Nghiên cứu giới hạn phát hiện (LOD) biến đổi gen trong đậu tương và các sản phẩm chế biến từ đậu tương phục vụ công tác kiểm nghiệm

LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành khóa luận này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS.
Lưu Minh Cúc và PGS.TS. Bùi Văn Thắng, những ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn
em trong suốt quá trình thực tập và viết khóa luận tốt nghiệp.
Em xin trân trọng cảm ơn quý Thầy, Cô trong Viện Công nghệ Sinh học –
Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam đã truyền đạt kiến thức trong những năm em học
tập. Với vốn kiến thức đƣợc tiếp thu trong q trình học khơng chỉ là nền tảng
cho q trình nghiên cứu khóa luận mà cịn là hành trang quý báu để em bƣớc
vào dời một cách vững chắc và tự tin.
Em chân thành cảm ơn các anh, chị tại Phòng Giám định Sinh vật và Sản
phẩm biết đổi gen – Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi trong quá trình em thực tập tại đây.
Cuối cùng em kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công
trong sự nghiệp nghề giáp cao q. Đồng kích chúc cơ và các anh, chị trong
Phòng Giám định Sinh vật và Sản phẩm biến đổi gen – Viện Di truyền Nông
nghiệp luôn dồi dào sức khỏe, đạt dƣợc nhiều thành công trong công việc.
n in

th n

nă

Sinh viên th c hi n
Nguyễn Phúc Hưng

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i
MỤC LỤC ............................................................................................................. ii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. v
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. T NG QU N T I IỆU ............................................................... 3
1.1.Cây trồng biến đổi gen .................................................................................... 3
1.1.1. Khái niệm về Cây trồng biến đổi gen ......................................................... 3
1.1.2. Tình hình sản xuất và thƣơng mại hóa cây trồng biến đổi gen ................... 3
1.1.3. Những vấn đề bàn luận xung quanh sản phẩm của cây trồng biến đổi gen ..
..................................................................................................................... 5
1.1.4. Một số sự kiện liên quan đến cay trồng biến đổi gen ................................. 7
1.1.5. Vấn đề dán nhãn sản phẩm biến đổi gen..................................................... 8
1.2.Khái qt về quy trình thí nghiệm và phƣơng pháp xác định giới hạn LOD
sản phẩm biến đổi gen ........................................................................................... 9
1.2.1. Quy trình thí nghiệm ................................................................................... 9
1.2.2. Tổng quan về phƣơng pháp tách chiết DNA dựa trên CTAB .................. 10
1.2.3. Định lƣợng và xác định độ tinh sạch của DNA ........................................ 11
1.2.4. Khái quát về giới hạn phát liện LOD (Limit of Detection) ...................... 12
1.2.5. Các phƣơng pháp điện di .......................................................................... 13
1.2.6. Các phƣơng pháp PCR .............................................................................. 13
CHƢƠNG 2.MỤC TI U, V T IỆU V PHƢƠNG PH P NGHI N CỨU .. 18
2.1. Mục tiêu........................................................................................................ 18
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 18
2.3. Vật liệu ......................................................................................................... 18
2.4. Phƣơng pháp tách chiết DNA ...................................................................... 18
2.4.1. Phƣơng pháp dựa trên CTAB.................................................................... 18
2.5. Định lƣợng và kiểm tra độ tinh sạch DNA trên máy NanoDrop2000 ......... 21
ii


2.6. Định lƣợng DN đã tách chiết bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose21

2.6.1. Hóa chất..................................................................................................... 21
2.6.2. Cách tiến hành ........................................................................................... 21
2.7. Realtime PCR ............................................................................................... 22
2.7.1. Thành phần phản ứng ................................................................................ 22
2.7.2. Biểu thị kết quả ......................................................................................... 24
2.8. Xác định giới hạn phát hiện LOD ................................................................ 24
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 26
3.1. Kết quả tách chiết DNA bằng phƣơng pháp CT B .................................... 26
3.2. Kết quả điện di kiểm tra DNA trên gel agarose 0,8% ................................. 27
3.3. Kết quả Realtime PCR và xác định giá trị LOD ......................................... 28
3.3.1. Kết quả Realtime PCR xác định giá trị OD đối với nền mẫu đậu tƣơng
hạt

................................................................................................................... 28

KẾT LU N V ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 41
1. KẾT LU N ..................................................................................................... 41
2. ĐỀ NGHỊ ......................................................................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... １

iii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Bp

Base pair

CTAB

Cetyltrimethylammonium bromide

DNA

Deoxyribonucleic Acid

RNA

Ribonucleic Acid

dNTP

Deoxynucleotide triphosphate

EDTA

Ethylenediaminetetra Acetic Acid

EtBr

Ethidium Bromide

Kb

Kilo base

GM

Genetically Modified (Biến đổi gen)

GMCs

Genetically Modified Crops (Cây trồng biến đổi gen)

GMOs

Genetically Modified Organism(Sinh vật biến đổi gen)

ISAAA

Cơ quan dịch vụ quốc tế và khuyến khích ứng dụng
công nghệ sinh học nông nghiệp

RNase

Ribonucleasa

PCR

Polymerase Chain Reaction

PVP

Polyvinyl-pyrrovylidon

TBE

Tris-Boric acid-EDTA

TCVN

Tiêu chuẩn Quốc gia

TE

Tris-EDTA

SDS

Sodium decyl sulfate

UV

Ultraviolet

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Các tính trạng chuyển gen đƣợc thƣơng mại hóa ............................................ 5
Bảng 2.1 : Trình tự mồi và mẫu dò sử dụng.................................................................... 22
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng Realtime PCR ............................................................. 23
Bảng 2.3: Chƣơng trình thời gian nhiệt độ Realtime PCR............................................. 24
Bảng 3.1 : Kết quả đo nồng độ DNA trên máy NanoDrop2000 ................................... 26
Bảng 3.2: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87705 ở nồng độ 0,01% ...........
................................................................................................................................. 28
Bảng 3.3: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87708 ở nồng độ 0,01% ...........
................................................................................................................................. 29
Bảng 3.4: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87701 ở nồng độ 0,01%. ..........

................................................................................................................................. 29
Bảng 3.5: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87705 tại điểm nồng độ 0.02%
................................................................................................................................. 30
Bảng 3.6: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87708 tại điểm nồng độ 0.02%.
................................................................................................................................. 32
Bảng 3.7: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87701 ..................................... 33
Bảng 3.8: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87705 tại điểm nồng độ 0,04%.
................................................................................................................................. 35
Bảng 3.9: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87708 tại điểm nồng độ 0,04%.
................................................................................................................................. 36
Bảng 3.10: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87701 tại điểm nồng độ
0,04%. ................................................................................................................................ 37
Bảng 3.11: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87705 tại điểm nồng độ 0.1%.
................................................................................................................................. 38
Bảng 3.12: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87708 tại điểm nồng độ 0.1%.
................................................................................................................................. 39
Bảng 3.13: Kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87701 ở điểm nồng độ 0.1%..
................................................................................................................................. 40

v


DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1: Kết quả điện di DNA tổng số trên gel agarose 0,8% .......................... 27
Hình 3.2. Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87705 ở nồng độ
0,01%. .................................................................................................................. 28
Hình 3.3. Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87708 ở nồng độ
0,01%. .................................................................................................................. 29
Hình 3.4. Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87701 ở nồng độ

0,01%. .................................................................................................................. 30
Hình 3.5. Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87705 ở nồng độ
0,02%. .................................................................................................................. 31
Hình 3.6. Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87708 ở nồng độ
0,02%. .................................................................................................................. 32
Hình 3.7. Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87701 ở nồng độ
0,02%. .................................................................................................................. 34
Hình 3.8. Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87705 ở nồng độ
0,04%. .................................................................................................................. 35
Hình 3.9. Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87708 ở nồng độ
0,04%. .................................................................................................................. 36
Hình 3.10. Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87701 ở nồng
độ 0,04%.............................................................................................................. 37
Hình 3.11. Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87705 ở nồng
độ 0,1%................................................................................................................ 38
Hình 3.12. Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87708 ở nồng
độ 0,1%................................................................................................................ 39
Hình 3.13. Biểu đồ kết quả Realtime PCR đối với sự kiện MON87701 ở nồng
độ 0,1%................................................................................................................ 40

vi


MỞ
Sinh vật biến đổi gen (Genetically Modified Organism – GMO) là những
sinh vật mà vật liệu di truyền đã đƣợc thay đổi nhân tạo trong phịng thí nghiệm
thơng qua kỹ thuật di truyền (genetic engineering – GE).
Sinh vật biến đổi gen (GMO) đƣợc tạo ra với những mục đích sử dụng
khác nhau, nhƣ tạo ta các giống cây trồng chuyển gen kháng sâu, kháng thuốc
diệt cỏ, v.v. [6]. Nhƣ vậy, một trong các mục đích và tiêu chí của cơng nghệ gen

là nhằm tạo ra những sinh vật biến đổi gen có thể đem lại những lợi ích to lớn
cho lồi ngƣời. Tuy nhiên, ít hay nhiều, sinh vật biến đổi gen đem lại sự hồi
nghi về tính an tồn trong quá trình sử dụng đối với con ngƣời và vật ni, thậm
chí một số quan diểm cho rằng GMO có thể ảnh hƣởng đến cân bằng sinh thái vì
quần thể GMCs (Genetically Modified Crops - GMCs) gây ra hiện tƣợng độc
canh làm xáo trộn các sinh cảnh và hệ sinh thái, làm giảm đa dạng sinh học do
các loài sinh vật khác khơng thể thích nghi nhanh với việc sử dụng ngay cây
biến đổi gen làm thức ăn đƣợc [8].
Đến nay, đã có 495 sự kiện chuyển gen đƣợc phê chuẩn, tập trung chủ yếu
vào một số cây trồng chính nhƣ ngơ (231 sự kiện); bơng (59 sự kiện); khoai tây
(47 sự kiện); cải dầu (40 sự kiện); đậu tƣơng (36 sự kiện) và các loại cây trồng
khác. Các nƣớc sử dụng sản phẩm biến đổi gen làm thực phẩm và thức ăn chăn
nuôi cũng tăng lên đến 40 nƣớc, trong đó có cả Cộng đồng châu Âu (EU), tính là
một nƣớc [9]. Việt Nam đã cấp phép 21 sự kiện ngô, đậu tƣơng biến đổi gen sử
dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Đây là một bƣớc tiến quan trọng
trong khâu quản lý để đảm bảo an ninh lƣơng thực trong nƣớc và quyền lợi
ngƣời tiêu dùng khi các thông tin về sản phẩm trở nên minh bạch, công khai hơn.
Các quyết định của cơ quan quản lý về việc có cấp phép hay khơng đối với một
số hoạt động liên quan đến sinh vật biến đổi gen đƣợc dựa trên quy trình phân
tích nguy cơ nghiêm ngặt, trong đó tập trung vào các bằng chứng khoa học và tƣ
vấn sâu rộng của các chuyên gia [7]. Các bằng chứng khoa học trên thế giới đã
1


chứng minh về tính an tồn của các sản phẩm đƣợc tạo ra từ các loại cây trồng
biến đổi gen (ISAAA, 2016). Thực phẩm có nguồn gốc từ sinh vật và sản phẩm
biến đổi gen trải qua nhiều thử nghiệm hơn bất cứ thực phẩm nào trong lịch sử.
Đối với Việt Nam, việc phát hiện biến đổi gen trong các sản phẩm thực
phẩm và thực hiện dán nhãn không liên quan đến an tồn thực phẩm mà chính là
để đảm bảo quyền lựa chọn của ngƣời tiêu dùng. Trong quá trình xây dựng

phƣơng pháp định tính, định lƣợng biến đổi gen trong các sản phẩm nông sản,
thực phẩm, việc xác định giới hạn phát hiện (Limit of detection - LOD), giới hạn
định lƣợng (Limit of quantification - OQ) là bƣớc quan trọng nhất để khẳng
định năng lực của phòng thử nghiệm.
Chính vì vậy, để phần nào phục vụ tốt hơn cho công tác giám định cây
trồng và sản phẩm biến đổi gen; tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu giới hạn
phát hiện (LOD) biến đổi gen trong đậu tương và các sản phẩm chế biến từ
đậu tương phục vụ cơng tác kiểm nghiệm”, qua đó khẳng định độ tin cậy,
chính xác về mặt kỹ thuật của các phịng thí nghiệm hoạt động theo tiêu chuẩn
quốc tế ISO/IEC 17025 theo tiêu chí tồn cầu hóa “M t tiêu chuẩn - m t lần thử
nghi m - được chấp nhận ở mọi nơi”.

2


CHƢƠNG 1.
NG

N TÀI LIỆU

1.1. Cây trồng biến đổi gen
1.1.1. Khái niệm về Cây trồng biến đổi gen
Cây trồng biến đổi gen (Genetically Modified Crop - GMC) là loại cây
trồng đƣợc tạo ra bằng cách sử dụng các kỹ thuật của cơng nghệ sinh học hiện
đại, hay cịn gọi là kỹ thuật di truyền, công nghệ gene hay công nghệ DNA tái tổ
hợp, để chuyển một hoặc một số gene chọn lọc nhằm tạo ra cây trồng mang tính
trạng mong muốn.
Đậu tƣơng biến đổi gen đƣợc tạo bằng cách sử dụng các kỹ thuật của công
nghệ sinh học hiện đại để chuyển một hoặc một số gen có giá trị để tạo ra giống
đậu tƣơng mang những tính trạng mong mn nhƣ chống chịu tốt với các điều

kiện bất lợi của môi trƣờng, hay chống chịu sâu bệnh, cho năng suất cao.
1.1.2. Tình hình sản xuất và thương mại hóa cây trồng biến đổi gen
Theo số liệu báo cáo của Trung tâm dịch vụ Quốc tế và tiếp thu các ứng
dụng Công nghệ Sinh học trong Nông nghiệp (IS

, 2015), đến nay các nhà

khoa học trên thế giới đang tập trung nghiên cứu, phát triển cây trồng biến đổi
gen cho 24 loại cây trồng khác nhau với 364 sự kiện (Event) chuyển gen đã
đƣợc tạo ra, bao gồm các nhóm cây lấy hạt, cây lấy dầu, cây lấy củ, cây lấy quả,
cây lấy sợi và cây hoa.
 Tình hình phát triển cây trồng biến đổi gen
Theo báo cáo hàng năm của IS

, sau 19 năm phát triển (kể từ năm

1996), các loại cây trồng chuyển gen đƣợc thƣơng mai hóa ngày càng tăng qua
các năm. Tính riêng năm 2014, cây trồng biến đổi gen đƣợc trồng rộng rãi tại 28
nƣớc với tổng diện tích khoảng 181,5 triệu ha (số nƣớc trồng cây biến đổi gen
tăng 4 lần, diện tích tăng hơn 100 lần so với năm 1996), tỷ lệ tăng trƣởng hằng
năm khoảng 3 đến 4%. Trong đó Hoa kỳ là quốc gia đứng đầu về diện tích cây
trồng chuyển gen trên thế giới (73,1 triệu ha, chiếm 40%), tiếp đến là Barazil
(42,2 triệu ha), Argentina (24,3 triệu ha), Ấn Độ (11,6 triệu ha), Canada (11,6
3


triệu ha). Điều đáng chú ý là số các quốc gia đang phát triển đƣa cây trồng biến
đổi gen vào canh tác ngày càng tăng trong khi các nƣớc phát triển (đặc biệt là
các nƣớc châu Âu) rất hạn chế mở rộng diện tích. Khoảng 10 năm đầu, từ 19962006, các nƣớc đang phát triển sử dụng cây trồng biến đổi gen trong canh tác
cịn rất ít. Tuy nhiên, khoảng cách đã dần thu hẹp ở các năm sau đó.

Trong 3 năm gần đây, diện tích cây trồng biến đổi gen ở các nƣớc đang
phát triển luôn cao hơn các nƣớc phát triển (khoảng 100 triệu ha năm 2016 so
với 81 triệu ha năm 2014). Điều này cho thấy, cây trồng chuyển gen đang đóng
góp tích cực cho phát triển nông nghiệp và tăng trƣởng kinh tế đặc biệt là các
nƣớc đang phát triển do giảm đƣợc chi phí sản xuất, nâng cao năng suất. Dựa
vào kết quả của 147 nghiên cứu đƣợc thực hiện trong 20 năm cho thấy, việc
trồng cây chuyển gen đã giảm 37% lƣợng phân bón hóa học, tăng 22% năng suất
cây trồng, lợi nhuận của ngƣời nơng dân tăng 68%. Ngồi ra, việc trồng cây
chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ, kháng sâu bệnh hại đã giảm đáng kể lƣợng
thuốc trừ sâu sử dụng, góp phần hạn chế ô nhiễm môi trƣờng, cân bằng sinh thái.
Mặc dù rất nhiều gen đƣợc ứng dụng chuyển vào trong cây nhƣng cho tới
nay mới chỉ có 7 nhóm tính trạng đƣợc phép thƣơng mại hóa (Bảng 1.1), bao
gồm khả năng chống chịu các stress phi sinh học, năng suất hạt, kháng côn trùng,
kháng thuốc diệt cỏ, nâng cao chất lƣợng, kiểm sốt sự thụ phấn. Trong đó 3
nhóm cây trồng chuyển gen đƣợc canh tác chủ yếu gồm: kháng thuốc diệt cỏ
(trên 100 triệu ha), đa tính trạng (khoảng 50 triệu ha), kháng côn trùng (khoảng
27 triệu ha). Đậu tƣơng, bông, ngô và cây cải dầu là 4 cây trồng đƣợc canh tác
rộng rãi nhất. Trong tổng số 111 triệu ha đậu tƣơng, giống chuyển gen chiếm
85% diện tích, bông chiếm 68% trong tổng số 37 triệu ha, ngô chiếm 30% trong
tổng số 184 triệu ha, cải dầu chiếm 25% trong 36 triệu ha.

4


Bảng 1.1: Các tính trạng chuyển gen đƣợc thƣơng mại hóa
Tính trạng
Chống chịu stress phi sinh

Cây trồng
Ngơ, mía đƣờng

học
Tăng năng suất hạt

Đậu tƣơng

Kháng bệnh

Đậu, đu đủ, mận, khoai tây, bí, ớt ngọt, cà chua

Kháng thuốc diệt cỏ

Alfalfa, cải dầu, cẩm chƣớng, bông, lanh, ngô,
rau diếp xoăn, khoai tây, đậu tƣơng, thuốc lá, lúa,
lúa mì, củ cải đƣờng

Kháng cơn trùng

Alfalfa, cải dầu, cẩm chƣớng, bông, lanh, ngô,
rau diếp xoăn, khoai tây, đậu tƣơng, thuốc lá, lúa,
lúa mì, củ cải đƣờng

Nâng cao chất lƣợng

Alfalfa, táo, cải dầu, cẩm chƣớng, ngô, chanh,
petunia, khoai tây, hoa hồng, lúa, đậu tƣơng,
thuốc lá, cà chua

Kiểm soát thụ phấn

Cải dầu, rau diếp xoăn, ngô

1.1.3. Những vấn đề bàn luận xung quanh sản phẩm của cây trồng biến đổi
gen
 Những quan điểm ủng hộ sinh vật biến đổi gen
Hiện nay, những nƣời ủng hộ nhiệt tình việc sử dụng sinh vật biến đổi gen
cho rằng: có thể sản xuất đƣợc hạt giống chống lại đƣợc những điều kiện khắc
nghiệt của mơi trƣờng; tạo ra vật ni có năng suất hơn; tạo ra cây trồng cho
năng suất cao ở đất nghèo dinh dƣỡng; giảm đƣợc nhu cầu sử dụng hóa chất; có
thể tạo ra vacxin hoặc dễ dàng hơn trong việc xác định những căn bệnh bằng
cách sử dụng dấu hiệu của gen hoặc xác định sớm các gen dị tật [3].
Theo cuộc điều tra của Hội đồng Thông tin Thực phẩm Quốc tế (IFIC)
năm 2012, 69% ngƣời tiêu dùng Hoa Kỳ tin tƣởng vào sự an toàn của nguồn
cung ứng thực phẩm ở quốc gia này.
5


Nghiên cứu cơng bố trên tạp chí Nature của các nhà nghiên cứu tại Học
viện Khoa học Nông nghiệp Trung Quốc cho rằng cây trồng biến đổi di truyền
có khả năng kháng sâu bệnh có thể cắt giảm việc sử dụng thuốc trừ sâu xuống
một nửa từ năm 1997 đến năm 2012 [10].
Theo tạp trí Science xuất bản tháng 2 năm 2016, các nhà sinh học thực vât
(ASBP) ủng hộ việc sử dụng kỹ thuật nhƣ một công cụ hữu hiệu để thúc đẩy an
ninh lƣơng thực và giảm tác động tiêu cực đến môi trƣờng của nông nghiệp.
SBP đã thu thập đƣợc hơn 1400 chữ ký từ cộng đồng của các nhà khoa học
thực vật, các quan chức trong một số tổ chức chính phủ và khoa học trên toàn
thế giới, cho thấy sự đồng thuận rõ rang về việc sử dụng công nghệ biến đổi gen
cho cây trồng là an toàn và hiệu quả [11].
Các cuộc khảo sát trực tuyến năm 2016 đã thu đƣợc trên 2.000 phiếu trả
lời, trong đó hai phần ba bày tỏ sự ủng hộ đối với thực phẩm biến đổi gen, miễn

là các sản phẩm này không gây hại cho sức khỏe cộng đồng và mơi trƣờng. Hơn
nữa, gần một nửa (44%) nói rằng về nguyên tắc họ chấp nhận các loại cây trồng,
trong khi 10% tin rằng thực phẩm biến đổi gen là giải pháp duy nhất để nuôi
sống số dân ngày càng tăng. Có 27% số ngƣời đƣợc hỏi cho rằng họ không chấp
nhận các phƣơng pháp tham gia vào việc sản xuất thực phẩm biến đổi gen [17].
 Những quan điểm phản đối sinh vật biến đổi gen
Những ý kiến phản đối việc sử dụng lúa mì biến đổi gen cho rằng loài
ngƣời đối mặt với nguy cơ thiếu lƣơng thực là do việc khai thác không bền vững
hệ sinh thái, ngay cả việc sử dụng sinh vật biến đổi gen cũng không giải quyết
đƣợc những vấn đề khác của loài ngƣời nhƣ bùng nổ dân số, sự can thiệp vào
nơng nghiệp q mức, thiếu năng lƣợng. Vì vậy, điều cần thiết không phải sinh
vật biến đổi gen mà là những phƣơng pháp nông nghiệp hiện đại. Hơn nữa, sử
dụng lúa mì biến đổi gen có thể đƣa những thay đổi DN

vào ngƣời mà chƣa

thể dự báo trƣớc đƣợc [8].
Ngƣời dân ở một số nƣớc lo lắng về việc chính phủ nhiều nƣớc hỗn thu
mua lúa mì biến đổi gen khi họ đã làm ra, trong khi họ hoàn toàn phụ thuộc vào
6


nhà cung cấp hạt giống cây biến đổi gen, vì lý do bản quyền, họ khơng cịn khả
năng tạo ra và giữ lại đƣợc giống từ chính cây họ trồng để dùng cho những năm
tiếp theo [5].
Theo Michael Antoniou và cộng sự, một lƣợng lớn và ngày càng tăng của
các bằng chứng khoa học có uy thế khác nhau cho thấy rằng những tuyên bố ủng
hộ cây trồng biến đổi gen có thể là khơng đúng. Các bằng chứng đƣợc trình bày
trong báo cáo chỉ ra rằng cây GM đƣợc làm trong phịng thí nghiệm, sử dụng
cơng nghệ hồn tồn khác so với phƣơng pháp tự nhiên, không đƣợc điều chỉnh

một cách hợp lý để đảm bảo an tồn, khơng tăng tiềm năng, không những không
giảm việc sử dụng thuốc trừ sâu mà còn làm tăng việc sử dụng chúng, tạo ra
những vấn đề nghiêm trọng đối với nông dân, bao gồm các loại cây trồng siêu
sâu chịu thuốc diệt cỏ, chất lƣợng đất bị phá hoại, cây trồng bị mẫn cảm, làm
ảnh hƣởng đến chất lƣợng đất, phá vỡ hệ sinh thái và giảm đa dạng sinh học.
không thể giải quyết vấn đề đói nghèo trên thế giới mà còn làm phân tán sự chú
ý đến các nguyên nhân thực sự gây đói nghèo[12].
1.1.4. Một số sự kiện liên quan đến cay trồng biến đổi gen
IITA (Viện Nông nghiệp nhiệt đới quốc tế) đƣa ra giống đậu tƣơng tốt
hơn cho nông dân châu Phi.Ba giống đậu tƣơng mới đƣợc phát triển bởi IIT đã
đƣợc đƣa ra tại Malawi và Nigeria. Giống đậu tƣơng TGx1740-2F đƣợc phát
triển bởi IITA và Sở nghiên cứu nppng nghiệp Dịch vụ Malawi (DARS), trong
khi các giống TGx1987-10F và TGx1987-62F đƣợc phát triển bởi IITA và Viện
nghiên cứu ngũ cốc Quốc gia Nigeria (NCRI). Việc đƣa ra giống đậu Malawi đã
đƣợc sự chấp thuận của Ủy ban Khai báo Công nghệ nông nghiệp (ATCC) ngày
18/1/2011, và việc đƣa ra 2 phiên bản khác đã đƣợc phê duyệt bởi Ủy ban công
bố giống của Nigeria ngày 02/12/2010. Nhà tạo giống đậu tƣơng của IITA ông
Hailu Tefera cho biết TGx1740-2F vƣợt quá sản lƣợng hạt giống đƣợc trồng
rộng rãi là Magoye tại nhiều điểm thử nghiệm trong hai năm qua.“Tại Nigeria,
giống sinh trƣởng vừa là TGx1987-10F và TGx1987-62F đã chứng minh khả

7


năng rất cao trong việc chống bệnh rỉ sét, bạc lá vi khuẩn và đốm lá Cercospora”,
ông Ranajit Bandyopadhyay, nhà nghiên cứu bênh học tại IITA cho biết.
Tháng 7 năm 2016, hơn 100 học giả đoạt giải Nobel đã ủng hộ GMOs và
việc đổi mới công nghệ sinh học trong nông nghiệp bằng cách ký một lá thƣ kêu
gọi Tổ chức Hịa bình xanh chấm dứt hành động phản đối GMO, đặc biệt với
Gạo vàng. Họ cũng kêu gọi các chính phủ trên tồn thế giới từ chối chiến dịch

của Tổ chức Hịa bình xanh chống lại Gạo vàng và các loại cây trồng, thực phẩm
mới đƣợc tạo ra bằng cơng nghệ sinh học nói chung. Bức thƣ đƣợc gửi đến các
nhà lãnh đạo của Tổ chức Hịa bình xanh, Liên Hiệp Quốc và các chính phủ trên
tồn thế giới. Bức thƣ đã dẫn rằng các cơ quan khoa học và pháp lý trên toàn thế
giới đã thống nhất và luôn khẳng định rằng các loại thực phẩm và cây trồng
đƣợc cải tiến bằng phƣơng pháp công nghệ sinh học là an tồn tƣơng đƣơng,
thậm chí an tồn hơn những thực phẩm và cây trồng đƣợc phát triển bằng những
phƣơng pháp truyền thống khác. Chƣa có một trƣờng hợp nào cho thấy các tác
động tiêu cực lên sức khỏe con ngƣời hay động vật khi ăn các loại thực phẩm và
cây trồng biến đổi gen. á thƣ đã kêu gọi mạnh mẽ chính phủ các quốc gia trên
tồn thế giới thực hiện mọi giải pháp có thể trong quyền hạn của mình để phản
đối các hành động của Tổ chức Hịa bình xanh; và tạo điều kiện để nơng dân có
thể tiếp cận nhanh nhất với các cơng cụ sinh học hiện đại, đặc biệt là các giống
cây trồng biến đổi gen.
1.1.5. Vấn đề dán nhãn sản phẩm biến đổi gen
Trong cuộc tranh luận xung quanh thực phẩm biến đổi gen (GM), tranh
cãi liên quan về việc liệu sản phẩm thực phẩm biến đổi gen phải đƣợc dán nhãn
hay không. Các tranh cãi này xảy ra trên các tập đoàn kinh tế và các nhà làm
chính sách, chủ yếu là ở Mỹ và châu Âu [13].
Ngƣời tiêu dùng thực phẩm phải có đầy đủ thơng tin về những gì họ tiêu
thụ, các thuộc tính của sản phẩm và các tác động tức thì hay lâu dài liên quan
đến việc tiêu thụ hang hóa hoặc dịch vụ. Đối với sản phẩm biến đổi gen, thơng
qua việc ứng dụng các quy trình công nghệ sinh học trong nông nghiệp phức tạp,
8


rất khó để ngƣời tiêu dùng có thể hiểu biết các kỹ thuật khoa học đã đƣợc dùng
trong sản xuất hàng hóa, tác dụng của việc tiêu dùng các sản phẩm đó lên sức
khỏe trong ngắn hạn và dài hạn, hoặc ảnh hƣởng của sản xuất và tiêu dùng đến
các vấn đề rộng hơn nhƣ môi trƣờng, đạo đức và tôn giáo. Nếu thiếu đi các

thông tin đầy đủ nhƣ trên, ngƣời tiêu dùng đƣợc cho là thiếu chủ quyền và
không thể đƣa ra quyết định tiêu dùng hợp lý [14].
Bắt đầu từ tháng 1 năm 2016, thực phẩm biến đổi gen (GM) tại Việt Nam
phải đƣợc ghi nhãn theo quy định tại Thông tƣ liên tịch số 45/2015/TTLTBNNPTNT-BKHCN của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn và Bộ Khoa
học và Công nghệ[1]. Đối tƣợng áp dụng của Thông tƣ này là các sản phẩm thực
phẩm có chứa ít nhất một thành phần GM chiếm trên 5% của tổng số các thành
phần của sản phẩm. Sản phẩm GM với tổng diện tích ghi nhãn nhỏ hơn 10cm2,
nhà sản xuất phải ghi cụm từ “biến đổi gen” trên nhãn. Thực phẩm chuyển gen
có nhãn khơng đúng quy cách sẽ khơng đƣợc phép sản xuất, kinh doanh bắt đầu
từ tháng 1 năm 2016. Nếu đến ngày đó, các loại thực phẩm đang lƣu hành trên
thị trƣờng, chúng có thể tiếp tục đƣợc phép kinh doanh cho đến ngày hết hạn sử
dụng. Thực vật, động vật GM tƣơi và sống, thực phẩm GM khơng đóng gói, và
những sản phẩm chỉ để xuất khẩu là một số mặt hàng không thuộc đối tƣợng quy
định này.
1.2.Khái qt về quy trình thí nghiệm và phƣơng pháp xác định giới hạn
LOD sản phẩm biến đổi gen
1.2.1. Quy trình thí nghiệm
Về cơ bản, các mẫu thử nghiệm của phịng thí nghiệm đề đƣợc xử lý theo
quy trình sau:

9


Kết quả của phịng thí nghiệm sẽ dựa trên kết quả sàng lọc với promoter
35S và Terminator TNOS để kết luận là mẫu cho kết quả âm tính hay dƣơng tính
với loại gen đƣợc sàng lọc.
1.2.2. Tổng quan về phương pháp tách chiết DNA dựa trên CTAB
Phƣơng pháp này có thể dùng để chiết DNA từ thực vật và các loại chất
nền có nguồn gốc thực vật, đặc biệt do có khả năng loại bỏ các hợp chất
polisacarit và polyphenol vốn có ảnh hƣởng đến chất lƣợng DN . Phƣơng pháp

này có thể dùng cho các loại chất nền khác, thơng dụng trong việc chuẩn bị
DNA ở các phịng thí nghiệm.
Qua bƣớc phân giải bằng nhiệt với sự có mặt của CTAB, tiếp theo là các
bƣớc loại bỏ các tạp chất nhƣ polisacarit và các protein mà thu đƣợc sản phẩm là
DNA tổng số tinh sạch[15].
Đối với một vài loại chất nền, cần tiến hành một số bƣớc có sự tham gia
của enzyme khác nhau. Alpha-amylaza đƣợc cho vào dung dịch đệm phân giải
để thủy phân các tinh bột khi các chất nền có chứa nhiều tinh bột. Việc xử lý

10


mẫu bằng proteinaza-K là cần thiết đối với nhiều loại chất nền khi việc kết tủa
đồng thời RNA có thể làm nhiễu phép phân tích tiếp theo.
Nồng độ muối trong suốt quá trình tách chiết là rất quan trọng trong việc
loại bỏ các tạp chất, vì sự kết của của axit CTAB-nucleic sẽ xảy ra nếu nồng độ
muối giảm xuống thấp khoảng 0,5 mol/l ở nhệt độ phòng và/hoặc nếu nhiệt độ
giảm xuống dƣới 160C. Bằng cách tăng nồng độ muối, việc loại bỏ các protein
đã biến tính và polysacarit đƣợc tạo phức với CTAB sẽ đƣợc thực hiện, lúc đó
axit nucleic sẽ đƣợc hịa tan. Clorofom đƣợc dùng để tách tiếp các axit nucleic
ra khỏi CTAB và các hợp chất polysacarit/protein.
Cuối cùng, các axit nucleic đƣợc tinh sạch bằng kết tủa isopropanol và rửa
bằng ethanol.
1.2.3. Định lượng và xác định độ tinh sạch của DNA
Để xác định độ tinh sạch và hàm lƣợng hỗn hợp DN , RN thu đƣợc sau
khi tách chiết, ngƣời ta dùng phƣơng pháp đo quang phổ và phƣơng pháp điện di.
Phƣơng pháp đo quang phổdựa trên khả năng hấp thụ ánh sáng có bƣớc
sóng khác nhau của các bazơ nitơ của các phân tử DNA mạch kép hoặc đơn. Giá
trị mật độ quang ở bƣớc sóng 260nm (Optical Density – OD260) cho phép xác
định nồng độ DNA trong dung dịch.

Một đơn vị OD ở bƣớc song 260nm ký hiệu là A260nm
A260nm= 50 µg/ml cho dung dịch DNA mạch kép
A260nm= 33µg/ml cho dung dịch DNA mạch đơn
A260nm= 40µg/ml cho dung dịch RNA
Cơng thức xác định hàm lƣợng DNA trong dung dịch:
cDNA (µg/ml)= 50 x A260nm x hệ số pha loãng
Để đánh giá độ tinh sạch của dung dịch DN , ngƣời ta đo dung dịch tại
bƣớc sóng A280nm là mức hấp thụ cực đại của protein. Nhƣng protein cũng hấp
thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 260nm do đó làm sai lệch giá trị thật sự của nồng độ
axit nucleic.
- Nếu tỉ lệ A260nm/A280nm = 1.8-2.0 thì có thể xem DNA chiết là tinh sạch.
11


- Nếu tỉ lệ A260nm/A280nm > 2 nhiễm RNA, DNA bị biến tính hoặc phân hủy.
- Nếu tỉ lệ A260nm/A280nm< 1.8 dung dịch lẫn tạp chất.
1.2.4. Khái quát về giới hạn phát liện LOD (Limit of Detection)
Thông thƣờng, từ “độ nhạy” đƣợc dùng để biểu thị khả năng của một
phƣơng pháp phân tích hoặc dụng cụ phân tích khi nói về khả năng phát hiện
một lƣợng rất nhỏ hợp chất. Ngày nay, độ nhạy là một thuật ngữ dùng để chỉ
mức độ đáp ứng phát hiện liên quan đến hàm lƣợng của một thành phần trong
mẫu một cách chính xác, “giới hạn phát hiện” hay “giới hạn định lƣợng” là một
chỉ số của khả năng phát hiện.
Định nghĩa: Giới hạn phát hiện ( OD) là lƣợng hoặc nồng độ thấp nhất
của trình tự gen đích có thể phát hiện nhƣng không nhất thiết định lƣợng đƣợc.
OD đƣợc xác định trong cả phƣơng pháp định tính, định lƣợng. [2]
-

OD tƣơng đối (%): có thể phân tích một vật liệu dƣơng tính (ví dụ

0.1%) trong tối thiểu 10 lần lặp, nếu cả 10 kết quả lặp là dƣơng tính, điều đó có
nghĩa là OD bằng hoặc thấp hơn giá trị đƣợc đo.
- LOD tuyệt đối (số bản sao): để tính tốn LOD của phƣơng pháp ở mức
tin cậy 95%, cần phân tích tối thiểu 10 kết quả lặp lại PCR, tính tốn giá trị
dƣơng tính giả. Nếu tỉ lệ dƣơng tính giả <5%, tại đó, chính là giá trị LOD tuyệt
đối.
Tiêu chí đánh giá: Đối với sản phẩm biến đổi gen, ngƣỡng dán nhãn của
Việt Nam là 5% (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Bộ Khoa học và
Công nghệ, 2015). Giá trị OD của phƣơng pháp nên thấp hơn 20 lần nồng độ
mục tiêu, liên quan đến ngƣỡng kiểm soát theo luật định, thì OD nên < 0,25%
để đảm bảo độ chính xác của phƣơng pháp.
Giá trị LOD rất có ý nghĩa trong phƣơng pháp định tính, đƣợc dùng để
đánh giá chất lƣợng phòng thử nghiệm, bao gồm các tiêu chí: con ngƣời, trang
thiết bị, dụng cụ, hóa chất theo tiêu chuẩn phòng thử nghiệm ISO/IEC 17025.

12


1.2.5. Các phương pháp điện di
1.2.5.1. Điện di trên gel agarose
Agarose là một polymer trung tính tạo nên từ tính đông tụ của agar. Cấu
trúc của agarose không đồng nhất: vừa tích điện, vừa trung hịa. Trong phân tử
có chứa nhóm sunfat, metoxyl, cacboxyl.Hàm lƣợng sunfat trong agarose đƣợc
coi là chỉ số độ sạch của agarose.Chỉ số này càng thấp thì chất lƣợng càng cao
và ngƣợc lại, thƣờng trong agarose có 0.04% sunfat.
Đây là phƣơng pháp thơng dụng để xác định nồng độ DNA trong các
dung dịch. Điện di gel agarose của DNA và nhuộm màu ethidium bromua (EtBr)
đƣa ra cách ƣớc tính số lƣợng DNA và phân tích tại cùng một thời điểm trạng
thái tự nhiên của chúng (ví dụ: độ phân hủy, sự có mặt của RN cịn dƣ và một
số tạp chất). Phƣơng pháp này có thể áp dụng để kiểm tra nếu DN

chƣa đủ

sạch và có thể còn chứa các tạp chất hấp thụ tia UV[16]. Điện di gel thƣờng
không đƣợc khuyến cáo để định lƣợng DN

đã bị biến tính.Trong trƣờng hợp

này, có thể áp dụng các phƣơng pháp khác.
1.2.5.2. Điện di trên gel polyacrylamide
Gel polyacrylamide là gel đƣợc tạo thành do sự polymer hóa các đơn phân
tử acrylamide và N, N’- merthylene-bis-acrylamide. Trong đó acrylamide là một
đơn phân tử có cấu trúc CH2=CH-CO-NH2 và bis-acrylamide có cấu trúc
CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2.
Phƣơng pháp này dung trong phân tách các phân tử DN

có kích thƣớc

nhỏ hơn 500 nucleotide. Điện di trên gel polyacrylamide có thể tách riêng từng
phân tử DNA khác biệt 1 nucleotide.
1.2.6. Các phương pháp PCR
1.2.6.1.Tổng quan về phƣơng pháp PCR
Vào năm 1985, K.Mullis đã phát minh ra phƣơng pháp đơn giản để
khuếch đại nhanh nhiều bản sao (amplification) của các đoạn DNA mà khơng
cần sự có mặt của các tế bào.Kĩ thuật này đƣợc gọi là Polymerase Chain
Reaction, viết tắt là PCR.Thực chất kĩ thuật PCR là phƣơng pháp tạo dòng (nhân
13


bản) DNA trong phịng thí nghiệm. Thành phần phản ứng PCR DNA sau khi

đƣợc tách chiết sẽ đƣợc bổ sung vào eppendorf chứa hỗn hợp các thành phần
của phản ứng PCR.
 Thành phần phản ứng PCR
- DNA mẫu (DNA cần khuếch đại): khơng cần độ tinh sạch cao, DNA
khn có thể là mạch đơn hoặc mạch đôi của mỗi đoạn DN hay RN , thƣờng
dài từ 300bp trở lên, đƣợc biết trƣớc trình tự ở 2 đầu thiết kế mồi. Thông thƣờng,
lƣợng DNA khuôn cho mỗi phản ứng nên sử dụng khoảng dƣới 1µg đối với
DNA hệ gen.
- Các mồi (primer): gồm mồi xuôi và mồi ngƣợc. Là những đoạn
oligonucleotide mạch đơn dài 6-100bp, có trình tự bazơ nitơ bổ trợ với bazơ nitơ
của 2 đầu đoạn DN

khn. Nó đƣợc sử dụng để làm mồi cho sự khởi đầu quá

trình tổng hợp DN . Các đoạn mồi cần mang tính đặc thù để làm tăng tính đặc
hiệu của phản ứng.
- Enzyme Taq DNA Polymerase chịu nhiệt. Thông dụng nhất là Taq DNA
polymerase. Taq DNA polymaresa có trọng lƣợng phân tử 94kDa và hoạt động
tốt nhất ở 70-80oC.
- dNTP: các loại nucleotide triphosphate nhƣ: d TP, dTTP, dCTP, dGTP
- Dung dịch đệp (buffer) thích hợp MgCl2.
- Nƣớc cất 2 lần.
 Chu kỳ của phản úng PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm
3 bƣớc:
- Bƣớc 1: Giai đoạn biến tính (denaturing)
Phân tử DN

đƣợc biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thƣờng

là ở 94-95oC trong vòng 30 giây đến 1 phút.
- Bƣớc 2: Giai đoạn lai hay gắn denaturing mồi (Annealing)

14


Nhiệt độ đƣợc hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép mồi bắt cặp
với khuôn.Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-70oC, tùy
thuộc vào Tm của các mồi sử dụng và kéo dài 30 giây – 1 phút.
- Bƣớc 3: Giai đoạn tổng hợp hay giai đoạn kéo dài (elongation)
Nhiệt độ đƣợc tăng lên đến 72oC. Thời gian phụ thuộc vào cả DN polymerase và chiều dài DN

cần khuếch đại.Một chu kỳ bao gồm nhiều bƣớc

nhƣ trên sẽ đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần lặp lại làm tăng gấp đôi lƣợng
mẫu của lần trƣớc. Số lƣợng chu kỳ khoảng từ 35 đến 40.
1.2.6.2.Realtime PCR
Là kỹ thuật PCR mà kết quả nhân bản DN đích trong ống nghiệm, thành
hàng tỷ bản sao, đƣợc hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Do đặc
điểm này nên ngƣời làm thí nghiệm khơng cần thiết phải làm tiếp các thao tác
sau đó để phát hiện sản phẩm nhân bản (điện di sản phẩm PRC trên gel agarose
hoặc lai với các đoạn dò đặc hiệu trên màng, giếng,..).
Real-time PCR là một cải tiến của phƣơng pháp PCR dựa trên chức năng
5’-3’ polymerase của Taq DNA polymerase do Holland và cộng sự công bố năm
1991. Trong phản ứng real-time PCR, ngƣời ta thƣờng sử dụng hai tác nhân phát
huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào DNA mạch đôi (Ethidium Bromide,
SYBR Green, EvaGreen,…) hoặc tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu
(F M, HEX,…).
Với việc sử dụng mẫu dò đánh dấu huỳnh quang màu FAM (mẫu dò
TaqMan) đặc hiệu cho đoạn gen đƣợc nhân bản, sự gia tăng số lƣợng sản phẩm

PCR có thể đƣợc theo dõi theo thời gian thực (real-time) bằng cách đo mật độ
tín hiệu huỳnh quang phát ra trong suốt q trình PCR. Mẫu dị TaqMan bao
gồm một đoạn DNA mạch đơn dài khoảng 30-40 nucleotide đặc hiệu cho vùng
gen mục tiêu cùng với phân tử phát huỳnh quang (reporter) và phân tử thu hút
huỳnh quang (quencher) đƣợc gắn cộng hóa trị ở hai đầu. Khi mẫu dị cịn
ngun vẹn, tín hiệu huỳnh quang phát ra bởi reporter sẽ bị quencher thu hút.
Khi phản ứng PCR xảy ra, mẫu dò bắt cặp với vùng gen mục tiêu nằm giữa 2
15


mồi và bị phân cắt bởi hoạt tính 5’-3’ exonuclease của Taq DNA polymerase.
Lúc này phân tử reporter và quencher đƣợc tách nhau ra và tín hiệu huỳnh quang
thu đƣợc từ reporter trở nên mạnh hơn. Sự gia tăng tín hiệu này mạnh hơn sau
mỗi chu kỳ và tƣơng ứng với lƣợng sản phẩm PCR đƣợc tạo ra.
Biểu đồ nhân bản của Realtime PCR có các đặc tính
sau:

-

ƣờng nền (baseline): đƣợc định nghĩa là số chu kỳ PCR trong đó tín

hiệu huỳnh quang đặc hiệu tích lũy dần nhƣng chƣa đạt ngƣỡng nhận biết của
thiết bị. Theo mặc định, đƣờng nền đƣợc xác lập trong khoảng chu kỳ 3 đến 15
và có thể thay đổi.
- Ngƣỡng (Threshold): là một giá trị huỳnh quang đƣợc xác lập một
cách tùy ý, dựa trên đƣờng nền. Một tín hiệu huỳnh quang phát hiện trên ngƣỡng
đƣợc xem là tín hiệu đặc hiệu, và sẽ đƣợc sử dụng để xác định chu kỳ ngƣỡng.
Ngƣỡng đƣợc thiết lập theo từng thí nghiệm và nó thƣờng cắt tất cả các đƣờng
tín hiệu đặc hiệu trong pha nhân bản cấp số mũ (exponential phase).
16

- Chu kỳ ngƣỡng ( Threshold cycle – Ct): đƣợc định nghĩa là số chu kỳ
PCR mà ở đó tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu lớn hơn ngƣỡng. Nói cách khác, đó
là số chu kỳ PCR ở đó tín hiệu đặc hiệu vƣợt khỏi tín hiệu nền. Đây chính là
nguyên lý cơ bản của real-time PCR và là yếu tố quyết định tính chính xác là lặp
lại của kết quả. Số trình tự mục tiêu trong mẫu ban đầu càng cao thì số chu kỳ
cần để vƣợt ngƣỡng phát hiện càng nhỏ, nghĩa là giá trị Ct càng thấp.
Hỗn hợp phản ứng PCR chứa một cặp mồi đƣợc thiết kế bắt cặp đặc hiệu
vùng trình tự gen để nhân bản một trình tự gen mục tiêu có kích thƣớc biết trƣớc.
Sản phẩm nhân bản đƣợc phát hiện bởi tín hiệu huỳnh quang có đƣợc do sự
phân cắt mẫu dị TaqMan đánh dấu màu F M đặc hiệu.Từ biểu đồ nhân bản, có
thể xác định đƣợc sự vắng mặt hay có mặt của gen cần xác định.

17


CHƢƠNG 2.
IỆ

MỤC TIÊU,

HƢƠNG H

NGHI N C

2.1. Mục tiêu
Xác định đƣợc giới hạn về hàm lƣợng sản phẩm biến đổi gen trong nền
mẫu hạt, thức ăn chăn nuôi và thực phẩm có chứa đậu tƣơng có thể phát hiện
bằng phƣơng pháp Realtime PCR tại Phòng Giám định Sinh vật và Sản phẩm

biết đổi gen – Viện Di truyền Nông nghiệp.
2.2. Nội dung nghiên cứu
-

Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu Đậu tƣơng hạt, bột đậu tƣơng, đậu
hũ, thức ăn chăn ni và sữa đậu nành.

-

Thực hiện và phân tích sản phẩm của phản ứng Realtime PCR với các
mẫu DNA tổng số từ các mẫu Đậu tƣơng hạt, bột đậu tƣơng, đậu hũ, thức
ăn chăn nuôi và sữa đậu nành bổ sung thành phần sản phẩm biến đổi gen
ở các hàm lƣợng khác nhau.

2.3. Vật liệu
- 5 nền mẫu các loại: Đậu tƣơng hạt, bột đậu tƣơng, đậu hũ, thức ăn chăn
nuôi và sữa đậu nành.
- Vật liệu tham chiếu chuẩn chứng nhận (Certified Reference Materials –
CRM): AOCS 0210-

(đậu tƣơng MON87705),

OCS 0311-

(đậu tƣơng

MON87708), AOCS 0809- (đậu tƣơng MON87701).
+ Đậu tƣơng MON87705: Đậu tƣơng tăng cƣờng hàm lƣợng axit oleic và
chống chịu thuốc trừ cỏ Roundup gốc glyphosphate.
+ Đậu tƣơng MON87701: Đậu tƣơng kháng sâu bộ cánh vảy.

+ Đậu tƣơng MON87708: Đậu tƣơng chống chịu thuốc trừ cỏ Dicamba.
+ Toàn bộ các chất chuẩn CRM và mẫu nền đƣợc phòng thử nghiệm cung
cấp.
2.4. hƣơng pháp tách chiết DNA
2.4.1. Phương pháp dựa trên CTAB
a. Hóa chất
18


 α-Amylaza
 Clorofom (CHCl3)
 Etanol (C2H5OH) 96%
 Muối dinatri axit etylendiamintetraaxetic (Na2EDTA)(C10H14N2O8Na2)
 Hexadexyl-trimetyl-amoni-bromua (CTAB)(C19H42BrN)
 Axit Clohydric (HCl) 37%
 Isopropanol [CH3CH(OH)CH3]
 Proteinaza-K (tùy chọn), khoảng 20 đơn vị /mg lyophilisat
 RNaza-A, khơng chứa DNaza từ tuyến tụy bị, khoảng 50 đơn vị/mg
lyophilisat
 Natri Clorua (NaCl)
 Natri Hydroxit (NaOH)
 Tris(hydroxylmetyl)-aminometan (Tris)(C4H11NO3)
 Dung dịch α-Amylaza (tùy chọn), c(α-Amylaza)=10 mg/ml Không hấp
áp lực. Bảo quản ở -20oC, tránh lặp lại việc cấp đông và rã đông.
 Dung dịch đệm chiết CT B, ρ(CT B)=20 g/l, c(NaCl)=1.4 mol/l,
c(Tris)=0.1 mol/l, c(Na2EDTA)=0.02 mol/l.
Dùng HCl hoặc NaOH để chỉnh pH đến 8.0
 Dung dịch đệm kết tủa CT B, ρ(CT B)=5 m/l, c(NaCl)=0.04 mol/l
 Dung dịch natri clorua, c(NaCl)=70%
 Dung dịch proteinnaza-K (tùy chọn), ρ=20 mg/ml Bảo quản trong dung

dịch lỏng ở -20oC.
 Dung dịch đệm TE, c(Tris)=0.01 mol/l, c(Na2EDTA)=0.001 mol/l
Dùng HCl hoặc NaOH để chỉnh Ph đến 8.0
b. Cách tiến hành
 Chiết mẫu
- Cân từ 200mg đến 300mg mẫu thử cho vào ống nghiệm.
- Thêm 1.5ml dung dịch đệm chiết CT B đã đƣợc ủ trƣớc ở 65oC và đảo đều.

19