Nghiên cứu phát triển bệnh viêm ruột hoạt tử ở lợn và gà do chủng vi khuẩn clostridium perfringens bằng kỹ thuật PCR (khóa luận công nghệ sinh học lâm nghiệp)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP
--------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
“NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH VIÊM RUỘT HOẠT TỬ Ở LỢN
VÀ GÀ DO CHỦNG VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
BẰNG KỸ THUẬT PCR”

NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ

: 7420201

Giáo viên hướng dẫn : TS. Hà Bích Hồng
Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Lê Nhật Trang

Mã sinh viên

: 1653070317

Lớp

: K61A – CNSH

Khóa học

: 2016 - 2020

Hà Nội -2020


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành bài khóa luận tốt nghiệp này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu
sắc tới giáo viên hướng dẫn TS. Hà Bích Hồng đã tận tình hướng dẫn, chỉ
bảo trong suốt q trình thực hiện khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô Viện Công nghệ
sinh học Lâm nghiệp – Trường Đại học Lâm nghiệp đã giúp đỡ, chỉ bảo hết
sức tận tình cho em khơng chỉ q trình làm khóa luận mà cả quá trình học
tập, bồi dưỡng tại Trường. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn
bè và người thân đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuân lợi trong quá
trình học tập, sinh hoạt, làm nghiên cứu khoa học và hoàn thành bài Khóa
luận tốt nghiệp này.
Vì điều kiện thời gian, khả năng của bản thân cịn có những hạn chế
nên bài Khóa luận tốt nghiệp này cịn có những thiếu sót, em rất mong nhận
được ý kiến đóng góp quý báu của thầy cô giáo, các nhà khoa học cũng như
các bạn sinh viên để bài khóa luận của em được hoàn thiện hơn.
Em xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng năm 2020

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Lê Nhật Trang

i

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
MỤC LỤC ..................................................................................................................ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................ v
DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................ vi
MỞ ĐẦU ................................................................................................................... vi
CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .......................................... 2
1.1. Bệnh truyền nhiễm ............................................................................................... 2

1.1.1. Khái niệm bệnh truyền nhiễm ................................................................. 2
1.1.2. Một số nhóm tác nhân gây bệnh truyền nhiễm ....................................... 4
1.2. Bệnh viêm ruột hoại tử (NE) ở gà và lợn ............................................................ 6

1.2.2. Yếu tố ảnh hưởng đến bệnh viêm ruột hoại tử ở gà và lợn ..................... 9
1.2.3. Bệnh viêm ruột hoại tử trên gà.............................................................. 11
1.3. Một số phương pháp chẩn đoán bệnh truyền nhiễm trên gia súc, gia cầm ............ 15

1.3.1. Phương pháp truyền thống .................................................................... 15
1.3.2. Phương pháp hiện đại ............................................................................ 16
1.3.3. Chẩn đoán bằng kĩ thuật PCR ............................................................... 19
CHƯƠNG II MỤC TIÊU, NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ......................................................................................................... 28
2.1. Mục tiêu của đề tài ............................................................................................. 28

2.1.1. Mục tiêu tổng quát ................................................................................ 28
2.1.2. Mục tiêu cụ thể ...................................................................................... 28
2.2. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................... 28
2.3. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................ 28
2.3. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 28

2.4. Mẫu bệnh phẩm, hóa chất và các trang thiết bị sử dụng nghiên cứu ................. 29

ii


2.4.1. Mẫu bệnh phẩm ..................................................................................... 29
2.4.2. Hóa chất thí nghiệm .............................................................................. 29
2.4.3. Trang thiết bị nghiên cứu ...................................................................... 29
2.4.4. Dụng cụ thí nghiệm ............................................................................... 29
2.5. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 30

2.5.1. Thu nhận, bảo quản mẫu bệnh phẩm .................................................... 30
2.5.2. Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm...................................................... 30
2.5.3. Kỹ thuật PCR ........................................................................................ 30
2.5.4. Kỹ thuật điện di ..................................................................................... 32
CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 33
3.1. Kết quả tách chiết DNA ..................................................................................... 33

3.1.1. Kết quả tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm của lợn ............................ 33
3.1.2. Kết quả tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm của gà .............................. 34
3.2. Kết quả phát hiện bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn................................................. 35
3.2. Kết quả phát hiện bệnh viêm ruột hoại tử ở gà .................................................. 38
CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 42
4.1. Kết luận .............................................................................................................. 42
4.2. Kiến nghị ............................................................................................................ 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO

iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết đầy đủ

STT

Từ viết tắt

1

AC-ELISA

2

AIDS

Acquired Immunodeficiency Syndrome

3

DNA

Deoxyribonucleic Acid

4

ELISA

5

FA

Flourescence Assay

6

ILT

Infectious Laryngotracheitis

7

ILTV

8

IP

9

ITS

Internal Strancribed Spacer

10

NE

Necrotic Enteritis

11

ORT

Ornithobacterium Rhinotracheale

12

PCR

Polymerase Chain Reaction

13

RNA

Ribonucleic Acid

14

SARS

Severe Acute Respiratory Syndrom

15

SDS

16

Ta

Temperature annealing

17

Tm

Temperature melting

Antigen Capture Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay

Enzyme Linked Immunosorbent Assay

Infectious Laryngotracheitis Virus
Immunoperoxidase

Sodium Dodecyl Sulfate

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Các typ độc tố chính của vi khuẩn C. perfringens ........................... 7
Bảng 1.2: Các type Clostridium perfringens gây bệnh viêm ruột hoại tử ở
lợn .................................................................................................................... 13
Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR ............................................................. 31
Bảng 2.2: Mồi sử dụng trong đề tài................................................................. 31
Bảng 2.3 : Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR................................................ 32

v


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Clostridium perfringens qua kính hiển vi ......................................... 9
Hình 3.1: Kết quả kiểm tra DNA tổng số được tách chiết từ các mẫu bệnh
phẩm khác nhau của lợn chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử trên gel agarose
1%.................................................................................................................... 33
Hình 3.2: Kết quả kiểm tra DNA tổng số được tách chiết từ các mẫu bệnh
phẩm khác nhau của gà chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử ........................... 34
Hình 3.3: Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi của cặp mồi 16S_F/R trên mẫu
DNA tách từ phân của Heo chẩn đốn bệnh viêm ruột hoại tử ...................... 36
Hình 3.4: Kết quả PCR với cặp mồi 16S_F/R ................................................ 37
Hình 3.5: Kết quả nhân bản đoạn gen 16S-rRNA của vi khuẩn C. perfringens
từ các mẫu bệnh phẩm của gà ......................................................................... 38
Hình 3.6: Quy trình phát hiện bệnh ở gia súc, gia cầm bằng phương pháp PCR
......................................................................................................................... 41

vi


MỞ ĐẦU
Trong lĩnh vực chăn nuôi gia xúc, gia cầm, bệnh truyền nhiễm được xem
như là trở ngại lớn nhất ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và phát triển bền vững
của ngành chăn nuôi ở nước ta. Những tác hại mà bệnh truyền nhiễm mang đến
như, bệnh nhẹ: vật chủ kém tăng trưởng – chất lượng thịt kém, giảm sản lượng
trứng, bệnh nặng: tử vong hàng loạt – gây ô nhiễm mơi trường. Để kiểm sốt và
giảm thiểu những hậu quả bệnh truyền nhiễm mang lại, chúng ta cần phải xác
định được tác nhân nào gây bệnh làm cơ sở để lựa chọn và hoàn thiện những giải
pháp nhằm hạn chế sự sinh trưởng và phát triển của tác nhân gây bệnh.

Bệnh viêm ruột hoại tử (Necrotic Enteritis) là một bệnh truyền nhiễm
điển hình thường gặp ở ngành chăn ni do chủng vi khuẩn Clostridium
perfringens gây ra. Bệnh đã được thừa nhận trên toàn cầu như một trong
những thách thức bệnh dẫn đầu, ước tính phí tổn trong ngành gia cầm gần 2 tỷ
USD chỉ riêng năm 2015. Ở Việt Nam, cơng tác chẩn đốn bệnh trên gia xúc,
gia cầm áp dụng các kĩ thuật chẩn đoán truyền thống là chủ yếu, hầu hết đều
dựa vào những triệu chứng và các vết bệnh tích ở vật chủ, hình thái, cấu tạo
và hoạt tính sinh học của các tác nhân gây bệnh,... điều đó ảnh hưởng đến
hiệu quả sử dụng thuốc và thuốc kháng sinh đối với những bệnh có bệnh lý và
triệu chứng tương đồng nhau. Tình trạng sử dụng thuốc kháng sinh không
hiệu quả dẫn đến bệnh không được tiêu diệt triệt để, hình thành những ổ dịch
tự nhiên, và thúc đẩy tích lũy các đột biến ở các tác nhân gây bệnh.
Với sự phát triển của lĩnh vực sinh học phân tử, tiêu biểu là kỹ thuật
polymerase chain reaction (PCR) đã kéo theo hàng loạt các thành tựu khoa học
mang tính thực dụng cao. Ưu điểm của phương pháp này: đơn giản, giá thành thấp
và nhanh chóng. Do đó, trong lĩnh vực chẩn đốn bệnh, PCR được xem là phương
pháp chẩn đốn chính xác tác nhân gây bệnh, phát hiện được đến từng phân
chủng, áp dụng được với nhiều dạng và hàm lượng mẫu bệnh phẩm khác nhau.
Xuất phát từ tính chất vượt trội của kỹ thuật PCR trong lĩnh vực chẩn đốn bệnh,
tơi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phát hiện nhanh bệnh viêm ruột hoạt tử ở
lợn và gà do chủng vi khuẩn Clostridium perfringens bằng kỹ thuật PCR”.
1


CHƯƠNG I

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Bệnh truyền nhiễm
1.1.1. Khái niệm bệnh truyền nhiễm
Bệnh truyền nhiễm là loại bệnh có khả năng lây lan nhanh chóng (từ một

quần thể nhỏ đến cả một cộng đồng), thời gian ủ bệnh tương đối dài nên việc
phát hiện và kiểm soát bệnh là một vấn đề khó khăn trong y tế dự phịng. Bên
cạnh đó một số bệnh có những biểu hiện, triệu chứng bệnh có điểm tương tự
nhau, bệnh xâm nhiễm ở một loài hay nhiều loài nhất định, mức độ phát tán
và bệnh trạng phụ thuộc vào đặc tính hình thái, cấu tạo và cấu trúc sinh học
của những tác nhân gây bệnh.
Bệnh truyền nhiễm là nguyên nhân chủ yếu làm trì trệ sự phát triển
bền vững của lĩnh vực chăn nuôi, không chỉ thiệt hại về kinh tế, mà cịn ảnh
hưởng đến mơi trường, và sức khỏe cộng đồng. Một số bệnh truyền nhiễm
gây thiệt hại ngành chăn nuôi gia cầm ở Việt Nam như: dịch cúm gia cầm
(12/2003), nước ta đã phải thiêu hủy 38 triệu con tương đương với hơn 380
tỷ đồng ( hàng
năm phải tiêu hủy hàng nghìn gia cầm do các trận dịch nhỏ, lẻ xảy ra thường
xuyên rải rác khắp cả nước; hay bệnh viêm ruột hoại tử (NE), ORT (Vi khuẩn
Ornithobacterium rhinotracheale), viêm thanh khí quản (Gallid herpesvirus
1), tiêu chảy (Vi khuẩn Escherichia Coli), thương hàn (Salmonella
Gallinarum),.. đều là những bệnh phổ biến ở Việt Nam, bệnh xảy ra thường
xuyên nếu gặp điều kiện thời tiết và dinh dưỡng thích hợp trong năm. Điển
hình là những trận dịch lợn tai xanh (Arterivirus), lở mồm long móng
(Aphthovirus) và gần đây nhất là dịch tả lợn Châu Phi (African swine fever
virus) đã gây thiệt hại vô cùng lớn cho ngành chăn nuôi (Đỗ Tiến Duy, 2015,
2016; Ngũn Đình Qt, 2015). Một số bệnh khơng gây tử vong nhưng thiệt
hại kinh tế do chúng mang đến thậm chí cịn nghiêm trọng hơn các bệnh gây
tử vong, bởi hậu quả của những căn bệnh đó là làm vật chủ chậm phát triển và
2


giảm sản lượng trứng.
Các tác nhân gây bệnh hầu hết đều là sinh vật nhân sơ, chúng chính là
những sinh vật đơn bào có tần số đột biến cao, lợi thế về vòng đời ngắn ngủi

giúp cho các tác nhân gây bệnh có thể dễ dàng hình thành nên một quần thể
kháng kháng thể (hoặc kháng thuốc kháng sinh) mới thơng qua tích lũy đột
biến và các yếu tố chọn lọc. Ngồi ra, ở sinh vật nhân sơ cũng khơng có những
yếu tố sửa sai hệ gen như ở sinh vật nhân thực, điều này dẫn đến tỉ lệ đột biến ở
sinh vật nhân sơ tăng cao. Thứ yếu, sự phát tán bệnh từ một quần thể cách ly và
nhỏ, bệnh lan truyền qua đường vận chuyển quốc tế, truyền máu,.. Thứ ba, sự
phát tán của các virus có sẵn ở các sinh vật khác địa vực (sống cách ly), các nhà
khoa học ước lượng rằng ba phần tư các bệnh mới bắt nguồn theo cách này. Các
loài sinh vật được xem như là ổ chứa tự nhiên của các chủng virus, như bệnh
SARS bùng phát năm 2002 ở Trung Quốc, nguyên nhân là dơi, ổ chứa bệnh
SARS được bán làm thức ăn cùng thời điểm đó (World Health Organization).
Một cách thức quan trọng khác là sự tái tổ hợp di truyền nếu một vật chủ bị lây
nhiễm nhiều chủng virus cùng một thời điểm. Cụ thể hơn là virus cúm, được
xem như là nguyên nhân dẫn đến bùng phát đại dịch cúm Tây Ban Nha năm
1918, virus 1918 gây ra đại dịch được cho là hậu đại của 02 chủng virus cúm từ
động vật có vú và lồi chim thông qua sự trôi dạt kháng nguyên (antigenic drift),
( />Bệnh phát tán thường thơng qua đường sol khí, hoặc tiếp xúc trực tiếp
với dịch thể nhiễm bệnh (máu, nước bọt ,..), các dụng cụ ô nhiễm (kim tiêm,
đồ dùng sinh hoạt ,..), hay vật trung gian (côn trùng, thức ăn ô nhiễm ,..).
Các tác nhân gây bệnh có thể phá hủy hay giết các tế bào bằng việc giải
phóng enzyme thủy phân từ lysosome làm phân giải màng tế bào vật chủ,
hoặc bản thân tác nhân có thành phần phân tử là độc tố như phần protein của
lớp áo virus, phần lipid của vi khuẩn…
Mức độ phá hủy tế bào chủ mà các tác nhân có thể gây ra phụ thuộc vào
khả năng tái sinh của mô bị lây nhiễm qua quá trình phân chia tế bào. Nhiều
3


triệu chứng tạm thời liên quan đến sự lây nhiễm (như virus,..), bao gồm sốt
cao, đau nhức thường là do các nỡ lực đáp ứng của chính cơ thể nhằm chống

lại virus hơn là do các tế bào bị chết bởi virus.
1.1.2. Một số nhóm tác nhân gây bệnh truyền nhiễm
Những tác nhân gây bệnh chính gồm virus, vi khuẩn, động vật ngun
sinh, vi nấm; ngồi ra cịn có viroid (hiện vật chủ là thực vật) và prion (gây
tổn hại đến hệ thần kinh động vật) được xem như là hai tác nhân gây bệnh
nguy hiểm đơn giản nhất (Campbell, 2008). Bệnh do virus và vi khuẩn gây ra
có tỉ lệ tử vong cho vật chủ cao hơn so với các tác nhân gây bệnh khác. Hiện
chưa có một loại thuốc hay kháng sinh nào tác động hữu hiệu đến virus, chỉ
có thể chủng ngừa virus thơng qua tiêm phịng vaccin.
1.1.2.1. Virus
Virus được xem là tác nhân gây bệnh nguy hiểm và khó kiểm sốt nhất,
phần lớn các ca tử vong do mắc bệnh truyền nhiễm đều là tác nhân virus gây
ra. Virus là dạng sống ký sinh nội bào bắt buộc. Virus gồm lõi (axit nucleic)
được bọc bằng vỏ capsid (protein), một số chủng có thêm màng ngồi.
Virus gây độc vật chủ bằng cách tiết enzyme thủy phân làm ly giải màng
tế bào, hoặc bản thân lớp vỏ capsid của virus là độc tố có thể gây độc tế bào
ảnh hưởng đến các q trình sinh hóa trong tế bào.
Hình thức sinh sản
Chu kỳ sinh tan: virus sẽ xâm nhập tế bào chủ thông qua thụ thể đặc
hiệu tồn tại trên tế bào chủ và tiêm vật chất di truyền (DNA, RNA) vào trong
tế bào chủ. Virus sẽ trưng dụng hệ enzyme và nguyên vật liệu (dNTPs,...) của
tế bào chủ để sao chép (tạo vật chất di truyền) và phiên mã, dịch mã (tạo vỏ
capsid). Hàm lượng vật chất di truyền và vỏ capsid đủ lớn, chúng sẽ tự đóng
gói lại với nhau hồn thiện thành các hạt virus hồn chỉnh. Sau q trình đóng
gói chúng sẽ làm chết tế bào bằng cách ồ ạt phá vỡ tế bào và di chuyển sang
các tế bào lân cận hay thay đổi trạng thái sinh lý của tế bào.
Chu kỳ tiềm tan: virus sẽ chèn vật chất di truyền của chúng vào trong
4

hệ gen tế bào chủ và cùng sao chép, phiên mã, dịch mã với hệ gen tế bào chủ.
Virus ở dạng tiềm tan sẽ không gây chết đến tế bào. Bên cạnh đó, khi gặp một
số điều kiện kích thích nhất định, virus ở dạng tiềm tan sẽ chuyển sang dạng
sinh tan và làm chết tế bào.
1.1.2.2. Vi khuẩn
Vi khuẩn được xem như là bậc thầy về khả năng thích nghi từ
Deinococcus radiodurans có thể sống ở bức xạ 3 triệu rads đến Picrophilus
oshimae sinh trưởng ở pH 0.03 (Campbell, 2008). Một số vi khuẩn có khả
năng hình thành nội bào tử khi gặp điều kiện môi trường bất lợi. Vi khuẩn hay
còn gọi là vi trùng (sinh vật nhân sơ) vừa là sinh vật gây hại vừa là sinh vật có
ích hoặc trung lập, vi khuẩn gây hại phần lớn là những vi khuẩn có dạng sống
dị dưỡng (ký sinh) và có ích gồm các dạng sống cộng sinh (hệ vi sinh đường
ruột,..) hoặc một số vi khuẩn có dạng sống tự dưỡng. Vi khuẩn có cấu tạo
phức tạp hơn virus, gồm màng tế bào, vùng nhân, plasmid và ribosome.
Hệ gene vi khuẩn có từ vài trăm đến vài nghìn gene. Có 3 hình dạng phổ
biến gồm hình cầu, hình que và hình xoắn. Dựa vào cấu trúc trên bề mặt tế
bào, vi khuẩn có thể được chia làm 2 loại gồm khuẩn Gram (-) và khuẩn
Gram (+). Bên cạnh khả năng kháng kháng sinh nhờ cấu trúc màng ngồi, vi
khuẩn cịn có plasmid R (DNA sợi đơn, dạng vòng) là một loại plasmid chứa
các gen kháng kháng sinh.
Khả năng sinh sản nhanh chóng là một ưu thế của vi khuẩn, vi khuẩn
sinh sản bằng cách phân đôi, từ một tế bào mẹ tạo thành hai tế bào con y hệt
nhau và cứ thế chúng tiếp tục phân đôi. Trong những điều kiện tối thích hợp,
nhiều chủng vi khuẩn cứ 1-3 tiếng lại phân chia, một số lồi có thể tạo ra thế
hệ mới chỉ trong thời gian 20 phút.
Vi khuẩn gây bệnh bằng cách tạo ra các chất độc gồm ngoại độc tố và
nội độc tố. Ngoại độc tố là các protein được tiết ra bởi vi khuẩn như độc tố
botulinum được tạo ra thông qua lên men nhiều loại thức ăn. Nội độc tố là các
thành phần lớp màng ngồi lipopolysaccharide của nhóm khuẩn Gram (-).
5

1.1.2.3. Động vật nguyên sinh
Động vật nguyên sinh là nhóm động vật đơn bào (hoặc đa bào) hay còn
gọi là ký sinh trùng thuộc nhóm nguyên sinh vật. Một số chủng phổ biến gây
bệnh ở gia cầm như Histomonias -bệnh đầu đen, chi Eimeria – bệnh cầu
trùng, bệnh ký sinh trùng máu do Leucocytotozoone, hoặc các loại bệnh giun,
sán dây là những căn bệnh nghiêm trọng do nhóm động vật đơn bào gây ra
trên gia cầm.
Hình thức sinh sản của nhóm động vật nguyên sinh khá là phức tạp, một
số chỉ sinh sản vơ tính, số khác cịn có thể sinh sản hữu tính hoặc ít nhất sử
dụng các quá trình hữu tính của giảm phân và thụ tinh. Hoặc vừa sinh sản vơ
tính vừa sinh sản hữu tính. Chi Eimeria thuộc nhóm động vật nguyên sinh vừa
sinh sản hữu tính vừa sinh sản vơ tính.
Động vật ngun sinh gây bệnh bằng cách phá hủy tế bào, mô hay các tổ
chức cơ quan bằng enzyme thủy phân, các ngoại tiết tố làm mất cân bằng nội
môi và ly giải màng tế bào.
1.2. Bệnh viêm ruột hoại tử (NE) ở gà và lợn
NE là bệnh nhiễm trùng ruột cấp tính; bệnh gây ra bởi vi khuẩn
Clostridium perfringens, do mức độ hiện diện cao của C. perfringens trong
môi trường bên trong lẫn bên ngoài cơ thể dẫn đến bệnh khá phổ biến trên
khắp thế giới và bệnh có tỷ lệ tử vong cao trong đàn.
C. perfringens là một loại vi khuẩn gần như có mặt ở khắp mọi nơi, từ
trong đất, bụi, thức ăn cho đến đường ruột của động vật. Bệnh xảy ra do sự
thay đổi hệ vi sinh đường ruột hoặc một tình trạng dẫn đến tổn thương niêm
mạc ruột (chẳng hạn, bệnh cầu trùng, hay nhiễm khuẩn Salmonella thường là
những tác nhân chính dẫn đến viêm ruột hoại tử). Tóm lại, bất cứ yếu tố nào
thúc đẩy sự phát triển quá mức của C. perfringens trong đường ruột cũng làm
xuất hiện bệnh viêm ruột hoại tử (Vijay Durairaj, 2007).
1.2.1. Một số hiểu biết về vi khuẩn Clostridium perfringens

Vi khuẩn Clostridium perfringens (thuộc giống Clostridium) được phát
6


hiện đầu tiên vào năm 1892, với tên gọi lúc đầu là Bacillus aerogenes capsulatus.
Sau này, vi khuẩn được đổi tên thành Bacillus enteritidis sporogenes, Bacillus
perfringens, Bacterium welchii và Clostridium welchii. Mặc dù tên gọi khơng
chính thức là C. welchii, nhưng được sử dụng từ năm 1939 và hiện nay vẫn có thể
tìm thấy trong cách viết của người Anh. Từ năm 1980, tên khoa học chính thức
của vi khuẩn là Clostridium perfringens (C. perfringens).
Phân loại khoa học
Tên khoa học: Clostridium perfringens (C. perfringens).
Phân loại:
Giới : Bacteria
Ngành : Firmicutes
Lớp

: Clostridia

Bộ

: Clostridiales

Họ

: Clostridiaceae

Chi

: Clostridium

Loài

: C. perfringens

1.2.1.1. Phân loại các typ độc tố
Trong quá trình sinh trưởng, C.perfringens sản sinh hơn 17 loại độc tố
khác nhau, dựa vào khả năng sản sinh 4 loại độc tố chính là độc tố alpha (a),
beta (β), epsilon (ε), lota (ι) các chủng vi khuẩn C.perfringens được phân
thành 5 typ khác nhau, gọi là typ độc tố (toxinotype: A, B, C, D, E). Typ A
sinh độc tố α; typ B sinh độc tố α, β, ε; typ C sinh độc tố α, β; typ D sinh độc
tố α, ε; typ E sinh độc tố α, ι. (xem bảng 1).
Bảng 1.1: Các typ độc tố chính của vi khuẩn C. perfringens

Typ độc tố
a
β
ε
+
A
+
+
+
B
+
+
C
+
+
D

+
E
Chú thích: có sản sinh độc tố (+); không sản sinh độc tố (-)

7

Ι
+


C. perfringens typ A thường có ở trong đường ruột của gà, lợn khoẻ với
số lượng nhỏ, khi gặp những điều kiện bất lợi như thay đổi chế độ chăm sóc
ni dưỡng, mật độ chăn ni cao hoặc nhiễm cầu trùng, vi khuẩn nhân lên
nhanh chóng và sản sinh độc tố (chủ yếu là độc tố α) gây viêm ruột hoại tử.
C. perfringens typ C hiếm khi phân lập được từ gà khỏe, lợn khỏe và
độc tố α và β được xác định là yếu tố độc lực chủ yếu trong quá trình sinh
bệnh của C. perfringens typ C.
Type là C. perfringens A và C. perfringens C liên quan đến khả năng gây
bệnh trên gia cầm của chi C. perfringens (H. To, 2017). C. perfringens không
hoạt động trên 74oC và dưới 4oC.
Ở nước ta, C.perfringens typ A và D đóng vai trò quan trọng trong bệnh
viêm ruột tiêu chảy ở dê, cừu, trâu, bị; một số chủng có độc lực rất mạnh (Lê
Lập và cs, 2009; Nguyễn Quang Tính, 2008; Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2010)
1.2.1.2. Đặc điểm hình thái
C. perfringens là vi khuẩn yếm khí khơng triệt để (thường phải bổ sung
2 - 10% CO2), khơng di động, hình thành giáp mô trong mô bào; là trực khuẩn
to, thẳng, hai đầu trịn, đứng riêng lẻ hoặc thành đơi, có kích thước từ 0,6 - 0,8
x 2 - 4 µm, bắt màu Gram dương. Có dạng hình que và sinh nội bào tử yếm
khí có khả năng gây bệnh ở vật ni, động vật hoang dã và ở người. Khuẩn
lạc trịn, nhẵn và bóng được bao bởi một vịng bên trong dung huyết hoàn

toàn ( do độc tố beta) và một vịng bên ngồi khơng dung huyết hồn tồn( do
độc tố alpha). Người ta gọi hiện tượng này là hiện tượng dung huyết beta trên
mơi trường ni cấy có bổ sung máu động vật.

8


Hình 1.1: Clostridium perfringens qua kính hiển vi
1.2.2. Yếu tố ảnh hưởng đến bệnh viêm ruột hoại tử ở gà và lợn
1.2.2.1. Chế độ dinh dưỡng
Chế độ ăn uống tạo thành một yếu tố nguy cơ chính có tác động mạnh mẽ
đến tỷ lệ mắc bệnh viêm ruột hoại tử ở gà cơng nghiệp . Protein chế độ ăn khó
tiêu, chẳng hạn như protein có trong động vật như thịt và bột xương hoặc bột cá,
khơng thể được tiêu hóa và hấp thụ ở phần trên của đường ruột. Thay vào đó,
protein tích tụ ở phần dưới của đường ruột, sau đó có thể hoạt động như một chất
nền cho hệ vi sinh vật đường ruột. Quá trình lên men của protein tạo ra các sản
phẩm sản phẩm phụ gây bất lợi cho đường ruột như amin, amoniac, tạo điều kiện
thuận lợi cho sự tăng sinh của vi khuẩn gây bệnh.
Một loạt các thành phần thức ăn và các yếu tố tiêu hóa có thể khiến vật
ni bị viêm ruột hoại tử, bao gồm:


Protein khó tiêu hóa



Viêm ruột / kích thích / tổn thương



Chế độ ăn nhiều chất xơ, tăng trưởng nhanh, năng lượng cao, độ nhớt

cao và chế độ ăn giàu protein


Axit amin (mức độ thấp Arginine và glutamine)



Mức độ cao của axit lactic

1.2.2.2. Độc tố nấm mốc
Mycotoxin - chất chuyển hóa nấm độc hại. Độc tố nấm mốc hay cịn
gọi là độc tố chuyển hóa thứ cấp được sản xuất bởi một số loại nấm mốc phổ
biến lẫn trong khẩu phần ăn của gia cầm có thể trực tiếp làm giảm tính tồn

9


vẹn của ruột. Do đó dẫn đến giảm hấp thu và tiêu hóa các chất dinh dưỡng
trong chế độ ăn uống và tăng tính thấm ở ruột, hậu quả là làm mất chức năng
của hàng rào biểu mô ruột. Giảm sự hấp thu chất dinh dưỡng và rò rỉ protein
huyết tương vào lòng do sự vi phạm này dẫn đến tăng nồng độ protein trong
lòng ruột, tạo cơ chất cho sự tăng sinh C. perfringens.
Mycotoxin cũng ảnh hưởng xấu đến khả năng miễn dịch và có mối
tương quan chặt chẽ với nhiễm trùng đường ruột. Với vô số tác hại của
mycotoxin, phát triển một quy trình kiểm sốt tác hại của độc tố mycotoxin là
điều cần thiết để bảo vệ sự toàn vẹn của đường ruột trong lĩnh vực chăn ni
nói riêng và y tế nói chung.
Sự ơ nhiễm của thức ăn ở gà công nghiệp với độc tố nấm Fusarium như

deoxynivalenol hoặc fumonisin hoặc sự kết hợp của cả hai là một yếu tố ảnh
hưởng đến viêm ruột hoại tử ở gà thịt
1.2.2.3. Bệnh cầu trùng
Những trường hợp nhiễm trùng cầu trùng phần lớn là do sự thay đổi
của các yếu tố tự nhiên (nhiệt độ, độ ẩm,..). Bên cạnh đó, vaccine cũng là
nguyên nhân gây nhiễm cầu trùng nếu khơng được sử dụng đúng cách (chẳng
hạn như tình trạng sức khỏe của vật chủ khi được tiêm phòng) hoặc sử dụng
những vaccine không đạt tiêu chuẩn. Bệnh cầu trùng thường dẫn đến những
tổn thương ở biểu mô ruột, chính những tổn thương này gây ra sự mất cân
bằng nội môi bên trong cơ quan ruột, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển
của C. perfringens. Sự tăng sinh mất kiểm soát của C. perfringens dẫn đến
bệnh viêm ruột hoại tử ở vật chủ mắc phải.
1.2.2.4. Paratyphoid
Nhiễm khuẩn Salmonella thyphimurium ở gà con là yếu tố ảnh hưởng
đáng kể đối với viêm ruột hoại tử ở gà thịt.

10


1.2.3. Bệnh viêm ruột hoại tử trên gà
Viêm ruột hoại tử thường thấy ở gà thịt 2 đến 5 tuần tuổi được nuôi trên
lứa và ở gà tây 7 đến 12 tuần tuổi. Bệnh sẽ tồn tại trong đàn từ 5 đến 10 ngày,
gây tử vong từ 2% đến 50% (Cẩm nang thú y Merck, 1998).
Viêm ruột hoại tử thường được mô tả ở gà thịt. Tuy nhiên, các lớp và
gà tây cũng bị ảnh hưởng bởi tình trạng này (Broussard et al., 1984;
Gazdzinski và Julian, 1991; Droual et al., 1994, 1995; Dhillon et al., 2004).
1.2.3.1. Triệu chứng lâm sàng
Viêm gan và viêm đại tràng liên quan đến viêm ruột hoại tử đã được
mô tả (Randal et al, 1983; Hutchincon và Ridell 1990, Loveland và
Kaldhusdal 1999; Sasaki et al 2000). Viêm đường mật gây ra bởi thắt ống mật

và viêm C. perfringens (Onderka et al 1990, và Sasaki et al 2000), viêm gan
hoại tử do C. perfringens ở gà con mới nở (Sasaki et al 2003), viêm túi mật, lá
lách và mề cũng có thể xảy ra.
Bệnh có 02 dạng độc lực gồm: dạng độc lực cao có các triệu chứng như
trầm cảm nặng, bỏ ăn, tiêu chảy sẫm màu và lông xù, tỷ lệ chết cao. Triệu
chứng ở dạng độc lực thấp thường không mấy rõ ràng, chúng chỉ ủ rũ, ăn ít,
lơng xù và giảm sản lượng trứng (Vijay Durairaj, 2007).
Thời gian ủ bệnh từ 6 đến 24 (thường là 10-12) giờ sau khi ăn thực phẩm
bị ô nhiễm, bệnh kéo dài từ 5 – 10 ngày, tỉ lệ tử vong 2 – 50% .
Bệnh xảy ra với thể cấp tính và thể mãn tính. Thể cấp tính gà bệnh giảm
ăn, chậm chạp, ỉa phân khơ có màu đen, đôi khi lẫn máu và nhầy gần giống
triệu chứng bệnh Cầu trùng. Gà hay nằm sấp gục đầu, xã cánh, không thể tự
đứng và di chuyển. Trong thể mãn tính triệu chứng lâm sàng khơng điển hình.
Gà chậm lớn, giảm cân, trong khi vẫn ăn uống bình thường và bị chết do gầy.
Bệnh xảy ra ở thể cấp tính với tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết cao. Bệnh có
tính dịch địa phương, và thường xảy ra ở đàn gà thịt 4-8 tuần tuổi.
1.2.3.2. Bệnh tích trên gà
Gà nhiễm bệnh viêm ruột hoại tử thường có những biểu hiện như sau:
11


- Gà gầy ốm.
- Niêm mạc đường ruột sưng có nhiều đốm đỏ tấy, xuất huyết thành vệt,
thành mảng. Rất nhiều trường hợp khi mổ ra đã thấy các vùng viêm hoại tử
tạo vết loét hoặc đám loét phủ một lớp màu vàng ngà.
- Đặc biệt ở phần ruột già, chất chứa trong đường tiêu hóa có màu đậm,
dính chặt và thối.
- Bệnh viêm loét kéo dài có thể thủng ruột, phân tràn ra ngồi gây viêm
dính phúc mạc.
- Gan, lách không to nhưng màu sắc lại thay đổi. Màu của gan có thể thâm hoặc

vàng hơn bình thường.Trên bề mặt gan có nhiều điểm lấm tấm hoại tử màu vàng.
- Thân và lách sưng to biến màu, khó quan sát được các điểm hoại tử.
1.2.3.3. Đường truyền bệnh
Vi khuẩn C. perfringens là một loại vi khuẩn yếm khí sống trong đường
ruột và ít gây bệnh cho gà nếu khơng có các yếu tố thúc đẩy.
Các yếu tố nguy cơ stress có hại như gà quá đói, quá khát, thay đổi đột
ngột nguồn thức ăn, nước uống, thức ăn bị ôi thiu, nấm mốc làm thay đổi môi
sinh trong đường ruột như cầu trùng, giun sán, rối loạn tiêu hóa. Hay do
chuồng trại ẩm thấp, chất độn chuồng không sạch khơng khơ, cắt mỏ,...Những
lí do đó rất có lợi cho việc phát triển C. perfringens và gây bệnh.
Nguy hiểm hơn là một số chủng có khả năng sinh tồn cao, ô nhiễm bên
ngoài trường, các dụng cụ thiết bị và con người... vì lí do đó mang mầm bệnh
vào đàn gà thì bệnh xảy ra với quy mơ lớn.
1.2.1.4. Cơ chế sinh bệnh
Cũng giống như vi khuẩn E.coli, vi khuẩn C. perfringen kí sinh bình
thường trong đường ruột mà khơng gây bệnh. Chúng tham gia vào quá trình
lên men, phân hủy thức ăn giúp gà đồng hóa và tăng trưởng tốt. Thế nhưng
khi có các bệnh và các yếu tố thúc đẩy(đã nêu trên) làm cho nhu động đường
ruột thay đổi và tạo điều kiện thuận lợi cho C. perfringens sinh trưởng nhanh,
phá vỡ thế cân bằng vi sinh có lợi cho vật chủ.
12


Trên cơ sở của rối loạn tiêu hóa, hoặc các bệnh cầu trùng, giun sán,…. đã
phá vỡ cấu trúc niêm mạc ruột tạo điều kiện cho C. perfringens bám vào long
mao niêm mạc ruột gây viêm xuất huyết hoại tử ruột. Chúng không dừng lại ở
đây mà tiếp tục vào đường huyết gây nên hiện tượng nhiễm trùng máu. C.
perfringens không thể tồn tại quá lâu trong môi trường của dịch thể máu, cơ thể
chúng sẽ bị phân hủy nhanh chóng sau khi chết và giải phóng nội độc tố vào vật
chủ, dẫn đến tình trạng bệnh của vật chủ trở nên trầm trọng hơn hoặc tử vong.

1.2.4. Bệnh viêm ruột hoại tử trên lợn
Bảng 1.2: Các type Clostridium perfringens gây bệnh
viêm ruột hoại tử ở lợn
Bệnh ở lợn

Vi khuẩn

Clostridium perfringens type A Viêm ruột hoại tử (sinh ngoại độc tố)
Clostridium perfringens type C Viêm ruột hoại tử xuất huyết
Clostridium difficile

Viêm đại tràng

1.2.4.1.Triệu chứng lâm sàng
Thể quá cấp tính: xảy ra rất nhanh trong vòng 8 giờ đầu tiên sau khi sinh,
heo con trở nên yếu ớt dần dần rồi chết. Thường khơng biểu hiện triệu chứng
gì bên ngồi, đơi khi quan sát sẽ thấy tiêu chảy ra máu.
Thể cấp tính: thường thấy trên heo con khoảng 2 – 5 ngày tuổi. Dấu hiệu
đầu tiên là chết bất thình lình và kèm theo tiêu chảy ra máu, bệnh xảy ra rất
nhanh, heo chết nhanh sau khi tiêu chảy ra máu. Heo con đi ngồi phân
thường có màu nâu đỏ, ngà vàng, phân có chứa những mảng nhầy do niêm
mạc ruột hoại tử hoặc màu nâu vàng có bọt, heo con trở nên yếu dần rồi chết
sau 2 – 3 ngày mắc bệnh.
Thể mãn tính: Lợn tiêu chảy dai dẳng khoảng hơn một tuần. Phân nhiều
nước, màu vàng xám có lẫn chất nhày. Heo gầy cịm nhợt nhạt, có thể chết
sau vài tuần hoặc còi cọc sau khi khỏi triệu chứng

13

1.2.4.2. Bệnh tích trên lợn
Lợn nhiễm bệnh viêm ruột hoại tử thường có những biểu hiện cụ thể như sau:
- Heo con gầy còm, yếu ớt rõ rệt trước khi chết.
- Phù vùng bụng.
- Cả hệ thống tiêu hoá ở heo con xung huyết hoặc xuất huyết.
- Ruột non xuất huyết, thành ruột non mỏng, chứa đầy khí, sinh hơi
thường ở vùng không tràng và hồi tràng.
- Ruột già giãn, nhợt nhạt, chất chứa nhão.
- Tổn thương niêm mạc (màu đỏ hoặc màu đen), với xuất huyết dữ dội
và bọt khí (hoặc sợi huyết + bọt khí).
- Hạch bạch huyết màng treo ruột sung huyết hay xuất huyết.
- Biểu mô có thể bị hoại tử, xuất huyết khắp niêm mạc và lớp dưới niêm.
1.2.4.3. Đường truyền bệnh
Bệnh có thể lan truyền qua đường tiêu hóa, thơng qua nguồn nước và
thực phẩm bị ô nhiễm. Do vi khuẩn Clostridium perfringens , chúng sống
trong ruột già của heo mọi lứa tuổi. Bình thường Clostridium perfringens hiện
diện ở các cơ quan tiêu hoá của tất cả các heo con trước khi cai sữa.
Vi khuẩn xâm ngập vào heo qua những tổn thương trên da và tổ chức mô, cơ
dưới da, đặc biệt trong giai đoạn nái nuôi con là nguồn truyền bệnh cho heo
con. Nếu chăm sóc ni dưỡng khơng tốt, yếu tố ngoại cảnh xấu, sức đề
kháng của heo con yếu vì thể heo con dễ phát bệnh.
1.2.4.4. Cơ chế gây bệnh
Vi khuẩn C. perfringens có trong hệ vi sinh vật đường ruột bình thường
của động vật. Vì vậy thường có 2 yếu tố gây nên bệnh tiêu chảy ở gia súc: thứ
nhất là do vi khuẩn sẵn có trong đường ruột, thứ hai là do thức ăn bị nhiễm
khuẩn C. perfringens, cùng với một số thay đổi đột ngột về môi trường, khẩu
phần thức ăn, thức ăn chứa nhiều protein,...dẫn tới cơ thể bị giảm hấp thu
ruột, giữ lại vi khuẩn trong cơ thể và cuối cùng thì cơ thể hấp thu các độc tố

14

gây bệnh. Cacbon hydrate khơng tiêu hóa được là mơi trường thuận lợi cho vi
khuẩn C. perfringens sinh trưởng và phát triển nhanh chóng.
Bình thường vi khuẩn này có nhiều ở ruột già nhưng khi sức đề kháng
của cơ thể giảm, vi khuẩn lại xâm nhập lên ruột non và sản sinh ra một lượng
lớn độc tố, gây nhiễm độc huyết đường ruột. Trong đường tiêu hóa, với sự bội
nhiễm về số lượng, vi khuẩn C. perfringens tấn công vào lớp màng nhầy rồi
vào lớp biểu mô ruột, dưới tác dụng của độc tố gây xuất huyết, hoại tử tổ chức
nhung mao ruột, từ đó lan dần vào sâu tới các lớp niêm mạc ruột. Trong nhiều
trường hợp, vi khuẩn xâm nhập sâu vào thành ruột tạo thành những ổ viêm
nhiễm, gây khí thũng dưới lớp niêm mạc hoặc lớp cơ hay đi sâu vào trong các
tổ chức hay các hạch lympho lân cận.
1.2.4.5. Chẩn đoán bệnh
Chẩn đoán sơ bộ thơng qua các tổn thương có thể quan sát được và
nhuộm Gram, từ đó rút ngắn phạm vi và tiến hành làm tan máu do
C.perfringens có khả năng làm tan máu. Hoặc có thể chẩn đốn bằng cách
ni cấy trên một số mơi trường thích hợp và kiểm định kết quả thơng qua
phương pháp hóa sinh,..
1.3. Một số phương pháp chẩn đoán bệnh truyền nhiễm trên gia súc, gia
cầm
1.3.1. Phương pháp truyền thống
1.3.1.1. Hóa sinh phân tích
Hóa sinh phân tích là phương pháp định tính và định lượng các sản phẩm
do tác nhân gây bệnh tiết ra. Phương pháp này xác định tác nhân gây bệnh
bằng cách đưa vào môi trường nuôi cấy các hợp chất tương ứng để các
enzyme mà những tác nhân gây bệnh tiết ra sẽ phân giải hoặc chuyển hóa các
hợp chất đó, người làm thí nghiệm thu nhận kết quả thông qua xử lý những dữ
liệu thu được. Phương pháp này chủ yếu được sử dụng trên vi khuẩn và vi
nấm, những vi sinh vật có dạng sống tự dưỡng.

15


1.3.1.2. Chẩn đoán bệnh dựa trên đặc điểm lâm sàng và bệnh lý
Trong quá trình mang bệnh, vật chủ sẽ biểu hiện một số triệu chứng (đáp
ứng của cơ thể chống lại tác nhân lạ) nhất định do sự ảnh hưởng của các tác
nhân gây bệnh (nội độc tố, ngoại độc tố,..) mang đến. Mặt khác, sự kéo dài
thời gian mang bệnh sẽ hình thành những tổn thương và những vết bệnh tích
trên một số mơ và cơ quan bị nhiễm bệnh; hình dạng, màu sắc, kích thước vết
bệnh tích phụ thuộc vào tác nhân gây bệnh. Dựa vào những yếu tố trên, người
làm cơng tác chẩn đốn bệnh có thể chẩn đốn sơ bộ cá thể, quần thể đó
nhiễm bệnh do tác nhân nào gây ra, nhưng độ chính xác thì khơng được đảm
bảo.
1.3.1.3. Chẩn đốn bệnh dựa trên cấu tạo và hình thái bằng kính hiển vi
Chẩn đốn bệnh dựa trên cấu tạo và hình thái là phương pháp quan sát
hình thái và đặc điểm cấu tạo của các tác nhân gây bệnh thơng qua kính hiển
vi quang học, từ kết quả quan sát người làm thí nghiệm có thể nhận dạng tác
nhân gây bệnh và tình trạng bệnh nhiễm. Phương pháp này thường được dùng
trong chẩn đoán bệnh do ký sinh trùng gây ra, phần lớn các ký sinh trùng có
đường kính khá lớn nên dễ dàng quan sát dưới kính hiển vi hơn các tác nhân
cịn lại. Ưu điểm của phương pháp này là giá thành thấp, đơn giản và tiết
kiệm thời gian. Nhược điểm là hình thái, kích thước của một số phân lồi
trong cùng một chi có độ tương đồng cao nên khó mà phân biệt chính xác.
1.3.2. Phương pháp hiện đại
1.3.2.1. Phản ứng huyết thanh học ELISA
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay – Xét nghiệm hấp thụ
miễn dịch liên kết với enzyme) dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng
nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme.
Phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất

như peptide, protein, kháng thể, hormone... ELISA được dùng để xác định
nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng.
Kĩ thuật ELISA gồm 3 thành phần tham gia phản ứng (kháng thể, kháng
16


nguyên và cơ chất - chất tạo màu), kĩ thuật được tiến hành qua hai bước:
- Phản ứng miễn dịch học: là sự kết hợp giữa kháng thể và kháng
nguyên.
- Phản ứng hóa học: sau khi sự kết hợp giữa kháng thể và kháng nguyên
diễn ra, quan sát và đọc kết quả thơng qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm
giải phóng oxy nguyên tử O từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó
làm thay đổi màu của hỡn hợp trong dung dịch thí nghiệm.
Phân loại ELISA
ELISA trực tiếp: kháng nguyên cần phát hiện được gắn trực tiếp với giá
thể và sẽ được phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể đã được gắn
enzyme). Tuy nhiên độ đặc hiệu bị giới hạn vì thường kháng ngun có ít nhất
2 epitop, trong khi đó ở dạng này chỉ sử dụng một kháng thể.
ELISA gián tiếp: kháng nguyên cần phát hiện gắn vào giá thể sau đó
được kết hợp với kháng thể đặc hiệu (khơng được gắn enzyme), cuối cùng
chúng sẽ được ủ với kháng kháng thể (có gắn enzyme) hình thành phức trên
giá thể KN-KT-KKT. Nhược điểm độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh
(kháng kháng thể) là khác nhau. Do đó cần phải thử nghiệm với nhiều kháng
huyết thanh khác nhau để có kết quả tin tưởng được.
ELISA Sandwich trực tiếp: “Sandwich” là do kết quả thí nghiệm được
đánh giá thơng qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (capture
antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies). ELISA Sandwich
gồm sự dính thụ động của kháng thể bắt vào pha rắn, những kháng thể này
sau đó được kết hợp với kháng nguyên, rồi bổ sung kháng thể phát hiện (có
gắn enzyme) vào phức KT-KN.

ELISA Sandwich gián tiếp: Ngồi phức KT-KN-KT(khơng gắn
enzyme) như ELISA sandwich trực tiếp, ở dạng gián tiếp sẽ được bổ sung
kháng kháng thể (được gắn enzyme) kết hợp với phức KT-KN-KT hình thành
phức KT-KN-KT-KKT.

17


Hạn chế của phương pháp ELISA
- Khơng phản ánh chính xác độc lực của chủng virus phân lập.
- Kết quả chẩn đốn là dương tính giả (kháng thể từ mẹ và thức ăn ảnh
hưởng đến kết quả).
- Kết quả chẩn đốn là âm tính giả (bệnh ở giai đoạn mới nhiễm).
1.3.2.2. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang IFA
Phương pháp IFA (Immunoflourescence Assays - Xét nghiệm miễn dịch
huỳnh quang) là phương pháp dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng thể và
kháng nguyên, cùng với một số yếu tố khác như là chất đánh dấu huỳnh
quang (thường là FITC – Flourescein Isothiocynate), nguồn sáng huỳnh
quang (tia UV). Đồng dạng với kỹ thuật ELISA, phức chất xuất hiện màu
chứng tỏ mẫu ta chẩn đốn là dương tính (khơng loại trừ khả năng nhận
dương tính giả).
Ở kĩ thuật này, kháng thể sẽ được gắn với kháng nguyên đã đánh dấu
huỳnh quang, khi phức KT – KN – Chất đánh dấu huỳnh quang, được kiểm
tra dưới kính hiển vi bằng nguồn sáng UV, phức sẽ phát sáng.
Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp: sử dụng duy nhất một
kháng thể đã được liên kết hóa học với flourophore, kháng thể sẽ nhận dạng
kháng ngun đích và hình thành liên kết tại thụ thể đặc hiệu, hay cịn gọi là
epitop. Sau đó, ta có thể quan sát thấy được những bước sóng cụ thể khi bị
kích thích dưới kính hiển vi huỳnh quang. Nhược điểm: ít nhạy hơn so với
phản ứng gián tiếp, và tốn kém.

Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp: sử dụng một kháng thể và
một kháng huyết thanh (kháng kháng thể), kháng thể sẽ tạo liên kết với kháng
nguyên đích, kháng kháng thể đã được gắn flourophore sẽ hình thành liên kết
với kháng thể. Nhược điểm: phức tạp, mất nhiều thời gian.
1.3.2.3. Phát hiện trình tự DNA đặc hiệu bằng lai với mẫu dò acid nucleic
Phương pháp lai với mẫu dị axit nucleic là phương pháp cho phép người
làm thí nghiệm xác định một trình tự DNA đặc hiệu từ hỗn hợp nhiều phân tử
18