen.
-D-glucose + O2

GOx

D-glucono-1,5-lactone + H2O2

Glucose oxidase có thể oxi hóa -D-glucose sử dụng các chất oxi hóa khác bên
cạnh phân tử oxy, bao gồm các quinine và các chất nhận 1 electron. D-glucono-1,5lactone sau đó tự động thủy phân để tạo ra axit gluconic.
GOx

C6H12O6 + O2 + H2O
Glucose

C6H12O7 + H2O2
Axit gluconic

Phản ứng tối ƣu ở điều kiện nhiệt độ giữa 30 đến 50oC tại pH giữa 4.5 đến 6.5.
Dựa vào hoạt động của enzyme này mà GOx đƣợc ứng dụng chủ yếu trong công
nghiệp thực phẩm, nhƣ khử oxy trong thức uống không cồn nhƣ nƣớc ngọt, hệ
thống bảo quản cá tƣơi, giảm quá trình hƣ hỏng các thực phẩm khô do sự khử oxy,
liên kết với lactoperoxydase để sản sinh ra ion OSCN nhƣ tác nhân kháng vi sinh
vật và dùng trong phép phân tích định lƣợng sinh hóa là đo hàm lƣợng glucose

trong máu.[10]

16


1.2.2. Ứng dụng của GOx
1.2.2.1. Ứng dụng trong thực phẩm và đồ uống
Glucose oxidase đƣợc sử dụng thành công để cắt cầu nối glucose và oxy trong
thực phẩm và thức uống để kéo dài thời gian bảo quản cho thực phẩm và đồ uống.
Hydro peroxit đƣợc sản sinh ra từ enzyme này hoạt động nhƣ một chất diệt vi khuẩn
rất tốt. Ví dụ, glucose đƣợc loại bỏ từ lịng trắng trứng trƣớc khi chúng
đƣợc sấy khô để dùng trong công nghiệp làm bánh sử dụng glucose oxidase /hệ
thống catalase. Glucose oxidase có thể đƣợc sử dụng để loại bỏ oxy ở đầu chai
nƣớc đồ uống trƣớc khi chúng đƣợc đóng chai.[14]
Ngoài ra, glucose oxidase đƣợc sử dụng để ngăn ngừa sự mất màu và mùi trong
thực phẩm và đồ uống. Ví dụ, chúng đƣợc sử dụng để làm giảm sự mất màu xảy ra
trong rƣợu và sốt mayonnaise.[14]
Trong công ngiệp làm rƣợu, glucose oxidase làm giảm độ cồn trong rƣợu thơng
qua việc loại bỏ một số glucose (chuyển nó thành dạng D-glucono-1,5-lactone) nếu
khơng nó sẽ chuyển thành cồn. Hơn nữa glucoseoxidase có thể ngăn chặn sự
hƣ hỏng rƣợu thơng qua tác động diệt vi khuẩn của nó lên vi khuẩn axit acetic và
vi khuẩn axit lacitc trong suốt quá trình lên men. Enzyme này sẽ đƣợc bổ sung
thêm vào rƣợu để tăng hiệu quả diệt vi sinh vật.[14]
1.2.2.2. Ứng dụng xác định hàm lượng glucose trong máu
Những ngƣời bệnh tiểu đƣờng cần phải kiểm tra hàm lƣợng glucose trong máu
thƣờng xuyên để xác định sự dao động của nồng độ glucose có thể tăng hay giảm
trong máu từ đó đƣa ra cách điều trị bệnh hợp lý. Gần đây, thiết bị cảm biến sinh
học (Biosensor) đƣợc phát triển để dùng cho việc đo lƣờng hàm lƣợng glucose, và
glucose oxidase là một trong những enzyme chủ yếu mà biosensor có thể sử dụng.
Sự định lƣợng chính xác hàm lƣợng glucose trong máu thì rất quan trọng trong sự

chuẩn đốn và điều khiển sự tăng và giảm đƣờng huyết.[14]
Phản ứng glucose oxidase kết hợp với một phản ứng phụ đã đƣợc sử dụng rộng
rãi cho việc xác định glucose trong dung dịch sinh học. Nhiều phản ứng bổ trợ khác

17


đƣợc phát triển để cải tiến toàn bộ hệ thống phản ứng đặc trƣng hoặc giữ lại các đặc
tính vốn có của glucose oxidase. Phƣơng pháp sử dụng thuốc thử dựa vào phản ứng
chỉ thị màu của hydroperoxit mà nó kết hợp với 4-aminoantipyrine để tạo một phức
phenolic, phƣơng pháp này đƣợc đề xuất đầu tiên bởi Trinder.[14]
C6H12O6 + O2 + H2O

GOx

Glucose

C6H12O7 + H2O2
Axit gluconic

Peroxidase
H2O2 + HBA + 4-AAP

thuốc nhuộm Quinoneimine + H2O

Phƣơng trình 1: Glucose bị oxy hóa bởi glucose oxidase tạo ra axit gluconic và
hydro peroxit.
Phƣơng trình 2: Hydro peroxit phản ứng với HBA và 4-aminoantipyrine với sự
hiện diện của enzyme Peroxidase hình thành nên 1 quinoneimine bắt màu đỏ.
Cƣờng độ màu tạo thành thì tƣơng ứng với nồng độ glucose và có thể đƣợc đo

lƣờng bằng phƣơng pháp đo mật độ quang ở bƣớc sóng giữa 460-560nm.[14]
Chú thích:
HBA = 4-hydroxybenzoic acid
4-AAP = 4-aminoantipyrine
1.3. Tổng quan về enzyme cố định
1.3.1. Định nghĩa[7]
Enzyme cố định có thể hiểu theo hai nghĩa:
 Nghĩa rộng: Enzyme khơng hịa tan là enzyme đƣợc đƣa vào những pha riêng
rẽ, pha này có thể tách riêng khỏi môi trƣờng dung dịch phản ứng. Pha enzyme khơng
hịa tan trong nƣớc và đƣợc gắn với polime ƣa nƣớc có phân tử khối lớn.
 Nghĩa hẹp: các chất xúc tác cố định là các enzyme, tế bào, có thể sống có thể
tái sử dụng lại. Nhƣ vậy theo nghĩa rộng, enzyme khơng hịa tan bao gồm enzyme
cố định vào chất mang, cả enzyme có trong tế bào sống, chúng đƣợc cố định trong
các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho sử dụng nhiều lần.

18


 Enzyme khơng hịa tan hay enzyme cố định thƣờng là những enzyme hòa tan
đƣợc gắn vào chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Nhờ quá trình gắn này mà
enzyme từ trạng thái hịa tan chuyển sang khơng hịa tan.
1.3.2. Đặc điểm của enzyme cố định[7]
Các enzyme cố định thƣờng có đặc điểm sau:
 Hoạt tính của enzyme cố định thƣờng nhỏ hơn hoạt tính của enzyme tự do
tƣơng ứng. Sự thay đổi các đặc tính của enzyme cố định là do:
 Ảnh hƣởng điện tích chất mang: khi điện tích chất mang có sự khác biệt
với điện tích enzyme thì khi gắn enzyme vào chất mang, cấu trúc khơng gian của
enzyme có sự thay đổi ở mức độ nhất định. Chính vì sự thay đổi cấu trúc này mà sự
kết hợp giữa enzyme và cơ chất kém đi, dẫn đến hoạt tính của chúng cũng giảm.
 Do enzyme bị nhốt vào mạng lƣới hoặc bị liên kết bởi chất mang khiến

cho sự tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất bị kém đi.
 Enzyme cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis – Menten nhƣng có
một số sai khác nhất định:
 Có sự cạnh tranh xảy ra giữa cơ chất với enzyme và chất mang.
 Xảy ra hiện tƣờng cản trở khuếch tán của cơ chất và chất phản ứng làm
giảm tốc độ phản ứng.
 Enzyme cố định thƣờng bền nhiệt hơn enzyme tự do nhờ tác dụng của chất mang.
 Enzyme cố định thƣờng có khoảng pH tối ƣu không trùng với enzyme tự do
cùng loại.
 Enzyme cố định có thể tái sử dụng nhiều lần, dễ dàng tách ra khỏi cơ chất một
cách dễ dàng sau phản ứng và độ bền của enzyme cố định cao hơn enzyme tự do.

19


1.3.3. Ưu – nhược điểm của enzyme cố định[7]
 Ưu điểm:
 Enzyme cố định có thể sử dụng nhiều lần trong thời gian dài.
 Enzyme cố định không lẫn vào sản phẩm cuối của phản ứng nên không gây
ảnh hƣởng xấu đến chất lƣợng sản phẩm và dễ dàng tách ra khỏi sản phẩm, tiết
kiệm chi phí.
 Có thể ngừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách hệ chất mang – enzyme
ra khỏi cơ chất.
 Enzyme cố định tƣơng đối bền với các tác nhân vật lý hay hóa học so với
enzyme tự do.
 Dễ dàng tiến hành theo phƣơng pháp sản xuất liên tục.
 Nhược điểm:
 Sự có mặt của chất mang có thể làm giảm hoạt tính của enzyme.
 Trong một số trƣờng hợp, enzyme có thể bị giảm hoặc mất hoạt tính sau q
trình cố định.

Tuy nhiên, những hạn chế trên không đáng kể so với những lợi ích mà enzyme
mang lại. Do đó, ngày càng có nhiều nghiên cứu về cố định enzyme cũng nhƣ ứng
dụng enzyme vào các lĩnh vực khác nhau.
1.3.4. Phương pháp cố định enzyme
Hiện nay có 4 phƣơng pháp điều chế enzyme cố định dựa trên cơ sở lý hóa học
nhƣ sau:
 Phƣơng pháp hấp thụ vật lý enzyme lên các vật liệu cố định có mang hoặc
khơng mang điện tích.

20


Hình 1.5: Sơ đồ hấp phụ enzyme lên chất mang khơng có và có điện tích
 Phƣơng pháp nhốt enzyme ở bên trong polime tạo thành xung quanh
enzyme, một hệ thống có lỗ nhỏ để khơng cho enzyme đi khỏi màng, nhƣng cũng
đủ lớn để cho cơ chất và chất tạo thành đi qua khỏi màng.

Hình 1.6: Cố định enzyme bằng cách nhốt enzyme trong chất mang
 Phƣơng pháp hóa học: liên kết cộng hóa trị và liên kết ion

Hình 1.7: Tạo liên kết giữa enzyme và chất mang
 Phƣơng pháp khâu mạch.

Hình 1.8: Cố định bằng cách tạo liên kết ngang với các enzyme
21