Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy, quang kỳ và ánh sáng đèn LED đến sự tăng trưởng, tạo cây hoàn chỉnh loài lan kim tuyến anoectochilus setaceus blume IN VITRO

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY,
ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY, QUANG KỲ VÀ ÁNH SÁNG ĐÈN LED
ĐẾN SỰ TĂNG TRƯỞNG, TẠO CÂY HOÀN CHỈNH LOÀI LAN
KIM TUYẾN (Anoectochilus setaceus Blume.) IN VITRO

Ngành

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS. Trịnh Thị Lan Anh
Sinh viên thực hiện
MSSV : 1611100391

: Nguyễn Thanh Thuận
Lớp : 16DSHA1

TP. Hồ Chí Minh, 2020


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY,
ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY, QUANG KỲ VÀ ÁNH SÁNG ĐÈN LED
ĐẾN SỰ TĂNG TRƯỞNG, TẠO CÂY HOÀN CHỈNH LOÀI LAN
KIM TUYẾN (Anoectochilus setaceus Blume.) IN VITRO

Ngành

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS. Trịnh Thị Lan Anh
Sinh viên thực hiện
MSSV : 1611100391

: Nguyễn Thanh Thuận
Lớp : 16DSHA1

TP. Hồ Chí Minh, 2020


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiệp là cơng trình nghiên cứu
thực sự của tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Trịnh Thị Lan Anh – giảng viên trường
Đại học Công Nghệ TP. HCM. Đồ án được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý
thuyết, tiến hành nghiên cứu thực nghiệm tại phịng thí nghiệm Công nghệ Sinh
học Thực vật - Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH, trường Đại học Công Nghệ
TP. HCM. Các số liệu, bảng, biểu đồ sử dụng phân tích trong đồ án là hồn tồn
trung thực.
Đồ án khơng sao chép dưới bất kì hình thức nào, nếu phát hiện có bất kỳ gian lận
nào tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm.
TP. Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 09 năm 2020
Sinh viên thực hiện

NGUYỄN THANH THUẬN

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

LỜI CẢM ƠN
Em xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ TP. HCM đã tạo
điều kiện cho em được học tập và thực hiện đồ án nghiên cứu của mình tại Viện
Khoa Học Ứng Dụng HUTECH ngành Cơng Nghệ Sinh Học.
Để hồn thành đồ án tốt nghiệp này em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu
sắc đến TS. Trịnh Thị Lan Anh. Cơ đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ dạy và đóng góp ý
tưởng trong q trình em thực hiện đồ án này. Cơ khơng chỉ giảng dạy kiến thức,
mà cịn truyền cảm hứng. khích lệ, động viên em cũng như khơi dậy đam mê được
làm nghiên cứu khoa học. Qua đó tạo động lực cho em theo đuổi đến cùng và
không ngừng học hỏi, tìm hiểu thêm kiến thức mới bổ ích. Em thực sự biết ơn Cô
đã giúp đỡ và ln hỗ trợ em vượt qua khó khăn trong q trình thực hiện đồ án
để có được kết quả thành công như hôm nay.
Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cơ, các Anh Chị nhân viên phịng thí
nghiệm Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH, trường Đại học Công nghệ TP.
HCM đã tạo điều kiện và hỗ trợ cho em trong suốt q trình hồn thành đồ án này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến gia đình,
người thân và bạn bè đã cổ vũ, động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập
và thực hiện đồ án. Đặc biệt bạn Huỳnh Thị Thanh Tuyền lớp 16DSHA1 đã đồng
hành cùng em suốt khoảng thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!
TP. Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 09 năm 2020
Sinh viên thực hiện

NGUYỄN THANH THUẬN


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................... i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................ v
DANH MỤC BẢNG ................................................................................. vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH ..................................................................... viii
MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề ............................................................................................... 1
2. Mục tiêu của đề tài .................................................................................. 3
3. Nhiệm vụ nghiên cứu .............................................................................. 3
4. Phương pháp nghiên cứu......................................................................... 4
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài ................................... 5
5.1. Ý nghĩa khoa học .............................................................................. 5
5.2. Ý nghĩa thực tiễn .............................................................................. 5
6. Kết cấu của đồ án .................................................................................... 5
CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................... 6
1.2.2. Ảnh hưởng của các thành phần hóa học .............................................. 6
1.3.3. Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý ........................................................ 11
1.5.2. Giá thể .................................................................................................. 12
1.5.3. Đơn vị sử dụng đối với các dung dịch nano ........................................ 16
1.5.3.1. Giới thiệu về hạt nano bạc ................................................................ 17
1.5.3.2. Sơ lược về hạt nano chitosan ............................................................ 22
1.5.3.3. Sơ lược về nano đồng........................................................................ 23

1.6. Ảnh hưởng của ánh sáng đến thực vật ............................................ 27
1.6.3. Vai trò của ánh sáng trong nhân giống in vitro .................................... 28
1.7.1. Ảnh hưởng của ánh sáng LED (Light Emitting Diode) trong nuôi
cấy in vitro ............................................................................................ 29

1.8. Phương pháp nuôi cấy lỏng lắc in vitro .......................................... 40

1.9.1. Phân loại thực vật lan Kim tuyến ......................................................... 43
1.9.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................... 43
1.9.4. Điều kiện sinh sống của lan Kim tuyến ............................................... 45
1.9.5. Giá trị dược liệu của lan Kim tuyến ..................................................... 46
1.9.6. Thành phần hoạt chất có trong lan Kim tuyến ..................................... 48

i


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
1.9.7. Giá trị kinh tế của lan Kim tuyến trên thị trường ................................. 48

1.11. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước loài lan Kim tuyến .... 49
1.11.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................................... 49
1.11.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ..................................................... 50

CHƯƠNG 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 55
2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài ............................................ 55
2.1.1. Địa điểm ............................................................................................... 55
2.1.2. Thời gian .............................................................................................. 55

2.2. Vật liệu và phương pháp ................................................................. 55
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 55
2.2.3. Môi trường nuôi cấy............................................................................. 56
2.2.4. Trang thiết bị và dụng cụ ..................................................................... 56
2.2.5. Điều kiện nuôi cấy ............................................................................... 58
2.2.6. Mẫu cấy ................................................................................................ 58
2.2.7. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 58

2.3. Bố trí thí nghiệm ............................................................................. 59

2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của CMC (carboxymethyl
cellulose) đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh lan Kim tuyến
(Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro trên mơi trường 2 lớp .......... 59
2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của alginate đến sự tăng trưởng
và tạo cây hoàn chỉnh lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus
Blume.) in vitro trên mơi trường 2 lớp ................................................. 60
2.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các kiểu kết hợp thành phần
giá thể nuôi cấy đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh loài lan
Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro ........................... 61
2.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của thể tích mơi trường đến sự
tăng trưởng lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro
khi nuôi cấy lỏng lắc ............................................................................. 62
2.3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc mẫu đến sự tăng
trưởng lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro khi
nuôi cấy lỏng lắc ................................................................................... 63

ii


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
2.3.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy đến sự tăng
trưởng lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro khi
nuôi cấy lỏng lắc ................................................................................... 64
2.3.7. Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của quang kỳ đến sự tăng trưởng
và tạo cây hoàn chỉnh lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus
Blume.) in vitro trên môi trường agar + bơng gịn xé vụn .................... 65
2.3.8. Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED đến sự
tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh lan Kim tuyến (Anoectochilus
setaceus Blume.) in vitro trên môi trường agar + bơng gịn xé vụn ..... 67

2.4. Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................. 72
2.5. Thống kê và xử lý số liệu ............................................................... 72
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................... 73
3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của CMC (carboxymethyl cellulose)
đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh lan Kim tuyến
(Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro trên môi trường 2 lớp
.................................................................................................... 73
3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của alginate đến sự tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus
Blume.) in vitro trên môi trường 2 lớp ........................................ 79
3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của các kiểu kết hợp giá thể đến sự
tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh lan Kim tuyến
(Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro .................................... 84
3.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của thể tích mơi trường đến sự tăng
trưởng loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in
vitro khi ni cấy lỏng lắc........................................................... 91
3.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của tốc độ lắc mẫu đến sự tăng trưởng
của lồi lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in
vitro khi ni cấy lỏng lắc........................................................... 95
3.6. Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy đến sự tăng trưởng
loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro
khi nuôi cấy lỏng lắc ................................................................. 100
iii


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
3.7. Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của quang kỳ đến sự tăng trưởng và
tạo cây hoàn chỉnh lồi lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus
Blume.) in vitro trên mơi trường agar + bơng gịn xé vụn ........ 107
3.8. Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED đơn sắc đến sự

tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh loài lan Kim tuyến
(Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro trên môi trường agar
+ bơng gịn xé vụn ..................................................................... 114
3.9. Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED kết hợp đến sự
tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh loài lan Kim tuyến
(Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro trên môi trường agar
+ bông gòn xé vụn ..................................................................... 121
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................... 128
4.1. Kết luận ........................................................................................ 128
4.2. Kiến nghị ...................................................................................... 128
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................... 129
PHỤ LỤC ................................................................................................... 1

iv


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ASA

Acetylsalicylic acid (Aspirin)

AC

Than hoạt tính

BA

Benzyladenine

BAP

6-Benzyl amino purine

B

LED xanh dương

CMC

carboxymethyl cellulose

DNA

Deoxyribonucleic acid

FL

Đèn huynh quang

GA3

Gibberellic acid

KIN

Kinetin

LED

Light emitting diode

MS

Murashige và Skoog, 1962

ND

Nước dừa

NAA

α-naphthaleneacetic acid

NĐ – CP

Nghị định của chính phủ

PE

Polyethylene

RNA

Ribonucleic acid

R

LED đỏ

SH

Schenk và Hildebrandt,1972

UV

Ultraviolet

W

LED trắng

αNAA

α-naphthylacetic acid

v


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Số nguyên tử bạc trong một hạt ag-np ...................................... 18
Bảng 1.2. Ảnh hưởng của các bước sóng ánh sáng khác nhau lên thực vật
.......................................................................................................... 27
Bảng 1.3. Phân loại thực vật lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus
Blume.) ............................................................................................. 43
Bảng 2.1. Khảo sát Ảnh hưởng của cmc (carboxymethyl cellulose) đến sự

tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh lan kim tuyến (Anoectochilus
setaceus Blume.) in vitro trên môi trường 2 lớp ............................... 60
Bảng 2.2. Khảo sát Ảnh hưởng của alginate đến sự tăng trưởng và tạo cây
hoàn chỉnh lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro
trên môi trường 2 lớp ........................................................................ 61
Bảng 2.3. Khảo sát Ảnh hưởng của các kiểu kết hợp thành phần giá thể
nuôi cấy đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh loài lan kim tuyến
(Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro .......................................... 62
Bảng 2.4. Khảo sát Ảnh hưởng của thể tích mơi trường đến sự tăng trưởng
lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro khi nuôi cấy
lỏng lắc ............................................................................................. 63
Bảng 2.5. Khảo sát Ảnh hưởng của tốc độ lắc mẫu đến sự tăng trưởng lan
kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro khi nuôi cấy lỏng
lắc ..................................................................................................... 64
Bảng 2.6. Khảo sát Ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy đến sự tăng trưởng lan
kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro khi nuôi cấy lỏng
lắc ..................................................................................................... 65
Bảng 2.7. Khảo sát Ảnh hưởng của quang kì đến sự tăng trưởng và tạo cây
hoàn chỉnh lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro
trên mơi trường agar + bơng gịn xé vụn ........................................... 66
Bảng 2.8. Khảo sát Ảnh hưởng của ánh sáng đèn led đơn sắc đến sự tăng
trưởng và tạo cây hoàn chỉnh loài lan kim tuyến (Anoectochilus
setaceus Blume.) in vitro trên mơi trường agar + bơng gịn xé vụn ... 68

vi


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Bảng 2.9. Khảo sát Ảnh hưởng của ánh sáng đèn led kết hợp đến sự tăng
trưởng và tạo cây hoàn chỉnh loài lan kim tuyến (Anoectochilus

setaceus Blume.) in vitro trên mơi trường agar + bơng gịn xé vụn ... 68
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của cmc (carboxymethyl cellulose) đến sự tăng
trưởng và tạo cây hoàn chỉnh lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus
Blume.) in vitro trên môi trường 2 lớp sau 12 tuần nuôi cấy ............. 74
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của alginate đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn
chỉnh lồi lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro trên
mơi trường 2 lớp sau 12 tuần nuôi cấy .............................................. 80
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các kiểu kết hợp giá thể đến sự tăng trưởng và
tạo cây hoàn chỉnh lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in
vitro sau 16 tuần nuôi cấy ................................................................. 86
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc mẫu đến sự tăng trưởng của loài lan
kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro khi nuôi cấy lỏng
lắc sau 8 tuần nuôi cấy ...................................................................... 96
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy đến sự tăng trưởng loài lan kim
tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro khi nuôi cấy lỏng lắc
sau 6 tuần nuôi cấy ......................................................................... 102
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của quang kỳ đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn
chỉnh loài lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro trên
môi trường agar + bơng gịn xé vụn sau 10 tuần ni cấy ............... 108
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của ánh sáng đèn led đơn sắc đến sự tăng trưởng và
tạo cây hoàn chỉnh loài lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus
Blume.) in vitro trên mơi trường agar + bơng gịn xé vụn sau sau 8
tuần nuôi cấy .................................................................................. 115
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của ánh sáng đèn led kết hợp đến sự tăng trưởng và
tạo cây hoàn chỉnh loài lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus
Blume.) in vitro trên mơi trường agar + bơng gịn xé vụn sau 10 tuần
nuôi cấy .......................................................................................... 122

vii

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Cấu tạo phân tử alginate (Nguồn: Internet) ............................... 15
Hình 1.2. Cấu tạo phân tử Carboxymethyl cellulose (Nguồn: Internet) .... 16
Hình 1.3. Salicylic Acid (SA) (Nguồn: Internet) ...................................... 25
Hình 1.4. Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) (Nguồn:
Internet)

Mộc sơn thạch tùng, thuộc họ Orchidaceae, gồm bốn

chi: Ludisia, Anoectochilus, Goodyera, Macodes và trên 50 loài (Paul,
2005). Lan Anoectochilus có tên thường gọi là lan lá Gấm, chúng
được biết đến bởi giá trị làm cảnh do hoa và lá đẹp và cịn có giá trị
làm thuốc, là loại thảo dược có giá trị và tiềm năng lớn. .................. 42
Hình 1.5. Hoa lan Kim tuyến (Nguồn: Internet) ....................................... 45
Hình 2.1. Mẫu chồi lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in
vitro được sử dụng làm nguồn mẫu ................................................... 55
Hình 2.2. Mơ hình thiết kế hệ thống chiếu sáng đèn LED đơn sắc ........... 69
Hình 2.3. Hệ thống chiếu sáng đèn LED đơn sắc theo thiết kế và thi công
để nuôi cấy lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro 69
Hình 2.4. Mơ hình hệ thống chiếu sáng LED kết hợp .............................. 70
Hình 2.5. Hệ thống chiếu sáng đèn LED kết hợp theo thiết kế và thi công
để nuôi cấy lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro 71
Hình 3.1. Ảnh hưởng của CMC (carboxymethyl cellulose) đến sự tăng
trưởng và tạo cây hoàn chỉnh loài lan Kim tuyến (Anoectochilus
setaceus Blume.) in vitro trên môi trường 2 lớp sau 12 tuần ni cấy
.......................................................................................................... 75
Hình 3.2. Ảnh hưởng của CMC (carboxymethyl cellulose) đến sự tăng

trưởng và tạo cây hoàn chỉnh loài lan Kim tuyến (Anoectochilus
setaceus Blume.) in vitro trên môi trường 2 lớp sau 12 tuần ni cấy
(tt) ..................................................................................................... 76
Hình 3.3. Ảnh hưởng của alginate đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn
chỉnh loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro
trên môi trường 2 lớp sau 12 tuần nuôi cấy ....................................... 81

viii


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Hình 3.4. Ảnh hưởng của alginate đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn
chỉnh loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro
trên môi trường 2 lớp sau 8 tuần ni cấy ......................................... 82
Hình 3.5. Ảnh hưởng của các kiểu kết hợp giá thể đến sự tăng trưởng và
tạo cây hoàn chỉnh lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in
vitro sau 16 tuần nuôi cấy (C0, C1, C2, C3, C4, C5 tương ứng với các
nghiệm thức lần lượt là: Agar + lỏng; alginate + bơng gịn xé vụn;
agar + bơng gịn xé vụn; CMC + bơng gịn xé vụn; agar + alginate;
agar + CMC) ..................................................................................... 87
Hình 3.6. Ảnh hưởng của các kiểu kết hợp giá thể đến sự tăng trưởng và
tạo cây hoàn chỉnh lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in
vitro sau 16 tuần nuôi cấy (tt) ........................................................... 88
Hình 3.7. Ảnh hưởng của thể tích mơi trường đến sự tăng trưởng loài lan
Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro khi nuôi cấy lỏng
lắc sau 4 tuần nuôi cấy ...................................................................... 92
Hình 3.8. Ảnh hưởng của thể tích mơi trường đến sự tăng trưởng loài lan
Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro khi nuôi cấy lỏng
lắc sau 4 tuần nuôi cấy ...................................................................... 93
Hình 3.9. Ảnh hưởng của tốc độ lắc mẫu đến sự tăng trưởng của loài lan

Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro khi nuôi cấy lỏng
lắc sau 8 tuần ni cấy ...................................................................... 97
Hình 3.10. Ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy đến sự tăng trưởng của loài lan
Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro khi nuôi cấy lỏng
lắc sau 6 tuần ni cấy (tt) .............................................................. 104
Hình 3.11. Ảnh hưởng của quang kỳ đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn
chỉnh của loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro
trên mơi trường agar + bơng gịn xé vụnsau 10 tuần ni cấy ......... 109
Hình 3.12. Ảnh hưởng của quang kỳ đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn
chỉnh của loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro
trên mơi trường agar + bơng gịn xé vụn sau 10 tuần nuôi cấy (tt) .. 110

ix


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Hình 3.13. Ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED đơn sắc đến sự tăng trưởng
và tạo cây hoàn chỉnh của loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus
Blume.) in vitro trên mơi trường agar + bơng gịn xé vụn sau sau 8
tuần ni cấy .................................................................................. 116
Hình 3.14. Ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED đơn sắc đến sự tăng trưởng
và tạo cây hoàn chỉnh của loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus
Blume.) in vitro trên môi trường agar + bông gịn xé vụn sau sau 8
tuần ni cấy (tt) ............................................................................. 117
Hình 3.15. Ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED kết hợp đến sự tăng trưởng
và tạo cây hoàn chỉnh của lồi lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus
Blume.) in vitro trên mơi trường agar + bơng gịn xé vụn sau 8 tuần
ni cấy .......................................................................................... 123
Hình 3.16. Ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED kết hợp đến sự tăng trưởng
và tạo cây hoàn chỉnh của loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus

Blume.) in vitro trên mơi trường agar + bơng gịn xé vụn sau 8 tuần
nuôi cấy (tt) .................................................................................... 124

x


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
TÓM TẮT
Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) là một trong những dược
thảo quý giá, giúp dưỡng âm, bổ máu, chữa trị nóng gan, lao phổi, phong thấp,
đau nhức khớp xương, địn ngã, viêm dạ dày mãn tính (Võ Văn Chi, 2012). Bên
cạnh đó, nó cịn được sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền của cộng đồng các
dân tộc thiểu số ở Việt Nam. Lan Kim tuyến phân bố hầu hết các tỉnh từ Bắc tới
Nam nhưng số lượng cá thể ngồi tự nhiên khơng nhiều do khả năng tái sinh
chậm, đòi hỏi điều kiện sống ngặt nghèo. Khơng những vậy, nó cịn đang bị
khai thác q mức do có nhiều dược tính q. Để khắc phục tình trạng đó, khơng
những Việt Nam mà trên tồn thế giới đã và đang có rất nhiều nghiên cứu được
thực hiện để nhân giống loài lan này. Phương pháp chủ yếu được thực hiện
nhiều nhất là nhân giống in vitro. Tuy nhiên, các nghiên cứu chủ yếu tập trung
vào nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trên điều
kiện nuôi cấy là agar. Các công trình nghiên cứu vẫn tiếp tục được thực hiện
nhằm nhân nhanh lồi lan này. Do vậy, để có thêm cơ sở khoa học cho việc bảo
tồn và phát triển loài lan này, người thực hiện đồ án tiến hành nghiên cứu sự
ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, điều kiện ni cấy, quang kì và ánh sáng
đèn LED ảnh hưởng đến khả năng tăng trưởng, phát triển cây hoàn chỉnh lồi
lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro trên mơi trường 2 lớp,
theo 6 hướng sau:
1. Nghiên cứu ảnh hưởng của CMC (carboxymethyl cellulose) đến sự
tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus
Blume.) in vitro trên môi trường 2 lớp. Kết quả cho thấy khi bổ sung CMC vào

mơi trường ni cấy thì nồng độ tốt nhất cho sự sinh trưởng của lan Kim tuyến
(Anoectochilus setaceus Blume.) là 20 g/l.
2. Nghiên cứu ảnh hưởng của alginate đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn
chỉnh loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro trên môi
trường 2 lớp. Kết quả cho thấy khi bổ sung alginate vào mơi trường ni cấy thì
nồng độ tốt nhất cho sự sinh trưởng của lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus
Blume.) là 20 g/l.

xi


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
3. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp các loại giá thể đến sự tăng trưởng
và tạo cây hoàn chỉnh loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in
vitro. Kết quả cho thấy ở sự kết hợp agar + bơng gịn xé vụn tạo ra mơi trường
ni cấy tốt nhất cho sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của lan Kim tuyến.
4. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lỏng lắc đến sự tăng
trưởng của loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro. Kết
quả cho thấy khi nuôi cấy lỏng lắc, điều kiện ni cấy tốt nhất kích thích sự tăng
trưởng chồi và rễ cho cây lan Kim tuyến là: 10 (ml) thể tích mơi trường ni
cấy, tốc độ lắc mẫu 100 (vịng/phút), 5 mẫu cấy trên bình và ni cấy trong thời
gian 8 tuần.
5. Nghiên cứu ảnh hưởng của quang kỳ đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn
chỉnh loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro trên môi
trường agar + bơng gịn xé vụn. Kết quả cho thấy ở nhóm chu kỳ sáng tối luân
phiên liên tục là tốt nhất cho sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của lan Kim
tuyến.
6. Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED đến sự tăng trưởng và tạo
cây hoàn chỉnh của lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro trên
môi trường agar + bơng gịn xé vụn. Kết quả cho thấy, 100% ánh sáng LED đỏ

ở thí nghiệm ánh sáng đèn LED đơn sắc và tỷ lệ kết hợp 80% LED đỏ + 20%
LED xanh dương ở thí nghiệm ánh sáng đèn LED kết hợp là tốt nhất cho sự tăng
trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của lan Kim tuyến.

xii


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Thế kỉ XXI được coi là thế kỉ của sự phát triển công nghệ sinh học trong đó
dược liệu là tài nguyên di truyền – tài nguyên tái tạo. Nắm được và phát huy được
tài nguyên di truyền là nắm kinh tế, nắm tương lai. Dùng thế mạnh dược liệu đẩy
mạnh công nghiệp dược trở thành kinh tế kĩ thuật mũi nhọn, làm cho nhân dân ta
có đủ thuốc tốt, khỏe mạnh và giàu có, đất nước ta kinh tế - xã hội phát triển, tạo
nên hình ảnh Việt Nam – một cường quốc về dược liệu đó là ý nguyện của dân tộc.
Từ lâu, người phương Đông đã tôn hoa lan là “vương giả chi hoa” và người phương
Tây cũng tôn hoa lan là “nữ hoàng của các loài hoa”. Hoa lan thật sự đã chinh phục
được người phương Đông và người phương Tây khơng chỉ bởi cấu trúc kì diệu và
sự đa dạng về màu sắc, hình dáng và hương thơm quyến rũ mà cịn bởi giá trị làm
thuốc của nó.
Họ lan (Orchidaceae) là một trong những họ thực vật đa dạng nhất của Việt
Nam, với tổng số 865 loài thuộc 154 chi. Thơng thường lan được dùng làm cảnh.
Ngồi ra, có nhiều lồi lan cịn được sử dụng làm thuốc (Nguyễn Tiến Bân, 2005).
Chi lan Kim tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện nay đã thống kê được hơn
12 loài, trong đó có lồi lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume. hay
Anoectochilus roxburghii Wall. ex Lindl) được biết đến nhiều hơn không những
bởi giá trị làm cảnh, mà còn bởi giá trị khoa học của nó, là lồi có giá trị thương
mại rất cao (Phùng Văn Phê và cộng sự, 2010). Trong tài liệu y học thế giới, lan

Kim tuyến là loài cây thuốc đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khỏe, phịng bệnh,
có tính kháng khuẩn, làm khí huyết lưu thơng, chửa các bệnh viêm khí quản, lao
phổi, khơ phổi, ho ra máu, suy nhược thần kinh, chống tăng huyết áp, đau nhức
xương khớp,…(Li et al., 2006; Shimura et al., 2007; Wang et al., 2006). Hơn nữa,
mới đây người ta ra khả năng phòng và chống ung thư của loại thảo dược này.
Tháng 7/2015, bằng sáng chế số: US 9072770 B2 của Mỹ đã công bố khẳng định
các hoạt chất trong cây lan Kim tuyến cịn có tác dụng bảo vệ tế bào gan.
Như vậy, lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) là loại thảo dược
có giá trị và có tiềm năng rất lớn.

1


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Tại Việt Nam, có nhiều lồi lan rất quý, được nước ngoài biết đến và đặt mua
với số lượng lớn nhưng thực tế nhu cầu người tiêu dùng quá cao trong khi lan Kim
tuyến chủ yếu được thu hái trong tự nhiên nên không đáp ứng được nhu cầu của
khách hàng, đồng thời sản lượng cây trong tự nhiên rất ít nên lồi lan Kim tuyến
đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tiệt chủng ngồi tự nhiên nếu chúng
ta khơng có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện tại, lan Kim tuyến đã có tên trong
sách đỏ Việt Nam trong danh mục thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp, quý
hiếm (nhóm IA), nghiêm cấm khai thác sử dụng vì mục đích thương mại và nhóm
thực vật rừng đang nguy cấp EN A1a,c,d, trong sách đỏ Việt Nam 2007 của Nghị
định số 32/2006/NĐ-CP ngày 30/03/2006 của Chính phủ nhằm nghiêm cấm khai
thác, sử dụng vì mục đích thương mại (Sách Đỏ Việt Nam, 2007).
Vì thế, chúng ta cần có biện pháp bảo tồn loài dược liệu quý này. Hiện nay,
Nhà nước ta cũng đang có những cơng trình nghiên cứu để nhân giống loài dược
liệu quý hiếm này. Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2015), nghiên cứu ảnh hưởng của
một số yếu tố lên quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lan Gấm
(Anoectochilus setaceus Blume.) nuôi cấy in vitro. Nguyễn Quang Thạch (2012),

nghiên cứu kỹ thuật nhân giống loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus
Blume.), Phùng Văn Phê và cộng sự (2010), nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi
in vitro loài lan Kim tuyến (Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.),… Tuy đã có
nhiều nghiên cứu nhưng các nghiên cứu vẫn tiếp tục được thực hiện nhằm tìm ra
phương pháp tối ưu nhất.
Xuất phát từ những vấn đề trên, được sự cho phép của Bộ môn Công nghệ
Sinh học – Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH, trường Đại học Công nghệ TP.
HCM, người thực hiện đồ án tiến hành đề tài: “nghiên cứu ảnh hưởng của môi
trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy, quang kỳ và ánh sáng đèn LED đến sự tăng
trưởng và tạo cây hoàn chỉnh loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.)
in vitro”, nhằm tìm ra mơi trường ni cấy cũng như điều kiện nuôi cấy tối ưu
nhất, xác định chu kỳ sáng tối, loại ánh sáng thích hợp nhất đến sự tăng trưởng và
tạo cây hồn chỉnh lan Kim tuyến. Góp phần tạo nguồn vật liệu và phát triển cây
dược liệu quý hiếm, cũng như bảo tồn nguồn gen quý hiếm đang có nguy cơ bị
tuyệt chủng của nước nhà, cung cấp nguồn giống lan Kim tuyến tốt hơn cho thị
2


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
trường trong nước và ngoài nước. Cung cấp cơ sở dữ liệu cho việc phát triển và
nghiên cứu sau này.

2. Mục tiêu của đề tài
- Nghiên cứu ảnh hưởng của CMC (carboxymethyl cellulose) và alginate đến
sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus
Blume.) in vitro trên môi trường 2 lớp nhằm tìm ra nồng độ CMC và alginate thích
hợp cho sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của loài lan này.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các kiểu kết hợp thành phần giá thể đến sự tăng
trưởng và tạo cây hồn chỉnh lan Kim tuyến (Anoectochilussetaceus Blume.) in
vitro trên mơi trường agar + bơng gịn xé vụn nhằm thiết lập mơi trường ni cấy

thích hợp nhất cho sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh loài lan Kim tuyến
(Anoectochilus setaceus Blume.).
- Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lỏng lắc in vitro nhằm tìm ra
và thiết lập điều kiện ni cấy thích hợp nhất, kích thích sự tăng trưởng chồi, rễ
của loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.).
- Nghiên cứu ảnh hưởng của quang kỳ và ánh sáng đèn LED đến sự tăng
trưởng và tạo cây hoàn chỉnh lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in
vitro trên môi trường agar + bơng gịn xé vụn, nhằm thiết lập thí nghiệm quang kỳ
và hệ thống chiếu sáng LED để tìm ra chu kỳ sáng tối, các nguồn chiếu sáng thích
hợp nhất cho sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của lan Kim tuyến.
Từ đó có thể rút ngắn thời gian nuôi cấy, tăng nhanh số lượng và chất lượng
cây giống, giúp hạ giá thành sản phẩm góp phần bảo tồn và cung cấp nguồn gene
lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) quý giá. Cung cấp cây giống chất
lượng cao với số lượng lớn không giới hạn cho các nhà vườn ươm, doanh nghiệp
trồng làm nguyên dược liệu, từ đó có thể cải thiện đời sống nhân dân.

3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Khảo sát ảnh hưởng của CMC (carboxymethyl cellulose) đến sự tăng trưởng
và tạo cây hoàn chỉnh lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro trên
môi trường 2 lớp.
- Khảo sát ảnh hưởng của alginate đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh
lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro trên môi trường 2 lớp.
3


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
- Khảo sát ảnh hưởng của các kiểu kết hợp thành phần giá thể đến sự tăng
trưởng và tạo cây hoàn chỉnh lan Kim tuyến (Anoectochilussetaceus Blume.) in
vitro.
- Khảo sát ảnh hưởng của thể tích mơi trường nuôi cấy đến sự tăng trưởng

của lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro khi nuôi cấy lỏng lắc.
- Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc mẫu đến sự tăng trưởng lan Kim tuyến
(Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro khi nuôi cấy lỏng lắc.
- Khảo sát ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy đến sự tăng trưởng lan Kim tuyến
(Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro khi nuôi cấy lỏng lắc.
- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lắc mẫu đến sự tăng trưởng lan Kim tuyến
(Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro khi nuôi cấy lỏng lắc.
- Khảo sát ảnh hưởng của quang kỳ đến sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh
của lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro trên môi trường agar
+ bơng gịn xé vụn.
- Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED đến sự tăng trưởng và tạo cây
hoàn chỉnh của lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.) in vitro trên mơi
trường agar + bơng gịn xé vụn.

4. Phương pháp nghiên cứu
- Nghiên cứu lý thuyết: đọc, thu thập thơng tin, phân tích, tổng hợp, chọn lọc
tài liệu là sách chun ngành, tạp chí chun ngành, các cơng trình nghiên cứu,
các bài thi eureka, các bài báo cáo của Viện, trường đại học, các nguồn internet tin
cậy, các bài báo khoa học trong và ngoài nước…
- Nghiên cứu thực nghiệm: tiến hành bố trí các thí nghiệm để khảo sát ảnh
hưởng của một số yếu tố môi trường, điều kiện nuôi cấy, môi trường nuôi cấy,
quang kỳ, ánh sáng LED,… Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên. Các nghiệm
thức được lặp lại 3 lần, ghi nhận kết quả trung bình. Các số liệu sau khi thu nhập
được sử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.4 và chương trình MicroSoft excel
2016 ®.

4


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
5.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài cung cấp những dẫn liệu khoa học về loài lan (Anoectochilus setaceus
Blume.), chi lan Kim tuyến, cung cấp những cơ sở khoa học về môi trường nhân
giống in vitro mới cho loài lan Kim tuyến này.
Nghiên cứu ảnh hưởng của CMC, alginate nuôi cấy trên môi trường 2 lớp,
ảnh hưởng của thể tích mơi trường, tốc độ lắc mẫu, mật độ mẫu cấy và thời gian
lắc mẫu khi nuôi cấy lỏng lắc, quang kỳ và ánh sáng LED trên môi trường tối ưu
nhất đến sự tăng trưởng, tạo cây hồn chỉnh lồi lan Kim tuyến (Anoectochilus
setaceus Blume.). Từ đó, cung cấp cơ sở khoa học để đánh giá khả năng tạo chồi,
rễ, tạo cây hoàn chỉnh của loài lan Kim tuyến dưới tác động của các thí nghiệm
trên.
Các kết quả nghiên cứu sẽ bổ sung thêm vào tài liệu khoa học, phục vụ cho
công tác giảng dạy, nghiên cứu khoa học về loài lan Kim tuyến (Anoectochilus
setaceus Blume.).
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đề xuất được môi trường nuôi cấy mới, điều kiện nuôi cấy lỏng lắc in vitro
mới tối ưu hơn cho lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume.)
Nghiên cứu quá trình nhân nhanh chồi, rễ cũng như sự tăng trưởng và tạo cây
hồn chỉnh, góp phần rất lớn trong cơng tác nhân nhanh giống lan Kim tuyến
(Anoectochilus setaceus Blume.). Từ đó, tạo ra một lượng lớn cây con có chất
lượng tốt hơn, làm giảm giá thành, góp phần bảo tồn, thúc đẩy sản xuất cây lan
Kim tuyến (Anoectochilus setaceu Blume.) như một nghề trồng lan mang lại giá
trị kinh tế cao.

6. Kết cấu của đồ án
Đồ án gồm 4 chương:
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị

5


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Ảnh hưởng của các thành phần hóa học
Trong ni cấy in vitro, cả yếu tố hóa học và yếu tố vật lý của cây trong
các bình ni đều phải được cung cấp đầy đủ. Môi trường dinh dưỡng phải cung
cấp tất cả các ion khoáng cần thiết, nguồn chất hữu cơ bổ sung như amino acid
và vitamin, nguồn cacbon cố định, và một thành phần cần cho sự sống cũng phải
được cung cấp đó là nước. Các nhân tố vật lý như nhiệt độ, pH, mơi trường khí,
ánh sáng và áp lực thẩm thấu, cũng phải được duy trì trong giới hạn chấp nhận.
Hiện nay trên thế giới có rất nhiều mơi trường được sử dụng như môi
trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Gamborg (1968), môi trường
Knop (1974), môi trường Anderson, Went, Knudson, Lindemann,… Trong đó
mơi trường MS được đánh giá là phù hợp rộng rãi nhất với nhiều loại cây trồng,
bao gồm cả cây hai lá mầm và cây một lá mầm. Thông thường trong một môi
trường nuôi cấy phải đảm bảo các thành phần hóa học sau:
1.2.2.1. Các nguyên tố khoáng
Tùy theo nồng độ sử dụng, các nguyên tố khống được chia vào hai nhóm
là ngun tố đa lượng và nguyên tố vi lượng.
Nguyên tố đa lượng: Các nguyên tố này thường chiếm 0,1 % khối lượng
khô của thực vật. Nitrogen, phosphoras, potassium, Magnesium, calcium và lưu
huỳnh là các muối vơ cơ. Chúng có mặt trong các hợp chất quan trọng (diệp lục,
protein, acid nucleic, acid amin,…), tham gia vào các quá trình như điều chỉnh
áp suất thẩm thấu tế bào, vận chuyển năng lượng trong hô hấp, quang hợp, thực

hiện vai trị tín hiệu tế bào,…
Ngun tố vi lượng: Được cung cấp với lượng rất thấp cho thực vật sinh
trưởng, phát triển và có nhiều vai trị khác nhau. Manganese, iod, đồng, cobalt,
bo, molypdenum, sắt và kẽm là các ngun tố vi lượng, ngồi ra nicken và nhơm
cũng được tìm thấy trong một số cơng thức. Ngun tố vi lượng thường có mặt
trong thành phần của một số coenzyme, vitamin; tham gia vào các phản ứng trao
đổi điện tử, sinh tổng hợp diệp lục,…

6


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
1.2.2.2. Nguồn carbon
Các mô và tế bào thực vật ni cấy nói chung, khơng thể tự quang hợp
hoặc quang hợp yếu do thiếu clorophin và các điều kiện khác,… Do đó phải bổ
sung thêm carbon. Saccharose thường được sử dụng làm nguồn carbon do đó
những đặc tính như rẻ, dễ kiếm, đồng hóa triệt để và tương đối ổn định. Ngoài
ra, các loại đường khác như glucose, maltose, galactose và sorbitol cũng có thể
được sử dụng và trong những trường hợp đặc biệt có thể cung cấp tốt hơn đường
saccharose. Đường vừa là nguồn carbon cung cấp cho mẫu ni cấy, đồng thời
cịn tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của mơi trường. Đường đóng góp
khoảng 50 – 70 % vào khả năng thẩm thấu của môi trường (Trigiano and Gray,
2000). Thông thường đường saccharose được sử dụng ở nồng độ 0,2 – 0,3 %,
nhưng nồng độ này có sự thay đổi ở từng đối tượng khác nhau và mục đích ni
cấy khác nhau, có khi xuống tới 0,2 % (tạo dịng), có khi tăng lên đến 12 % (gây
cảm ứng stress nước).
Sự hình thành rễ đòi hỏi một lượng đường được cung cấp từ quang hợp
hoặc ngoại sinh. Theo George (1993) hầu hết các loại thực vật khi ra rễ thích
hợp với lượng đường 20 – 30 g/l. Tuy nhiên, cũng có lồi u cầu nguồn
carbohydrate ngoại sinh cao hơn. Ví dụ theo Sharma (1993) cây Gentiana kurroo

chỉ có thể ra rễ tốt khi bổ sung 60 g/l saccharose trong mơi trường. Thí nghiệm
áp dụng phương pháp quang tự dưỡng cho thấy các cây in vitro đã phát triển tốt
trên mơi trường khơng có đường và vitamin, độ thống khí cao. Tỷ lệ nhiễm nấm
giảm đáng kể. Cây có diện tích lá lớn hơn và sự đóng mở của lá theo quy luật tự
nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi của môi trường. Trong khi đó cây ni
cấy theo điều kiện truyền thống (có đường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí
khổng ln luôn ở trạng thái mở trong nhiều giờ khi chuyển từ điều kiện in vitro
ra vườn ươm. Tỷ lệ sống 95 – 100 % sau một tháng ở vườn ươm đối với cây ni
cấy trên mơi trường khơng có đường, trái lại chỉ từ 70 – 80 % theo phương pháp
truyền thống (Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự, 2005).
Đường trong ni cấy mơ, các tế bào chưa có khả năng quang hợp để tổng
hợp nên các chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp
chất carbon nhất định để cung cấp năng lượng cho tế bào và mô. Đường là nguồn
7


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
cung cấp carbon chủ yếu và được sử dụng thường xuyên trong hầu hết môi trường
trong nuôi cấy mô, kể cả khi nuôi cấy chồi non hoặc tế bào. Khi hấp khử trùng,
đường bị phân hủy một phần, thuận lợi cho cây hấp thụ. Có nhiều loại đường khác
nhau được sử dụng trong nuôi cấy mô và sự ảnh hưởng của nó cũng khác nhau đến
mẫu cấy. Tùy thuộc vào đối tượng và mục đích nghiên cứu có thể lựa chọn loại
đường và nồng độ bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Người ta thường sử dụng 2
loại đường đó là saccarose và glucose (Trần Văn Minh, 1994)
1.2.2.3. Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là thành phần môi trường khắt khe trong
việc xác định con đường phát triển của tế bào thực vật. Các chất điều hòa sinh
trưởng được sử dụng thông thường là các hormome thực vật hoặc các chất tổng
hợp tương tự chúng, phổ biến là auxin và cytokinin, gibberellin, abscisic acid,
ethylene. Trong đó auxin và cytokinin là hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất.

Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân idol trong phân tử. Trong
nuôi cấy in vitro, auxin thúc đẩy sinh trưởng của mẫu do hoạt hóa sự phân chia
và giãn nở của tế bào, kích thích các q trình tổng hợp và trao đổi chất, tham
gia điều chỉnh sự phân hóa của rễ, chồi,… (Bhojwani và Razdan, 1983).
Các auxin được sử dụng với nồng độ thấp từ 10 -6 – 10-1 M tùy theo từng
chất, mục đích và đối tượng nghiên cứu. Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự
phân hóa rễ, hàm lượng cao kích thích hình thành mơ sẹo.
Auxin được chia thành hai nhóm có nguồn gốc khác nhau: trong các auxin
tự nhiên, quan trọng nhất là IAA. Nhưng IAA chỉ được dùng trong một số môi
trường nuôi cấy do có đặc tính khơng ổn định với nhiệt độ và ánh sáng. Vì vậy,
các amino acid kết hợp với IAA ổn định hơn được sử dụng phổ biến hơn làm
giảm bớt liên kết khi sử dụng IAA. Nhóm auxin tổng hợp tương tự IAA được sử
dụng rộng rãi hơn trong các môi trường nuôi cấy như: 2,4-D, IBA, NAA.
Cytokinin kích thích sự phân chia và ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của tế
bào, cảm ứng hình thành chồi phụ và loại bỏ ưu thế ngọn (Nguyễn Như Khanh,
2002). Trong ni cấy mơ thực vật cytokinin được dùng để kích thích sự phát
sinh chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào. Nồng độ
cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ (Narayaswamy, 1994).
8


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Trong các cytokinin tự nhiên có hai nhóm được sử dụng trong mơi trường ni
cấy, đó là zeatin và 2iP (2-isopentyl adenine). Nhưng chúng không được dùng
phổ biến vì rất đắt (đặc biệt là zeatin) và khơng ổn định. Các chất tổng hợp tương
tự như kinetin và BAP được sử dụng phổ biến hơn. Các chất hóa học khơng có
based purin và thay thế bằng phenylureas, cũng được sử dụng như cytokinin
trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật.
Trong cây có sự cân bằng nội hormone (Vũ Văn Vụ, 2007). Do vậy, khi sử
dụng các chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy cần đặc biệt lưu ý để sử dụng

nồng độ thích hợp đạt hiệu quả cao. Nhiều tác giả đã tổng kết, tỷ lệ
auxin/cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích hình thành rễ; nghiêng
về phía cytokinin sẽ thúc đẩy hình thành chồi; ở tỷ lệ trung gian sẽ hình thành
mơ sẹo.
1.2.2.4. Than hoạt tính
Than hoạt tính ban đầu được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cố gắng
mô phỏng điều kiện trồng trọt, sau đó nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều môi
trường nuôi cấy. Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng của than hoạt tính trong mơi
trường ni cấy mơ thực vật. Đó là sự hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol,
các sản phẩm trao đổi thứ cấp, ảnh hưởng tới pH, xúc tác bẻ gãy đường saccharose
trong khử trùng (Van Winkle et al., 1995). Ngoài ra than cũng hút các chất hữu cơ
như: Phytohormone, vitamin, sắt, kẽm,… (Nissen và Sutter, 1990).
Điều tra tác dụng của than hoạt tính, sự khử trùng, và mơi trường ni cấy
trong thủy phân đường cho thấy, sự thủy phân của đường trong môi trường nuôi
cấy phụ thuộc vào cả ion H+ và sự khử trùng và thành phần than hoạt tính. Sau khử
trùng, ở môi trường MS + 5 % saccharose bổ sung than hoạt tính cho tỷ lệ đường
thủy phân là 70 %, tỷ lệ tương ứng ở môi trường Gamborg là 56 %, cịn ở mơi
trường khơng có than hoạt tính là 20 % (Pan và Staden, 1999).
Bổ sung than hoạt tính vào mơi trường ni cấy sẽ có lợi ích và có tác dụng
khử độc, hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng hoặc làm đen môi
trường. Người ta cho rằng tác dụng cản sự tăng trưởng của mơ cấy khi có sự hiện
diện của than hoạt tính trong mơi trường là do nó hút chất điều hịa sinh trưởng có
trong mơi trường. NAA, kinetine, IAA, BAP, 2-Ip liên kết với than hoạt tính. Khả
9