Tuyển chọn và xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho các chủng bacillus subtilis có khả năng sản sinh bacteriocin hoạt tính cao

BỘ CƠNG THƯƠNG
ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

Tên đề tài: TUYỂN CHỌN VÀ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN NI CẤY
THÍCH HỢP CHO CÁC CHỦNG Bacillus subtilis CÓ KHẢ NĂNG SẢN
SINH BACTERIOCIN HOẠT TÍNH CAO
Mã số đề tài: 19.2TP05SV
Chủ nhiệm đề tài: Đinh Thị Ngọc Ngân
Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm

Tp. Hồ Chí Minh, 10/2020


LỜI CÁM ƠN
Để có được thành cơng như ngày hơm nay không chỉ là công sức của mỗi cá nhân mà đó là
nhờ vào sự cố gắng của một tập thể, của bạn bè, anh chị và quan trọng hơn hết đó là sự hỗ trợ
tận tình của thầy cơ, những người đưa đị dẫn lối cho chúng tơi trên con đường tìm kiếm tri
thức.
Trước tiên chúng tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Trường đại học Công nghiệp TP.
HCM cùng với phòng Quản lý khoa học và Hợp tác quốc tế đã hỗ trợ và tạo điều kiện để
chúng tơi có thể thực hiện đề tài này. Chúng tôi cảm ơn đến quý thầy cô viện Công nghệ Sinh
học và Thực phẩm đã tận tình truyền đạt cho tôi những kiến thức và kỹ năng chuyên môn,
những hành trang q giá để tơi có thể tự tin bước vào đời và cống hiến hết mình cho xã hội.
Chúng tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô.
Đặc biệt, chúng tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Ngọc Ẩn đã dành thời gian quý báu
của mình để cố vấn cho chúng tôi về lĩnh vực nghiên cứu khoa học.
Bên cạnh đó chúng tơi cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Phạm Tấn Việt và TS.

Nguyễn Thị Diệu Hạnh đã luôn đồng hành, tạo điều kiện hỗ trợ chúng tơi trong q trình thực
hiện đề tài.
Mặc dù đề tài này không tránh khỏi những thiếu sót, chúng tơi rất mong nhận được những ý
kiến đóng góp q báu của q thầy cơ giúp đề tài được hoàn thiện hơn.

1


PHẦN I. THƠNG TIN CHUNG
I. Thơng tin tổng qt
1.1. Tên đề tài: Tuyển chọn và xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho các chủng

Bacillus subtilis có khả năng sản sinh bacteriocin hoạt tính cao
1.2. Mã số: 19.2TP05SV
1.3. Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài
TT

Họ và tên
(học hàm, học vị)

Đơn vị cơng tác

Vai trị thực hiện đề tài

1

Đinh Thị Ngọc Ngân Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm
(Sinh viên)
-

Khảo sát các điều kiện nuôi
cấy Bacillus subtilis NN
Viết báo cáo

2

Trịnh Tiền Kim Ngân Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm
(Sinh viên)

Khảo sát các điều kiện nuôi
cấy Bacillus licheniformis
KN
Viết báo cáo

3

Nguyễn Phúc Thạnh
(Sinh viên)

Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm
-

Phân lập và định danh vi
khuẩn sinh bacteriocin
Kiểm tra khả năng kháng
VSV của 2 chủng Bacillus
Viết báo cáo

1.4. Đơn vị chủ trì: Viện Cơng nghệ Sinh học vả Thực phẩm trường Đại học Công nghiệp
TP. HCM

1.5. Thời gian thực hiện:
1.5.1. Theo hợp đồng: từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 04 năm 2020
1.5.2. Gia hạn (nếu có): đến tháng 09 năm 2020
1.5.3. Thực hiện thực tế: từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 09 năm 2020
1.6. Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có):
Dựa trên một số thay đổi thực tế về cơ sở và điều kiện thí nghiệm cũng như tình Hình dịch
bệnh, chúng tơi có một số thay đổi so với thuyết minh ban đầu như sau:
Thuyết minh ban đầu
Aspergillus niger
Vi sinh vật đối kháng

Nguồn nitrogen
pH môi trường ban đầu

Thay đổi
- Thay bằng: A. fumigatus
- Bổ sung thêm 3 vi khuẩn: S.
aureus, S. typhi, E. coli
- Bổ sung thêm 5 nấm mốc: F.
oxysporum, F. equiseti, Aspergillus
sp., P. chermesinum, N. dimidiatum
(NH4)2HPO4, NH4H2PO4, - Thay bằng: NH4Cl, NaNO3,
tryptone.
peptone.
- Bổ sung ở nồng độ 0.1% - Bổ sung ở nồng độ 1.0%
Thay bằng: 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0,
6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2
9.0
2

Nhiệt độ nuôi cấy

36.0℃, 36.5℃, 37.0℃,
37.5℃, 38.0℃

Thời gian nuôi cấy

12h, 24h, 36h, 48h

Nồng độ NaCl

3.3%, 3,4%, 3.5%, 3.6%,
3.7%

Nhiệt độ bảo quản

-40℃, 0℃, 4℃

Thay bằng: 25℃, 28℃, 33℃,
37℃, 45℃
Thay bằng: sau mỗi 3 hay 6 giờ,
trong 24 giờ
Thay bằng: 0%, 0.5%, 1.0%, 1.5%,
2.0%
Thay bằng: -60℃, -20℃, 4℃, và
nhiệt độ phòng (~33℃)

1.7. Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 5 triệu đồng.
II. Kết quả nghiên cứu

1. Đặt vấn đề
Trong những năm ngày đây việc xuất hiện nhiều vi sinh vật đề kháng kháng sinh ngày
càng gia tăng và đang là một vấn đề báo động trên toàn thế giới. Theo báo cáo của WHO từ
giữa năm 2014 đến nay có hơn 1 triệu người tử vong do nhiễm siêu vi khuẩn kháng kháng
sinh. Các chủng vi khuẩn gây bệnh hiện nay đa phần đều kháng thuốc, khoảng 60% các ca
nhiễm trùng trong bệnh viện đều do vi khuẩn kháng thuốc và các nhóm kháng sinh đều đã bị
kháng. Hiện nay, WHO xếp Việt Nam vào nhóm các nước kháng sinh bị kháng cao nhất thế
giới mà nguyên nhân chính đến từ việc lạm dụng quá mức và sử dụng kháng sinh không phù
hợp với bằng chứng cho thấy 88-97% các cửa hàng bán thuốc kê kháng sinh mà khơng có
đơn thuốc của bác sĩ [1] [2]. Theo nghiên cứu từ bệnh viện Hữu Nghị Việt Tiệp cho thấy E.
coli và Klebsiella spp. đều kháng cephalosporin thế hệ 3 với tỷ lệ tương đối cao: cefotaxime
(52,2%-64,4%) và (43,2%-56,7%), kháng ceftazidime (32,3%-53,0%) và (39,9%-50,8%),
Klebsiella spp. kháng imipenem là 26,2%-28,1%, kháng meropenem 21,9%-29,6%, và đặc
biệt là sự xuất hiện những chủng Acinetobacter baumannii và Pseudomonas aeruginosa đề
kháng với tất cả kháng sinh thử nghiệm ở trên [3]. Kháng sinh hầu hết được sản xuất là kháng
sinh phổ rộng có thể dùng để ức chế hoặc tiêu diệt nhiều loài vi sinh vật gây bệnh do đó việc
sử dụng kháng sinh cịn có thể tiêu diệt các vi sinh vật sống cộng sinh trong cơ thể vật chủ
(các loài bacteroides sống trong đại tràng tổng hợp vitamin K cần thiết; vi khuẩn đường ruột
giúp chúng ta chống lại các sinh vật gây bệnh), mặc dù đa số các vi sinh vật này có thể trở về
trạng thái tiền xử lí kháng sinh nhưng cũng có một số khơng thể phục hồi làm ảnh hưởng đến
sức khỏe vật chủ [4]. Sự khan hiếm trong việc tìm ra các loại kháng sinh mới thay thế các loại
kháng sinh khơng cịn tác dụng chữa trị thúc đẩy chúng ta cần tìm ra một giải pháp an tồn
hơn chẳng hạn như bacteriocin và các hợp chất giống bacteriocin (bacteriocin like substances)
[5].
3


Bacteriocin và các hợp chất giống bacteriocin có một số điểm thuận lợi bởi vì chúng
là protein hoặc peptide được sản xuất bởi ribosome nên không giống với kháng sinh, chúng
nhạy cảm với protease, ít có hại với con người và môi trường xung quanh [6]. Bacteriocin ức

chế hoặc giết chết các lồi có quan hệ gần gũi hoặc thậm chí khác lồi nhưng vơ hại đối với
bản thân vi sinh vật sản xuất do chúng có các gen giúp chống lại tác động của bacteriocin [6]
Chính vì những tác dụng có lợi và tiềm năng ứng dụng lớn của những hợp chất này
trong y học cũng như chăn nuôi, thủy sản, và thực phẩm… nên chúng tôi tiến hành tuyển chọn
từ chế phẩm sinh học các chủng Bacillus và khảo sát các điều kiện ni cấy thích hợp cho sự
sản sinh bacteriocin từ các chủng vi khuẩn này.
2. Mục tiêu
Xác định được các điều kiện ni cấy thích hợp cho sự sản sinh bacteriocin từ 2 chủng
Bacillus.
Với mục tiêu này đề tài gồm có các nội dung nghiên cứu như sau:
 Phân lập và định danh 2 chủng vi khuẩn Bacillus từ chế phẩm sinh học.
 Sàng lọc khả năng kháng khuẩn và kháng mốc của các chủng Bacillus.
 Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ và thời gian nuôi cấy lên khả năng kháng
khuẩn và kháng mốc của các chủng Bacillus.
 Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu lên khả năng kháng khuẩn và kháng
mốc của các chủng Bacillus.
 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitrogen lên khả năng kháng khuẩn và kháng mốc của
các chủng Bacillus.
 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên khả năng kháng khuẩn và kháng mốc của
các chủng Bacillus.
 Khảo sát nhiệt độ và thời gian bảo quản dịch bacteriocin thô.

4


3. Phương pháp nghiên cứu
3.1 Phương pháp phân lập
Cân 1 g bột chế phẩm sinh học cho vào môi trường LB broth, ni lắc ở 150 vịng/phút trong
30 phút ở 37°C. Dùng que cấy nhúng vào ống giống đã được hoạt hóa tiến hành cấy ria trên
đĩa mơi trường LB agar và nuôi ủ ở 37°C trong 24 giờ.

Chọn khuẩn lạc đặc trưng và cấy ria cho đến khi có được chủng vi khuẩn thuần khiết. Tiến
hành giữ giống cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2 Phương pháp giữ giống
Chọn một khuẩn lạc riêng lẻ tăng sinh trong 3 ml môi trường LB, hút 10% giống vào 10 ml
môi trường LB và ni cấy lắc ở 150 vịng/phút đến OD600= 0.6-0.8. Sau đó phân phối vào
eppendorf dịch khuẩn và glycerol với tỷ lệ 1:1, tiến hành trữ đông ở -60ºC.
3.3 Phương pháp định danh
Quan sát đại thể, vi thể
Hình thái khuẩn lạc được quan sát sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường thạch LB. Tiến hành
quan sát đặc điểm khuẩn lạc dựa vào các yếu tố: màu sắc, kích thước, bề mặt khuẩn lạc, hình
dạng rìa khuẩn lạc [7].
Cấu trúc vi thể của khuẩn lạc được quan sát trên tiêu bản nhuộm Gram:
(1) Chọn khuẩn lạc đặc trưng.
(2) Tạo vết bơi bằng cách dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn hịa vào giọt nước ở giữa lam
kính sau đó hông khô bằng ngọn lửa đèn cồn.
(3) Nhuộm tiêu bản theo thứ tự thuốc nhuộm tím kết tinh trong 60 giây - rửa nước - Lugol
trong 60 giây - rửa nhanh bằng cồn 96° - rửa nước - safranin trong 60 giây - rửa nước.
(4) Quan sát và ghi nhận Hình ảnh dưới vật kính X100 với dầu.
Vi khuẩn Bacillus đa số tạo bào tử sau 48 giờ, sau thời gian nuôi ủ chọn khuẩn lạc đặc trưng
và tiến hành nhuộm bào tử:
(1) Chọn khuẩn lạc đặc trưng.
(2) Tạo vết bơi bằng cách dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn hịa vào giọt nước ở giữa lam
kính sau đó hong khơ bằng ngọn lửa đèn cồn.
(3) Đặt lam kính lên trên giá đỡ và đặt vào nồi nước đun sôi, đặt giấy lọc trên vệt bôi.
(4) Nhỏ 2-3 giọt malachite lên trên và để yên trong 10 phút sau đó rửa bằng nước cất.
5


(5) Nhỏ 2-3 giọt safranin trong 30 giây, rửa lại bằng nước cất, để khơ.
(6) Quan sát ở vật kính X100 và ghi nhận Hình ảnh

Các phản ứng sinh hóa
Thử nghiệm các phản ứng sinh hóa: Thử nghiệm indol, VP, amylase, catalase, có khả năng di
động, hiếu khí [7].
-

Thử nghiệm indol: Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường canh thang Tryptophan

ở 35-37°C trong 18-24 giờ, sau thời gian ủ nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Kovac và quan sát kết quả.
Dương tính nếu xuất hiện vịng đỏ phía trên dung dịch nuôi cấy.
-

Thử nghiệm VP: Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường MR-VP ở 37°C trong 24-48

giờ. Sau thời gian nuôi ủ lấy 1 ml dịch nuôi cấy cho vào ống nghiệm mới, tiếp theo thêm 0.6
ml dung dịch α-napthol 15% cùng với 0.2 ml KOH 40%. Sau 15-20 phút quan sát kết quả.
Kết quả là dương tính nếu xuất hiện màu đỏ trên mơi trường
-

Thử nghiệm tính di động: Cấy vi khuẩn đâm sâu vào môi trường thạch mềm (0.5%

agar). vi khuẩn có tính di động sẽ làm môi trường đục, phát triển lan ra khỏi vệt cấy.
-

Thử nghiệm catalase: Lấy một ít vi khuẩn đặt lên lam kính sạch, nhỏ vài giọt H2O2 30%

lên trên vi khuẩn, quan sát sau 1 - 2 giây. Phản ứng dương tính nếu có bọt khí xuất hiện.
-

Kiểm tra hoạt tính amylase: bổ sung vào môi trường LB agar 1% tinh bột, cấy chấm

điểm vi khuẩn sau đó ủ ở 37°C trong 24-48 giờ. Tiến hành nhỏ lugol vào đĩa thạch, vi khuẩn
có khả năng phân giải amylase sẽ xuất hiện vòng phân giải.
Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử
Mẫu được gửi và giải trình tự tại cơng ty TNHH Dịch Vụ và Thương Mại Nam Khoa. Kết
quả giải trình tự được xử lí và so sánh với cơ sở dữ liệu 16S-rRNA của vi khuẩn có sẵn trên
NCBI bằng công cụ BLAST ( và được sử dụng để vẽ
cây phát sinh loài bằng phần mềm Mega version 5 (Tamura, Peterson, Stecher, Nei, and
Kumar, 2011).
3.4 Phương pháp thu nhận dịch nuôi cấy
Bacillus được nuôi tăng sinh trong môi trường LB broth với tốc độ lắc 150 vòng/phút trong
24 giờ, sau đó chia nhỏ dịch huyền phù vào các ống eppendorf 1.5 ml, tiến hành ly tâm 14000
6


vòng/ phút trong 15 phút ở 4℃ và loại bỏ cặn tế bào. Phần dịch sau ly tâm được lọc qua màng
lọc 0.45 µm trong điều kiện vơ trùng để loại bỏ phần tế bào cịn sót lại [8].
3.5 Phương pháp khuếch tán giếng thạch
Vi khuẩn được nuôi cấy qua đêm trên mơi trường LB broth, sau đó dịch vi khuẩn được pha
loãng tương đương với giá trị McFarland 0.5 (≈1.5x108 CFU/ml) để sử dụng làm đối kháng.
Chuẩn bị các đĩa mơi trường LB agar (10 ml), hút 100 µl dịch vi khuẩn chỉ thị và trang đều
trên bề mặt thạch cho đến khi khô. Tiến hành đục 2 giếng với đường kính 8 mm trên đĩa thạch.
Hút 50 µl dịch cho vào các giếng với giếng 1: dịch nuôi cấy; giếng 2: dung dịch NaCl 0.9%
[8].
Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng và đọc kết quả sau 12 giờ.
Khả năng kháng khuẩn của dịch nuôi cấy được xác định bằng sự hiện diện của vòng kháng
khuẩn xung quanh giếng, đường kính vịng kháng khuẩn được tính bằng cơng thức: [8] [9]
H= D-d
Trong đó

H: Độ lớn vùng kháng khuẩn (mm)

D: Đường kính vịng ức chế (mm)
d: Đường kính giếng (mm).

3.6 Phương pháp chuẩn bị giống
Bacillus từ eppendorf giống được hoạt hóa trên đĩa môi trường LB agar ủ ở 37°C trong 24
giờ. Sau thời gian ủ, dùng que cấy tròn lấy một khuẩn lạc cho vào bình chứa 5 ml mơi trường
LB broth ni lắc ở 150 vịng/phút, 37°C, qua đêm. Tiếp theo dùng micropipette hút 10%
giống cho vào bình 20 ml môi trường LB broth tiếp tục nuôi cấy lắc 150 vịng/phút ở 37°C
trong 12-15 giờ. Dịch ni cấy này được sử dụng làm giống cho thí nghiệm tiếp theo.
3.7 Phương pháp khảo sát nhiệt độ và thời gian nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh
bacterocin từ Bacillus
Tiến hành trên môi trường LB broth, dùng micropiptette hút 2 ml dịch vi khuẩn đã chuẩn bị
cho vào các bình chứa 20 ml môi trường và được nuôi cấy lắc ở 150 vòng/phút ở các nhiệt độ
khác nhau: 25°C, 28°C, 33°C, 37°C, 45°C. Sau mỗi 3 giờ nuôi cấy, tiến hành thu dịch và xử
7


lí, đánh giá khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán giếng để lựa chọn ra
nhiệt độ và thời gian mà ở đó dịch ni cấy có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất. Giá trị nhiệt
độ và thời gian nuôi cấy này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo [9] [10].
3.8 Phương pháp khảo sát giá trị pH thích hợp cho khả năng sinh bacterocin từ
Bacillus
Tiến hành trên môi trường LB broth, dùng micropiptette hút 2 ml dịch nuôi cấy đã chuẩn bị
cho vào các bình chứa 20 ml mơi trường được điều chỉnh với các giá trị pH khác nhau: 4.0,
5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0. Các bình được ni cấy lắc ở 150 vịng/phút, nhiệt độ và thời gian đã
lựa chọn ở thí nghiệm trước. Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành thu dịch và đánh giá khả
năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch để lựa chọn ra giá trị pH
thích hợp [9] [11].
3.9 Phương pháp khảo sát nguồn nitrogen thích hợp cho khả năng sinh bacterocin từ
Bacillus

Tiến hành trên môi trường MTCB (0.5 g MgSO4.7H2O, 3 g NaH2PO4.2H2O, 3 g
Na2HPO4.12H2O) có bổ sung 1% glucose, dùng hút 2 ml dịch ni cấy đã chuẩn bị cho vào
các bình chứa 20 ml môi trường với 1% các nguồn nitrogen khác nhau (NH4Cl, NH4NO3,
NaNO3, peptone, yeast extract, urea). Các bình được ni cấy lắc ở 150 vịng/phút với giá trị
pH là 7.0, nhiệt độ, thời gian đã được lựa chọn từ các thí nghiệm trước. Sau thời gian ni
cấy, tiến hành thu dịch và đánh giá khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán
giếng thạch để lựa chọn ra nguồn nitrogen thích [9] [11] [12].
3.10 Phương pháp khảo sát nồng độ NaCl thích hợp cho khả năng sinh bacterocin từ
Bacillus
Tiến hành trên môi trường LB broth hoặc môi trường cơ bản (MTCB) (0.5 g MgSO4.7H2O,
3g NaH2PO4.2H2O, 3 g Na2HPO4.12H2O). Dùng micropiptette hút 2 ml dịch nuôi cấy đã
chuẩn bị cho vào các bình chứa 20 ml mơi trường có bổ sung các nồng độ NaCl khác nhau
(0%, 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0%). Các bình được ni cấy lắc ở 150 vòng/phút với giá trị pH,
nhiệt độ, thời gian đã được lựa chọn từ các thí nghiệm trước. Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành
thu dịch và đánh giá khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
để lựa chọn ra nồng độ thích hợp [13].

8


3.11 Phương pháp khảo sát nhiệt độ và thời gian bảo quản dịch bacteriocin thô từ các
chủng Bacillus
Dịch bacteriocin thô sau khi được thu nhận sẽ được bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau (-60℃,
-20℃, 5℃, nhiệt độ phòng). Hoạt tính được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán giếng
thạch sau mỗi 10 ngày trong 30 ngày [14].
4. Tổng kết về kết quả nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu đã:
- Phân lập và định danh được 2 chủng Bacillus từ chế phẩm sinh học
- Xác định được khả năng kháng khuẩn, kháng mốc của 2 chủng này.
- Xác định được điều kiện ni cấy thích hợp cho khả năng sinh bacteriocin thô của 2 chủng

Bacillus: thời gian và nhiệt độ nuôi cấy, giá trị pH môi trường ban đầu, nguồn nitrogen, và
nồng độ NaCl.
- Xác định được nhiệt độ và thời gian thích hợp để bảo quản bacterioin thơ trong thời gian
ngắn.
5. Đánh giá các kết quả đã đạt được và kết luận
Đề tài đã hoàn thành tốt tất cả các nội dung nghiên cứu và đáp ứng được mục tiêu nghiên cứu
đã đề ra. Các kết quả đạt được từ đề tài sẽ là tiền đề có giá trị tham khảo cao cho các nghiên
cứu sản xuất về sau cũng như các ứng dụng trong lĩnh vực chăn nuôi, dược phẩm, thực
phẩm…
6. Tóm tắt kết quả (tiếng Việt và tiếng Anh)
Chi Bacillus là vi khuẩn có khả năng sản sinh nhiều hợp chất kháng khuẩn và kháng
mốc, có tiềm năng ứng dụng trong y học, chăn nuôi và thực phẩm. Chúng tôi đã phân lập và
định danh được 2 chủng Bacillus từ chế phẩm sinh học là B. subtilis NN và B. lichenifomis
KN, có nhiều tiềm năng ứng dụng trong tương lai. Bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch,
B. subtilis NN được chứng minh có khả năng ức chế Bacillus cereus, Salmonella enteritica
subsp. enteritica, Fusarium oxysporum, Fusarium equiseti, và Penicilium chermesinum,
tương tự B. licheniformis KN cũng ức chế được sự phát triển của B. cereus, Salmonella
enteritica subsp. Enteritica, F. oxysporum và F. equiseti. Điều kiện ni cấy thích hợp cho sự
9


sản sinh bacteriocin thô của B. subtilis NN là 18 giờ nuôi cấy ở 37℃ trong môi trường cơ bản
(0.5 g MgSO4.7H2O, 3 g NaH2PO4.2H2O, 3 g Na2HPO4.12H2O) có pH ban đầu là 6.0, được
bổ sung 1% glucose cùng với 1% yeast extract hoặc 1% peptone. Đối với B. licheniformis
KN, mơi trường thích hợp là LB (5 g/l yeast extract, 10 g/l peptone, 10-15 g/l NaCl) với pH
ban đầu là 7.0 và ở 37C trong 15 giờ. Dịch bacteriocin thu nhận từ B. subtilis NN hoạt tính
ổn định khi bảo quản ở nhiệt độ -20C và -60C trong thời gian ít nhất là 30 ngày, và dịch thu
nhận từ B. licheniformis KN có hoạt tính ổn định nhất khi bảo quản ở -20C và -60C ít nhất
là 10 ngày.
The Bacillus genus is well-known for the ability of producing antibacterial and

antifungal compounds, with applied potential in medical, animal husbandry, aquaculture and
food technology. In this study, we have successfully isolated and identified two Bacillus
strains B. subtilis NN and B. lichenifomis KN, and shown that these two strains have high
potential applications. The agar diffusion bioassay was carried out and we have proved that
B. subtilis NN strain is able to inhibit Bacillus cereus, Salmonella enteritica subsp. enteritica,
Fusarium oxysporum, Fusarium equiseti, and Penicilium chermesinum while B. licheniformis
KN is able to inhibit B. cereus, Salmonella enteritica subsp. Enteritica, F. oxysporum and F.
equiseti. Suitable growth condition for bacteriocin production from B. subtilis NN was
determined at 37C in the medium containing 0.5 g MgSO4.7H2O, 3 g NaH2PO4.2H2O, 3 g
Na2HPO4.12H2O supplemented with 1% glucose, 1% yeast extract or 1% peptone, pH 6.0 for
18 hours. In the case of B. licheniformis KN growth condition was determined at 37C in the
medium containing 5 g yeast extract, 10 g peptone, 10-15 g NaCl, pH 7.0 for 15 hours. Raw
bacteriocin from B. subtilis NN is stable at -20C or -60C for at least 30 days, and at least 10
days in the case of B. licheniformis KN.

10


III. Sản phẩm đề tài, công bố và kết quả đào tạo
3.1. Kết quả nghiên cứu (sản phẩm dạng 1,2,3)

TT

Tên sản phẩm

Yêu cầu khoa học hoặc/và chỉ tiêu
kinh tế - kỹ thuật
Đăng ký

Đạt được

1

Giống vi sinh vật

2

2

2

Quy trình ni cấy và
thu nhận bacteriocin

2

2

3.2. Kết quả đào tạo
Thời gian
TT Họ và tên
thực hiện đề tài

Tên đề tài
Tên chuyên đề nếu là NCS
Tên luận văn nếu là Cao học

Đã bảo vệ

Nghiên cứu sinh

Học viên cao học
Sinh viên Đại học
IV. Tình Hình sử dụng kinh phí
T
T
A
1
2
3
4
5
6
7
8
B
1
2

Nội dung chi

Kinh phí
được duyệt
(triệu đồng)

Kinh phí
thực hiện
(triệu đồng)

Ghi
chú

Chi phí trực tiếp
Th khốn chun mơn
Ngun, nhiên vật liệu, cây con..
Thiết bị, dụng cụ
Cơng tác phí
Dịch vụ th ngồi
Hội nghị, hội thảo,thù lao nghiệm thu giữa kỳ
In ấn, Văn phịng phẩm
Chi phí khác
Chi phí gián tiếp
Quản lý phí
Chi phí điện, nước
Tổng số

11


V. Kiến nghị
Bên cạnh việc tìm ra các yếu tố mơi trường thích hợp cho q trình sinh tổng hợp bacteriocin
thơ từ B. subtilis và B. licheniformis, chúng tơi có những kiến nghị:
 Nghiên cứu thêm 2 yếu tố môi trường ni cấy thích hợp cho sự sinh tổng hợp
bacteriocin từ 2 chủng là nguồn chất khoáng và nguồn vitamin.
 Nghiên cứu phân tích nhằm xác định thành phần hóa học cũng như tính chất của các
loại bacteriocin được sinh tổng hợp từ 2 chủng Bacillus này bằng các phương pháp hiện đại
như SDS-PAGE, HPLC và MALDI-TOF từ đó có những ứng dụng cụ thể trong tương lai.
VI. Phụ lục sản phẩm
 Sản phẩm dạng I: Giống vi sinh vật
Giống B. subtilis NN và B. licheniformis KN được lưu trữ trong các eppendorf chứa
glycerol 50% ở -60C tại phòng T3.08.

12


 Sản phẩm II: Quy trình ni cấy và thu nhận bacteriocin từ các chủng B.
subtilis (B. subtilis NN và B. licheniformis KN)

Chủ nhiệm đề tài

Tp. HCM, ngày ........ tháng........ năm .......
(ĐƠN VỊ)
Phòng QLKH&HTQT
Trưởng (đơn vị)
(Họ tên, chữ ký)

13


PHẦN II. BÁO CÁO CHI TIẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Chi Bacillus
Chi Bacillus là những trực khuẩn nhỏ Gram dương, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, sinh nội
bào tử với hình thái tế bào đặc trưng là hình que, sản xuất catalase. Chúng được tìm thấy ở
nhiều mơi trường như đất, nước, thảm thực vật và trong hệ tiêu hóa của các lồi động vật [15].
Các bào tử Bacillus được sản xuất khi vi khuẩn gặp điều kiện môi trường khắc nghiệt. Khi
chất dinh dưỡng suy giảm, tế bào sinh dưỡng thay đổi hình thái tạo ra tiền bào tử bên trong
nang bào tử và sau khoảng 8 tiếng, bào tử hoàn chỉnh sẽ được giải phóng [16]. Bào tử của
Bacillus là các tế bào khơng hoạt động trao đổi chất và có khả năng chống lại các tác động
của nhiệt, sự khô hạn, hóa chất độc hại và bức xạ. Việc sử dụng các loài Bacillus làm thực
phẩm bổ sung đang được nghiên cứu rộng rãi nhờ khả năng kích thích miễn dịch, hoạt động

kháng khuẩn và đảm bảo được tính ổn định của sản phẩm [17].
1.2. Bacteriocin và Bacteriocin like substance
Bacteriocin rất phong phú, bản chất là protein hoặc peptide được sản xuất bởi ribosome.
Bacteriocin có khả năng ức chế sự sinh trưởng hoặc giết chết các vi sinh vật khác [18] [19].
Bacteriocin từ vi khuẩn Gram âm khác với bacteriocin từ vi khuẩn Gram dương, do đối tượng
nghiên cứu của đề tài là Bacillus nên tôi chỉ đề cập đến bacteriocin từ vi khuẩn Gram dương.

14


1.2.1 Phân loại
Các bacteriocin và BLS được phân loại theo kích thước phân tử, tính đặc hiệu của phương
thức hoạt động, sự hiện diện của các acid amin biến đổi và đặc điểm hình thái thành bốn lớp
chính và các lớp được chia thành các loại hoặc các lớp con.

Hình 1.1 Sơ đồ phân loại bacteriocin ở vi khuẩn Gram dương [20]
Các bacteriocin loại I được gọi là lantibamel, là chuỗi peptide ngắn (<6 kDa), thẳng, bền nhiệt
có chứa các acid amin hiếm (lanthionine và/hoặc methyllanthionine) được hình thành bởi các
sửa đổi hậu dịch mã. Các lantibamel có tính lưỡng cực (đầu kị nước và đầu không kị nước),
mang điện tích dương, do đó hoạt động tiêu diệt vi khuẩn bằng cách kết hợp với các phân tử
phospholipid mang điện tích âm trên màng từ đó hình thành giếng trên màng tế bào [21].
Các bacteriocin loại II được phân thành 4 nhóm phụ (a, b, c, d) là các chuỗi peptide thẳng dài,
gồm 20-60 amino acid, bền nhiệt, khơng có acid amin biến đổi, mang điện tích dương, kị
nước [22].
Lớp III là các bacteriocin không bền nhiệt, chia làm 2 nhóm phụ IIIa và IIIb, chuỗi peptide
dài (>15 kDa), có chứa cấu trúc domain.

15

Bảng 1.1 phân loại một số bacteriocin
Phân loại

Bacteriocin

Chủng sản xuất

Lớp I

Nisin A

Lactococcus lactis subsp. lactic

Nisin U

Streptococcus uberis

Lớp II

Mersacidin

Bacillus sp.Y85,54728

Subtilosin A

Bacillus subtilis 168

Lactacin F
Lactococcin A
ABP-118

Lactobacillus spp.
Lactococcus lactis subsp. Cremoris
Lactobacillus salivarius subsp.
salivarius UCC118

Lớp III

Caseicin 80

Lactobacillus casei B80

Helveticin J

Lactobacillus helveticus 481

1.2.2 Cơ chế tác động
Các bacteriocin được tổng hợp bởi ribosome của vi khuẩn và được vi khuẩn giải phóng ra bên
ngồi. Các bacteriocin này ức chế hoặc tiêu diệt các vi khuẩn khác qua các con đường:
Tạo lỗ: Bacteriocin tác động vào lớp phospholipid sau đó dẫn đến sự hình thành lỗ hoặc các
kênh vận chuyển ở màng trong gây rò rỉ các hợp chất ở tế bào chất như acid amin, ATP, gây
mất điện tích, phá hủy gradient điện hóa từ đó gây chết tế bào [6].
Nuclease: các BLS là các enzyme như DNase, 16S rRNase, tRNase có đặc tính phân hủy
DNA và RNA của vi khuẩn đích từ đó dẫn đến ức chế sao chép DNA, phiên mã RNA, dịch
mã tạo protein [6].
Peptidoglycanase: các BLS là các enzyme phân giải tiền chất của peptidoglycan dẫn đến vi
khuẩn đích khơng thể tổng hợp vách tế bào, làm cho tế bào vi khuẩn trở nên dễ vỡ [6].

16

Hình 1.1 cơ chế tác động của bacteriocin
1.2.3 Bacteriocin / bacteriocin like substance của chi Bacillus
Lồi Bacillus subtilis có khả năng sinh một số bacteriocin như: Subtilin [10], Subtilosin A,
Ericin [23],… Một nghiên cứu báo cáo rằng chủng Bacillus subtilis 168 sản xuất hơn 10 loại
bacteriocin trong mơi trường hình thành bào tử (sporulation medium), trong đó subtilosin A
là một trong những loại chính được sản xuất trong giai đoạn đầu của quá trình hình thành bào
tử [24]. Năm 2011 Syed Iqbal Alam và cộng sự đã xác định một BLS có kích thước từ 3-5
kDa từ chủng Bacillus subtilis BS15 có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhi. Năm 2013
Clarisse S. Compaoré và cộng sự đã phân lập chủng B. subtilis H4 từ Bikalga (một loại thực
phẩm lên men từ cây dấm bụt) ở Tây Phi có khả năng ức chế Listeria monocytogenes,
Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus và Bacillus cereus, người ta nghiên cứu được
rằng các chất kháng khuẩn từ chủng này được sản xuất ở pha tăng trưởng. Sau khi phân tích
bằng SDS-PAGE và UHPLC-TOFMS, dịch nuôi cấy vô bào được xác định có chứa các
protein với kích thước xấp xỉ 4 kDa (tương đương kích thước của subtilin và subtilosin) [25].
Năm 2018 Seul Gi Lee đã phát hiện một loại bacteriocin mới có tên là mejucin từ chủng B.
subtilis SN7 có tác dụng ức chế B. cereus [26].
Một số hợp chất kháng khuẩn sản xuất từ Bacillus licheniformis được nghiên cứu và công bố
như: các bacteriocin-like peptide gồm lichenin phân lập từ dạ cỏ trâu, bacillocin 490 từ sản
phẩm bơ sữa, lichenicidin (, ) thuộc lớp I.3. Lichenin là một loại bacteriocin được sản xuất
trong điều kiện yếm khí do B. licheniformis 26L-10/3RA phân lập từ dạ cỏ trâu. Đây là một
17


peptide được mã hóa bởi gen trên nhiễm sắc thể, có tính kỵ nước, nhạy cảm với oxy, bền với
nhiệt (duy trì hoạt tính ngay cả sau khi đun sơi trong 10 phút). Trọng lượng phân tử của
lichenin được ước tính bởi điện di gel SDS-PAGE và sắc ký lọc gel là khoảng 1400-1500 Da,
trùng với giá trị của 1344 Da ước tính từ acid amin hồn chỉnh của nó [27].
1.3. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước

Bacteriocin, peptide kháng khuẩn hay hợp chất kháng mốc ngày nay được ứng dụng rộng rãi
trong các ngành công nghiệp khác nhau: ứng dụng trong việc kéo dài thời gian bảo quản thực
phẩm, ức chế các vi sinh vật gây bệnh trên động vật, thực vật.
Năm 2006, bacteriocin-like peptides của Bacillus licheniformis ZJU12 đã được Lili He và
cộng sự phân lập từ đất có phổ đối kháng rộng chống lại các lồi vi khuẩn Gram dương
(Staphylococcus aureus, S. aureus ATCC 25923, Enterococcus faecium) và vi nấm gây bệnh
(Alternaria brassicae, Fusarium oxysporum, Guignardia sp., Pyricularia grisea, Rhizoctonia
solani) nhưng không chống lại vi khuẩn Gram âm trừ Xanthomonas oryzae pv. oryzae [28].
Năm 2012 Asma Ansari và cộng sự đã tiến hành khảo sát các điều kiện nuôi cấy chủng
Bacillus subtilis KIBGE IB-17 sản sinh bacteriocin hoạt tính cao. Điều kiện được lựa chọn ở
thời gian nuôi cấy là 24 giờ, pH môi trường được điều chỉnh về pH 7.0, 37°C, nồng độ NaCl,
tryptone, yeast extract được bổ sung lần lượt là 0.5%, 1%, 0.5% [29].
Năm 2013, Alvarez-Ordóđez và cộng sự đã xác định được khả năng kháng khuẩn của mười
chủng Bacillus licheniformis phân lập từ các loại sữa bột cho trẻ sơ sinh bán ở Ireland chống
lại một loạt các vi sinh vật (Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus
agalactiae, Salmonella typhimurium và Escherichia coli). Kết quả thu được từ các phương
pháp phân tích bằng PCR và MALDI-TOF MS đã chỉ ra rằng có bốn chủng B. licheniformis
sản xuất một loại bacteriocin là lichenicidin. Sáu chủng cịn lại sản xuất một loại bacteriocin
khác có hoạt tính cao hơn so với các chủng sản xuất lichenicidin [30].
Năm 2015 Xiaoming Liu và cộng sự đã phân lập B. subtilis EMD4 từ nước tương có khả năng
ức chế mạnh sự phát triển của B. cereus và B. thuringiensis. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch
ni cấy ổn định ở pH từ 3.0-9.0, hoạt tính được giữ nguyên sau 15 phút ở 80°C và giảm 50%
sau 15 phút ở 90°C. Dựa vào trình tự nucleotide, hợp chất kháng khuẩn từ B. subtilis EMD4
đã được xác định là Subtilosin A [31].

18


Năm 2015, Khochamit và cộng sự đã phân lập từ đất địa phương chủng Bacillus subtillis
KKU213 có khả năng ức chế vi khuẩn gồm Bacillus cereus, Listeria monocytogenes,

Micrococcus và Staphylococcus aureus, dịch ni cấy này vẫn giữ được hoạt tính kháng
khuẩn khi được xử lí ở 60°C-100°C, ở pH 4.0-10.0. Sau khi phân tích bằng SDS-PAGE cho
thấy rằng protein có hoạt tính kháng khuẩn có kích thước nhỏ hơn 10 kDa, cuối cùng được
xác định là subtilosin A [32]
Năm 2015 A. Asaturova và cộng sự tiến hành khảo sát các điều kiện lên men thích hợp cho
hai chủng B. subtilis BZR 336g và B. subtilis BZR 517 đối kháng với Fusarium graminearum,
các yếu tố khảo sát gồm: nhiệt độ, pH, nguồn nitrogen, nguồn carbon. Kết quả mơi trường
khảo sát thích hợp đối với chủng B. subtilis BZR 336g là 30°C ở pH 6.0 hoặc 8.0; đối với
chủng B. subtilis BZR 51 là 35°C ở pH 10.0 với nguồn dinh dưỡng đều là molasses và corn
extract [33].
Năm 2018 Đỗ Thị Hiền khảo sát các điều kiện nuôi cấy B. subtilis để sản sinh bacteriocin có
hoạt lực cao, mơi trường được sử dụng là môi trường Luria Bertani chứa cao nấm men và
peptone với nồng độ NaCl 3.5%, pH 7.0. Bacteriocin thô thu được có khả năng đối kháng tốt
với Vibrio spp. nên có tiềm năng trong việc thay thế chất kháng sinh trong ni tơm [9].
Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước được đề cập ở trên cho thấy hướng nghiên cứu xác
định điều kiện ni cấy thích hợp cho khả năng sinh bacteriocin từ Bacillus vẫn còn rất nhiều
tiềm năng và có ý nghĩa khoa học lẫn thực tiễn. Vì lý do đó tơi đã quyết định thực hiện đề tài
“Tuyển chọn và xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho các chủng Bacillus subtilis có khả
năng sản sinh bacteriocin hoạt tính cao”.

19


2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Chế phẩm sinh học Bacillus của công ty BioSpring Việt Nam (162/12 Bình Lợi, Phường 13,
Bình Thạnh, Hồ Chí Minh) được thiết kế dành riêng cho các nhà máy thức ăn chăn nuôi và
thức ăn cho ngành thủy sản, nguyên liệu cho thú y và dược phẩm.
Vi sinh vật được sử dụng để khảo sát khả năng đối kháng
Bảng 2.1 Các vi sinh vật dùng trong thử nghiệm khả năng đối kháng

Vi khuẩn chỉ thị

Nấm mốc chỉ thị

Pseudomonas aeruginosa

Fusarium oxysporum

Bacillus cereus

Fusarium equiseti

Salmonella enteritica subsp. enteritica

Aspergillus sp.

Staphylococcus aureus

Aspergillus fumigatus

Salmonella typhi

Penicillium chermesinum

Escherichia coli

Neoscytalidinum dimidiatum

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp phân lập

Cân 1 g bột chế phẩm sinh học cho vào mơi trường LB broth, ni lắc ở 150 vịng/phút trong
30 phút ở 37ºC. Dùng que cấy nhúng vào ống giống đã được hoạt hóa tiến hành cấy tria trên
đĩa mơi trường LB agar và nuôi ủ ở 37°C trong 24 giờ.
Chọn khuẩn lạc đặc trưng và cấy ria cho đến khi có được chủng vi khuẩn thuần khiết. Tiến
hành giữ giống cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.2 Phương pháp giữ giống
Chọn một khuẩn lạc riêng lẻ tăng sinh trong 3 ml môi trường LB, hút 10% giống vào 10 ml
môi trường LB và ni cấy lắc ở 150 vịng/phút đến OD600= 0.6-0.8. Sau đó phân phối vào
eppendorf dịch khuẩn và glycerol với tỷ lệ 1:1, tiến hành trữ đông ở -60ºC.
20


2.2.3 Phương pháp định danh
Quan sát đại thể, vi thể
Hình thái khuẩn lạc được quan sát sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường thạch LB. Tiến hành
quan sát đặc điểm khuẩn lạc dựa vào các yếu tố: màu sắc, kích thước, bề mặt khuẩn lạc, hình
dạng rìa khuẩn lạc [7].
Cấu trúc vi thể của khuẩn lạc được quan sát trên tiêu bản nhuộm Gram:
(1) Chọn khuẩn lạc đặc trưng.
(2) Tạo vết bôi bằng cách dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn hòa vào giọt nước ở giữa lam
kính sau đó hơng khơ bằng ngọn lửa đèn cồn.
(3) Nhuộm tiêu bản theo thứ tự thuốc nhuộm tím kết tinh trong 60 giây - rửa nước - Lugol
trong 60 giây - rửa nhanh bằng cồn 96° - rửa nước - safranin trong 60 giây - rửa nước.
(4) Quan sát và ghi nhận hình ảnh dưới vật kính X100 với dầu.
Vi khuẩn Bacillus đa số tạo bào tử sau 48 giờ, sau thời gian nuôi ủ chọn khuẩn lạc đặc trưng
và tiến hành nhuộm bào tử:
(1) Chọn khuẩn lạc đặc trưng.
(2) Tạo vết bôi bằng cách dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn hòa vào giọt nước ở giữa lam
kính sau đó hong khơ bằng ngọn lửa đèn cồn.
(3) Đặt lam kính lên trên giá đỡ và đặt vào nồi nước đun sôi, đặt giấy lọc trên vệt bôi.

(4) Nhỏ 2-3 giọt malachite lên trên và để yên trong 10 phút sau đó rửa bằng nước cất.
(5) Nhỏ 2-3 giọt safranin trong 30 giây, rửa lại bằng nước cất, để khơ.
(6) Quan sát ở vật kính X100 và ghi nhận hình ảnh
Các phản ứng sinh hóa
Thử nghiệm các phản ứng sinh hóa: Thử nghiệm indol, VP, amylase, catalase, có khả năng di
động, hiếu khí [7].
-

Thử nghiệm indol: Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường canh thang Tryptophan

ở 35-37°C trong 18-24 giờ, sau thời gian ủ nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Kovac và quan sát kết quả.
Dương tính nếu xuất hiện vịng đỏ phía trên dung dịch ni cấy.
-

Thử nghiệm VP: Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường MR-VP ở 37°C trong 24-48

giờ. Sau thời gian nuôi ủ lấy 1 ml dịch nuôi cấy cho vào ống nghiệm mới, tiếp theo thêm 0.6
21


ml dung dịch α-napthol 15% cùng với 0.2 ml KOH 40%. Sau 15-20 phút quan sát kết quả.
Kết quả là dương tính nếu xuất hiện màu đỏ trên mơi trường.
-

Thử nghiệm tính di động: Cấy vi khuẩn đâm sâu vào mơi trường thạch mềm (0.5%

agar). vi khuẩn có tính di động sẽ làm môi trường đục, phát triển lan ra khỏi vệt cấy.
-

Thử nghiệm catalase: Lấy một ít vi khuẩn đặt lên lam kính sạch, nhỏ vài giọt H2O2 30%

lên trên vi khuẩn, quan sát sau 1 - 2 giây. Phản ứng dương tính nếu có bọt khí xuất hiện.
-

Kiểm tra hoạt tính amylase: bổ sung vào mơi trường LB agar 1% tinh bột, cấy chấm

điểm vi khuẩn sau đó ủ ở 37°C trong 24-48 giờ. Tiến hành nhỏ lugol vào đĩa thạch, vi khuẩn
có khả năng phân giải amylase sẽ xuất hiện vòng phân giải.
Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử
Gen mã hóa cho 16S-rRNA được giải trình tự tại cơng ty TNHH Dịch Vụ và Thương Mại
Nam Khoa. Kết quả giải trình tự được xử lí và so sánh với cơ sở dữ liệu 16S-rRNA của vi
khuẩn có sẵn trên NCBI bằng cơng cụ BLAST và được sử dụng để vẽ cây phát sinh loài bằng
phần mềm Mega 5.
2.2.4 Phương pháp thu nhận dịch nuôi cấy
Bacillus được nuôi tăng sinh trong môi trường LB broth với tốc độ lắc 150 vịng/phút trong
24 giờ, sau đó chia nhỏ dịch huyền phù vào các ống eppendorf 1.5 ml, tiến hành ly tâm 14000
vòng/ phút trong vòng 15 phút ở 4°C và loại bỏ cặn tế bào. Phần dịch sau ly tâm được lọc qua
màng lọc 0.45 µm trong điều kiện vô trùng để loại bỏ phần tế bào cịn sót lại [8].
2.2.5 Phương pháp khuếch tán giếng thạch
Vi khuẩn được nuôi cấy qua đêm trên môi trường LB broth, sau đó dịch vi khuẩn được pha
lỗng tương đương với giá trị McFarland 0.5 (≈1.5x108 CFU/ml) để sử dụng làm đối kháng.
Chuẩn bị các đĩa môi trường LB agar (10 ml), hút 100 µl dịch vi khuẩn chỉ thị và trang đều
trên bề mặt thạch cho đến khi khô. Tiến hành đục 2 giếng với đường kính 8 mm trên đĩa thạch.
Hút 50 µl dịch cho vào các giếng với giếng 1: dịch nuôi cấy; giếng 2: dung dịch NaCl 0.9%
[8].
Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng và đọc kết quả sau 12 giờ.

22

Khả năng kháng khuẩn của dịch nuôi cấy được xác định bằng sự hiện diện của vòng kháng
khuẩn xung quanh giếng, đường kính vịng kháng khuẩn được tính bằng cơng thức: [8] [9]
H= D-d
Trong đó

H: Độ lớn vịng kháng khuẩn xung quanh giếng (mm)
D: Đường kính vùng ức chế (bao gồm đường kính giếng) (mm)
d: Đường kính giếng (mm).

2.2.6 Phương pháp chuẩn bị giống
Bacillus từ eppendorf giữ giống được cấy ria trên đĩa môi trường LB agar ủ ở 37°C trong 24
giờ. Sau thời gian ủ, dùng que cấy tròn lấy trọn một khuẩn lạc cho vào bình chứa 5 ml mơi
trường LB broth ni lắc ở 150 vịng/phút, 37°C, qua đêm. Tiếp theo dùng micropipette hút
10% giống cho vào bình 20 ml mơi trường LB broth tiếp tục ni cấy lắc 150 vịng/phút ở
37°C trong 12-15 giờ. Dịch ni cấy này được sử dụng làm giống cho thí nghiệm tiếp theo.
2.2.7 Phương pháp khảo sát nhiệt độ và thời gian ni cấy thích hợp cho khả năng sinh
bacterocin từ Bacillus
Tiến hành trên môi trường LB broth, dùng micropiptette hút 2 ml dịch vi khuẩn đã chuẩn bị
cho vào các bình chứa 20 ml mơi trường và được ni cấy lắc ở 150 vòng/phút ở các nhiệt độ
khác nhau: 25°C, 28°C, 33°C, 37°C, 45°C. Sau mỗi 3 giờ nuôi cấy, tiến hành thu dịch và xử
lí, đánh giá khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán giếng để lựa chọn ra
nhiệt độ và thời gian mà ở đó dịch ni cấy có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất. Giá trị nhiệt
độ và thời gian nuôi cấy này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo [9] [10].
2.2.8 Phương pháp khảo sát giá trị pH thích hợp cho khả năng sinh bacterocin từ
Bacillus
Tiến hành trên môi trường LB broth, dùng micropiptette hút 2 ml dịch nuôi cấy đã chuẩn bị
cho vào các bình chứa 20 ml mơi trường được điều chỉnh với các giá trị pH khác nhau: 4.0,
5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0. Các bình được ni cấy lắc ở 150 vòng/phút, nhiệt độ và thời gian đã
lựa chọn ở thí nghiệm trước. Sau thời gian ni cấy, tiến hành thu dịch và đánh giá khả
năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch để lựa chọn ra giá trị pH

thích hợp [9] [11].

23


2.2.9 Phương pháp khảo sát nguồn nitrogen thích hợp cho khả năng sinh bacterocin từ
Bacillus
Tiến hành trên môi trường MTCB (0.5 g MgSO4.7H2O, 3 g NaH2PO4.2H2O, 3 g
Na2HPO4.12H2O) có bổ sung 1% glucose, dùng micropiptette hút 2 ml dịch nuôi cấy đã chuẩn
bị cho vào các bình chứa 20 ml môi trường với 1% các nguồn nitrogen khác nhau (NH4Cl,
NH4NO3, NaNO3, peptone, yeast extract, urea). Các bình được ni cấy lắc ở 150 vòng/phút
với giá trị pH là 7.0, nhiệt độ, thời gian đã được lựa chọn từ các thí nghiệm trước. Sau thời
gian nuôi cấy, tiến hành thu dịch và đánh giá khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp
khuếch tán giếng thạch để lựa chọn ra nguồn nitrogen thích [9] [11] [12].
2.2.10 Phương pháp khảo sát nồng độ NaCl thích hợp cho khả năng sinh bacterocin từ
Bacillus
Tiến hành trên môi trường LB broth hoặc MTCB (0.5 g MgSO4.7H2O, 3 g NaH2PO4.2H2O,
3 g Na2HPO4.12H2O). Dùng micropiptette hút 2 ml dịch ni cấy đã chuẩn bị cho vào các
bình chứa 20 ml mơi trường có bổ sung các nồng độ NaCl khác nhau (0%, 0.5%, 1.0%, 1.5%,
2.0%). Các bình được ni cấy lắc ở 150 vịng/phút với giá trị pH, nhiệt độ, thời gian đã được
lựa chọn từ các thí nghiệm trước. Sau thời gian ni cấy, tiến hành thu dịch và đánh giá khả
năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch để lựa chọn ra nồng độ
thích hợp [13].
2.2.11 Phương pháp khảo sát nhiệt độ và thời gian bảo quản dịch bacteriocin thô từ các
chủng Bacillus
Dịch bacteriocin thô sau khi được thu nhận sẽ được bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau (-60°C,
-20°C, 5°C, nhiệt độ phịng). Hoạt tính được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán giếng
thạch sau mỗi 10 ngày [14].
2.2.12 Phương pháp xử lí số liệu
Các thí nghiệm trong nghiên cứu được lặp lại 3 lần. Số liệu được tính toán, vẽ biểu đồ trên

Excel và được xử lý thống kê bằng phương pháp phân tích ANOVA với phần mềm
Statgraphics centurition XVIII, mức độ tin cậy 95%.

24