Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có một số đặc tính dùng để định hướng ứng dụng sản xuất sản phẩm probiotic

LỜI CẢM ƠN
Trên thực tế khơng có sự thành cơng nào mà không gắn liền với những sự
hỗ trợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của ngƣời khác. Trong
suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập tại trƣờng đến nay, em đã nhận đƣợc rất
nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cơ, gia đình và bạn bè. Với lịng biết
ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến các Cô ở Bộ mơn Vi sinh - Hóa sinh thuộc Viện
Cơng nghệ Sinh học - Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp đã cùng với tri thức và tâm
huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt
thời gian học tập tại Trƣờng.
Và đặc biệt em cũng xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Nhƣ Ngọc đã
nhiệt tình hƣớng dẫn em hồn thành tốt báo cáo khóa luận tốt nghiệp này.
Nếu khơng có những lời hƣớng dẫn, dạy bảo của các Thầy Cơ thì em nghĩ
bài báo cáo khóa luận tốt nghiệp này của em rất khó có thể hoàn thiện đƣợc. Một
lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy cô. Bƣớc đầu đi vào thực tế của em cịn
hạn chế và cịn nhiều bỡ ngỡ, trình độ lý luận cũng nhƣ kinh nghiệm thực tiễn
còn hạn chế. Do vậy, khơng tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận đƣợc
những ý kiến đóng góp quý báu của quý Thầy Cô để kiến thức của em trong lĩnh
vực này đƣợc hoàn thiện hơn, giúp em học hỏi thêm đƣợc nhiều kinh nghiệm và
sẽ làm hành trang tốt cho công việc sau này.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà nội, ngày 8 tháng 5 năm 2018
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Lý


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN ..................................................................................... 3
1.1 Vi khuẩn Lactic (LAB) ................................................................................... 3
1.1.1 Khái quát về nhóm vi khuẩn sinh Lactic...................................................... 3
1.1.2. Phân loại vi khuẩn lactic ............................................................................. 4
1.1.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của vi khuẩn lactic .................... 7
1.1.4 Ứng dụng của vi khuẩn lactic....................................................................... 9
1.2 Probiotic ........................................................................................................ 10
1.2.1 Khái niệm Probiotic ................................................................................... 10
1.2.2 Vai trò của Probiotic .................................................................................. 11
Chƣơng 2: MỤC TIÊU – NÔI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.. 16
2.1 Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 16
2.2 Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 16
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................... 16
2.3.1 Nguyên liệu ................................................................................................ 16
2.3.2 Hóa chất và Thiết bị ................................................................................... 16
2.3.3 Các phƣơng pháp nghiên cứu..................................................................... 18
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 25
3.1 Kết quả phân lập và thuần khiết giống .......................................................... 25
3.2 Kết quả khả năng sinh axit lactic .................................................................. 27
3.3 Kết quả đặc điểm sinh hoá của các chủng đƣợc chọn lọc............................. 28
3.4 Kết quả kiểm tra khả năng chịu nhiệt ........................................................... 30
3.5 Kết quả kiểm tra khả năng chịu pH thấp ....................................................... 31
3.6 Kết quả khả năng sinh chất kháng khuẩn ...................................................... 32


3.7 Kết quả thử hoạt tính enzyme ngoại bào....................................................... 36
3.8 Kết quả thử hoạt tính kháng kháng sinh........................................................ 38
Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................... 41
4.1 Kết luận ......................................................................................................... 41

4.2 Kiến nghị ....................................................................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

LAB (Lactic Acid Bacteria) Vi khuẩn lactic
MRS

de Man, Rogosa, Sharp

BC (Bacterial Cellulose)

Cellulose vi khuẩn

kDa

kiloDalton

sp. (species)

Loài

GRAS

Generally Recognized As Safe (Đƣợc cơng
nhận chung là an tồn)

aa

Acid amino

VSV

Vi sinh vật

VK

Vi khuẩn

NCCLS

National Committee for Clinical Laboratory
Standards

LB

Lysogeny Broth (môi trƣờng cơ bản để nuôi cấy
vi khuẩn)

WHO
FAO

World Health Organization (Tổ chức Y tế thế
giới)
Food and Agriculture Organization of the
United Nations (Tổ chức Lƣơng thực và Nông
nghiệp Liên Hiệp Quốc)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Danh sách máy móc thiết bị sử dụng ................................................... 18
Bảng 3.1: Kết quả phân lập vi khuẩn LAB ......................................................... 26
Bảng 3.2: Kết quả khả năng sinh axit của các chủng vi khuẩn.......................... 27
Bảng 3.3: Kết quả thử nghiệm các phản ứng Calatase và nhuộm Gram ............ 29
Bảng 3.4: Kết quả mật độ vi khuẩn cfu /ml với sự ảnh hƣởng của nhiệt dộ ...... 31
Bảng 3.5: Kết quả mật độ vi khuẩn cfu/ml với sự ảnh hƣởng của pH................ 32
Bảng 3.6: Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn 33
Bảng 3.7: Hoạt tính enzyme ngoại bào ............................................................... 36
Bảng 3.8: Hoạt tính kháng kháng sinh Tetracylin .............................................. 38
Bảng 3.9: Hoạt tính kháng kháng sinh Streptomycin ......................................... 39
Bảng 3.10: Hoạt tính kháng kháng sinh Gentamycin ........................................ 39


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Một số hình ảnh về vi khuẩn lactic [1].................................................. 4
Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc của các vi khuẩn phân lập từ thực phẩm lên men 27
Hình 3.2 Ống nghiệm bảo quản giống vi khuẩn ................................................. 28
Hình 3.3 Khả năng ức chế vi khuẩn Ecoli gây bệnh của dịch chất kháng khuẩn
thô các các chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn ..................................................... 33
Hình 3.4 Khả năng ức chế vi khuẩn Samonella gây bệnh của dịch chất kháng
khuẩn thô các các chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn ........................................... 33
Hình 3.5 Khả năng ức chế vi khuẩn Shigella gây bệnh của dịch chất kháng
khuẩn thô các các chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn ........................................... 34
Hình 3.6 Khả năng ức chế vi khuẩn H12 của dịch chất kháng khuẩn thơ các các
chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn ........................................................................ 34
Hình 3.7 Khả năng ức chế vi khuẩn BA của dịch chất kháng khuẩn thô các các
chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn ........................................................................ 34
Hình 3.8 Khả năng ức chế vi khuẩn NT1 của dịch chất kháng khuẩn thô các các

chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn ........................................................................ 35
Hình 3.9 Hoạt tính phân giải Tinh bột của 6 chủng vi khuẩn ............................. 37
đƣợc tuyển chọn .................................................................................................. 37
Hình 3.10 Hoạt tính phân giải Cellulose của 6 chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn ....37
Hình 3.11 Hoạt tính phân giải Protease của 6 chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn ......37
Hình 3.12 Hoạt tính kháng kháng sinh ở nồng độ 10mg/l của 3 chủng vi khuẩn
tuyển chọn ........................................................................................................... 39
Hình 3.13 Hoạt tính kháng kháng sinh ở nồng độ 50mg/l của 3 chủng vi khuẩn
tuyển chọn ........................................................................................................... 40


ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ thời cổ đại con ngƣời đã biết sử dụng các Vi sinh vật (VSV) để chế
biến và bảo quản thực phẩm, nhƣng ý tƣởng tạo ra những sản phẩm VSV sống
hữu ích để bổ sung vào thức ăn hoặc nƣớc uống nhằm cải thiện sức khoẻ và
nâng cao năng suất của vật nuôi chỉ đƣợc quan tâm nhiều trong vài thập kỷ trở
lại đây. Khi chƣa tìm ra thuốc kháng sinh, con ngƣời đã biết tiêu thụ các thực
phẩm chứa vi sinh vật sống có lợi nhƣ các sản phẩm lên men có nguồn gốc từ
sữa. Theo Ayurveda, một trong những ngành y học lâu đời nhất khoảng 2500
năm trƣớc công nguyên, sự tiêu thụ sữa chua (1 sản phẩm sữa lên men) đã đƣợc
ủng hộ để duy trì sức khỏe tốt (Chopra v Doiphode, 2002). Các vi khuẩn có lợi
trong ruột tạo ảnh hƣởng tốt cho cơ thể bằng cách ngăn cản các khối ung thƣ,
làm bất hoạt các virus, tạo ra cc enzyme và các kháng thể tự nhiên, làm giảm
cholesterol. Bên cạnh đó chúng cũng có thể ức chế sự tăng trƣởng của các vi
khuẩn có hại qua việc tiết ra mơi trƣờng các acid hữu cơ, các chất kháng khuẩn,
đặc biệt là sự tạo thành chất kháng khuẩn. Trong khi đó các vi khuẩn có hại lại
tạo ra các sản phẩm có hại cho vật chủ nhƣ các độc tố và các chất gây ung thƣ.
Khi các vi khuẩn có hại này chiếm ƣu thế, sẽ cạnh tranh các chất dinh dƣỡng với
tế bào vật chủ và đồng thời nồng độ các chất có hại tăng lên. Các chất này đơi
khi khơng tác động ngay lập tức mà có thể tích lũy trong cơ thể vật chủ theo thời

gian, vì vậy chúng đƣợc xem nhƣ là các yếu tố gây ra sự lo hại, ung thƣ, xơ vữa
động mạch, giảm khả năng miễn dịch.
Năm 1974, Paker đã đƣa ra khái niệm probiotic để chỉ những VSV và
những chất làm cân bằng hệ VSV trong đƣờng ruột của ngƣời và vật ni, kể từ
đó đã có rất nhiều những phát hiện mới về vai trò, tác dụng của các VSV sống
nhƣ: tăng cƣờng sức khoẻ của hệ tiêu hố thơng qua cải thiện cân bằng hệ vi
sinh vật ruột (Fuller, 1989), tăng đáp ứng miễn dịch, phịng chống ung thƣ
đƣờng tiêu hố (FAO/WHO, 2001), giảm colesterol máu (Pereira và Gibson,
2002)... Các (VSV) probiotic nhất thiết phải là các VSV sống hữu ích, chúng có
thể là các vi khuẩn (VK) (thƣờng là các VK khuẩn lactic, một số chủng Bacillus)
và nấm men.
1


Đề tài: “Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic
có một số đặc tính dùng để sản xuất sản phẩm probiotic” đƣợc tiến hành nhằm
phân lập, đánh giá, tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có các đặc tính
probiotic phục vụ cho việc sản xuất các sản phẩm Probiotic.

2


Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1 Vi khuẩn Lactic (LAB)
1.1.1 Khái quát về nhóm vi khuẩn sinh Lactic
Vi khuẩn lactic (LAB) đƣợc định nghĩa là một nhóm vi khuẩn Gram (+),
gồm các trực khuẩn và cầu khuẩn không sinh bào tử, không ƣa khí (non-aerobic)
nhƣng chịu oxy (aerotolerant), sinh ra acid lactic là sản phẩm chính khi lên men
carbohydrat. LAB gồm nhiều chi, trong đó tiêu biểu nhất là các chi
Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus [3,14].

Các LAB đều không di động, catalase âm tính, tỉ lệ GC thấp dƣới 50%.
LAB ƣa ấm và chịu nhiệt, nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu tùy từng lồi, dao động từ
28 đến 45oC. LAB có nhu cầu dinh dƣỡng phức tạp, khi lên men cần các
vitamin, acid amin và peptid ngắn. Nguồn carbohydrat có thể là glucose,
fructose, lactose, maltose, sucrose; một số chủng vi khuẩn có thể sử dụng tinh
bột nhƣ Lactobacillus amylophilus và L. amylovorus [15].
LAB phân bố rộng rãi trong nhiều hệ sinh thái, thƣờng đƣợc tìm thấy
trong một số loại thực phẩm (các sản phẩm từ sữa, thịt và rau quả lên men, bột
nhào chua…), trên thực vật, trong đƣờng tiêu hóa, hơ hấp và sinh dục của ngƣời
và động vật [2,3].
LAB có lịch sử ứng dụng lâu đời trong thực phẩm lên men vì các tác động
có lợi về mặt dinh dƣỡng, cảm quan và tuổi thọ sản phẩm, nhất là với các sản
phẩm dễ hỏng nhƣ sữa, thịt, cá, một số loại rau quả. Trong y dƣợc, nhiều loài
LAB đã đƣợc sử dụng làm probiotic để cải thiện và nâng cao sức khỏe với nhiều
tác dụng trị liệu đáng chú ý nhƣ ngăn ngừa nhiễm khuẩn đƣờng ruột, điều trị tiêu
chảy, tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch, giảm cholesterol máu, giảm nguy cơ mắc
ung thƣ [15].
LAB sinh ra nhiều loại chất có tác dụng kháng khuẩn: acid lactic, acid
acetic, ethanol, acid béo, H2O2, diacetyl… và đặc biệt là chất kháng khuẩn. Mặc
dù chất kháng khuẩn có thể đƣợc tìm thấy ở nhiều loại vi khuẩn khác, chất
kháng khuẩn sinh ra bởi LAB vẫn thu hút đƣợc sự chú ý đặc biệt của các nhà
3


khoa học bởi tính an tồn và tác dụng ức chế nhiều vi khuẩn gây bệnh nguy
hiểm nhƣ Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes… Trong số khoảng
200 chất kháng khuẩn đã đƣợc mô tả cho đến nay, chất kháng khuẩn từ LAB
chiếm tới 90% [16].
Một số vi khuẩn thƣờng dùng trong thực phẩm, một số giống vi khuẩn
lactic nòng cốt liên quan đến quá trình lên men thực phẩm nhƣ: Lactobacillus,

Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus [3].
1.1.2. Phân loại vi khuẩn lactic
1.1.2.1. Phân loại vi khuẩn lactic theo Orla-Jensen
Orla-Jensen đã phân loại vi khuẩn lactic dựa vào những đặc điểm hình
thái học (cầu khuẩn hoặc trực khuẩn), kiểu lên men, khả năng phát triển ở các
nhiệt độ khác nhau, mức độ sử dụng đƣờng. Một số giống vi khuẩn lactic nòng
cốt liên quan đến quá trình lên men thực phẩm nhƣ Lactobacillus, Lactococcus,
Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus [2,3].

Hình 1.1. Một số hình ảnh về vi khuẩn lactic [1]
 Streptococcus
Nhóm vi khuẩn này có dạng hình cầu hoặc hình trứng, kết đơi hay dạng
chuỗi, lên men đồng hình. Hiện đã có trên 50 lồi Streptococus đƣợc nhận biết,
những vi khuẩn này phân bố chủ yếu trong xoang miệng và ở đƣờng hô hấp.
Một số Streptococcus nhƣ Sp. Mutans là tác nhân gây bệnh sâu răng và viêm
màng tim [4].

4


Về cơ bản, chỉ có Sp. Thermophilus là đƣợc sử dụng trong sản xuất yogurt
(cùng với Lb. delbrueckii.sub sp.bulgaricus) và phô mai. Vi khuẩn này đƣợc sử
dụng nhƣ một tác nhân acid hóa để đơng tụ Lactic [3].
 Pediococcus
Pediococcus có dạng tứ cầu, vi hiếu khí, phát triển từ 20-30oC và không
phát triển ở 45oC, ƣa acid và lên men đồng hình. Hiện có 7 lồi Pediococcus
đƣợc nhận biết. Những vi khuẩn này thƣờng đƣợc tìm thấy với một lƣợng lớn
trên lá nho, dƣa bắp cải lên men, trái oliu và bia [16].
Pediococcus quan trọng trong thực phẩm về cả hai mặt tiêu cực và tích
cực. Ví dụ nhƣ: Pe. Damnosus là vi sinh vật gây hƣ hỏng chính trong sản xuất

bia, vì sự sinh trƣởng của chúng có thể dẫn đến việc hình thành diacetyl/acetoin
tạo ra vị bơ. Trong khi đó Pe. Acidilactici và Pe. Pentosaceus đƣợc sử dụng nhƣ
các chủng khởi động cho việc làm xúc xích lên men. Pediococcus cũng tham gia
vào q trình làm chín phơ mai góp phần làm tăng hƣơng vị cho phơ mai [15].
 Lactococcus
Lactococcus có dạng hình cầu hoặc hình trứng, thƣờng bắt cặp hoặc thành
chuỗi. Có 5 lồi Lactococcus (Lactococcus lactis, Lc. garvieae, Lc. plantarum,
Lc. pisciumvà Lc. raffinolactis) hiện đang đƣợc cơng nhận. Tuy nhiên, chỉ có Lc.
lactis subsp. lactisvà Lc. lactissubsp. Cremoris mới đƣợc sử dụng trong quá
trình lên men thực phẩm [16].
Một số chủng Lc.lactis có khả năng chuyển hóa citrate, sản sinh CO2,
diacetyl và các chất trung gian khác tạo hƣơng thơm cho sản phẩm (ví dụ nhƣ bơ
và phô mai Gouda). Nisin, một chất kháng khuẩn peptide sản sinh bởi các giống
Lactococcus có sẵn trong thƣơng mạiđƣợc coi nhƣ là một phụ gia bền acid, đƣợc
sử dụng để kéo dài thời gian bảo quản thông qua việc ức chế hệ vi sinh vật Gram
dƣơng trong thực phẩm [14].
 Lactobacillus
Lactobacillus là giống lớn nhất trong LAB với hơn 80 lồi và phân lồi
đƣợc cơng nhận. Đây cũng là nhóm lồi rất hỗn tạp với sự đa dạng về các đặc
tính lý hóa, sinh hóa và kiểu hình nhƣng chủ yếu là dạng que. Các Lactobacillus
5


là những vi khuẩn Gram (+), không sinh bào tử, thỉnh thoảng cặp đôi hoặc tạo
thành chuỗi, không di dộng và catalsae âm tính [2].
Phân bố rất nhiều trong tự nhiên và nhiều loài đã đƣợc ứng dụng trong
thực phẩm, nhóm vi khuẩn này đƣợc ghi nhận là chịu acid cao nhất, có mặt
trong cơ thể ngƣời (khoang miệng, đƣờng tiêu hóa,...), và trong một số thực
phẩm lên men nhƣ thịt, sữa, rau quả, ngũ cốc,... Một số loài nhƣ Lb. casei, Lb.
plantarum, Lb. brevis,… tham gia trong quá trình làm chín phơ mai; Lb.

delbrueckii subsp. bulgaricus là một trong hai loài vi khuẩn cho phép sử dụng
trong lên men yogurt [3,4].
 Leuconostoc
Leuconostoc có dạng hình cầu xếp chuỗi hoặc bắt cặp, lên men dị hình.
Chúng thƣờng đƣợc tìm thấy trên lá, ngũ cốc, nho và các cụm hoa. Những vi
khuẩn này phát triển ở 20 -30oC và không phát triển ở 45oC. Leuconostoc (đặc
biệt là Ln. lactis và Ln. mesenteroides) có vai trị quan trọng trong việc lên men
sữa do chúng có khả năng sinh CO2 và một lƣợng đáng kể diacetyl từ citrate
trong sữa. Diacetyl là hợp chất chính tạo hƣơng cho bơ chua, kem chua và phơ
mai tƣơi, cịn CO2 thì đóng vai trị quan trọng trong việc hình thành mắt phơ
mai. Ngồi ra, nhóm vi khuẩn này cịn đóng vai trị chủng khởi động trong việc
lên men tự nhiên của rau quả (ví dụ nhƣ dƣa cải) [4].
1.1.2.2 Phân loại vi khuẩn lactic dựa vào quá trình lên men
Lên men lactic là một trong những quá trình sinh hố phổ biến trong thiên
nhiên, đó là q trình chuyển đổi các chất gluxit thành axit lactic nhờ hoạt động
sống trực tiếp của hệ vi sinh vật lactic. Trong thiên nhiên vi khuẩn lactic tồn tại
dƣới hai dạng:
• Nhóm vi khuẩn lactic đồng hình: có khả năng phân huỷ đƣờng đơn giản và tạo
nên axit lactic, đây là quá trình lên men lactic đồng hình.
C6H12O6 → 2CH3CH(OH)COOH + 22,5 Kcalo
Do hệ enzyme trong những vi sinh vật khác nhau thƣờng khác nhau nên
cơ chế hoá học của quá trình lên men lactic ở các giống vi sinh vật thƣờng
khơng giống nhau.Ở vi khuẩn lactic đồng hình sự chuyển hoá đƣờng thành axit
6


lactic đi theo con đƣờng lên men rƣợu đến giai đoạn tạo axit pyruvic, axit này
đƣợc khử hai nguyên tử hidro nhờ hoạt động của lacticodehydrogenase để trở
thành axit lactic [14].
CH3COCOOH + 2H

CH3CHOHCOOH

• Nhóm vi khuẩn lactic dị hình: tạo ra quá trình lên men phức tạp hơn, gọi là lên
men lactic dị hình, chúng tạo nên trong mơi trƣờng ngồi axit lactic cịn có nhiều
sản phẩm phụ: axit axetic, rƣợu etylic, CO2, H2, một số chất thơm nhƣ diacetyl
este [14].
C6H12O6 →CH3CHOHCOOH +COOHCH2CH2COOH +CH3COOH +
CH3CH2OH + CO2 + H2
Số lƣợng các sản phẩm phụ này hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh
vật, môi trƣờng dinh dƣỡng và điều kiện ngoại cảnh. Nói chung axit lactic
thƣờng chiếm 40% lƣợng đƣờng đó phân huỷ, axit succinic gần 20%, rƣợu
etylic khoảng 10% và các chất khác vào khoảng 20%. Đôi khi lƣợng khí ít hơn
và thay vào đó là lƣợng axit formic [14].
Lên men lactic cần có sự lên men đồng thời của vi khuẩn lactic đồng hình
và dị hình. Vì quá trình lên men dị hình ngồi việc tạo thành axit lactic còn tạo
các sản phẩm phụ nhƣ axit và rƣợu sinh ra este có mùi thơm làm cho sản phẩm
có hƣơng vị đặc trƣng.
1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic
 Nguồn cacbon: Khả năng sử dụng các nguồn cacbon của vi sinh
vật không phải là giống nhau ở nhiều nguồn cacbon khác nhau. Có những
nguồn cacbon dễ sử dụng và những nguồn cacbon khó sử dụng, thậm chí phải
huy động nhiều vi sinh vật cùng tham gia phân hủy từ từ. Thông thƣờng vi sinh
vật trong tự nhiên hay trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo sẽ tiến hành phân hủy
nguồn cacbon có cấu tạo đơn giản có mức độ oxy hóa mạnh sau đó mới phân
hủy nguồn cacbon phức tạp và có mức độ oxy hóa thấp. Nhìn chung vi sinh vật
dễ hấp thu cacbon từ hydratcacbon, trong đó glucose là chất đƣợc đa số vi sinh
7

vật sử dụng. Đối với vi khuẩn lactic thì đƣờng mono và disaccharide là nguồn
cacbon tốt nhất, còn các polysaccharide hầu nhƣ không thể lên men đƣợc. Tốc
độ lên men của các loại đƣờng khác nhau là khác nhau nhƣng khi nhân giống ta
dùng một loại đƣờng cố định thì vi khuẩn có thể thích nghi với loại đƣờng đó và
về sau chúng phát triển hiệu quả trên môi trƣờng chứa loại đƣờng này [4].
 Nguồn nitơ: Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp đƣợc các
hợp chất chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trƣởng và phát triển chúng
phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trƣờng. Các nguồn nitơ đƣợc sử dụng
trong nuôi cấy vi sinh vật thƣờng ở hai dạng: nguồn nitơ hữu cơ và nguồn nitơ
vơ cơ. Trong đó nguồn nitơ đƣợc sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy vi sinh vật là
protein nhƣ: Cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa…Hiện
nay cao nấm men là nguồn nitơ đƣợc sử dụng nhiều và có hiệu quả nhất trong
phịng thí nghiệm [4].
 Vitamin: Hàm lƣợng vitamin của mơi trƣờng giữ một vai trị quan trọng
trong sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn lactic. Vitamin B6 là vitamin rất
quan trọng trong sự sinh tổng hợp các amino acid ở vi khuẩn lactic [4].
 Muối khoáng: Các chất khống có vai trị quan trọng trong qua trình trao
đổi chất ở vi sinh vật. Các chất khoáng đƣợc sử dụng trong mơi trƣờng ni cấy
có thể là những chất khống ở dạng hợp chất, đơn chất, có thể ở dạng vô cơ hay
hợp chất hữu cơ. Một số muối khống đƣợc sử dụng trong ni cấy vi sinh vật
là: K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O ,CaSO4,…Trong các loại muối khống đó
photpho là loại muối quan trọng nhất mà các vi khuẩn lactic cần. Số lƣợng
photpho trong mơi trƣờng ni cấy có ảnh hƣởng rất lớn đến sự phát triển của vi
sinh vật. Nếu hàm lƣợng quá cao vi sinh vật khó phát triển, nếu q ít sẽ khơng
đủ cho q trình trao đổi chất và nhƣ vậy sẽ ảnh hƣởng rất lớn đến sự đồng
hóahydratcacbon [4].

8

 Nhiệt độ: Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng ảnh hƣởng
đến sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn lactic. Tùy thuộc vào nhiệt độ tối ƣu
cho lên men và cho sinh trƣởng vi khuẩn lactic đƣợc chia làm hai loại: loại ƣa
nhiệt và loại ƣa ấm. Loại ƣa nhiệt bao gồm: L.bulgaricus, L.thermophilus,
L.delbrueckii…phát triển tốt ở 45–60oC. Loại ƣa ấm gồm: L.causasicus,
L.lactic, L.acidophilus…phát triển tốt ở 37–45oC và L.brevis, L.buchner
và L.pastorianus phát triển tốt ở 28–32oC [18,19].
 PH: Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sản sinh ra axit làm pH
môi trƣờng giảm và khi giảm đến một mức nào đó nó sẽ ức chế chính sự phát
triển của vi khuẩn lactic. Vì vậy trong q trình ni ngƣời ta phải ln điều
chỉnh pH về khoảng tối thích cho vi khuẩn phát triển. Mỗi một lồi vi khuẩn
lactic có một khoảng pH tối thích khác nhau, dao động trong khoảng 4,5 - 6,5,
nhƣng cũng có một số chủng có thể phát triển ở Ph = 9,6 và một số hoạt động ở
pH = 3,2 nhƣ Lactobacillus fermentum có thể chịu đƣợc pH = 3 [14].
1.1.4 Ứng dụng của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic đƣơc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau
nhƣ: công nghiệp, nông nghiệp, môi trƣờng, y dƣợc và nhiều nhất là trong chế
biến bảo quản thực phẩm.
 Trong công nghiệp
Vi khuẩn lactic đƣợc sử dụng để lên men thu acid lactic. Có vi chua dễ
chịu và có đặc tính bảo quản nên có thể làm gia vị đối với các loại nƣớc uống
nhẹ, tinh dầu, dịch quả, mứt. Chúng đƣợc dùng để axit hóa rƣợu vang và hoa
quả nghèo axit. Ngồi ra cịn đƣợc sử dụng trong cơng nghiệp thuộc da, dệt ,
nhuộm, sơn và chất dẻo [9].
 Trong nơng nghiệp và mơi trƣờng
Vi khuẩn lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium loại nấm
gây bệnh quan trọng trong nông nghiệp. Nấm Fusarium khi phát triển sẽ làm cây
yếu đi và đây là cơ hội gây bệnh cho cây trồng.

9

Các chế phẩm EM hay chế phẩm vi sinh hữu cơ bao gồm 80 chủng vi sinh
trong đó có sự góp mặt của vi khuẩn lactic. Hiệu quả của chế phẩm này là cải
tạo đất, tăng năng suất cây trồng. Giải quyết vấn đề gây ô nhiễm môi trƣờng [3].
Trong nông nghiệp vi khuẩn lactic đƣợc sử dụng để ủ chua thức ăn gia
súc cho mục đích sử dụng lâu dài và làm tăng giá trị dinh dƣỡng. Ở Việt Nam,
gần đây ngƣời ta không chỉ thành công trong lên men lactic để bảo quản thức ăn
cỏ xanh cho trâu, bị mà cịn thành cơng trong việc bảo quản cá, tôm và sản
phẩm phụ, phế phẩm gây ra khi thiếu hoặc khơng có phƣơng tiện bảo quản
chun chở, chế biến kịp thời. Do đó đã hạn chế đƣợc các sản phẩm phụ, phế
phẩm của các xí nghiệp chế biến thuỷ hải sản, các lò mổ… [8,9].
 Trong y dƣơc
Vi khuẩn lactic đƣợc trong y học để chữa bệnh đƣờng ruột, dùng trong
phẫu thuật chỉnh hình, nha khoa, bệnh phụ khoa….
 Trong bảo quản và chế biến thực phẩm
Vi khuẩn lactic đƣợc sử dụng làm dƣa muối, làm quả chua mà không mất
màu tự nhiên của quả. Dùng trong sản xuất đậu phụ hay lên men sữa. Vi khuẩn
lactic thuần khiết làm tác nhân chính cho q trình sản xuất vì chúng là những vi
sinh vật có nhiều đặc tính tốt nhƣ sử dụng đƣợc nhiều nguồn cacbon khác nhau,
có khả năng sinh axit, phát triển đƣợc ở nhiệt độ khá rộng và chịu mặn… Chủng
này đƣợc ứng dụng trong công nghệ thịt, tạo ra các sản phẩm nhƣ xúc xích khơ,
xúc xích bán khơ, thịt lên men…Có những sản phẩm đƣợc tạo ra từ một loại vi
khuẩn, nhƣng cũng có những sản phẩm đƣợc tạo ra từ hai hay nhiều loại vi
khuẩn phối trộn lại với nhau. Một số chủng vi khuẩn lactic đã đƣợc nghiên cứu
và đƣa vào ứng dụng nhƣ: giống Lactobacillus bao gồm các vi khuẩn chiếm ƣu
thế trong hệ vi sinh vật tự nhiên của thịt lên men. Các vi khuẩn lactic thuộc
nhóm này thƣờng sử dụng nhƣ: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis,
Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, plantarum
[8].

1.2 Probiotic
1.2.1 Khái niệm Probiotic
10


Probiotic là các vi sinh vật sống khi đƣa vào cơ thể theo đƣờng tiêu hoá
với một số lƣợng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho cơ thể ngƣời và động vật [6].

1.2.2 Vai trò của Probiotic
 Vài trò đối với hệ tiêu hóa:
a) Tác động kháng khuẩn
Khi đƣa probiotic vào hệ tiêu hóa sẽ làm giảm số lƣợng vi khuẩn bởi vì
VI khuẩn trong probiotic có thể tiết ra các chất kháng khuẩn: Vi khuẩn Probiotic
tạo ra các chất đa dạng có thể ức chế cả khuẩn Gram (+) và Gram (-), gồm có
các acid hữu cơ, hydrogen peroxide và chất diệt khuẩn. Những hợp chất này có
thể làm giảm không chỉ những sinh vật mang mầm bệnh có thể sống đƣợc mà
cịn ảnh hƣởng đến sự trao đổi chất của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố. Điều
này đƣợc thực hiện bằng cách giảm pH khoang ruột thông qua sự tạo ra các acid
béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate, và butyrate, nhất là
acid lactic [15].
Ngoài ra vi khuẩn trong probiotic còn cạnh tranh với các nguồn bệnh để
ngăn chặn sự bám dinh vào đƣờng ruột và cạnh tranh dinh dƣỡng cần thiết cho
sự sống sót của mầm bệnh [16].
b) Tác động trên mơ biểu bì ruột
Khi sử dụng các probiotic, các vi khuẩn có lợi sẽ giúp đẩy mạnh sự liên
kết chặt giữa những tế bào biểu mô, đồng thời giảm việc kích thích bài tiết và
những hậu quả do bị viêm của sự lây nhiễm vi khuẩn và đẩy mạnh sự tạo ra các
phân tử phòng vệ nhƣ chất nhầy.
c) Tác động miễn dịch
Probiotic đƣợc xem nhƣ là phƣơng tiện phân phát các phân tử kháng viêm

cho đƣờng ruột. Đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng
viêm. Tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng và cải thiện hệ vi sinh vật
đƣờng ruột, ngăn ngừa tiêu chảy và táo bón.
d) Tác động đến vi khuẩn đƣờng ruột
11


Probiotic có tác dụng điều chỉnh thành phần cấu tạo của vi khuẩn đƣờng
ruột. Sự sống sót của probiotic đƣợc tiêu hóa ở những phần khác nhau của bộ
phận tiêu hóa thì khác nhau giữa các giống. Khi tập trung ở khoang ruột, chúng
tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ sinh thái đƣờng ruột, sự thay đổi này đƣợc
nhận thấy một vài ngày sau khi bắt đầu tiêu thụ thực phẩm có probiotic, phụ
thuộc vào cơng dụng và liều lƣợng của giống vi khuẩn. Kết quả chỉ ra rằng với
sự tiêu thụ thƣờng xuyên, vi khuẩn định cƣ một cách tạm thời trong ruột, một
khi chấm dứt sự tiêu thụ thì số lƣợng vi sinh vật probiotic sẽ giảm xuống. Điều
này thì đúng cho tất cả các loại probiotic.
Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của sinh vật đƣờng
ruột. Probiotic có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó
sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết ra enzyme của sinh vật đƣờng ruột. Đồng thời
tăng sự dung nạp đƣờng lactose: giúp tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi
hấp thu những loại thức ăn có chứa nhiều lactose và làm tăng vi khuẩn có lợi và
giảm vi khuẩn gây hại [5].
e) Một số vai trò khác đối với cơ thể
Probiotic có vai trị nhƣ chất chống dị ứng :thực phẩm probiotic góp phần
chống lại một số dị ứng của cơ thể, cung cấp nhiều chất quan trọng cho cơ thể
nhƣ (folic acid, niacin, riboflavin, vitamin B6 và B12) [6].
Ngồi ra probiotic cịn có vai trị chống ung thƣ: nhiều nghiên cứu cho thấy các
vi khuẩn probiotic có thể làm giảm nguy cơ ung thƣ ruột kết và ung thƣ bàng
quang. Ngồi ra cịn có tác dụng khử chất độc gây ung thƣ có trong cơ thể và
làm chậm sự phát triển của các khối u bƣớu. Probiotic có tác dụng làm giảm

nồng độ cholesterol trong huyết thanh, làm giảm huyết áp cao. Ngồi ra cịn
giúp nhanh chóng bình phục sau khi mắc bệnh tiêu chảy và sử dụng nhiều kháng
sinh.
 Probiotics và những lợi ích trong chăn ni gia súc: Nhiều vật ni
đã thích nghi về mối quan hệ cộng sinh với vi khuẩn. Khả năng lên men phức
hợp polysaccharides của vật nuôi với sự giúp sức của vi khuẩn ruột, thu đƣợc
12


mức năng lƣợng tới 70% ở thú nhai lại và đến 30% ở vật dạ dày đơn. Tuy nhiên,
chỉ mới gần đây, mối quan hệ cộng sinh giữa vật nuôi và hệ vi khuẩn mới nhận
đƣợc sự đồng tình của ngƣời chăn nuôi và sử dụng probiotic. Trong khi sự
kháng kháng sinh của vi khuẩn đang tăng, thì kết quả các nghiên cứu cho thấy
sử dụng probiotic có thể thay thế kháng sinh trong việc ngăn ngừa tình trạng
mắc bệnh và thúc đẩy sinh trƣởng ở vật nuôi. Sử dụng probiotic trong chăn nuôi
gà và gà Tây đã chứng tỏ sự gia tăng đề kháng với nhiễm khuẩn Salmonella qua
sự gia tăng về thiết lập hệ vi khuẩn khỏe mạnh cho những gia cầm này. Ngoài
ra, kết quả nghiên cứu còn cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh tiêu chảy tự phát ở những
chuồng nhân giống gà Tây thƣơng phẩm đƣợc giảm thấp bằng cách sử dụng
probiotic. Nhìn chung, các thử nghiệm thƣơng mại với phạm vi rộng về sử dụng
probiotic hợp lý ở gà và gà Tây đã chứng tỏ năng suất vật ni tăng lên và chi
phí sản xuất tổng thể giảm xuống [15].
1.2.3 Các tiêu chuẩn chất lượng của chế phẩm Probiotic
Theo B.Kosin và S.K.Rakshit (2006) thì những tiêu chuẩn truyền thống
đƣợc dùng để chọn lọc các dòng vi khuẩn Probiotic bao gồm:
- Tính an tồn: Các chủng vi sinh phải đƣợc xếp vào nhóm GRAS
(Generally Recognized As Safe), với ý nghĩa các vi sinh đƣợc công nhận là an
tồn. Nói chung các chế phẩm vi sinh đƣợc phép thƣơng mại hóa ở châu Âu đều
chứa các vi sinh đƣợc xếp vào nhóm an tồn.
- Nguồn gốc của chủng vi sinh: Các chủng vi sinh cần đƣợc phân lập và

định danh dòng (strain). Các dòng khác nhau trong cùng một lồi có thể có ảnh
hƣởng có lợi khác nhau đối với động vật sử dụng nó
- Kháng với các điều kiện thí nghiệm in vivo và in vitro: Sau khi sử dụng
Probiotic, vi sinh vật trong chế phẩm không bị giết bởi cơ chế bảo vệ của con
vật chủ và kháng lại những điều kiện bất lợi trong đƣờng ruột nhƣ pH, dịch mật
và dịch tụy.
- Khả năng bám dính và khu trú trên biểu mơ ruột: khả năng này phụ
thuộc vào chính bản thân vi sinh của chế phẩm Probiotic và vào điều kiện môi

13


trƣờng ruột (chịu đƣợc acid và các enzym của dạ dày và tụy, pH, mật, muối...)
cũng nhƣ phụ thuộc vào muối tƣơng tác với hệ vi sinh của con vật chủ.
- Hoạt tính kháng vi khuẩn bệnh: Xem xét hoạt tính kháng khuẩn của vi
khuẩn lactic, ta thấy vi khuẩn lactic có một số đặc tính kháng khuẩn do năng lực
sản sinh acid lactic đẻ làm giảm pH môi trƣờng ruột, giảm năng lực oxy hóa
khử, sản sinh hydrogen peroxide dƣới điều kiện hiếu khí, sản sinh các chất ức
chế đặc biệt nhƣ chất kháng khuẩn, subtilin, coagulin. Những đặc tính này tạo ra
hiệu quả của Probiotic.
- Kháng được thuốc kháng sinh: các chủng dùng làm Probiotic cần có khả
năng chịu đƣợc kháng sinh, giúp các vi khuẩn trong probiotic sống sót, tránh
mất cân bằng các vi sinh vật có trong đƣờng ruột.
- Kích thích đáp ứng miễn dịch: Vi khuẩn dùng Probiotic kích thích tế bào
biểu mơ ruột tăng tiết niêm dịch (mucins) có tác dụng bảo vệ hàng rào biểu mơ,
kích thích mơ lympho gắn với ruột (GALT: Gut Associated Lymphoid Tisues)
tăng tiết kháng thể để tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh.
- Khả năng bảo toàn số lượng (bền nhiệt và sống trong quá trình bảo
quản): Để phát huy đƣợc tác dụng của Probiotic, vi khuẩn dùng làm Probiotic
phải sống và có mặt với nồng độ cao, số lƣợng tế bào phải đạt từ 106 -107 CFU/g

chế phẩm trở lên. Có một số yếu tố hạn chế khả năng sống của vi khuẩn trong
chế phẩm Probiotic với tính chất kháng khuẩn do chúng sinh ra...
Ví dụ về vi khuẩn lactic: Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus
caesei chịu đƣợc môi trƣờng acid trong 2 giờ ở pH 1 và 2 với tỷ lệ rất thấp
nhƣng ở pH 3 và 4 là 41- 65%; đề kháng với ít nhất là 3 kháng sinh, có thể chịu
đƣợc ampicillin (32 μg/ml), streptomycin (32 μg/ml) hơn 10 giờ. Streptococcus
feacalis chịu đƣợc môi trƣờng acid trong 2 giờ ở pH 1-3 với tỷ lệ rất thấp và pH
4 là 75%, chịu đƣợc mơi trƣờng có 0,5-2% muối mật trong 10 giờ là 0,50,003%; đề kháng với ít nhất 3 kháng sinh, chịu đƣợc ampicillin (32 μg/ml) và
streptomycin (2 mg/ml) hơn 5 giờ [7].
Trong việc kiểm soát những yếu tố đảm bảo khả năng sống cao của vi
khuẩn thì quan trọng nhất là việc chọn lọc chủng đề kháng tốt với acid và dịch
14


mật trong ống tiêu hóa, cũng nhƣ với nhiệt độ cao trong dây chuyền chế biến,
bảo quản.

15


Chƣơng 2: MỤC TIÊU – NÔI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập và tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn Lactic có các đặc tính tốt
(chịu nhiệt; chịu pH thấp; kháng khuẩn; sinh enzyme ngoại bào, kháng kháng
sinh) để phụ vụ sản xuất các sản phẩm probiotic.
2.2 Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn thông qua xác
định khả năng sinh axit lactic của các chủng vi khuẩn.
- Nghiên cứu xác định một số đặc điểm sinh hóa và đặc điểm probiotic
của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn (chịu nhiệt; chịu pH thấp; kháng khuẩn;

sinh enzyme ngoại bào; kháng kháng sinh).
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1 Nguyên liệu
Thu thập mẫu từ các nguồn lên men lactic (dƣa cải muối chua, kim chi,
sữa chua, nem chua,…) có tại khu vực Xuân Mai- Chƣơng Mỹ- Hà Nội.
Vi khuẩn kiểm định: B. subtilis (NT1, H12, Ba1), Ecoli, Salmonella,
Shigella có ở phịng thí nghiệm Vi sinh – Hóa sinh, Trƣờng Đại học Lâm
Nghiệp.
2.3.2 Hóa chất và Thiết bị
a) Hóa chất:
Pepton; Cao nấm men; axit lactic; MgSO4.7H2O; MnSO4.H2O; Tween 80;
Glucose; K2HPO4; CaCO3; CH3COONa; Amoni xitrat; NaOH 0,1N; Hcl 0,1N;
thuốc thử;…
b) Môi trƣờng

16


- Môi trƣờng MRS Agar Tween 80 (g/l):
Glucose

20g

Pepton

10g

K2HPO4

42g

MgSO4.7H2O

0,58g

CaCO3

5g

Cao nấm men

5g

CH3COONa

5g

MnSO4.H2O

0,28g

Cao thịt

10g

Tween 80

1 ml

Amoni xitrat

2g

Thạch

15g

Nƣớc cất vừa đủ 1 lít; pH= 7,0; khử trùng121oC /15 phút.
- Môi trƣờng MRS lỏng (MRS Broth) (g/l): Có thành phần nhƣ trên ngoại trừ
thạch và CaCO3. Công thức môi trƣờng MRS Broth (g/L):
Pepton

10g

MgSO4.7H2O

0,58g

Amoni citrat

2g

Glucose

20g

Cao thịt

10g

MnSO4.H2O

0,28g

Natri acetat

5g

K2HPO4

2g

Cao nấm men

5g

Tween 80

1ml

Nƣớc cất vừa đủ 1000 ml , pH= 7
-Công thức môi trƣờng Thạch dùng để nuôi cấy vi sinh vậy kiểm định:
Pepton

10g

Cao thịt

5g

NaCl

10g

Thạch

15g

Nƣớc cất vừa đủ 1000ml , pH=7

17


c)Thiết bị:
Bảng 2.1 Danh sách máy móc thiết bị sử dụng
STT Tên máy
1
Bếp cách thủy

STT Tên máy
8
Tủ hấp

2

Cân kỹ thuật

9

Tủ cấy

3

Cân Phân tích

10

Tủ lạnh

4

Lị vi sóng

11

Tủ sấy

5

Máy lắc Vortex

12

Tủ cấy vơ trùng

6

Kính hiển vi

13

Tủ ấm

7

Máy li tâm

d) dụng cụ:
Bình định mức 50, 100, 1000 ml

Đèn cồn

Ống nghiệm

Pipetman (Pipet Eppendorf)

Bình nón 100, 250, 500, 1000 ml

Đĩa petri đƣờng kính 9 cm

Pipet chia vạch

Que cấy đầu tròn

Chày cối sứ

Ống đong

Pipet Pasteur

Ống Eppendorf 1,5

Đầu côn
2.3.3 Các phương pháp nghiên cứu
2.3.3.1 Thu thập mẫu
Thu thập mẫu từ các nguồn lên men lactic (Dƣa cải muối chua, kim chi,
sữa chua Vinamilk, nem chua,…) có tại khu vực Xuân Mai - Chƣơng Mỹ - Hà
Nội. Các mẫu thực phẩm lên men phải đƣợc lên men đủ thời gian từ 48-72 giờ.
Sử dụng các ống fancol 30 ml đã khử trùng đựng mẫu nƣớc lên men.

18


Các mẫu vi khuẩn kiểm định có sẵn trong phịng thí nghiệm Vi sinh - Hóa
sinh Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp, tiến hành hoạt háo các chủng vi khuẩn kiểm
định trên môi trƣờng LB lỏng.
2.3.3.2 Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men
Nguyên tắc:
Phân lập vi khuẩn là quá trình tách rời một loại vi khuẩn từ quần thể vi
sinh vật, sau đó cấy chúng lên mơi trƣờng thạc dinh dƣỡng chọn lọc cho đến khi
vết cấy cạn dần. Sau khi ủ ở các điều kiện thích hợp các vi khuẩn sẽ phân chia
nhiều lần, tạo thành các quần thể riêng rẽ gọi là khuẩn lạc. Một ít tế bào đƣợc
cấy truyền vào ống môi trƣờng giữ giống và ủ ở điều kiện thích hợp để chúng
phát triển thành quần thể mới.
Tiến hành:
- Đối với mẫu thí nghiệm dạng lỏng thì chỉ cần pha lỗng ra các nồng độ
10-1, 10-2, 10-3, 10-4,… rồi hút 0,05 ml dịch mẫu nhỏ lên đĩa peptri chứa môi
trƣờng MRS đặc. Dùng que trải gạt đều trên mặt thạch cho đến khi khô mặt
thach, ủ ở 37oC trong 24 giờ.
- Đối với mẫu thí nghiệm ở dạng rắn thì cần cân 5g mẫu, cho hòa tan vào

nƣớc cất, hút dịch lỏng rồi lại pha lỗng nhƣ trên.
- Kiểm tra hình thái khuẩn lạc đặc trƣng cho vi khuẩn lactic. Những dòng
vi khuẩn đƣợc chấp nhận khi có hình dạng khuẩn lạc trắng đục, khơng màu, bờ
láng, lồi, bìa ngun hoặc chia thùy. Khuẩn lạc này nằm trên đƣờng cấy chuyển
và không lẫn với những khuẩn lạc có hình thái và màu sắc lạ. Sau khi đƣợc tách
dòng, những dòng phân lập sẽ đƣợc kiểm tra hình thái và quan sát độ thuần dƣới
kính hiển vi quang học.
- Tiến hành cấy ria để tinh sạch các chủng vi khuẩn. Các kỹ thuật cấy ria
nhƣ: kiểu chữ chi; chữ T; ria 3 góc;…vết cấy cạn dần cho đến khi xuất hiện các
khuẩn lạc riêng rẽ.

19