Bài giảng môn học Nguyên lý và phương pháp chọn giống cây trồng: Chương 5 - TS. Trần Văn Quang

Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

7/18/15

/>5.1. PHƢƠNG PHÁP LAI HỮU TÍNH
5.1.1. Khái niệm

Chƣơng 5
PHƢƠNG PHÁP TẠO BIẾN DỊ DI TRUYỀN
TRONG CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG

“Lai giống là sự giao phối (thụ phấn, thụ tinh) giữa hai hay nhiều
dạng bố mẹ có nền di truyền khác nhau để tạo ra biến dị tái tổ hợp
theo mục tiêu chọn giống ”.
Sự giao phối có thể xảy ra trong tự nhiên (lai tự nhiên) hoặc do
con ngƣời tiến hành (lai nhân tạo) đều tạo ra biến dị tái tổ hợp.
Lai hai bố mẹ có các cặp gen alen khác nhau, không liên kết, một
trong số chúng là trội, phân chia nhiễm sắc thể và giao phối ngẫu
nhiên giữa giao tử đực và giao tử cái, ở thế hệ F1 sẽ có các kiểu gen
mới do tái tổ hợp gen của hai bố mẹ.
Tổng quát để tính số kiểu gen khi lai hai bố mẹ khác nhau n gen,
sẽ có 2n giao tử và số kiểu gen là 3n. Quần thể nhỏ nhất ở F2 cần

thiết để biểu hiện các biến dị là 4n cá thể.

 Phƣơng pháp lai hữu tính tạo giống thƣờng đƣợc ứng dụng đối
với cây trồng có cấu tạo hoa hồn chỉnh.
 Trong phép lai, ngƣời ta sẽ có ký hiệu cây bố (male parent - cây
cho phấn) và cây mẹ (female parent - cây nhận phấn).
 Đối với thực vật có cấu tạo hoa hồn chỉnh gồm đủ cả nhị và
nhuỵ thì cần tiến hành khử đực (emasculation) ở cây mẹ trƣớc

khi tiến hành lai.
 Các lồi cây trồng có sinh sản đặc thù nhƣ: bất dục đực (male
sterility), đơn tính cái (Gynoecious), tự bất hợp (self incompatibility) do yếu tố di truyền gene nhân, tế bào chất hay
do yếu tố mơi trƣờng có thể lợi dụng hiện tƣợng này để giảm
bớt công khử đực, hạt thu đƣợc trên cây mẹ là hạt lai.

5.1.2. Các phƣơng pháp lai hữu tính
a) Lai đơn (single cross)

Lai hữu tính tạo giống đƣợc phân chia thành lai gần và lai xa:
Lai gần là lai giữa hai bố mẹ trong cùng lồi. Ví dụ, lai giữa các
giống trong mỗi loài lúa trồng Oryza sativa L. (châu Á), O.
glaberrima (châu Phi)…
Lai xa là sự giao phối giữa hai bố mẹ khác lồi hay khác lồi phụ.
Ví dụ: lai hai bố mẹ thuộc hai loài phụ lúa Indica x Japonica; lai giữa
loài khoai tây trồng (Solanum tuberosum L.) với loài khoai tây dại
(Solanum demissum) hay lai giữa chi (genus) lúa mỳ (Triticum) với
mạch đen (Secale) tạo ra cây Triticale.

d) Lai đỉnh (topcross)
Dòng 1

AxB
Ký hiệu: A/B (theo IRRI và USDA) hoặc A - B ( theo CIMMYT).

Dòng 2
Tester

b) Lai ba (three-way cross)

(A x B) x C
Ký hiệu A/B//C (theo IRRI và USDA) hoặc A - B x C (theo CIMMYT).

c) Lai kép (double cross)

Dòng 3
*
*
*

(A x B) (C x D)
Ký hiệu A/B//C/D (theo USDA); A/B//C///D (theo IRRI) hoặc A – B x C- D
( theo CIMMYT).

Dòng n

1


Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

7/18/15

/>e) Lai dialen (dialen cross)

g) Lai trở lại (backcross)

A

B

C

D

A

AxA

AxB

AxC

AxD

B

BxA

BxB

BxC

BxD

C

CxA

CxB

CxC

CxD

D

DxA

DxB

DxC

DxD

Griffing (1956) đƣa ra 4 phƣơng pháp lai nhƣ sau:
Phƣơng pháp 1: Lai thuận, lai nghịch và tự phối (bố mẹ) và số tổ hợp lai = p2
Phƣơng pháp 2: Lai một chiều và tự phối (bố mẹ) và số tổ hợp lai = p(p + 1)/2
Phƣơng pháp 3: Lai thuận, lai nghịch, không tự phối và số tổ hợp lai = p(p - 1)
Phƣơng pháp 4: Lai một chiều không tự phối và số tổ hợp lai = p(p - 1)/2

f) Lai thuận nghịch (reciprocal cross)

A♀ x B♂
Lai thuận

B♀ x A♂
Lai nghịch

h) Lai trở lại nhờ marker (Marker-assisted backcrossing- MAB)

MAB có nhiều mức:
Mức thứ nhất: chọn lọc các gen hay QTL điều khiển tính trạng có
lợi, nhƣng tính trạng đó khó đánh giá dựa trên kiểu hình hoặc do
gen lặn điều khiển. Giảm bớt các gen khơng mong muốn liên kết kéo
theo trong q trình lai trở lại.
Mức thứ hai: sử dụng hai marker liên kết hai đầu của locus mục
tiêu để chọn lọc phối hợp, tối thiểu gen kéo theo và yêu cầu quần
thể lớn tùy thuộc vào khoảng cách của hai marker với locus mục
tiêu. Yêu cầu này rất quan trọng khi thể cho (donor) là giống địa
phƣơng.
Mức thứ ba: chọn lọc nền di truyền, sử dụng marker không liên
kết để chọn donor tƣơng phản, lấy lại nhanh genome của bố mẹ
nhận gen. Sử dụng kỹ thuật này có thể tiết kiệm 2, 3 thậm chí 4 thế
hệ lai trở lại.

i) Lai hồi quy (Conservatative cross)

j) Lai nhiều bậc (convergent cross)

Beloturca x Potapca

Alpha x Xaroza

Albidum-24 x Liutexen55/11

Xaratopca-29
Hình 5.7. Sơ đồ lai tạo giống lúa mì Xaratopca-29 (A.P. Sekhudin)

2

7/18/15

Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

/>k) Lai nhiều bố mẹ (multi-parent hybridization)

l) Lai quy tụ gen dựa trên marker phân tử (Marker-Assisted Gene Pyramiding)
Năng suất cao

Thời gian sinh trưởng ngắn

2

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Kháng rầy nâu và bạc lá

Năng suất cao

TGST ngắn
1

1

1

2

2

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Kháng rầy nâu và bạc lá
1

2

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Dòng/ giống mới quy tụ các gen quy định tính trạng mong muốn ở lúa
TGST ngắn – Habataki; Năng suất cao – Habataki; Kháng rầy nâu – ADR52; Kháng bạc lá – O. longistaminata

Lƣu ý: Để tiến hành đƣợc phƣơng pháp này, các nghiên cứu cần tạo ra các
dòng đẳng gen (NIL – nearly isogenic line). Sau đó, các dịng NIL này đƣợc
tiến hành lai với nhau. Chọn lọc sẽ sử dụng các marker liên kết với các gen
mong muốn để chọn.

m) Lai tế bào soma (Somatic hybridization)

5.1.3. Kỹ thuật lai hữu tính
a) Nguyên lý chọn cặp bố mẹ

Các bƣớc lai tế bào soma:

Nguyên lý 1: Chọn cặp bố mẹ dựa trên loại hình sinh thái và xa cách
di truyền

Bƣớc 1: Phân lập tế bào soma từ mô lá của cây con, tinh sạch
Bƣớc 2: Lai tế bào soma và kiểm tra tế bào lai
Bƣớc 3: Tái sinh cây
Bƣớc 4: Đánh giá và chọn lọc các thế hệ sau lai tế bào soma

Nguyên lý 2: Chọn cặp bố mẹ dựa trên khả năng kết hợp
Nguyên lý 3: Chọn cặp bố mẹ dựa trên khả năng chống chịu bệnh
Nguyên lý 4: Chọn cặp bố mẹ dựa trên năng suất và yếu tố tạo
thành năng suất
Nguyên lý 5: Dựa trên chỉ thị phân tử chọn bố mẹ có các tính trạng
mục tiêu.

c) Chuẩn bị cây lai và dụng cụ lai
b) Gieo trồng, chăm sóc vƣờn cây bố mẹ và chọn cây bố mẹ
Các dòng, giống bố mẹ đƣợc trồng ở ruộng riêng, có sơ đồ bố trí
để thuận tiện cho cơng tác chăm sóc cũng nhƣ chọn cây để lai.
Các kỹ thuật nhƣ thời vụ, phân bón, tƣới nƣớc và phịng trừ sâu
bệnh cỏ dại tối ƣu đối với loài cây trồng để cây lai sinh trƣởng
phát triển tốt, cơ quan sinh sản (hoa) phát triển hoàn chỉnh thuận
tiện cho thao tác khử đực và thụ phấn.

Trƣớc khi thực hiện thao tác lai, cây lai cần đƣợc chọn kỹ và chuẩn bị
chu đáo: cắt bỏ các cây không dùng cho lai, dọn sạch lá chết, lá vàng úa,
cắt bỏ các hoa không khử đực là những hoa đã nở đầu, hoa cuối trên bông
và cành hoa.
Ví dụ, cây lúa đƣợc chọn làm vật liệu lai sẽ đƣợc đánh trồng trong chậu,
cắt bỏ các bông thừa chỉ để lại từ 3 - 4 bông, dọn sạch lá chết. Tiến hành
cắt bỏ các hoa đã nở và hoa non chỉ để lại khoảng 15 - 20 hoa thành thục
để khử đực.
Dụng cụ lai cần thiết gồm panh, kéo, thẻ đánh dấu, bao cách li bằng giấy

bóng kính, lọ mầu đen đựng hạt phấn, ghim, bút chì hoặc bút dầu viết
trên bao cách li không bị phai…

Bố trí thời điểm gieo bố và mẹ để bố mẹ nở hoa trùng nhau,
trong trƣờng hợp bố mẹ lệch nhau có thể sử dụng kỹ thuật điều
chỉnh nhƣ ánh sáng, nhiệt độ, hóa chất…

3


7/18/15

d) Khử đực và bao cách li

e) Thụ phấn và đánh dấu
Thu hoa của cây bố tách bao phấn lấy phấn và thụ hoa mẹ đã đƣợc
khử đực.

Có 4 phƣơng pháp sau:

Thu hoa bố trên các cây khỏa mạnh, không sâu bệnh và thời gian thu
khi hoa nở rộ thƣờng vào buổi sáng.

Khử đực bằng tay: áp dụng với cây trồng có hoa đủ lớn, bộ phận
đực và cái trong thời điểm khử đực phân biệt rõ ràng nhƣ lúa, cà
chua, thuốc lá, đậu, vừng…

Một số loài cây phấn hoa dính để tách lấy phấn phải hong khơ nhƣ cà
chua, khoai tây.

Khử đực bằng máy: máy hút chân không đƣợc sử dụng để khử
đực ở lúa.

Những loài cây giao phấn, hoa đơn tính thì có thể thu nhận hạt phấn
vào lọ tối sau đó thụ phấn cho từng hoa.

Khử đực bằng hố chất: các lồi cây có hoa rất nhỏ (kê, rau dền,
hành…). Các hoá chất thƣờng dùng để khử đực có hiệu quả cao là
các hydrazid của axit malic và ester thơm, sodium methyl arsenate,
Maleic hydrazide, NAA, IAA, FW450, Ethrel, RH531, MSMA, ZMA.

Dùng panh gắp bao phấn đƣa lên đầu nhụy của hoa mẹ đã khử đực
bóp nhẹ để bao phấn vỡ tung phấn lên đầu nhụy, dùng bút lông chấm
vào cốc phấn rồi chấm lên đầu nhụy, đƣa phấn lên ngón tay hoặc vật
phẳng rồi vít đầu nhụy chấm vào phấn bố…
Quá trình thụ phấn cần lặp lại vài lần để đảm bảo thụ phấn thành
công.

Khử đực bằng nƣớc nóng: Nhiệt độ và thời gian khử đực tuỳ
thuộc vào loài cây trồng (lúa sử dụng nhiệt độ 430C trong 5 phút;
lúa miến sử dụng nhiệt độ 47 - 480C trong 10 phút).

f) Chăm sóc và thu hoạch hạt lai
Sau khi lai, cây lai phải đƣợc theo dõi thƣờng xuyên để ngăn
chặn kịp thời côn trùng và động vật phá hoại quả và hạt lai.
Cây yếu cần đƣợc bón thêm phân kali hydrophotphat (KH2PO4)
Hình 5.13. Bao cách
ly và ghi thông tin
sau khi thụ phấn
trong lai tạo giống

lúa

để hạt lai đƣợc chắc, sức sống cao.
Hạt lai đã chín cần thu hoạch kịp thời, phơi khô vào bảo quản
tránh mất sứ nảy mầm.
Hạt lai bảo quản trong các túi ghi đầy đủ thông tin, cất trữ trong
nhiệt độ thấp và khô để sử dụng trong giai đoạn tiếp theo của quá
trình chọn tạo giống.

5.1.4. Lai xa
a) Một số ứng dụng của lai xa
Tạo ra loài mới: kết quả lai xa giữa lúa mì và lúa mạch đen, lƣỡng
bội hố nhiễm sắc thể của con lai F1 đã tạo ra loài mới triticale.
Chọn tạo giống cây trồng mới

Trƣờng hợp 2: Con lai không kết hạt (thu đƣợc hạt lai F1 nhƣng
con lai F1 bất thụ)
Nguyên nhân:
Do bố mẹ sai khác quá lớn về di truyền và sinh lý;

Tạo biến dị mới, những tính trạng, đặc điểm mới mà dạng bố mẹ
chƣa có.

Hệ thống sinh sản của con lai bị phá vỡ.

Tạo giống kháng bệnh và kháng sâu vào cây trồng

Biện pháp khắc phục:

Tạo giống cây trồng chống chịu với điều kiện bất thuận phi sinh

học

Kéo dài thời gian sinh trƣởng của con lai;

Tạo giống lai có ƣu thế lai cao

Kỹ thuật canh tác và chăm sóc phù hợp;

Tạo dịng đơn bội, tạo con lai tế bào và đa dạng các loại bất dục tế
bào chất…

Xử lý đa bội thể.

4


7/18/15

b) Những khó khăn khi lai xa và biện pháp khắc phục
Trƣờng hợp 1: Cây lai không kết hạt
Nguyên nhân do:
Môi trƣờng trên đầu nhụy hoa của cây mẹ không phù hợp cho hạt phấn
nảy mầm.
Ống phấn ngắn không thực hiện đƣợc quá trình thụ tinh hoặc khả năng
xuyên của ống phấn phát triển chậm dẫn đến khi thụ tinh trứng đã mất sức
sống.
Sai khác quá lớn về di truyền khơng hình thành đƣợc hợp tử, phơi hoặc
hình thành phơi nhƣng không phát triển hoặc tiêu biến.

5.2. ĐỘT BIẾN TẠO BIẾN DỊ DI TRUYỀN

5.2.1. Khái niệm và ý nghĩa
Đột biến là thuật ngữ chỉ sự thay đổi về vật chất di truyền của tế bào
(gene và nhiễm sắc thể).
Theo định nghĩa trong từ điển thuật ngữ khoa học cây trồng là sự
thay đổi di truyền trong vật chất di truyền của tế bào, ở mức lớn hơn
là phá vỡ hoặc sắp xếp lại bộ nhiễm sắc thể, đột biến có thể di truyền
lại cho con cái ở các thế hệ sau.
Hugo de Vries (1980) đƣa ra “Học thuyết đột biến” bao gồm những
nội dung chính có ý nghĩa sau:
(i)Đột biến xảy ra đột ngột, không qua bƣớc trung gian nào;

Biện pháp khắc phục:

(ii)Các dạng đột biến mới xuất hiện có thể hoàn toàn ổn định, bền vững;

Thụ phấn bổ sung

(iii)Đột biến tạo nên những biến đổi rời rạc, không tập trung;

Lai trung gian

(iv)Đột biến xảy ra ngẫu nhiên, có thể có lợi hoặc có hại;

Cứu phơi

(v)Sự xuất hiện đột biến phụ thuộc vào số lƣợng cá thể;
(vi)Một đột biến có thể lặp lại nhiều lần.

Bảng 5.1. Đột biến tạo giống thành công trên một số cây trồng ở Brazil
Cây trồng

Thuốc lá

Đặc điểm và tính trạng cải tiến
Kháng virus; khắc phục khó khăn khi lai xa khác lồi

Cam qt Kiểu cây gọn, chín tuần tự, khơng hạt
Đậu co ve Hàm lƣợng protein cao hơn; màu vở hạt mới, tập tính
sinh trƣởng, kháng virus khảm vàng đậu
Chuối

Giảm chiều cao cây, chịu mặn

Hoa cúc

Màu sắc hoa mới, thấp cây, nhiều canh hoa hơn

Lúa mỳ

Kháng rỉ sắt thân; rỉ sắt lá; thân mềm; chín sớm; thấp
cây; chống chịu chua phèn

Lúa

Thời gian chín ngắn; chín sớm; thấp cây; cải tiến chất
lƣợng hạt
Đậu tƣơng Lá hẹp, lá rộng, nhiều màu sắc, hạt to, chín sớm...
Cà chua

Quả ôvan; màu quả xanh đậm, chín chậm, giảm kích
thƣớc cây, tăng độ Brix và giảm độ Brix...

Ý nghĩa của đột biến:
Tạo ra nguồn biến dị di truyền phong phú cho chọn giống. Đặc
biệt là những tính trạng mong muốn mà nguồn biến dị tự nhiên
khơng có.
Có khả năng tạo ra giống mới, nhanh, ổn định, khơng phân ly, có
nhiều đặc tính, tính trạng q nhƣ chín sớm, khơng cảm quang
(tám thơm đột biến), năng suất cao, chống chịu sâu bệnh, tăng
hàm lƣợng protein, lipid, glucid trong sản phẩm; các dòng bất dục
đực dùng trong tạo giống ƣu thế lai…
Có thể tạo ra các biến dị mới cho một số loài cây trồng sinh sản
bằng con đƣờng vơ tính hay nhóm cây sinh sản vơ tính nhƣ đột
biến khảm đƣợc ứng dụng trong tạo giống hoa cây cảnh.
Làm mất đi mối liên kết cũ, xây dựng mối liên kết mới dẫn đến
làm tăng khả năng tổ hợp của gen.

5.2.2. Phân loại đột biến
Hạn chế của đột biến:
Tạo biến dị không định hƣớng;

a) Đột biến ở mức phân tử ADN
Đột biến làm thay đổi cấu trúc phân tử ADN đƣợc gọi là “đột
biển điểm” hay “đột biến gen” ở nhiều mức khác nhau:

Khơng xác định đƣợc vị trí, số lƣợng gene đột biến;

Đột biến điểm (Point Mutation) là đột biến làm thay đổi một cặp
cơ bản trên phân tử ADN, thay một nucleotide này bằng một
nucleotide khác.

Phần lớn các đột biến là những biến dị có hại, tỉ lệ biến dị
có lợi thấp (10-6).

Đột biến mất đoạn (Deletion mutation) là đột biến làm mất một
hay nhiều hơn các nucleotide trên gen hoạch nhiễm sắc thể.

Ngày nay, cơng nghệ gene có thể khắc phục đƣợc những
khó khăn này.

Đột biến chèn đoạn (Insertion mutation) là đột biến lồng thêm
ít nhất một nucleotide và chuỗi ADN.
Ngồi ra cịn có các đột biến tạo ra gen chức năng hoặc khơng
có chức năng, đột biến gây ra sắp xếp ADN trở dạng hoang dại
của chúng, đột biến phá vỡ gen quyết định dẫn đến gây chết cơ
quan sông đang phát triển…

5


7/18/15

c. Đột biến thể khảm (Chimaras):
b) Đột biến ở mức độ nhiễm sắc thể:
Bao gồm thay đổi cấu trúc NST và số lƣợng NST
Đột biến thiếu đoạn, đảo đoạn, đổi đoạn, lặp đoạn.

Theo R. Daniel Lineberger: “Một cây đƣợc gọi là đột biến thể
khảm khi các tế bào có trên một kiểu gen đƣợc tìm thấy ở các mơ
sinh trƣởng liền kề nhau của cây”.
Các cây có đốm màu khác nhau có thể là dạng chung nhất để

nhận biết đột biến thể khảm.

Dạng đột biến này đƣợc gọi là “đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể”.

Thể khảm có ý nghĩa quan trọng trong chọn tạo giống cây sinh
sản vơ tính, cây hoa, cây cảnh.

Mức độ thay đổi số lƣợng nhiễm sắc thể nhƣ tăng hay giảm số
lƣợng nhiễm sắc thể tạo ra các thể đa bội, đơn bội hay lệch bội.

Phân loại đột biến thể khảm: Đột biến thể khảm ra ở đỉnh sinh
trƣởng phát triển ở các lớp khác nhau và phân thành 3 loại khảm
chính là:

Dạng đột biến này đƣợc gọi là “đột biến số lƣợng nhiễm sắc thể”.

Khảm từng phần
Khảm quạt
Khảm vòng.

5.2.3. Các tác nhân gây đột biến

a) Tác nhân vật lý
Tác nhân

Đặc điểm
Bƣớc sóng ngắn λ = 0,05 - 10Å, sức đâm xuyên mạnh từ
vài mm đến vài cm
Bƣớc sóng rất ngắn λ < 0,05Å, sức xuyên mạnh hơn tia X
nhƣng không mang điện nên chỉ có tác dụng điện ly gián

Tia Gamma (γ)
tiếp nhờ hiệu ứng quang điện. Trong sinh học thƣờng sử
dụng tia γ là đồng vị phóng xạ Co60 và Ce137
Neutron
Tạo ra từ lò phản ứng nhiệt hạch, rất nguy hiểm, mức đâm
(nhanh, chậm,
xuyên mạnh.
nhiệt)
Đƣợc hình thành từ hạt nhân của nguyên tử helium (He),
Tia alpha (α) gồm 2 proton và 2 nơtron. tia α có khả năng xun sâu
0,07mm trong mơ sinh vật.
Bƣớc sóng 200 – 400nm (nanomet). Photon của tia UV có
năng lƣợng thấp, khơng xun sâu nên khơng tác động
đến tế bào nằm sâu trong cơ thể sinh vật nhƣng có tác
Tia tử ngoại UV
dụng khi xử lý hạt phấn và noãn. Tần số gây đột biến của
tia này khá cao vì bƣớc sóng của nó trùng với bƣớc sóng
DNA hấp phụ (từ 260 – 265nm).
Tia X

Hình 5.15. Hình thành và phát triển của khảm

Các tác nhân gây đột biến gồm:

b) Tác nhân hố học
Trình tự tác động của các tác nhân hoá học:
Trước hết, chúng đi vào các bộ phận tế bào, gây chấn thương
ở mức phân tử;
Sau đó, tác nhân hoá học tương tác với các sản phẩm trung
gian trong tế bào và cùng với sản phẩm của tương tác tác

động vào ADN. Đây là giai đoạn tiền đột biến.
Cuối cùng, các liên kết hoá học làm sai lệch thơng tin đã gây
ra đột biến.

Các chất oxy hố khử và các gốc tự do: H2O2, HNO2, các aldehyd,
các muối kim loại nặng.
Các chất alkyl hoá: ethylmethan sunfonat (EMS), nitrozoethyl-urea
(NEU), nitrozomethylurea (NMU), ethylenimin (EI), diethylsulphat
(DES), dimethylsunphat (DMS),…
Các chất đồng đẳng của base nitơ: cafein, 5-bromuaraxin (5-BU),
aminopurin, các hợp chất chứa halogen…
Các chất cảm
teobromin…

ứng

với

base:

ethylurethan,

5-aminouracin,

Các chất nhóm acridin (C13H9N): proflavin đƣợc dùng nhiều trong
nghiên cứu đột biến gene.
Ngồi ra cịn một số chất hóa học: H2S2O7, Na2CO3, Na3PO4, ...

6

7/18/15

5.2.4. Vật liệu và phƣơng pháp xử lý đột biến
a) Vật liệu xử lý là những bộ phận có khả năng hoạt động sống
Các bộ phận xử lý: cây, hạt khô, hạt ƣớt, mầm, bộ phận sinh dƣỡng, hạt
phấn, tế bào, phôi, calus trong nuôi cấy mô.

c) Tác nhân sinh học:

b) Phƣơng pháp xử lý

Virus là nhóm sinh học có thể mang gen lạ, xâm nhập
vào cơ thể cây trồng để gây đột biến.

Phƣơng pháp xử lý tuỳ thuộc vào tính chất của các tia, liều lƣợng, loại
hố chất, nồng độ.
Khi xử lý đột biến cần chú ý đến đặc tính sinh lý của cây, thời gian và
bộ phận cây trồng đƣợc xử lý.

Đây là một trong những công cụ của phƣơng pháp

Liều lƣợng và nồng độ hoá chất căn cứ vào liều lƣợng gây chết (lethal
dose) - giá trị LD50.

chuyển gen.

LD50 đƣợc xác định bằng nghiên cứu cụ thể với loại tác nhân và vật liệu
xử lý.
Liều lƣợng xử lý bằng TNVL đƣợc đo bằng các đơn vị Rad, Kr hay Gray.

Đơn vị tiêu chuẩn thống nhất là Gray viết tắt là Gy (Gray (Gy) = 1 Joule
= 100rad, rad = 100erg/g vật chất),
Nồng độ xử lý bằng tác nhân hóa học có đơn vị là mM hoặc ppm.

Bảng 5.3. Liều lƣợng và thời gian xử lý đột biến đối với hạt lúa khô
Tác nhân đột biến

Liều lƣợng và thời gian xử lý

c) An toàn trong xử lý đột biến
Phải tuân thủ các quy tắc, quy định an toàn và đảm bảo hiệu quả
xử lý.

Neutrons nhanh

3 - 8 Gy

X-rays

X-rays 95 - 250 Gy

Tia gamma

gamma rays 100 – 350 Gy

MNH (MNU)

MNH (MNU) (0,7–1,5 mM) x (3 – 5 h)

Cán bộ thực hiện phải đƣợc đào tạo

ENH (ENU)

ENH (ENU) (1,7–2,5 mM) x (3 - 5 h)

Phải đầy đủ trang thiết bị bảo hiểm an toàn cho ngƣời thực hiện

EMS

EMS (0,2 – 0,5%) x (8–20 h)

NaN3

NaN3 (0,5 – 2 mM) x (3-5 h)

Việt Nam đã ban hành luật “Luật năng lƣợng nguyên tử” năm
2008. Một số nguyên tắc cơ bản là:
Phải có phịng thí nghiệm chun dụng đủ tiêu chuẩn an tồn,

hoặc khu vực xử lý an toàn.

Sau khi sử lý phải có phƣơng pháp đảm bảo phân rã hết phóng xạ

hay độc tố mới đƣợc sử dụng

5.2.5. Chọn lọc sau đột biến
Vật liệu xử lý đột biến là thế hệ M0 đƣợc gieo trồng và thu hoạch
gieo trồng M1 và thu hoặc trồng quần thể M2.
Bắt đầu từ quần thể M2 phân thành hai khu chọn lọc, một khu vực
tiếp tục chọn lọc các thế hệ phân ly, một khu vực khác đánh giá các

dòng đã thuần để phát triển giống mới hoặc làm vật liệu khởi đầu
cho phƣơng pháp tạo giống khác nhƣ lai, chuyển gen…
Chọn lọc sau đột biến đối với cây sinh sản sinh dƣỡng phân thành
2 nhóm,
(i)Nhóm cây cần tách đột biến riêng rẽ ra khỏi thể khảm sử dụng nhân và
ghép vơ tính tạo thành các dịng vơ tính ở thế hệ sau. Qua một số thế hệ
chọn lọc đánh giá độ thuần và các đặc điểm nơng sinh học khác để phát
triển thành giống mới.

Hình 5.16. Cánh đồng xử lý đột biến ở Viện Đột biến tạo
giống (IRB) quốc gia Nhật Bản

(ii)Nhóm cây khơng cần tách đột biến ra khỏi thể khảm nhƣ hoa và cây
cảnh đánh giá đột biến ổn định nhân vơ tính phát triển thành giống mới.

7


7/18/15

Chọn lọc sau đột biến với cây sinh sản hữu tính: tƣơng tự nhƣ
chọn lọc phân ly sau lai điểm khác biệt là có thể chọn lọc một quả,

Bảng 5.4. Yêu cầu số cá thể của gia đình M2 đảm bảo xuất hiện đột biến

một bơng để hình thành dịng ở thế hệ sau mà không nhất thiết từ
một cây hay một khóm nhƣ chọn lọc sau lai.
Yêu cầu chọn lọc quần thể phân ly lớn, ƣớc lƣợng độ lớn quần thể
M1 theo Brock (1971).

N

Số gia đình M2

Tỉ lệ đột biến

log(1  p1 )
log(1  )

p1 = 0,90

p1 = 0,99

10-2

233

465

10-3

2.326

5.652

10-4

23.260

46.520

10-5

232.600

465.200

Trong đó: N là số cá thể M1 sống sót để tạo gia đình M2; µ là tỉ lệ đột
biến; p1 là xác suất ít nhất xảy ra một đột biến.

5.3. ĐA BỘI THỂ
5.3.1. Khái niệm và ý nghĩa đa bội trong chọn giống

Khái niệm: “Đa bội thể là những sinh vật trong tế bào sinh dƣỡng có
số lƣợng nhiễm sắc thể tăng theo bội số nguyên lần của bộ nhiễm
sắc thể đơn bội (từ 3n trở lên)”.

Sinh trƣởng, phát triển mạnh hơn nên khả năng thích ứng tốt
nhƣ cây chuối
Thân lá to nên năng suất xanh cao
Bất dục đặc biệt dạng tam bội 3n. Nhiều trƣờng hợp bất dục hoàn
toàn

- Một số dạng đa bội

Bảng 5.5. Đa bội ở một số loài cây trồng
Loài cây trồng

Đặc điểm dạng đa bội

Đơn bội (n)

Đa bội

Hàm lƣợng các chất cao nhƣ đƣờng, methol bạc hà…
Những điểm hạn chế ở cây đa bội

Họ cà

6 hoặc 12

24, 36, 48, 60, 72, 96, 108

Lúa nƣớc

12

24, 48

Đa bội thể cao (6n, 8n…) có hiện tƣợng sinh trƣởng phát triển
khơng bình thƣờng, cây thấp đi do tế bào dầy không phát triển
chiều dài.

Cải bẹ

8, 9, 10

16, 18, 20

Hiện tƣợng bất dục khó khăn đối với lấy hạt.

Mía

40

80, 120

Trong trƣờng hợp nhân giống hữu tính, q trình sản xuất hạt
giống rất khó khăn

5.3.2. Phân loại đa bội thể
a) Đa bội cùng nguồn (autopoly ploidy)
Đa bội cùng nguồn hay còn đƣợc gọi là đồng nguyên đa bội, tự đa
bội là hiện tƣợng đa bội thể đƣợc tạo nên từ bộ nhiễm sắc thể giống
nhau của cùng một loài
- Tam bội - Autotriploidy (3x)
- Tứ bội - Autotetraploidy (4x)
- Ngũ bội - Autopentaploidy (5x)
- Lục bội - Autohexaploidy (6x)

b) Đa bội khác nguồn (Allopolyploidy)
- Tứ bội khác nguồn - Allotetraploidy (2x1+2x2)
- Lục bội khác nguồn - Allohexaploidy (2x1+2x2 + 2x3)
- Bát bội khác nguồn - Allooctaploidy (2x1+2x2 + 2x3 + 2x4)
Hình 5.17. Những con đƣờng chủ yếu hình thành đa bội

8


7/18/15

c. Đa bội lệch (aneuploid)
Đa bội lệch là sự thay đổi bộ NST không bằng bội số mà từng NST
riêng biệt
Công thức tổng quát: 2n ± x (x: số NST)
Đa bội lệch đƣợc phát hiện ở nhiều loài cây trồng: lúa mì, ngơ, cà
chua, bơng, thuốc lá…
Các dạng đa bội lệch dẫn tới biến dị dị hình, sức sống kém do mất
cân bằng bộ NST, không phân bào đƣợc nên bất dục, khơng hoặc ít
có giá trị trong chọn giống mà chỉ có thể sử dụng để xác định nhóm
gen liên kết.

5.3.3. Phƣơng pháp tạo đa bội thể
Nguyên tắc xử lý đa bội: xử lý đa bội có thể dùng tác nhân lí, hố
học... tác động vào sơ thể sinh vật đặc biệt lúc tế bào đang phân chia
dẫn đến phân chia khơng bình thƣờng và hình thành đa bội.
Các phƣơng pháp xử lý
Phƣơng pháp gây chấn thƣơng: có hiệu quả nhất ở cây họ cà.
Phƣơng pháp thay đổi nhiệt độ đột ngột.
Phƣơng pháp hoá học: xử lý bằng chất colchicine, idol axetic axit,
sunfamit...

Phƣơng pháp tạo đa bội thể bằng colchicine (C22H25NO6)
Colchicine là một chất hoá học đƣợc chiết từ cây (Colchicum
autumnale) có nhiều ở vùng Địa Trung Hải, colchicine dạng tinh thể,
màu trắng tan trong rƣợu và benzen, không tan trong nƣớc.

Tạo đa bội thể bằng lai

Nồng độ và thời gian xử lý tùy thuộc vào vật liệu và loài cây trồng,

nồng độ dao động từ 0,01 – 1,6%, thời gian xử lý từ 30 phút đến 10
giờ.

Các thể đa bội có thể tiến hành lai với nhau nhƣ lai giữa dạng tứ
bội (4n) và nhị bội (2n) tạo ra dạng tam bội (3n).

Một số loài cây trồng khi xử lý có bổ sung thêm hóa chất khác nhƣ
DMSO (Dimethyl sulfoxide - (CH3)2SO).

Phƣơng pháp này đã đƣợc áp dụng thành cơng ở một số lồi cây
trồng nhƣ dƣa hấu tam bội, dâu tằm tam bội.

Khi xử lý trực tiếp lên đỉnh sinh trƣởng của cây trên đồng ruộng thời
gian ngắn hơn và lặp lại một vài ngày.

Sử dụng các vật liệu đa bội theo các hƣớng sau:

Sau khi xử lý phải rửa sạch bằng nƣớc vô trùng 30 phút
Phƣơng pháp xử lý tuỳ thuộc vào từng trƣờng hợp cụ thể
Tiêm vào đỉnh sinh trƣởng

Chọn lọc sử dụng trực tiếp.
Tạo giống lai làm vật liệu cho các tổ hợp lai.
Khắc phục hiện tƣợng bất dục trong lai xa.

Dùng bông thấm đặt lên đỉnh sinh trƣởng cây con khi lá mầm mở
Nhúng đỉnh sinh trƣởng hoặc đỉnh rễ vào dung dịch colchicine
Phun dung dịch colchicine lên đỉnh sinh trƣởng của cây con

5.4.2. Giá trị của cây đơn bội và đơn bội kép

5.4. ĐƠN BỘI THỂ VÀ ĐƠN BỘI KÉP

5.4.1. Khái niệm
Đơn bội (Haploid) là thực vật có bộ nhiễm sắc thể n = 1 nhƣ một
giao tử đực là hạt phấn hoặc giao tử cái là tế bào trứng.

Để tiến hành nghiên cứu di truyền các tính trạng.
Tạo cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn in vitro
Đến nay, số lƣợng các cây đơn bội của hơn 247 loài thuộc 88 chi
và 34 họ thực vật hạt kín đã đƣợc tạo ra từ nuôi cấy bao phấn và
hạt phấn.

Đơn bội kép (Double Haploid - DH) có bộ nhiễm sắc thể 2n giống hệt
nhau do nhân lên từ bộ NST đơn bội và có thể hình thành từ tế bào
trứng hoặc hạt phấn.

H.H. Geiger và G.A. Gordillo (2010) cho rằng tiến bộ chủ yếu của
dịng DH trong chọn tạo giống ngơ lai là

Chawla (2002) khái niệm đơn bội kép (DH) là một kiểu gen đƣợc
đƣợc hình thành khi các tế bào đơn bội trải qua q trình nhân đơi
nhiễm sắc thể.

(ii)đồng hợp hoàn toàn,

(i)biến di di truyền tối đa,

(iii)nhanh thƣơng mại,
(iv)đơn giản,
(v)giảm chi phí

(vi)(vi) tối ƣu cho ứng dụng marker.

9


7/18/15

5.4.3. Phƣơng pháp tạo đơn bội (Haploid) và đơn bội kép (DH)
Phƣơng pháp 1: Tạo đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn

Các bƣớc nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội:

Một số kỹ thuật tạo đơn bội nhƣ:

Bƣớc 1: Lựa chọn kiểu gen

Chiếu xạ hạt phấn

Bƣớc 2: Trồng và chăm sóc cây cho phấn

Trì hỗn thụ phấn

Bƣớc 3: Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy

Sử dụng tế bào chất lạ hoặc tác nhân thụ phấn

Bƣớc 4: Thu bao phấn, khử trùng, bảo quản

Lai xa
Tạo đa phôi

Bƣớc 5: Nuôi cấy tạo calus và tái sinh cây
Bƣớc 6: Chuyển cây ra giá thể, ngồi đất và đánh giá chọn lọc dịng.

Ghép cây con
Xử lý hóa chất

Bƣớc 2: Trồng và chăm sóc cây
Bƣớc 1: Lựa chọn kiểu gen
Kiểu gen là dòng, giống thuần, giống thụ phấn tự do hoặc con lai
F1 đƣợc chọn để trồng cây cho phấn.
Bƣớc lựa chọn kiểu gen rất quan trọng, quyết định khả năng nuôi
cấy thành công. Kiểu gen của mỗi lồi cây trồng phản ứng khác
nhau với ni cấy bao phấn.

Trồng và chăm sóc cây lấy bao phấn trong điều kiện phù hợp với loài,
trong một số trƣờng hợp trồng trong nhà kính, nhà lƣới và trong chậu vại.

Bƣớc 3: Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng nuôi cấy bao phấn trên môi trƣờng MS cơ bản, một số lồi cây
trên mơi trƣờng N6 của Chu (1978).
Mơi trƣờng nuối cấy bao phấn nghiên cứu cải tiến phù hợp với mỗi loài cây
trồng và kiểu gen.

Nhiều nhà nghiên cứu khẳng định nuôi cấy bao phấn ở lúa (Ozyza
sativa L.) gặp khó khăn là khả năng tạo calus của hạt phấn rất thấp
và sai khác lớn khi tái sinh cây

Ví dụ đối với lúa lồi phụ Indica mơi trƣờng N6 bổ sung thêm galactose
(0,1M), lactose (0,1M), nƣớc dừa (5%), caseine hydrolisate (0,05% w/v), Lglutamine (1,3mM), biotin (2mM), ascorbic acid (2,8mM) và các chất điều

tiết sinh trƣởng

Loài phụ Japonica khả năng tạo calus tốt hơn lồi phụ Indica

Lồi phụ Japonica mơi trƣờng SK-I hiệu quả cao hơn.

Kết quả nuối cấy tạo ra cây đơn bội, cây lƣỡng bội và cây tam bội,
sau nuôi cấy tiến hành đánh giá và chọn lọc cây đơn bội.

Môi trƣờng MS bổ sung thêm 2,4D và BAP hiệu quả đối nuôi cấy bao phấn
cây họ thập tự.
Các nhà khoa học Úc cho rằng môi trƣờng B5 + 2,4-D (2mg/l) + 9%
sucrose phù hợp cho cây họ đậu.

Bƣớc 4: Thu nụ hoa, khử trùng và tách bao phấn nuôi cấy

Bước 5: Nuôi cấy tạo calus và tái sinh cây

Thu nụ hoa giai đoạn hình thành tiểu bào tử đơn nhân (lúa khi
bơng vẫn trong bẹ lá địng, khoảng cách giữa lá đòng và tai lá cuối
cùng là 3cm).

Môi trường nuôi cấy bao phấn dựa trên môi trường MS hoặc N6 cải
tiến phù hợp với mỗi loài cây trồng và kiểu gen.

Sau khi thu hoa, phƣơng pháp nhuộm màu để xác định thời điểm
nuôi cấy phù hợp, một số hóa chất nhuộm màu sử dụng nhƣ iron alum haematoxylin nhuộm màu bao phấn lúa, DAPI (4,6 diamidino
2-phenylindol dichloride) với bao phấn cây họ cam quýt.
Thu hoa khử trùng và bảo quản trong nhiệt độ thấp
Sau khi bảo quản, tách bao phấn ra khỏi hoa đƣa vào môi trƣờng

nuôi cấy trên đĩa petri
Số lƣợng ni cấy tùy theo lồi, cơ sở vật chất. Bình qn số lƣợng
bao phấn ni cấy trên mỗi đĩa petri khoảng 30 bao phấn, nuôi cấy
tổng số 100 bao phấn cho một kiểu gen.

Môi trường cải tiến thường bổ sung thêm các chất điều tiết sinh
trưởng và hóa chất khác (xem bước chuẩn bị mơi trường).
Điều kiện buồng nuôi cấy thường ở nhiệt độ 25 ± 1oC, thời gian chiếu
sáng 16 giờ, cường độ ánh sáng 1000lux (đối với lúa).
Một số loài cây trồng yêu cầu môi trường tạo calus và môi trường tái
sinh cây khác nhau như: lúa sau khi tạo calus 3 tuần chuyển sang môi
trường tái sinh cây là môi trường MS bổ sung thêm 1-2mg NAA
(Naphthalene acetic acid), 4mg/l kinetin, 40mg/l adenine sulfat và 15%
CM.
Điều kiện nuôi cấy giống như nuôi cấy tạo calus nhưng cường độ ánh
sáng tăng lên 2000lux.

10


7/18/15

Bƣớc 6: Chuyển cây ra ngoài giá thể hoặc ngoài đất đánh giá chọn
dòng
Trồng cây tái sinh ra chậu chứa đất và dinh dƣỡng phù hợp, hoặc
ngoài đất trong nhà kính, nhà lƣới đánh giá các đặc điểm nơng sinh
học và xác định độ bội.
Ví dụ đối với lúa: xác định độ bội bằng xử lý đỉnh rễ trong dung
dịch 8- hydroxyquinoline tại 18oC trong 3 giờ, cố định trong dung
dịch ethanol-acetic axít (3:1 v/v) qua đêm và nhuộm màu bằng kỹ

thuật Feulgen squash và quan sát trên kính hiển vi.
Những tiến bộ trong khoa học đã có các thiết bị mới có thể xác
định độ bội nhanh và tiết kiệm chi phí hơn nhƣ máy đo độ bội hoặc
sử dụng marker phân tử.

Phƣơng pháp 2: tạo đơn bội bằng kích tạo đơn bội tự nhiên
Phƣơng pháp kích tạo đơn bội tự nhiên hay còn gọi là phƣơng pháp
tạo đơn bội kép (DH) in vivo.
Geiger (2009) đã thông báo rằng nếu thụ phấn các cây ngơ có kiểu
gen đặc thù gọi là cây kích tạo (inducer), cây nhận phấn tạo ra một tỉ
lệ hạt nhất định có phơi đơn bội (haploid embryo) và nội nhũ tam
bội.
Kỹ thuật sử dụng rộng rãi phát triển dịng thuần trong tạo giống
ngơ lai thƣơng mại.
Các bƣớc tạo dịng DH ở ngơ đƣợc trình bày trong hình 5.20.
Sau khi thu hạt đơn bội có thể lƣỡng bội hóa tạo dịng đơn bội kép
ngay từ thế hệ đầu tiên.

* Lƣỡng bội hóa cây đơn bội tạo cây đơn bội kép (DH):
Phƣơng pháp lƣỡng bội hóa cây đơn bội từ ni cấy bao phấn
hay kích tạo đơn bội (in vivo) phổ biến nhất là sử dụng colchicine.
Chất alkaloid này hoạt động cản trở quá trình phân chia tế bào
và dẫn đến không giảm số lƣợng nhiễm sắc thể khi phân chia.
Colchicine có tính độc cao, ngày nay có thể sử dụng một số chất
khác thay thế là thuốc trừ cỏ, pronamid, APM, trifluralin, oryzalin,
Nitrous oxide gas (Kato, 2002), nhƣng những chất thay thế này
không phù hợp xử lý một số lƣợng lớn.

Hình 5.20. Các bƣớc tạo dịng DH ở ngô băng Phƣơng pháp in vivo

5.4.4. Ứng dụng của đơn bội và đơn bội kép trong cải tiến giống cây
trồng
Phƣơng pháp phát triển dòng thuần truyền thống bằng thụ phấn cƣỡng
bức của chính cây đó (tự phối) qua 8 - 10 thế hệ thu đƣợc dòng thuần, tuy
nhiên khơng thể tạo đồng hợp hồn tồn.
Tỉ lệ đồng hợp tăng qua các thế hệ tự thụ phấn. Giả sử lai 2 bố mẹ đồng
hợp AA x aa thu đƣợc con lai F1 (Aa), bắt đầu từ F1 cho thụ phấn hoàn toàn
tỉ lệ đồng hợp và dị hợp thu đƣợc qua các thế hệ nhƣ sau:

Bảng 5.6. Tỉ lệ đồng hợp qua các thể hệ tự thụ phấn
Thế hệ tự thụ phấn
F1
F2
F3
F4
F5
F6
F7
F8

Tỉ lệ (%)
Đồng hợp
50
75
87,5
93,75
96,88
98,44
99,32

Dị hợp
100
50
25
12,5
6,25
3,12
1,56
0,78

5.5. TẠO BIẾN DỊ BẰNG CƠNG NGHỆ TẾ BÀO
Ni cấy mơ tế bào tạo ra một lƣợng lớn biến dị di truyền ở các
loài thực vật, những biến dị di truyền này có thể sử dụng trong các
chƣơng trình chọn tạo giống cây trồng.
Bằng chọn lọc in vitro các đột biến về đặc điểm nơng sinh học có
lợi, chống chịu mặn, hạn và chống chịu sâu bệnh có thể phân lập
đƣợc trong một thời gian ngắn.
Biến dị soma tạo thành giống mới thành công ở một số cây trồng
nhƣ cải, lúa và cây trồng khác (S. Mohan Jain, 2001).

11


7/18/15

5.5.1. Những thay đổi di truyền xảy ra trƣớc khi ni cấy mơ in vitro
Trong q trình phát triển cá thể, phân hố và già hố của mơ và tế
bào, một số thay đổi di truyền xảy ra và đƣợc tích luỹ trong các tế
bào soma.

5.5.2. Những thay đổi di truyền xảy ra trong quá trình in vitro

Nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô, cây đƣợc tái sinh từ tế bào soma sẽ là
các đột biến.

Mức độ đột biến tế bào soma lớn đến mức tần số đột biến do các
chất đột biến gây ra.

Nguyên nhân gây đột biến có thể do cấu trúc bình thƣờng của hạt
và tế bào bị phá vỡ - các enzym tiếp xúc với các chất và tạo ra sản
phẩm đột biến.

Có thay đổi số lƣợng, cấu trúc nhiễm sắc thể, đột biến gen.

Tuỳ theo phƣơng thức nuôi cấy tế bào soma, ngƣời ta phân biệt các
loại biến dị dƣới đây:

Auxin gây ra đa bội hoá bên trong tế bào nuôi cấy.

Thay đổi di truyền phổ biến nhất xảy ra trong tế bào nuôi cấy là đa
bội thể.

Biến dị dịng tế bào mơ sẹo (calusoclonal variation): khi cây biến dị
tái sinh từ mô sẹo (calus).

Đột biến tế bào soma xảy ra ở các gen trong tế bào chất (ty thể và
lục lạp).

Biến dị dòng tế bào trần (protoclonal variation) - khi cây biến dị tái
sinh từ tế bào trần.

Đột biến tế bào soma đã ứng dụng vào chọn giống hiệu quả ở nhiều
cây trồng nhƣ mía, khoai tây, cà chua, thuốc lá, lúa và lúa mì.

Những biến dị di truyền xảy ra và đƣợc phát hiện trong q trình
ni cấy in vitro gọi chung là đột biến dòng tế bào.

5.6. TẠO BIẾN DỊ DI TRUYỀN DỰA TRÊN CÔNG NGHỆ GEN
5.5.3. Ứng dụng của biến dị tế bào soma
Biến dị và chọn lọc các đột biến tế bào soma xảy ra trong nuôi cấy
in vitro cung cấp một số lƣợng lớn biến dị và có thể ứng dụng rất đa
dạng:
Tạo ra dịng tế bào ni cấy có khả năng sản xuất các chất hoạt
tính sinh học với năng suất cao (xem công nghệ bioreactor)
Tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính biến dị quý,
Ví dụ, các nhà khoa học ở Đài Loan đã chọn tạo đƣợc giống chuối
thấp cây, chống chịu bệnh thối rũ do nấm Fusarium gây ra.
Ở nƣớc ta, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam đã tạo đƣợc
giống lúa mới DR2 có khả năng chịu hạn, chịu lạnh bằng phƣơng
pháp chọn lọc các biến dị tế bào soma in vitro kết hợp xử lý các điều
kiện cực đoan từ một giống lúa khơng có khả năng chống chịu.

Ứng dụng cơng nghệ gen tạo biến dị di truyền ở mức phân tử ADN,
locus tính trạng số lƣợng (QTL) hay từng gen, sau đây gọi chung là

kỹ nghệ di truyền.

Chuyển gen là một kỹ nghệ di truyền và là một công cụ mới bổ
sung cho chọn tạo giống truyền thống và có thể giúp cho việc mở
rộng các nguồn gen có lợi từ các loài khác chuyển sang các loài

cây trồng mong muốn.
Kỹ nghệ di truyền chuyển gen có lợi thế là có thể chuyển một gen,
một số gen hay một QTL mà phƣơng pháp truyền thống rất khó
thực hiện.
Khái niệm cây trồng chuyển gen theo J. Machex (1997): “Cây

trồng chuyển gen là cây đƣợc chuyển một hay nhiều gen mới từ đó
ta thu đƣợc thêm một hay nhiều đặc điểm mới. Các gen đƣợc
chuyển vào cây không phải bằng con đƣờng lai hữu tính giữa hai
bố mẹ mà đƣợc chuyển bằng kỹ thuật di truyền”.

5.6.1. Chuyển gen trực tiếp

b) Chuyển gen nhờ phân tử PEG (polyethylene glycon)

Là phƣơng pháp chuyển trực tiếp các gen đã đƣợc thiết kế trong plasmid
vào tế bào thực vật có sự trợ giúp của yếu tố hoá học, vật lý và tác nhân cơ
giới.

PEG là một phân tử lớn có phân cực, lợi dụng tính chất này ngƣời
ta tách gen cần chuyển, đƣa vào dung môi cùng với phân tử PEG và
tế bào trần.

Chuyển gen trực tiếp sử dụng một số kỹ thuật sau:

a) Chuyển gen bằng xung điện
Sử dụng xung điện với thời gian ngắn trong một điện trƣờng cực mạnh.
Khi các tế bào trần (protoplast) trong điện trƣờng, sự dẫn điện và tính
thấm của màng nguyên sinh bị thay đổi.
Sự thay đổi này kéo theo sự mất ổn định tại chỗ và tạm thời của màng hình

thành lỗ hổng.
Một loạt các lỗ hổng đƣợc hình thành, ADN đƣợc chuyển qua lỗ hổng vào tế
bào gắn vào bộ máy di truyền.
Tế bào chuyển gen đƣợc nuối cấy tạo calus, tái sinh cây và đánh giá cây
chuyển gen.
Một tế bào thực vật có thể tiếp thụ ADN nhờ xung điện mà không cần xử lý
trƣớc nhƣ tế bào ngơ, lúa và phơi non lúa mì.

Các ADN bị hút vào các đầu phân tử PEG có điện cực trái dấu, sau
đó PEG bị tế bào trần hút về phía nó.
Các ADN trên đầu PEG đi vào tế bào trần theo cơ chế nuốt amip.
Thuốc lá và hoa mào gà là hai đối tƣợng đầu tiên đƣợc sử dụng cho
chuyển gen trực tiếp nhờ tác động của PEG.
Nhƣợc điểm lớn nhất khi sử dụng phƣơng pháp chuyển gen bằng
xung điện và nhờ xử lý PEG là việc tái sinh cây hữu thụ tốn rất nhiều
thời gian, công sức mà kết quả phụ thuộc vào kiểu gen của loài cây
trồng.
Ngồi ra, vấn đề về các biến dị soma, có nhiều bản sao gắn trong
hệ gen, tái sinh cây bạch tạng… là những trở ngại cho việc chuyển
gen khi sử dụng hai phƣơng pháp này ở cây hoà thảo (cây lúa).

12


7/18/15

c) Chuyển gen bằng vi tiêm
Ngƣời ta sử dụng vi kim và kính hiển vi để tiêm một lƣợng nhỏ ADN
vào những tế bào nhất định, có thể là tế bào trần hay tế bào nguyên.
Phƣơng pháp này có ƣu điểm là ADN đƣợc đƣa vào tế bào một cách

chính xác.
Phƣơng pháp này cần thao tác khéo léo, yêu cầu trang thiết bị.
Vật liệu chuyển gen là tế bào trần, hoặc qua ống phấn.
Khi hạt phấn rơi trên đầu nhuỵ (quá trình thụ phấn), hạt phấn sẽ
nảy mầm và hình thành ống phấn. Lúc này tiêm ADN mong muốn đã
tách đi theo ống phấn mang giao tử đực vào thụ tinh với giao tử cái,
ADN cần chuyển kết hợp hình thành hợp tử có mang gen cần chuyển.
Phƣơng pháp này khá thành công trên cây lúa và cây bông, tuy
nhiên hạn chế của phƣơng pháp là kỹ thuật cao và tốn kém.

d) Chuyển gen bằng bắn gen
Lịch sử và thành tựu chuyển gen bằng bắn gen:
Phƣơng pháp chuyển gen bằng bắn gen đƣợc Klein T.M., Wolf E.D.
và Sanford J.C công bố lần đầu tiên năm 1987 với tiêu đề vi đạn tốc
độ cao đƣa nucleic axít vào tế bào sống đăng trên tạp chí Nature số
327.
Các nhà khoa học sử dụng hạt tungsten có kích thƣớc nhỏ, khối
lƣợng phân tử lớn, bay với vận tốc nhanh khi xuyên qua thành và
màng tế bào không gây chết tế bào sống.
Các tác giả cho rằng phƣơng pháp này có thể khắc phục những
khó khăn của phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens vì phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn bị hạn chế
phạm vi ký chủ.

Nguyên lý chung chuyển gen bằng bắn gen:
Thiết kế vector mang ADN cần chuyển, kết tủa ADN lên bề mặt vi
đạn, sử dụng áp lực khí He (helium) bắn vi đạn bay đi xuyên qua mô
tế bào.
Các ADN trên bề mặt vi đạn đƣợc giữ lại trong mô tế bào và gắn
vào bộ máy di truyền, tái sinh cây và đánh giá tế bào và cây chuyển

gen.
Vi đạn là các loại vi đạn là vàng, tungsten (Wolfram).
Vật liệu sử dụng chuyển gen bằng bắn gen: Vật liệu sử dụng bắn
chuyển gen có thể là mơ tế bào, phôi, mô hạt, calus tế bào huyền
phù trong nuôi cấy mô tế bào.
Các bƣớc chuyển gen bằng bắn gen gồm: chọn kiểu gen, tách mô,
thiết kế vector chuyển gen, xử lý mơ, thiết kế q trình bắn gen (kết
tủa ADN trên bề mặt vi đạn, nuôi cấy tạo mô chuyển gen, nạp đạn
và vi đạn), tái sinh cây, đánh giá và chọn lọc cây chuyển gen.
Hình 5.21. Sơ đồ các bƣớc bắn gen vào mô thực vật

Bƣớc 2: Chuẩn bị vector chuyển gen
Bƣớc 1: Chọn kiểu gen và tách mơ
Kiểu gen sử dụng chuyển gen là dịng, giống ƣu tú cần cải tiến một
hoặc một số tính trạng nào đó.
Tách mơ và khử trùng đƣa vào ni cấy in vitro tạo vật liệu chuyển
gen.
Ví dụ, chuyển gen CBF3 biểu hiện tăng cƣờng tính chịu lạnh, chịu
mặn và chịu hạn ở cây Arabidopsis, thuốc lá (Nicotiana tabacum L.)
và lúa mỳ (Triticum aestivum L.) vào ngô bằng hạt cho nảy mầm trên
môi trƣờng MS + vitamin B5 bổ sung thêm 9 µmol L–1 2,4-D (2,4dichlorophenoxyacetic acid, Sigma, St. Louis, MO) trong 3 đến 4
ngày.

Cấu trúc mang gen có nhiều loại khác nhau gọi là vector chuyển
gen.
Vector chuyển gen là plamid một phân tử ADN mạch đơi dạng vịng
có kích thƣớc 1 đến hơn 400 kilobase pairs (kbp).
Ví dụ: vector chuyển gen vào mô hạt ngô của Diaa Al-Abed và cs.
năm 2007. Plasmid pC1301 mang vùng khơng phiên mã intron ßglucuronuridase (GUS) của Australia (Black Mountain, ACT,
Australia). The GUS intron sử dụng để kiểm tra nhanh và xác định

điều kiện biểu hiện trong bao mầm và mô phân sinh chồi.
ADN cần chuyển đƣợc gắn vào vector trƣớc khi kết tủa lên bề mặt
vi đạn.
Mỗi loài cây trồng, vật liệu chuyển gen thiết kế vector chuyển gen
phù hợp có ý nghĩa quan trọng để bắn gen thành công.

13


Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

7/18/15

/>Bƣớc 4: Chọn lọc và tái sinh cây
Xác định kết quả chuyển gen đối với vector gắn GUS có thể nhận
biết mơ chuyển gen thành công nhờ sử dụng nhuộm màu trong
dung dịch X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid)
sau bắn gen 48 giờ và quan sát trên kính hiển vi.
Các mô xác định chuyển gen thành công chuyển vào môi trƣờng
nuôi cấy để tái sinh cây.

Bƣớc 3: Bắn gen
Thiết kế bắn gen cần quan tâm đến các điều kiện nâng cao hiệu
quả của bắn gen nhƣ: áp lực khí He
Theo nghiên cứu của Diaa Al-Abed và cs. (2007) áp lực khí He là
10,69 MPa hiệu quả nhất

Mơi trƣờng và điều kiện ni cấy tùy thuộc lồi cây trồng.
Ví dụ đối với nuôi cấy mô ngô chuyển gen trên môi trƣờng MSI
trong 4 ngày, nhiệt độ 26oC và điều kiện ánh sáng 16/8 giờ

sáng/tối, tiếp theo chuyển sang môi trƣờng MSI chọn lọc bổ sung
thêm 25 mg/l hygromycin, thay môi trƣờng sạch hai tuần một lần
trƣớc khi chuyển sang mơi trƣờng tạo rễ là mơi trƣờng MS có chứa
3,2 μmol/ L NAA (1-naphthaleneacetic acid), bổ sung thêm 10 mg/ l
hygromycin trƣớc khi chuyển ra ngoài giá thể và ngoài đất.

Bƣớc 5: Trồng đánh giá và chọn lọc cây chuyển gen
Cây chuyển gen đƣợc chuyển ra giá thể tiếp nhận, khi cây khỏe

Theo Elina Helenius và cs. (1996) kết quả tối ƣu nhất với

Arabidopsis là 75psi, nhƣng tối ƣu với thuốc lá và bạch dƣơng là
200psi. Kích thƣớc vi đạn vàng tối ƣu là 0,6µm và lƣợng ADN trên vi
đạn là 1 µg tối ƣu cho cả 3 cây. Khoảng cách từ súng bắn gen đến
mô từ 6 – 9cm là phù hợp.

5.6.2. Chuyển gen gián tiếp
Phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp là gen đƣợc chuyển vào tế bào
thực vật qua một sinh vật trung gian, thƣờng là vi khuẩn hoặc virus.

mạnh chuyển ra ngồi đất trong nhà kính, nhà lƣới, nhân cây và

* Chuyển gen nhờ virus:

đánh giá.

Virus cũng đƣợc coi là một vectơ trong chuyển gen thực vật. Tiêu
chuẩn để virus làm vectơ chuyển gen:

Trên cơ sở gen chuyển để thiết kế thí nghiệm đánh giá. Thí nghiệm

Có cấu trúc ADN

đánh giá cây chuyển gen kháng bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo,
chống chịu bất thuận bằng gây bất thuận nhân tạo... Ngày nay nhờ
marker phân tử, có thể đánh giá và nhận biết cây chuyển gen nhanh
và chính xác hơn.

Khơng gây hại hoặc có độ gây hại thấp
Có phổ ký chủ rộng
Có khả năng mang gen
Có khả năng di chuyển qua các lỗ tế bào.

Một số hạn chế của phƣơng pháp là các mô bị phá huỷ dẫn tới khả
năng phục hồi và khả năng tái sinh thấp, khả năng tái sinh ra những
cây khơng hồn chỉnh, nhiều bản sao đƣợc chuyển vào trong tế bào
gây khó khăn cho việc phân tích, hiệu quả chuyển gen thấp.

Có hai loại virus đảm nhận vai trò làm vectơ chuyển gen là:
Caulifower Mosaic Virus (CaMV): virus hại cây họ cải
Geninivirus: nhóm virus này gây hại trên phổ ký chủ rộng (cây 1 lá mầm và
cây 2 lá mầm).

* Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium:
Hai chủng đƣợc sử dụng phổ biến để chuyển gen là A. tumefaciens
và A. rhizogenes.
Những nghiên cứu chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium vào
cây Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. đầu tiên của các nhà nghiên An,
G. và cs. (1986), Lloyd, A. và cs. (1986), Sheikholeslam, S. N. &
Weeks, D. P. (1987).

Đến nay phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn thành cơng ở hầu
hết các lồi cây trồng nhƣ lúa, ngô, đậu tƣơng…
Nguyên lý của phƣơng pháp: dựa trên hiện tƣợng nhóm vi khuẩn
Agrobacterium mang plasmid gây khối u ở thực vật gọi là Ti-plasmid
nhƣ mô tả trong hình 5.23.

Ghi chú:(a) Ti- plamid chứa T-DNA ở vai phải (RB) và vai trái (LB), trong vùng phiên mã
của virulence (vir); (b) Các T-DNA khoảng 25bp lặp lại và cung cấp điểm tiếp hợp để
cắt DNA của endonuclease VirD2–VirD1. Nó cắt giữa nucleotides thứ ba và thứ tƣ của
trình tự hai vai; (c) Bản sao của T-DNA phóng thích phân tử DNA sợi đơn (T-strand) có
phân tử VirD2 gắn ở đầu 5’. Chuỗi cịn lại của T- DNA có chức năng sinh học không dài,
thƣờng sử dụng nhƣ điểm định hƣớng và toàn vẹn của T-DNA trong tế bào thực vật; TDNA tổ hợp vào bộ genome của ký chủ; (d) độ dài đầy đủ của sợi đơn; (e) phân tử TDNA bị cắt; (f) nhân bản phân tử T-DNA.

14


Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam

7/18/15

/>Q trình vi khuẩn chuyển gen vào tế bào trải qua 10 bƣớc là:
Cây bị nhiễm A. tumefaciens qua các vết thƣơng tạo thành khối
u, khối u tiếp tục phát triển khi khơng có mặt của vi khuẩn do
nó đã truyền một đoạn ADN của Ti-plasmid (T-ADN) vào bộ gen
của cây.
Ti-plasmid là ADN mạch vòng kép có cấu trúc đƣợc chia thành
bốn vùng chính gồm hai vùng tác động trực tiếp đến sự hình
thành khối u là vùng T-ADN và vùng vir, hai vùng còn lại có
chức năng của q trình tiếp hợp và tái bản Ti-plasmid của vi
khuẩn.

Trong đoạn T-ADN gắn vào bộ gen có chứa ít nhất 3 gen tổng
hợp các phytohormon auxin và cytokinin nên liên quan đến việc
sản sinh hay duy trì sự phân chia tế bào liên tục tạo thành các
khối u ở cây trồng.

Bƣớc 1: vi khuẩn tiếp xúc với thực vật;
Bƣớc 2 và 3: kích thích sự biểu hiện của vùng vir bằng tín hiệu đặc thù của
ký chủ;
Bƣớc 4: tạo phân tử ADN sợi đơn (T- strand), tổ hợp hoạt động của protein
VirD1 và VirD2;
Bƣớc 5: tế bào vi khuẩn tồn tại T-DNA nhƣ một phức hợp protein ADN với
một phân tử VirD2 gắn ở đầu 5’ của T-strand và có một số protein vir khác
chuyển vào tế bào ký chủ bằng hệ thống VirB/D4, mỗi bƣớc yêu cầu có
tƣơng tác của T-pilus với 1 protein đặc thù của ký chủ;
Bƣớc 6: bên trong tế bào chất của tế bào ký chủ T-DNA tồn tại một chút Tcomplex thành thục, phân tử T-strand có độ dài hồn chỉnh với vỏ là một số
phân tử VirE2. Những phân tử này là T-DNA cấu trúc và protein cần thiết cho
vận chuyển nhân đến nhân tế bào ký chủ, đây là bƣớc chính trong q trình
biến nạp di truyền;
Bƣớc 7: thâm nhập vào nhân;
Bƣớc 8: vận chuyển trong nhân;
Bƣớc 9: T- DNA khơng vỏ bọc;
Bƣớc 10: hịa hợp với di truyền ký chủ.

Chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens phụ thuộc vào
một số yếu tố liên quan đến vi khuẩn và thực vật.

Các bƣớc chuyển gen nhờ vi khuẩn

Các yếu tố liên quan đến vi khuẩn bao gồm:

Bƣớc 1: Tách và nhân vi khuẩn

Chủng vi khuẩn,

Vi khuẩn A. tumefaciens là vi khuẩn gram âm trong đất (hình
5.24), phân lập và nuôi cây nhân vi khuẩn là bƣớc đầu tiên phục vụ
công việc chuyển gen.

Mật độ vi khuẩn,
Thời gian lây nhiễm,
Hoạt tính của gen vir,
Khả năng xâm nhập vào các cây chủ và loại vectơ.
Các yếu tố liên quan đến thực vật gồm:
Loại cây, kiểu gen,
Dạng mẫu mô,
Khả năng phân bào của các tế bào đích và TP mơi trƣờng…

Ni cấy, nhân vi khuẩn thông thƣờng trên môi trƣờng L-broth
(LB), trong điều kiện 28oC, máy lắc 200 vòng phút, bổ sung kháng
sinh phù hợp từ 8-12 giờ.
Kháng sinh bổ sung trong nuôi nhân vi khuẩn, thƣờng là
kanamycin nồng độ 50 mg/ml, carbenicillin nồng độ 50 hoặc 100
mg/ml, và tetracycline nồng độ 2 mg/ml.
Sau khi nhân tách dịch khuẩn bằng ly tâm và nhân vi khuẩn để sử
dụng chuyển gen.

Bƣớc 2: Gắn ADN cần chuyển vào Ti - plamid của vi khuẩn
Các kỹ thuật chủ yếu của bƣớc này là tách ADN cần chuyển bằng
ezime, tách Ti - plamid của vi khuẩn và cắt đoạn ADN tƣơng ứng
tại vị trí nhân gen của plamid (Multiple cloning site - MCS).

Đƣa DNA và Ti - plamid đã cắt đoạn tƣơng ứng và enzyme T4 Ligase vào môi trƣờng đệm T4 để nối ghép DNA với Ti - plamid
trong điều kiện nhiệt độ thấp qua đêm, kết quả thu đƣợc Ti plamid đã gắn gen DNA cần chuyển dạng vòng.
Bƣớc tiếp theo kiểm tra Ti - plamid trên E.coli xác định các Ti plamid chuẩn đƣợc tách chuyển vào vi khuẩn A. tumefaciens, bƣớc
tiếp theo lây nhiễm vào mô, tế bào thực vật chuyển gen.

Hình 5.24. Vi khuẩn A.tumefaciens

15


7/18/15

Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

/>Bước 3: Tách mô chuyển gen
Vật liệu chuyển gen nhờ vị khuẩn có thể bằng đĩa lá, mô, calus, mô
hạt được tách từ kiểu gen mong muốn cần chuyển gen, khử trùng,
đưa lên môi trường nuôi cấy in vitro.
Chuyển gen vào mô hạt khá phổ biến ở nhiều lồi cây trồng như lúa,
ngơ, cây họ thập tự.
Bước 4: Lây nhiễm vi khuẩn đã gắn plamid vào mô tế bào
Lây nhiễm để chuyển gen bằng trộn vi khuẩn với vật liệu nuôi cấy
trên môi trường chọn lọc, mơi trường chọn lọc là mơi trường có
kháng sinh.
Những tế bào nhận gen chuyển đồng thời nhận được cả promoter
và gen kháng kháng sinh sẽ sống sót các tế bào khác bị chết trên
mơi trường chọn lọc.
Hình 5.25. Vị trí nhân gen của Ti-plamid vi khuẩn A. tumefaciens

Những tế bào nhận gen sống sót phát triển thành calus và đưa sang

môi trường tái sinh cây.

Bảng 5.7. Thành phần môi trƣờng ni cấy sử dụng
trong thí nghiệm chuyển gen nhờ

A. tumafaciens (Theo Sambrook và cs., 1989; Frame và cs., 2002)

Bƣớc 5: Tái sinh cây chuyển gen
Môi trƣờng tái sinh cây là mơi trƣờng cơ bản MS, có cải tiến đặc
thù với mỗi loài cây trồng bổ sung thêm các chất điều tiết sinh
trƣởng, vitamin và các hợp chất hữu cơ khác.
Sau khi tái sinh cây in vitro chuyển cây ra giá thể tiếp nhận hoặc
ngoài đất, nhân cây và đánh giá cây chuyển gen.

Thành phần
N6/MS
Sucrose (g/l)
Glucose (g/l)
L-proline (g/l)
MES (g/l)
2,4-D (mg/l)
pH
Phytagel (g/l)
AgNO3 (1mg/l)
AS (mM)
Cefotaxime
(mg/l)

LBa
7,0

-

Myo-inositol
(g/l)

-

Paromycin
(mg/l)

-

Hóa chất khác

IM
N6
30
60

5,2

200

CCM
N6
20
10
0,7
2
5,8

3
0,85
200

ReM
N6
20
10
0,7
0,5
2
5,8
3
0,85

SeM
N6
20
10
0,7
0,5
1
5,8
3
0,85

RM
MS
20

250

250

250

5,8
3

1
100

100

Cao nấm men: 5g; Trypton: 10g; NaCl: 10g; Agar 15g

Bước 6: Đánh giá cây chuyển gen
Đánh giá cây chuyển gen thực hiện bằng các thí nghiệm đồng
ruộng, thí nghiệm đánh giá trong nhà kính, nhà lưới.
Thí nghiệm đánh giá kiểu hình kết hợp với marker phân tử để đánh
giá nhanh và chính xác hơn.
Cây trồng biến đổi gen trước khi đưa ra sản xuất đại trà cần được
đánh giá rủi ro về an toàn sinh học, an toàn với sức khoẻ con người
và an toàn với môi trường.

16