Nghiên cứ phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp dextran

LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này đƣợc thực hiện tại phịng thí nghiệm của bộ mơn Vi sinhhóa sinh, Viện cơng nghệ sinh học Lâm Nghiệp. Để hồn thành đƣợc khóa luận
này em đã nhận đƣợc rất nhiều sự động viên, giúp đỡ của nhiều cá nhân và tập
thể.
Trƣớc hết, em xin chân thành cảm ơn tồn thể thầy cơ giáo trong Viện
công nghệ sinh học Lâm nghiệp- Trƣờng đại học Lâm Nghiệp Việt Nam đã tạo
điều kiện phịng thí nghiệm, trang thiết bi và hóa chất vật tƣ.
Tiếp theo, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Nhƣ Ngọc đã
luôn đồng hành, tận tâm hƣớng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt những kiến thức, kinh
nghiệm của cô trong khoảng thời gian em nghiên cứu khóa luận này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn động
viên giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Do vốn kiến thức của bản thân cịn hạn hẹp nên khóa luận khơng tránh
khỏi sai sót. Vì thế em mong nhận đƣợc những ý kiến đóng góp của thầy cơ và
bạn bè để bài khóa luận đƣợc hồn thiện hơn.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2018
Sinh Viên Thực Hiện
Nguyễn Thị Hiền

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i
DANH MỤC CẤC TỪ VIẾT TẮT ..................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................................... v
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
Chƣơng 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU..................................... 2
1.1. Giới thiệu chung về dextran ........................................................................... 2

1.1.1. Định nghĩa ................................................................................................... 2
1.1.2. Công thức cấu tạo dextran........................................................................... 2
1.1.3. Cơ chế hình thành dextran .......................................................................... 3
1.1.4. Ứng dụng của dextran ................................................................................. 6
1.2. Vi sinh vật sinh tổng hợp dextran .................................................................. 8
1.2.1. Giống Leuconostoc ..................................................................................... 8
1.2.2. Giống Streptococcus ................................................................................... 9
1.3.1: Trên thế giới .............................................................................................. 10
Chƣơng 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 12
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 12
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 12
2.3. Vật liệu và hóa chất ...................................................................................... 12
2.3.1. Vật liệu ...................................................................................................... 12
2.3.2. Hóa chất..................................................................................................... 12
2.4. Dụng cụ, thiết bị ........................................................................................... 12
2.5. Các môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu .................................................. 12
2.6. Địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm....................................................... 14
2.7. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 14
2.7.1. Phƣơng pháp phân lập ............................................................................... 14
2.7.2. Phƣơng pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh dextran cao. 14

ii


2.7.3. Phƣơng pháp xác định một số dặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn
tuyển chọn ........................................................................................................... 17
3.1. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn .......................................................... 20
3.2. Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp dextran cao
............................................................................................................................. 23
3.2.1. Kết quả đo độ nhớt .................................................................................... 23

3.2.2. Kết quả xác định hoạt độ enzyme dextransucrase bằng phƣơng pháp DNS
............................................................................................................................. 24
3.2.3. Kết quả thu nhận dextran thô .................................................................... 26
3.3. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng D3, D4, D5, D7. .................... 28
Chƣơng 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................... 32
4.1. Kết luận ........................................................................................................ 32
4.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO

iii


DANH MỤC CẤC TỪ VIẾT TẮT

KHV

Kính hiển vi

L. mesenteroides

Leuconostoc mesenteroides

S. mutan

Streptococcus mutan

S. sobrinus

Streptococcus sobrinus

CTCT

Công thức cấu tạo

MRS

De man, rogosa, sharpe

VP

Voges_Proskauer

DNS

acid dinitrosalicylic

ACM

acetyl metyl carbinol

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Thành phần môi trƣờng MRS ............................................................. 13
Bảng 2.2: Thành phần môi trƣờng lên men đƣờng ............................................. 13
Bảng 2.3: Thành phần môi trƣờng thử phản ứng VP .......................................... 13
Bảng 3.1: Các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc..................................................... 20
Bảng 3.2: Độ nhớt của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc................................. 23
Bảng 3.3: Mật độ quang của dãy dung dịch chuẩn glucose theo phƣơng pháp

DNS ..................................................................................................................... 24
Bảng 3.4: Mật độ quang của các mẫu đối chứng (enzyme đã bị bất hoạt) theo
phƣơng pháp DNS ............................................................................................... 25
Bảng 3.5: Hoạt độ enzyme .................................................................................. 26
Bảng 3.6: Khối lƣợng dextran thô thu đƣợc ....................................................... 28
Bảng 3.7: Đặc điểm dƣới KHV của 4 chủng đã đƣợc tuyển chọn...................... 29
Bảng 3.8: Tổng hợp một số đặc điểm hóa sinh của 4 chủng vi khuẩn ............... 30

v


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Hình ảnh cơng thức cấu tạo dextran ..................................................... 2
Hình 1.2: Hình ảnh cơ chế hoạt động của enzyme dextransaccharase ................ 4
Hình 1.3: Cơ chế ngƣng phản ứng tổng hợp dextran của chất nhận..................... 5
Hình 3.1: Đƣờng chuẩn tƣơng quan giữa nồng độ glucose và độ hấp thụ ......... 25
Hình 3.2: Dung dịch sau khi kết tủa với ethanol để qua đêm ở -80C ................. 27
Hình 3.3: Dextran thơ thu đƣợc .......................................................................... 27
Hình 3.4: Lên men đƣờng glucose ...................................................................... 30
Hình 3.5: Lên men đƣờng lactose ....................................................................... 30
Hình 3.6: Lên men đƣờng sucrose ...................................................................... 31
Hình 3.7: Phản ứng VP ....................................................................................... 31

vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng và phong phú. Ngoài những tác hại
do vi sinh vật gây ra thì nguồn lợi do chúng mang lại cho chúng ta là vô cùng to
lớn nếu ta hiểu, biết và sử dụng chúng hợp lí. Vì vậy, ngành công nghệ vi sinh

ngày càng đƣợc trú trọng phát triển. Các sản phẩm từ vi sinh vật ngày càng đa
dạng, gần gũi và đã dần thay thế các sản phẩm nhân tạo.
Có rất nhiều loại polysaccharide đƣợc sinh tổng hợp bởi vi sinh vật nhƣ
alginate, curlane, dextran. Đa số các polysaccharide đƣợc tổng hợp bên trong tế
bào vi sinh vật hoặc là sản phẩm trung gian của sự chuyển hóa nội bào nên việc
thu hồi và tinh sạch sẽ khó khăn. Trong khi đó, dextran là một polysaccharide
đƣợc tổng hợp bên ngoài tế bào vi khuẩn nên việc thu nhận nó sẽ tiết kiệm thời
gian và kinh phí hơn. Hơn nữa nó đƣợc ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực nhƣ:
Chất làm đặc cho mứt và kem, ngăn chặn sự kết tinh đƣờng, cải thiện duy trì độ
ẩm, hƣơng vị,.. trong ngành công nghiệp thực phẩm; ứng dụng trong các thuốc
thay thế huyết tƣơng, sephadex,.. trong y tế. Ngoài ra, dextran còn đƣợc ứng
dụng trong mỹ phẩm, nhiếp ảnh, ...
Với nhiều ứng dụng nhƣ vậy nhƣng ở Việt Nam, các cơng trình khoa học
nghiên cứu nhằm khai thác, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh
tổng hợp dextran cao cịn rất ít. Vì vậy, em tiến hành nghiên cứu “phân lập và
tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp dextran” nhằm
khai thác để sử dụng trong các mục đích khác nhau phục vụ đời sống con ngƣời.

1


Chƣơng 1
TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Giới thiệu chung về dextran
1.1.1. Định nghĩa
Dextran là polymer sinh học, phần lớn đƣợc tổng hợp từ các vi khuẩn lactic,
có các monomer là các gốc glucose liên kết với nhau nhờ liên kết 1,6-glucoside
[11]. Những vi sinh vật khác nhau thƣờng tạo nên những dextran khác nhau về
trọng lƣợng phân tử, về sự phân bố nhánh trong cấu trúc phân tử. Cấu trúc này
cịn phụ thuộc điều kiện ni cấy những vi sinh vật sản sinh ra dextran.

Dextran chỉ đƣợc tổng hợp từ sucrose, không thể tổng hợp từ glucose hay bất
kỳ một loại đƣờng nào khác. Các loại đƣờng khác trong mơi trƣờng lên men chỉ
đóng vai trị nhƣ nguồn cacbon cho vi khuẩn phát triển [21].
1.1.2. Công thức cấu tạo dextran
Dextran là một loại polysaccharide tƣơng tự nhƣ amylopectin, nhƣng mạch
chính đƣợc hình thành bởi liên kết α-1,6 glucoside và các nhánh bên đƣợc gắn
với nhau bởi liên kết α-1,3 hoặc α-1,4 glucoside [11].

Hình 1.1: Hình ảnh cơng thức cấu tạo dextran

2


1.1.3. Cơ chế hình thành dextran
Đa số các polysaccharide ngoại bào từ vi sinh vật đều là sản phẩm của sự
chuyển hóa nội bào cơ chất thành các sản phẩm trung gian, và cuối cùng thành
polymer. Dextran khác các polysaccharide này, cơ chất không thâm nhập vào tế
bào vi sinh vật mà nó đƣợc chuyển hóa bên ngồi tế bào thành α-D-glucan phân
nhánh, tức là dextran. Chỉ có sucrose đƣợc dùng làm cơ chất cho phản ứng này,
các loại đƣờng khác thúc đẩy tăng trƣởng của vi khuẩn nhƣng không sản xuất
enzyme dextransucrase – là enzyme tham gia trực tiếp vào q trình chuyển hóa
sucrose thành dextran [21].
Polysaccharide có thể đƣợc sản xuất bởi các tế bào nguyên vẹn trong mơi
trƣờng ni hoặc có thể đƣợc tạo ra từ các chế phẩm phi tế bào chứa phức hệ
enzyme dextransaccharase. Enzyme này giải phóng Fructose và chuyển gốc
glucose lên một gốc nhận cũng đã đƣợc liên kết với enzyme:
(1,6- α- D- glucosyl)n + sucrose  ( 1,6- α- D- glucosyl )n+1 + fructose

3

Hình 1.2: Hình ảnh cơ chế hoạt động của enzyme dextransaccharase
Enzyme giải phóng fructose ra khỏi saccharose và kết hợp tạo phức với
gốc glucose. Sau đó nhóm C6 - OH của một gốc phức khác kết hợp với C1 và
giải phóng X, kết quả là hai gốc glucose liên kết lại với nhau bởi liên kết α-1,6glucoside. Trong quá trình polymer hóa chuỗi dextran đang dài ra vẫn liên kết
chặt chẽ với enzyme, mức độ polymer hóa tăng cho đến khi phân tử chất nhận
giải phóng chuỗi polymer khỏi enzyme.
Năng lƣợng tự do của liên kết glucoside trong phân tử disaccharide nằm
vào khoảng 23kJ trong khi năng lƣợng tự do của liên kết glucoside bên trong
dextran thấp hơn một chút (12-17 kJ). Do vậy phản ứng diễn ra theo chiều từ trái
sang phải đi kèm với một sự giảm năng lƣợng tự do. Fructose có thể chuyển
thành acid lactic, acid acetic, ethanol [7, 21].
Đáng lƣu ý là trong chuỗi phản ứng cịn có sự xuất hiện của một chất
cho H+ trong phản ứng giải phóng fructose và nhận H+ trong phản ứng liên kết
hai gốc glucoside lại với nhau. Đó là hai nhóm imidazolium (C3H4N2) của
histidine rất cần thiết cho q trình tổng hợp dextran.
Các loại đƣờng khác ngồi sucrose tham gia phản ứng tạo thành các
oligosaccharide thay vì các dextran cao phân tử. Các gốc glucosyl cịn sót lại
trong quá trình tổng hợp dextran đƣợc chuyển thành các gốc tự do đóng vai trị

4


nhƣ là chất nhận có ảnh hƣởng lớn đến phản ứng. Trong tất cả các chất nhận thì
maltose và isomaltose đƣợc xem là ảnh hƣởng lớn nhất đến phản ứng. Các chất
nhận này tƣơng tác cùng hóa trị với phức enzyme-glucosyl hoặc enzymedextranosyl để giải phóng glucose hay mạch dextran ra khỏi enzyme hoạt động,
đồng thời tạo liên kết với glucose hay dextran ngay tại vị trí của enzyme.

Hình 1.3: Cơ chế ngƣng phản ứng tổng hợp dextran của chất nhận
Dựa vào cơ chế này ngƣời ta có thể khống chế đƣợc độ dài mạch dextran

trong quá trình sản xuất bằng cách điều khiển sự thủy phân dextran để tạo các
chất nhận.
Khi chất nhận là dextran cao phân tử, C3 của dextran làm chất nhận kết
hợp với C1 của phức glucosyl – enzyme hoặc dextranosyl – enzyme để giải
phóng glucose hay dextran và hình thành một liên kết nhánh giữa dextran chất
nhận và glucose hay dextran giải phóng tại vị trí của enzyme.
Phản ứng này đã tạo thành liên kết nhánh cho mạch dextran, dạng α(1,3)glucosyl. Ngồi ra vẫn có liên kết nhánh dạng α(1,2)- glucosyl nhƣng rất ít gặp
trong cấu trúc dextran.

5


1.1.4. Ứng dụng của dextran
Dextran là polysaccharide đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Hiện nay, các ứng dụng này đang ngày càng đƣợc mở rộng.
1.1.4.1. Trong y tế
- Tác dụng chống huyết khối: Các thuốc chứa dextran đƣợc sử dụng để
làm giảm huyết khối mạch máu. Dextran là chất trung gian cho sự kết hợp của
hồng cầu, tiểu cầu và nội mơ mạch, làm tăng điện tích âm và do đó làm giảm sự
kết dính hồng cầu và sự kết dính tiểu cầu. Các cục máu đơng đƣợc hình thành
sau khi dùng dextran dễ bị dung giải hơn do cấu trúc huyết khối bị thay đổi.
Bằng cách ức chế antiplasmin alpha-2, dextran hoạt động nhƣ một chất kích
hoạt plasminogen và do đó có tính năng thrombolytic. Ngồi các tính năng này
dextrans có kích thƣớc lớn hơn nên khơng thoát ra khỏi các mạch là các tác nhân
gây thẩm thấu mạnh mẽ vì vậy nên nó đã đƣợc sử dụng để điều trị giảm bạch
cầu [6].
- Sử dụng trong các chất lỏng truyền tĩnh mạch: Dextran đƣợc sử dụng
trong một số thuốc nhỏ mắt nhƣ một chất bôi trơn và trong một số dịch truyền
tĩnh mạch để hòa tan các yếu tố khác. Nó đơi khi đƣợc sử dụng để thay thế máu
bị mất trong các tình huống khẩn cấp, nơi máu thay thế khơng có sẵn, nhƣng

phải đƣợc sử dụng thận trọng vì nó khơng cung cấp chất điện phân và có thể gây
ra giảm natri hoặc các rối loạn điện giải khác.
- Hoạt tính chống đơng máu: Dung dịch chứa dextran có tác dụng làm
tăng nhanh thể tích tuần hồn. Do áp suất thẩm thấu cao hơn huyết tƣơng, nên
dịch từ khoang gian bào sẽ đi vào trong nội mạch . Tác dụng duy trì thể tích kéo
dài trong 3 - 4 giờ [6, 21].
Ngoài ra, nhờ khả năng gắn với nƣớc mạnh mà dextran phân tử lƣợng
thấp có thể cải thiện các tính chất lƣu biến của máu vì thế có tác dụng đặc hiệu
lên vi tuần hồn: Tăng cấp dịch vào mơ, tăng cung cấp oxygen cho mơ, dẫn đến
làm lỗng máu, tăng cung cấp máu đến tim và giảm sức cản ngoại biên.

6


- Sắt Dextran: Dextran là một vật liệu khởi đầu quan trọng cho tổng hợp
sắt dextran. Dung dịch sắt dextran để tiêm đƣợc áp dụng để điều trị thiếu hụt
thiếu máu ở ngƣời và thú y.
1.1.4.2. Trong công nghiệp thực phẩm
- Trong sản xuất bánh kẹo: Dextrans đƣợc sử dụng làm chất phụ gia trong
các sản phẩm nhƣ bánh kẹo và kem vì nó có tác dụng ổn định, ngăn ngừa sự kết
tinh đƣờng, cải thiện độ giữ ẩm và duy trì hƣơng vị cho sản phẩm [21].
- Trong sản xuất kem: Bởi vì dextran có nhiều ƣu điểm vƣợt trội hơn so
với các chất ổn định khác nhƣ không mùi, khơng vị và khơng độc nên nó thƣờng
đƣợc sử dụng làm chất ổn định trong sản xuất kem. Ngƣời ta đã thực hiện các
nghiên cứu và thấy rằng khi bổ sung 2-4% dextran thì độ ổn định của kem đƣợc
cải thiện [6].
1.1.4.3. Trong cơng nghiệp nhiếp ảnh
Phần Dextran có độ tinh khiết cao đƣợc sử dụng rộng rãi trong ngành
cơng nghiệp nhiếp ảnh bởi vì ngƣời ta đã chứng minh đƣợc rằng nó có tác dụng
cải thiện chất lƣợng nhũ tƣơng của các bức ảnh [6].

1.1.4.4. Trong lĩnh vực mỹ phẩm
Dextran và dẫn xuất của nó có khả năng liên kết tạo muối với các chất
hoạt động bề mặt nên nó có nhiều tác dụng có lợi nhƣ chống lão hóa, chống
nhăn, duy trì độ ẩm tốt, làm mềm các vùng da thơ ráp, nứt nẻ. Vì vậy, ngƣời ta
đã sử dụng dextran và các dẫn xuất của nó để sản xuất các sản phẩm dƣỡng ẩm,
giảm nhăn và chống lão hóa [6].
Ngồi ra, Giri et al đã chứng minh rằng dextran sulfat có tác dụng chống
viêm [21].
1.1.4.5. Trong phịng thí nghiệm
- Dextran đƣợc sử dụng trong một số kỹ thuật sắc ký loại trừ kích thƣớc,
ví dụ: sephadex đƣợc sử dụng để chế tạo các chất mang vi sinh vật trong nuôi
cấy tế bào.

7


- Dextran ƣu tiên gắn kết với các endosome có gắn huỳnh quang nên nó
đƣợc ứng dụng trong quan sát các endosome dƣới kính hiển vi huỳnh quang.
- Dextran đã đƣợc sử dụng trong cố định cảm biến sinh học. Nó cũng có
thể đƣợc sử dụng nhƣ một lớp phủ ổn định để bảo vệ các hạt nano kim loại
mạnh từ q trình oxy hóa [6].
1.1.4.6. Trong xử lý nước thải
Dextran đã đƣợc chứng minh có tác dụng trong xử lý nƣớc thải vì nó có
tính ổn định ở mơi trƣờng kiềm và axit ở nhiệt độ phòng. Do dextran có khả
năng liên kết các ion kim loại ở pH kiềm và có thể phân hủy sinh học nên nó
đƣợc sử dụng rộng rãi trong quá trình keo tụ [6].
1.2. Vi sinh vật sinh tổng hợp dextran
Vi sinh vật dùng để lên men dextran chủ yếu là vi khuẩn axit lactic bao
gồm các chủng thuộc Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum,
Leuconostoc citrovorus, Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus plantarum,

Lactobacillus sanfrancisco, Streptobacterium dextranicum, Streptococcus
mutans, ... Tuy nhiên hiện nay những chủng có khả năng sinh tổng hợp dextran
cao đƣợc đƣa vào trong sản xuất quy mô cơng nghiệp thƣờng là các chủng thuộc
giống Leuconostoc. Ngồi ra, ngƣời ta cịn tiến hành tìm hiểu thêm về các chủng
thuộc giống Streptococcus để sản xuất vaccin chống sâu răng.
1.2.1. Giống Leuconostoc
- Leuconostoc là vi khuẩn kị khí khơng bắt buộc, phân bố rộng rãi trong
môi trƣờng tự nhiên và đóng vai trị quan trọng trong q trình lên men thực
phẩm và lên men công nghiệp. Sinh trƣởng ở nhiệt độ từ 50C đến 300C, nhiệt độ
tối ƣu là 250C đến 300C. Hầu hết các giống nằm trong canh trƣờng lỏng có dạng
hình cầu, đơn lẻ hoặc tạo thành một cặp hay một chuỗi ngắn. Tuy nhiên, hình
thái của chúng cũng có thể thay đổi theo điều kiện sinh trƣởng mà chúng có hình
dạng hơi dài hoặc hình ovan. Là vi khuẩn Gram (+), không sinh bào tử và không
di chuyển, có khả năng sinh acid lactic nên chịu đƣợc pH thấp.

8


- Một số vi khuẩn Leuconostoc có khả năng tiết ra enzyme ngoại bào là
dextransucrase xúc tác cho phản ứng chuyển nhóm glucosyl cịn lại từ phân tử
sucrose ngoại bào tạo thành dextran, giải phóng fructose.
- Trên thế giới đã có một số nghiên cứu về chủng Leuconostoc sinh tổng
hợp dextran. Trong đó, Leuconostoc mesenteroides là chủng nổi bật dùng trong
nghiên cứu sinh tổng hợp dextran. Trong môi trƣờng chứa scrose, to từ 25-30oC,
pH lên men ban đầu là 7 thì L. Mesenteroides sẽ sản xuất enzyme tối đa [28].
+ L. mesenteroides CMG 713: Đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng chứa 20g/l
sucrose, nuôi ở nhiệt độ 30oC, pH giảm từ 7,5 xuống 4,5. Hoạt động enzyme tối
đa đã quan sát đƣợc lúc 20 giờ ủ là 40DSU/ml/giờ, độ nhớt đo đƣợc là 14,58 cp.
Dextran tạo ra không màu, khối lƣợng dextran tinh khiết trong khoảng 0,11-0,65
(g%) [11].

+ L. mesenteroides NRRL B1299: Dextran đƣợc tạo ra có đặc điểm chứa
63% liên kết α- 1,6 glucoside, 27% liên kết α- 1,2 glucoside, 8% liên kết α- 1,3
glucoside [11].
+ L. mesenteroides B512F: Dextran đƣợc tạo ra có đặc điểm chứa 95%
liên kết α- 1,6 glucoside, 5% liên kết α- 1,3 glucoside [11].
+ L. mesenteroides AA1: Đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng tối ƣu chứa
2,5% sucrose, ở nhiệt độ 25oC. Hoạt độ của enzyme dextransucrase là 53
DSU/ml/giờ [3].
+ L. mesenteroides T1: Đƣợc phân lập từ nƣớc lên men trá cây, nuôi cấy
trong môi trƣờng chứa 5% sucrose thì lƣợng dextran đƣợc tạo ra khoảng 11,5618,46 g/l [19].
1.2.2. Giống Streptococcus
- Streptococcus là vi khuẩn G (+), hình cầu hoặc hình trứng đƣờng kính
nhỏ hơn 1μm, chúng thƣờng đứng riêng lẻ, xếp thành đôi hoặc thành từng chuỗi
ngắn nhƣ chuỗi hạt, có độ dài ngắn khơng đều nhau. Chiều dài của chuỗi tuỳ
thuộc vào điều kiện môi trƣờng.

9


- Streptococcus có khả năng sinh tổng hợp dextran thƣờng là các chủng
gây bệnh sâu răng nhƣ S. mutan, S. sobrinus. Dextran đƣợc tạo ra sẽ giúp vi
khuẩn gây bệnh bám vào răng tạo thành các mảng bám gây sâu răng. Dựa vào
cơ chế này ngƣời ta đã tiến hành nghiên cứu vaccin chống sâu răng [22].
1.3. Tình hình nghiên cứu dextran
1.3.1: Trên thế giới
- Dextran là 1 polysaccharide ngoại bào từ vi khuẩn đƣợc phát hiện vào
năm 1861 trong 1 lần Pasteur phát hiện nƣớc ép từ mía bị đặc quánh lại một
cách khó hiểu.
- Dextran đƣợc sản xuất bởi nhiều loài:
+ Năm 1930: Hucker và Pederson là ngƣời đầu tiên thông báo việc sản

xuất dextran từ sucrose bởi chủng Leuconostoc [20].
+ Năm 1941: Dextran đƣợc sản xuất từ chủng Streptococcus trong môi
trƣờng chứa sucrose cũng đã đƣợc báo cáo [20].
- Scheibler là ngƣời đầu tiên chứng minh dextran có trọng lƣợng phân tử
> 1000 Da, có CTCT gồm mạch chính đƣợc hình thành bởi liên kết α-1,6
glucoside và các nhánh bên đƣợc gắn với nhau bởi liên kết α-1,3 hoặc α-1,4
glucoside.
- 1980: Seymour và knapp đã nghiên cứu đƣợc cấu trúc chính xác của
từng loại dextran [21].
- Càng ngày dextran càng đƣợc biết đến nhiều hơn vì nó có các ứng dụng
tuyệt vời trong nhiều lĩnh vực. Ngồi những ứng dụng hữu ích trong y dƣợc đã
đƣợc Ingelman và Gronwall tìm thấy, năm 2003 Neubauer et al. đã nghiên cứu
ứng dụng dextran trong ngành công nghiệp thực phẩm nhƣ trong đồ uống có
sữa, sữa chua và kem [10].
- Mặc dù dextran có nhiều cơng dụng nhƣng sản lƣợng dextran đƣợc tạo
ra từ các chủng bản địa lại không cao, khơng đủ đáp ứng nhu cầu sử dụng. Vì
vậy cần phải nghiên cứu các điều kiện tối ƣu, đột biến chủng để thu đƣợc lƣợng
dextran tối đa.
10


+ Năm 2003: Behravan et al. đã nghiên cứu và thấy rằng đƣờng mật,
đƣờng củ cải và cám gạo có thể đƣợc sử dụng nhƣ nguồn cacbon chính để sản
xuất enzyme [10]
+ Năm 2005: UL Qader et al. đã nghiên cứu tối ƣu hóa các điều kiện sản
xuất dextran từ 2 chủng Leuconostoc mesenteroides PCSIR-4 và PCSIR-9 [20].
+ Năm 2008: Sarwat et al. đã nghiên cứu tối ƣu hóa các điều kiện để thu
đƣợc năng suất tối đa từ chủng Leuconostoc mesenteroides CMG 713 [21].
Cùng trong năm 2008 Kim et al. đã nghiên cứu một quy trình mới để sản xuất
dextran lâm sàng đơn giản và tiết kiệm hơn các phƣơng pháp truyền thống và

đƣợc chứng minh là một phƣơng pháp công nghiệp cho sản xuất dextran lâm
sàng [21].
- Năm 2012: Ahmed và Sarwat đã nghiên cứu tối ƣu hóa các thông số nhƣ
pH, to, NaCl và sucrose để vi sinh vật tập trung vào tăng trƣởng và sinh dextran
[21].
1.3.2. Ở Việt Nam
Chƣa thấy có nghiên cứu nào đã cơng bố về phân lập các chủng vi sinh vật có
khả năng sinh tổng hợp dextran. Mà chỉ có nghiên cứu ứng dụng sử dụng
dextran vào các mục đích khác nhau.

11


Chƣơng 2
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập và tuyển chọn đƣợc một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh
tổng hợp dextran.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp dextran từ các
sản phẩm lên men.
- Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp dextran cao.
- Nghiên cứu một số đặc tính sinh hóa của chủng vi khuẩn tuyển chọn.
2.3. Vật liệu và hóa chất
2.3.1. Vật liệu
Nƣớc bắp cải muối, nƣớc kimchi, mẻ, nƣớc mía lên men thu thập tại chợ
Xuân Mai, Chƣơng Mỹ, Hà Nội.
2.3.2. Hóa chất
- Các hóa chất đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là các hóa chất thơng dụng
có ở phịng Bộ mơn Cơng nghệ vi sinh – Hóa sinh thuộc Viện Công Nghệ Sinh

Học Lâm Nghiệp (do Việt Nam, Trung Quốc, Đức, Mỹ sản xuất nhƣ: Cao nấm
men, peptone, glucose, sucrose, triammonium citrate, natri axetat, MnSO4. H2O,
MgSO4.7H2O, K2HPO4, Tween 80, bộ nhuộm gram, ...)
2.4. Dụng cụ, thiết bị
- Buồng cấy, tủ ấm, máy lắc ổn nhiệt, máy li tâm, cân điện tử, kính hiển vi
quang học, nồi hấp, tủ lạnh, tủ mát, đĩa petri, bình tam giác, ống nghiệm và các
thiết bị khác thuộc phịng thí nghiệm Vi sinh – Hóa sinh Trƣờng Đại Học Lâm
Nghiệp Việt Nam.
2.5. Các môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu
- Môi trƣờng MRS:

12


Bảng 2.1: Thành phần môi trƣờng MRS
Thành phần môi trƣờng
Trọng lƣợng (g/l)
Cao nấm men
12
Peptone
10
Triammonium citrate
2
Glucose
20
Natri axetat
5
MgSO4.7H2O
0,1
MnSO4.H2O

0,05
K2HPO4
2
Tween 80
1
Agar
15
pH = 7,0
- Môi trƣờng mMRS: Tƣơng tự môi trƣờng MRS, chỉ thay glucose (20
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

g/l) bằng sucrose (20g/l) [16; 21].
- Môi trƣờng thử hoạt tính sinh hóa:
Bảng 2.2: Thành phần mơi trƣờng lên men đƣờng
STT

Thành phần môi trƣờng

Trọng lƣợng (g/l)

1

Cao nấm men

5

2

Peptone

10

3

Phenol red

0,01

4

Glucose

10

pH = 7,4
Bảng 2.3: Thành phần môi trƣờng thử phản ứng VP
STT

Thành phần môi trƣờng

Trọng lƣợng (g/l)

1

Peptone

3

2

Glucose

5

3

K2HPO4

5

pH = 7,5
Môi trƣờng sau khi đƣợc điều chỉnh về pH phù hợp đƣợc thanh trùng ở
1210C trong 20 phút.

13


2.6. Địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm
Phịng Vi sinh - Hóa sinh, Viện cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng
Đại Học Lâm Nghiệp Việt Nam.

2.7. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.7.1. Phương pháp phân lập
2.7.1.1. Nguyên tắc phân lập
- Tạo khuẩn lạc riêng rẽ, tách biệt nhau trên môi trƣờng ni cấy thích
hợp.
- Cấy tách từ khuẩn lạc mọc tách biệt sang ống môi trƣờng dinh dƣỡng
thạch nghiêng để thu nhận chủng vi khuẩn thuần khiết.
2.7.1.2. Tiến hành phân lập
- Pha loãng mẫu đến các nồng độ: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5.
- Hút 0,1ml (100µl) dịch ở nồng độ từ 10-2 đến 10-5 nhỏ vào các đĩa petri
chứa môi trƣờng MRS. Sau đó, dùng que gạt thủy tinh trải đều dịch mẫu khắp
mặt thạch. Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 300C trong 1-2 ngày.
- Các khuẩn lạc có hình dạng, màu sắc khác nhau đƣợc tách riêng làm
thuần trên môi trƣờng mMRS và giữ giống trong các ống nghiệm để sử dụng
cho các thí nghiệm sau.
2.7.1.3. Phương pháp cấy truyền bảo quản giống trên môi trường thạch nghiêng
- Dán nhãn ghi gồm tên giống vi sinh vật và ngày cấy.
- Dùng que cấy lấy khuẩn lạc đã đƣợc tách rời cấy sang ống thạch
nghiêng theo đƣờng zíc zắc
2.7.2. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh dextran
cao.
2.7.2.1. Xác định độ nhớt bằng nhớt kế
a, Nguyên tắc:
Độ nhớt của dung dịch càng lớn thì thời gian chảy của một thể tích xác
định dung dịch qua ống mao quản càng dài.
b, Tiến hành:
14


- Mẫu đối chứng: Môi trƣờng lỏng mMRS không đƣợc bổ sung vi sinh vật.

- Mẫu thí nghiệm: Cấy các chủng vi khuẩn vào môi trƣờng lỏng mMRS,
nuôi lắc trong 24 giờ.
- Lấy dịch canh trƣờng sau 24 giờ của mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm
để xác định độ nhớt của dung dịch bằng nhớt kế.
- Cơng thức tính độ nhớt: ndd : ndm = Tdd : Tdm
Trong đó: + ndd: là độ nhớt dung dịch
+ ndm: là độ nhớt nƣớc cất (1,002 mPa.s)
+ Tdd: là thời gian chảy của dung dịch (s)
+ Tdm: là thời gian chảy của nƣớc cất (s) (đo đƣợc 0,86s)
2.7.2.2. Xác định hoạt độ enzyme dextransucrase bằng phương pháp DNS
a, Nguyên tắc:
- Phƣơng pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đƣờng khử với
thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS). Cƣờng độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ
lệ thuận với nồng độ đƣờng khử trong một phạm vi nhất định. So màu tiến hành
ở bƣớc sóng 540nm. Dựa theo đồ thị đƣờng chuẩn của glucose tinh khiết với
thuốc thử DNS sẽ tính đƣợc hàm lƣợng đƣờng khử của mẫu nghiên cứu.
b, Tiến hành:
Từ dung dịch tiêu chuẩn glucose 10 mg/ml, pha thành các dung dịch
chuẩn 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06 mg/ml.
- Xây dựng thang chuẩn Glucose:
+ Lần lƣợt hút chính xác 1,0 ml các dung dịch chuẩn từ 0,1 – 0,6 mg/ml
cho vào các ống nghiệm, sau đó cho vào các ống mỗi ống 1,0 ml dung dịch
thuốc thử DNS, tiếp đó cho vào mỗi ống 2,0 ml nƣớc cất, lập tức lắc đều. Đun
các ống nghiệm trong nƣớc sôi 5 phút. Thuốc thử DNS sẽ phản ứng với đƣờng
trong quá trình đun nóng cho sản phẩm có màu nâu đỏ. Làm lạnh các ống
nghiệm và thêm 6 ml nƣớc cất vào mỗi ống. Lắc đều các ống nghiệm.

15

- Sau 24 giờ nuôi vi khuẩn trong môi trƣờng lỏng mMRS, lấy dịch trƣờng
mang đi ly tâm 7000 vòng trong 15 phút ở 4oC, thu phần dịch nổi (dịch
enzyme).
- Để xác định hoạt tính tổng hợp dextran, phản ứng đƣợc thực hiện ở 30 °
C trong đệm natri axetat 20 mM (pH 5,4) có chứa 0,05 g CaCl2 trên lít và 100 g
sucrose trên lít [11; 15].
+ Mẫu đối chứng: 1ml dịch enzyme đã đƣợc bất hoạt (dịch enzyme đƣợc
đun sôi 5 phút) + 1ml cơ chất.
+ Mẫu phân tích: 1ml dịch enzyme + 1ml cơ chất
+ Đặt cả 2 ống nghiệm vào tủ 370C trong vòng 30 phút.
Phản ứng với DNS
+ 2ml dịch sau phản ứng + 2ml DNS, đun sôi 5 phút.
+ Làm nguội.
So màu bằng máy đo quang
+ Đo OD540nm của mẫu thí nghiệm so với mẫu đối chứng.
- Xác định hàm lƣợng đƣờng khử có trong mẫu sau phản ứng enzyme so
với đối chứng để tính hoạt độ enzyme.
Cơng thức tính hoạt độ enzyme:
HĐE = (C2 – C1) x n / 0,18
+ HĐE: Là hoạt độ enzyme (là lƣợng enzyme cần thiết để giải phóng ra 1
µmol cơ đƣờng khử (glucoz) trong 1ml dịch lên men trong 30 phút (U/ml).
+ C1: Nồng độ đƣờng khử trong mẫu đối chứng (mg/ml).
+ C2: Nồng độ đƣờng khử trong mẫu phân tích (mg/ml).
+ n: Hệ số pha lỗng (nếu có).
+ 0,18: Khối lƣợng của 1 µmol glucose (mg).
2.7.2.3. Phƣơng pháp thu nhận dextran thô
Dextran đƣợc kết tủa bằng ethanol theo phƣơng pháp của S.Z. Davidovic
et al. [19]
- Các bƣớc kết tủa dextran:
16

+ Dịch nuôi cấy sau 24 giờ đƣợc lấy đem ly tâm 7000 vòng trong 15 phút
ở 40C nhằm loại bỏ tế bào vi khuẩn.
+ Sau khi ly tâm thu lấy phần dịch nổi.
+ Tiếp theo, ethanol 96% đƣợc cho vào dịch nổi với tỉ lệ ethanol:dịch nổi
là 2:1 (v/v) và giữ qua đêm ở -80C.
+ Sau đó, các mẫu đƣợc đem ly tâm 10000 vòng trong 15 phút ở 40C, thu
phần kết tủa.
+ Kết tủa đƣợc hòa tan trong nƣớc cất nóng rồi lại bổ sung ethanol 96%
với tỉ lệ và cách thực hiện nhƣ lần 1.
+ Phần kết tủa thu đƣợc sau khi ly tâm đƣợc đem sấy đến trọng lƣợng
khơng đổi thì ta thu đƣợc dextran thơ.
- Cách tính khối lƣợng dextran thơ thu đƣợc:
+ Cơng thức: m = ms – mt
Trong đó: + m: Khối lƣợng dextran thô thu đƣợc (g)
+ mt: Khối lƣợng ống eppendorf trƣớc khi kết tủa (g)
+ ms: Khối lƣợng ống eppendorf sau khi kết tủa (g)
2.7.3. Phương pháp xác định một số dặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn
tuyển chọn
2.7.3.1. Phương pháp xác định hoạt tính catalase
Nhỏ trực tiếp vài giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc vi khuẩn lactic đã
đƣợc nuôi 48 giờ trong môi trƣờng MRS ở 370C. Quan sát sự xuất hiện bọt khí
bằng mắt thƣờng. Nếu thấy có xuất hiện bọt khí thì phản ứng là dƣơng tính,
ngƣợc lại khơng xuất hiện bọt khí là phản ứng catalase âm tính.
2.7.3.2. Nhuộm gram
- Các bƣớc tiến hành:
+ Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy 1 ít khuẩn lạc hịa vào 1
giọt nƣớc cất ở giữa phiến kính, làm khơ trong khơng khí.
+ Cố định tiêu bản vi khuẩn: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3

lần
17


+ Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút  Rửa nƣớc
+ Nhuộm bằng dung dịch Lugol trong 1 phút  Rửa nƣớc
+ Để nghiêng phiến kính 450, tẩy màu bằng cồn 90% khoảng 30 giây (khi
giọt cuối cùng chảy ra khỏi phiến kính khơng cịn màu)
+ Nhuộm bổ sung dung dịch Fuchsin khoảng 1 phút  Rửa nƣớc, để khơ
trong khơng khí
+ Soi kính: Sử dụng dầu soi kính và vật kính dầu để quan sát.
2.7.3.3. Khả năng lên men đường
a, Nguyên tắc:
- Các vi sinh vật sử dụng và lên men đƣờng sinh ra axit làm cho pH của
mơi trƣờng giảm. Khi đó, chất chỉ thị màu phenol red hiện diện trong môi
trƣờng từ màu đỏ chuyển sang màu vàng.
b, Tiến hành:
- Phân mơi trƣờng có các loại đƣờng vào các ống nghiệm
- Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút.
- Sau đó cấy 0,1ml dịch vi khuẩn vào môi trƣờng (ống đối chứng không
cấy dịch vi khuẩn), nuôi lắc ở 37oC trong 24 giờ.
- Quan sát sự đổi màu.
2.7.3.4: Phản ứng VP (Voges_Proskauer)
a, Nguyên tắc:
- Một số vi khuẩn len men đƣờng tạo axit pyruvic, sau đó tiếp tục chuyển
hóa thành acetyl metyl carbinol (ACM). Trong mơi trƣờng kiềm ACM bị oxy
hóa thành diacetyl. Diacetyl sẽ kết hợp với nhóm guadinin chứa trong acid amin
arginin của thuốc thử α- napton tạo thành hợp chất mào đỏ cam (VP dƣơng
tính).
b, Tiến hành:

- Phân mơi trƣờng vào các ống nghiệm.
- Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút.

18


- Sau đó cấy 0,1ml dịch vi khuẩn vào mơi trƣờng (ống đối chứng không
cấy dịch vi khuẩn), nuôi lắc ở 37oC trong 24 giờ.
- Sau đó, nhỏ 5 giọt dung dịch α- naphtol 6% (trong cồn 90%, giữ ở 4oC
trƣớc khi dùng) và 5 giọt NaOH 16% (trong nƣớc), lắc nhẹ. Nếu dịch thể chuyển
sang màu đỏ nâu là phản ứng dƣơng tính, màu vàng nhạt là âm tính.

19