Phân tích đa hình di truyền gen PIT1 của lợn đen định hóa bằng phương pháp PCR RFLP (khóa luận công nghệ sinh học lâm nghiệp)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP
----------o0o----------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN PIT1 CỦA LỢN ĐEN
ĐỊNH HÓA BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR-RFLP
NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ

: 7420201

Giáo viên hướng dẫn

: PGS.TS Bùi Văn Thắng
TS. Hà Bích Hồng

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Vân Anh

Mã sinh viên

: 1653070317

Lớp

: K61A – CNSH

Khóa học

: 2016 - 2020

Hà Nội, 2020


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành khóa luận, trong suốt q trình thực hiện em ln nhận
được sự quan tâm giúp đỡ, động viên của các cơ quan, các cấp lãnh đạo, các
thầy cô của trường Đại học Lâm Nghiệp.
Em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Lâm Nghiệp, các
thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học đã truyền đạt kiến thức quý báu, giúp đỡ,
quan tâm tạo điều kiện cho em về mọi phương diện trong q trình thực hiên
khóa luận.
Em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới các thầy, cô hướng dẫn: PGS.TS.
Bùi Văn Thắng, TS. Hà Bích Hồng – người trực tiếp hướng dẫn khoa học luôn
dành thời gian, công sức tận tình giúp đỡ em về phương hướng và phương pháp
nghiên cứu cũng như hồn thiện khóa luận.
Kinh phí thực hiện đề tài được hỗ trợ bởi đề tài cấp Tỉnh “Nghiên cứu bảo
tồn nguồn gen Lợn đen huyện Định Hóa, tỉnh Thái Nguyên”
Tuy có nhiều cố gắng, nhưng trong nghiên cứu khoa học này khơng tránh
khỏi những thiếu sót. Chúng em kính mong Q thầy cơ, các chun gia, những
người quan tâm đến đề tài, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè tiếp tục có những ý
kiến đóng góp, giúp đỡ để đề tài được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà nội, ngày 15 tháng 7 năm 2020
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Vân Anh

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i
MỤC LỤC ............................................................................................................. ii
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................ iv
DANH MỤC HÌNH.............................................................................................. v
DANH MỤC KÝ HIỆU TỪ VIẾT TẮT ............................................................. iv
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 2
1.1. Tổng quan về Lợn đen Định Hóa................................................................ 2
1.2. Tình hình nghiên cứu, bảo tồnvề gen quy định tính trạng sản xuất ở vật
ni ..................................................................................................................... 6
1.2.1. Nghiên cứu trên thế giới ....................................................................... 6
1.2.2.Nghiên cứu tại Việt Nam ........................................................................ 9
1.4. Kỹ thuật PCR .......................................................................................... 15
1.5. Phương pháp PCR – RFLP (Restriction Fragments Length
Polymorphism) ................................................................................................. 17
CHƯƠNG 2 MỤC TIÊU – NỘI DUNG – VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ................................................................................................... 20
2.1. Mục tiêu ..................................................................................................... 20
2.1.1. Mục tiêu tổng quát .............................................................................. 20
2.1.2. Mục tiêu cụ thể .................................................................................... 20
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 20
2.1.4. Thời gian nghiên cứu .......................................................................... 20
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 20
2.3. Vật liệu, hóa chất nghiên cứu.................................................................... 21
2.4. Phương pháp nghiên cứu đa hình gen ....................................................... 21
2.4.1. Phương pháp lấy mẫu ......................................................................... 21

2.4.2. Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mô tai ................................. 21
ii


2.4.3. Phương pháp nhân bản đoạn gen PIT1 .............................................. 23
2.4.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR .............................................. 24
2.4.5. Giải trình tự nucleotide....................................................................... 25
2.4.6. Phương pháp PCR – RFLP................................................................. 25
2.4.7. Kiểm tra sản phẩm bằng phương pháp điện di trên gel agarose ....... 26
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 27
3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số ............................................................... 27
3.2. Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi của cặp mồi PIT1_F/R .......................... 28
3.3. Kết quả nhân bản và tinh sạch đoạn gen PIT1 .......................................... 30
3.3.1. Kết quả nhân bản đoạn gen PIT1 bằng phương pháp PCR ............... 30
3.3.2. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp thơi gel ........... 32
3.4. Kết quả giải trình tự nucleotide đoạn gen PIT1 của Lợn đen Định Hóa .. 32
3.4.1. So sánh trình tự đoạn gen PIT1 với các trình tự gen đã công bố trên
ngân hàng gen quốc tế NCBI ........................................................................ 34
3.4.2. Kết quả xây dựng cây quan hệ di truyền dựa trên trình tự đoạn gen
PIT1 ............................................................................................................... 36
3.5. Kết quả phân tích đa hình di truyền đoạn gen PIT1 của giống Lợn đen
Định Hóa .......................................................................................................... 37
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN – TỒN TẠI – KIẾN NGHỊ ................................... 40
4.1. Kết luận ..................................................................................................... 40
4.2. Tồn tại ....................................................................................................... 40
4.3. Kiến nghị ................................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 41

iii

DANH MỤC KÝ HIỆU TỪ VIẾT TẮT
Các chữ
viết tắt
ATP
bp

Nghĩa tiếng Anh
Adenosin triphosphat

Phân tử mang năng lượng

Base pair

Cặp base
Cộng sự

cs
DNA (DNA) Deoxyribonucleic acid
dNTP

Nghĩa tiếng Việt

Axit deoxyribonucleic

Deoxyribonucleotide triphosphate

Deoxyribonucleotid
triphosphate

Foward-Primer

Mồi xuôi

kb

Kilobase (1000 base)

1000 cặp base

µl

Microlit

F-Primer

mRNA
NAD(P)H
NCBI

PCR
RFLP

Messenger RNA

ARN thơng tin

Nicotinamide adenine dinucleotide

Nicotinamide adenine

phosphate

dinucleotide phosphate

National Center for Biotechnology

Trung tâm Quốc gia về Thông

Information

tin Công nghệ sinh học

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi polymerase

Restriction fragment length

Phân tích đa hình trình tự DNA

polymorphism

RNA

Ribonucleic acid

Axit ribonucleic

rRNA

Ribosomal RNA

ARN ribosome

Room temperature

Nhiệt độ phịng

Reverse primer

Mồi ngược

TAE

Tris-Acetate-EDTA

Tris-Acetate-EDTA

tRNA

Transfer RNA

ARN vận chuyển

UV

Untraviolet

Tia cực tím

V/p

v/p

Vịng / phút

Qualified Teacher Learning and Skills

locus

RT
R-Primer

QLTs

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR để nhân bản đoạn gen PIT1 .................... 23
Bảng 3.1. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen PIT1 của Lợn đen Định Hóa với các
trình tự tương đồng trên ngân hàng gen quốc tế NCBI....................................... 34

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình dạng đặc điểm của Lợn đen Định Hóa ......................................... 3
Hình 3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô tai .................................. 27
Hình 3.2. Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi của cặp mồi PIT1_F/R .................... 29
Hình 3.3. Kết quả nhân bản đoạn gen PIT1 ở các cá thể Lợn đen Định Hóa ..... 31
Hình 3.4. Trình tự đoạn gen PIT1 ở Lợn đen Định Hóa ..................................... 33

Hình 3.5. So sánh trình tự sai khác nucleotide của đoạn gen PIT1 ở Lợn đen
Định Hóa với 03 trình tự trên ngân hàng gen quốc tế NCBI .............................. 36
Hình 3.6. Kết quả cây quan hệ di truyền giữa Lợn đen Định Hóa và 03 lồi trên
ngân hàng gen quốc tế NCBI .............................................................................. 37
Hình 3.7. Trình tự và vị trí nhận biết củaenzym cắt giới hạn đối với đoạn gen
PIT1 ..................................................................................................................... 39

v


ĐẶT VẤN ĐỀ
Chăn nuôi luôn là một ngành kinh tế nông nghiệp quan trọng. Hiệu quả
của ngành chăn nuôi lợn phụ thuộc rất nhiều vào tốc độ tăng trọng, sản lượng
thịt và khả năng sinh sản. Trước nhu cầu của thị trường, các nhà khoa học đã
chú ý chọn lọc giống vật nuôi để nâng cao chất lượng thịt tỷ lệ nạc, độ mềm,
màu sắc, và độ ngọt của thịt cũng như khả năng sinh sản. Vì vậy, giống Lợn đen
Định Hóa là lồi đang rất được quan tâm, đây là giống lợn bản địa của vùng
Định Hóa, tỉnh Thái Nguyên.
Ngày nay, với sự phát triển của các kỹ thuật hiện đại các nhà nghiên cứu đã
chọn lọc giống vật nuôi dựa vào các chỉ thị phân tử, tăng khả năng chính xác, rút
ngắn thời gian và nâng cao hiệu quả chọn lọc. Trong đó, kỹ thuật RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphism) là một công cụ quan trọng trong
việc lập bản đồ gen, xác định nguy cơ mắc bệnh và thử nghiệm quan hệ huyết
thống, là một marker có tính chất đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng
hợp và dị hợp. Trong tương lai, nhiều nhà chọn giống cho rằng kỹ thuật này sẽ
giữ một vai trò chủ đạo trong công tác chọn giống vật nuôi.
Một trong số các gen đã được nhà khoa học quan tâm nghiên cứu khá
nhiều là gen PIT1, gen mã hóa nhân tố phiên mã chuyên biệt tuyến yên
(pituitary-specific transcription factor), điều hòa sự phiên mã hormone tăng
trưởng, prolactin và thyrotropin subunit β. Gen PIT1 nằm trên nhiễm sắc thể

(NST) 13 củalợn, gen PIT1 có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của lợn do
liên quan đến mức độ tuần hoàn của hormone sinh trưởng (growth hormone,
GH) trong máu, thông qua mối tương quan dương ý nghĩa giữa PIT1-alpha
mRNA và nồng độ GH trong huyết tương. Từ đó, có thể thấy ảnh hưởng quan
trọng của gen PIT1 đến tốc độ sinh trưởng và đặc tính thịt ở lợn, gen PIT1 có thể
được dùng như marker trong việc chọn giống. Chính vì thế, việc nghiên cứu:
“Phân tích đa hình di truyền gen PIT1 của Lợn đen Định Hóa bằng phương
pháp PCR-RFLP” được thực hiện, nhằm mục đích xác định kiểu gen PIT1 trên
từng cá thể lợn giống, tìm sự liên quan giữa kiểu gen PIT1 với khảnăng sinh
trưởng và chất lượng thịt và bảo tồn được nguồn gen quý hiếm, đang dần bị
tuyệt chủng.
1


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về Lợn đen Định Hóa
Nguồn gốc
Định Hóa là một huyện miền núi thuộc tỉnh Thái Nguyên, Việt Nam, đã
và đang sở hữu một nguồn gen vật nuôi bản địa quý hiếm là giống Lợn đen.
Giống Lợn đen Định Hóa có nguồn gốc từ một giống lợn địa phương của vùng
núi Định Hóa. Do điều kiện địa lý, đồi núi cao hiểm trở, việc thơng thương có
nhiều hạn chế, người dân ni lợn ở vùng núi huyện Định Hóa, Tỉnh Thái
Nguyên chỉ giao dịch mua bán lợn quanh huyện nên việc pha tạp với các giống
lợn nhập ngoại và lợn nội khác của vùng đồng bằng hầu như khơng thể thực
hiện được. Chính vì vậy, giống Lợn đen Định Hóa đến nay vẫn giữ được độ
thuần chủng nhất định.
Lý do giống Lợn đen Định Hóa vẫn chưa bị tuyệt chủng là vì chúng rất dễ
nuôi, phàm ăn, ăn khỏe, ăn bất cứ loại thức ăn nào kể cả thức ăn khơng có chất
dinh dưỡng, chống chịu bệnh tật rất tốt: hầu như không bị mắc bệnh kể cả nuôi

trong điều kiện hoang vu sơ đẳng, mất vệ sinh và dân trí hiểu biết về chăn ni
lợn cịn lạc hậu, khơng có sự xâm nhập của các giống lợn khác và đặc biệt chất
lượng thịt thơm ngon, đã thực sự trở thành thịt lợn đặc sản nên giá bán khá đắt,
dẫn đến hiệu quả cao. Với những ưu điểm đó, giống Lợn đen Định Hóa vẫn là
nguồn cung cấp thịt lợn chủ yếu cho vùng núi cao hiểm trở này nên Lợn đen
Định Hóa vẫn được duy trì ni và chưa bị tuyệt chủng.
Đặc điểm nhận dạng
Lợn đen Định Hóa là giống lợn bản địa thuộc vùng núi Định Hóa, tỉnh Thái
Nguyên đa phần có màu lông đen tuyền, lưng hơi võng, bụng sệ, mõm dài, bốn
chân trắng. Đặc điểm lông da của lợn đen Định Hóa là khá đồng nhất, xương nhỏ,
thể trạng rắn chắc, thích nghi với điều kiện địa hình ni thả rông trên rừng núi.

2


Hình 1.1. Hình dạng đặc điểm của Lợn đen Định Hóa
Phân loại khoa học:
Giới (regnum)

: Animalia

Ngành (phylum)

: Chordata

Lớp (class)

: Mammalia

Bộ (ordo)

: Artiodactyla

Họ (familia)

: Suidae

Chi (genus)

: Sus

Loài (species)

: Sus domesticus

Danh pháp ba phần

: S.scrofa x S.domesticus (Linnaeus, 1758).

Đặc điểm cấu tạo
Lợn có tính chịu đựng kham khổ cao, có khả năng chịu đựng bệnh tật rất
tốt. Thức ăn chủ yếu là tận dụng các phế phụ phẩm nông nghiệp, các loại thức ăn
thơ xanh (mía cây, bẹ chuối, cây chuối, thân cây ngô non, rau muống, bèo tây, các
loại cỏ, các loại quả xanh…), thức ăn nghèo dinh dưỡng và tính chống chịu các
bệnh tật nhiệt đới tốt, phù hợp với phương thức chăn ni ở những vùng kinh tế
khó khăn. Năng suất sản xuất thịt ở mức trung bình, chất lượng thịt thơm ngon
được người dân ưa chuộng.

3

Sinh sản
Lợn đen Định Hóa có khả năng sinh sản ở mức trung bình, đẻ ít con và
sinh trưởng chậm. Chính người dân địa phương đã để tình trạng giống Lợn đen
Định Hóa, giao phối cận thân dẫn đến tình trạng Lợn đen Định Hóa bị cận huyết
rất cao, dần có nguy cơ bị tuyệt chủng. Họ khơng hề ni lợn đực giống. Tất cả
con nái khi đến kỳ động dục đều được người chăn nuôi đi mượn những con lợn
đực ni thương phẩm, chưa bị thiến, kích cỡ khoảng 20 - 25 kg về làm giống.
Chính vì sự vậy mà hiện tượng giao phối cận huyết rất phổ biến nên chất lượng
Lợn đen Định Hóa nhiều khi khơng ổn định, có nguy cơ đi xuống.
Giá trị: Lợn có ngoại hình nhỏ, hướng sản xuất mỡ nạc, thịt nạc có màu đỏ, thịt
mỡ có màu trắng, da dầy và giịn, thịt có mùi thơm ngon.
Lợi ích đến sức khỏe con người
Chứa nhiều chất dinh dưỡng cần thiết
Hàm lượng protein của thịt nạc, nấu chín là khoảng 26% trọng lượng tươi.
Khi khơ, hàm lượng protein của thịt lợn nạc có thể lên tới 89% làm cho nó trở
thành một trong những nguồn protein giàu dinh dưỡng nhất.
Thực phẩm này cũng chứa tất cả chín axit amin thiết yếu cần thiết cho sự
tăng trưởng và phát triển cơ thể của bạn.
Vì vậy, ăn thịt lợn hoặc các loại thịt khác có thể đặc biệt có lợi cho người
sau phẫu thuật, vận động viên, người tập thể hình hoặc những người cần phát
triển về cơ bắp. Thịt lợn là một nguồn thức ăn phong phú có chứa nhiều vitamin
và chất khống bao gồm cả thiamine. Không giống các loại thịt đỏ khác, chẳng
hạn như thịt bị, thịt trâu, thì thịt lợn đặc biệt chứa nhiều thiamine – một trong
nhóm chất vitamin B có vai trò thiết yếu trong cơ thể.
Chứa nhiều vitamin và khống chất
Trong thịt lợn có chứa nguồn phong phú của nhiều vitamin và khoáng chất, bao
gồm:

4

Thiamine: không giống như các loại thịt đỏ khác, chẳng hạn như thịt bị,
thịt trâu, thì thịt lợn đặc biệt chứa nhiều thiamine – một trong nhóm chất vitamin
B có vai trị thiết yếu trong cơ thể.
Kẽm: một khống chất quan trọng, cần thiết cho một bộ não khỏe mạnh
và hệ miễn dịch tốt.
Vitamin B12: hầu như chỉ tìm thấy trong thực phẩm có nguồn gốc từ động
vật, vitamin B12 rất quan trọng đối với sự hình thành tế bào máu và chức năng
bộ của não. Thiếu vitamin B12 có thể gây thiếu máu làm ảnh hưởng đến hệ thần
kinh.
Vitamin B6: đóng vai trị quan trọng đối với hình thành tế bào máu.
Da thịt lợn đen có chứa vitamin E, collagen và elastin nhiều hơn, nếu ăn
thường xuyên, có thể có vai trị trong việc phịng chống lão hóa.
Thịt lợn đen giàu vitamin A, có thể giúp duy trì chức năng bình thường
của thị lực và sức khỏe các tế bào biểu mơ, có lợi cho da.
Thịt lợn đen khá giàu chất sắt, protein và vitamin… đều là những chất mà
chế độ ăn của người hiện đại đang bị thiếu hoặc thấp. Đặc biệt, lượng chất béo
và cholesterol thấp hơn thịt lợn bình thường, giúp cơ thể cân bằng dinh dưỡng,
bổ sung khống chất, vitamin và protein.
Duy trì cơ bắp
Giống như hầu hết các loại thực phẩm động vật, thịt lợn là một nguồn
protein chất lượng cao tuyệt vời. Do tác động tuổi tác, duy trì cơ bắp là một cân
nhắc sức khỏe quan trọng.
Không tập thể dục và chế độ ăn uống hợp lý, khối lượng cơ bắp bị thối
hóa một cách tự nhiên khi bạn già đi - một thay đổi bất lợi có liên quan đến
nhiều vấn đề sức khỏe liên quan đến tuổi tác.
Trong những trường hợp nghiêm trọng nhất, suy giảm cơ bắp dẫn đến một
tình trạng mức độ khối lượng cơ rất thấp và giảm chất lượng cuộc sống. Hiện
tượng này là phổ biến nhất ở người lớn tuổi.

5


Hấp thụ đủ chất lượng protein chất lượng cao có thể đẩy lùi q trình
thối hóa cơ liên quan đến tuổi tác - làm giảm nguy cơ mắc bệnh sarcop.
Ăn thịt lợn - hoặc các thực phẩm giàu protein khác - là một cách tuyệt vời
để đảm bảo đủ lượng protein chất lượng cao có thể giúp duy trì khối lượng cơ
bắp.
Yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của Lợn
Các yếu tố bên trong: yếu tố di truyền là một trong những yếu tố có ý nghĩa
quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát dục của lợn. Quá trình sinh
trưởng tuân theo các quy luật sinh học, nhưng chịu ảnh hưởng của các giống lợn
khác nhau,do ảnh hưởng của các yếu tố nội tiết của hệ thống thần kinh. Quá trình
trao đổi chất trong cơ thể xảy ra dưới sự điều khiển của các hocmon. Vì hocmon
tham gia vào tất cả các quá trình trao đổi chất của tế bào giữ cân bằng các chất
trong máu.
Các yếu tố bên ngoài: các yếu tố bên ngoài ảnh hưởng đến quá trình sinh
trưởng và phát triển cơ thể lợn bao gồm dinh dưỡng, nhiệt độ và độ ẩm mơi
trường, ánh sáng và các yếu tố khác.
1.2. Tình hình nghiên cứu, bảo tồnvề gen quy định tính trạng sản xuất ở vật
nuôi
1.2.1. Nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới sự đa dạng sinh học thể hiện rõ nhất ở vùng nhiệt đới, vùng
này chỉ chiếm 15% diện tích bề mặt trái đất nhưng chiếm tới 78% tổng số lồi
sinh vật trên hành tinh. Cho đến nay đã có 90.000 loài sinh vật đã được xác định ở
vùng nhiệt đới, trong khi đó tồn bộ vùng ơn đới Bắc Mỹ và Châu Âu - Á chỉ có
50.000 lồi. Mỗi năm, trái đất mất đi khoảng 2.000 loài động vật, thực vật, nghĩa
là mất đi hơn 10% số loài đã được mô tả. Nếu như các thế kỷ trước đây bình qn
cứ vài chục năm mới có một lồi bị tuyệt chủng, thì những năm của thập niên

chín mươi, người ta tính ra rằng cứ bình qn 7 phút có một lồi bị tuyệt chủng,
đặc biệt các lồi có ích như chim, ếch ăn sâu bọ…Theo tính tốn gần đây căn cứ
trên tốc độ phá rừng, người ta dự đoán rằng sẽ khoảng từ 2-8% số cây và con trên
6


trái đất sẽ bị tuyệt chủng trong 25 năm tới. Theo đánh giá của các nhà khoa học,
trong các điểm nóng trên thế giới có tới 34.000 lồi đặc hữu. Tuy nhiên, theo đà
thu hẹp diện tích phân bố của các loài đặc hữu hiện nay, số loài sẽ giảm xuống
10% trong 20 năm tới. Tất cả điều đó sẽ mất đi tính đa dạng về di truyền. Nhiều
lồi động vật có ích, có nguồn gen q hiếm đang bị thu hẹp vùng phân bố, số
lượng cá thể và mất dần nguồn gen. Chẳng hạn như heo vòi, hươu sao, tê giác, bò
rừng….
Vai trò của đa dạng sinh học trong kinh tế du lịch rất lớn, nhất là du lịch
sinh thái. Trên thế giới hiện nay, xu hướng du lịch sinh thái đang phát triển mạnh
thông qua việc tham quan các Vườn Quốc gia và các khu bảo tồn. Các vườn Quốc
gia, các khu bảo tồn cho phép giữ gìn quần thể của các loài như bảo tồn các hệ sinh
thái sao cho chúng ở trạng thái không bị nhiễu loạn.
Nguồn gen giống vật nuôi là sản phẩm vật thể do con người sáng tạo trên
cơ sở các hoạt động thuần hóa, chọn lọc, cải tạo động vật có nguồn gốc hoang dã.
Các giống vật nuôi song hành cùng lịch sử phát triển của cộng đồng mỗi dân tộc
và mỗi quốc gia. Gắn liền với những biến đổi của điều kiện kinh tế xã hội trong
tiến trình văn minh của con người, các giống vật nuôi cũng biến đổi theo, chúng
ra đời, tồn tại rồi biến mất gắn với nhu cầu của con người về sản phẩm chăn nuôi
trong đời sống. Theo thông báo của tổ chức Nông nghiệp và lương thực thế giới
(FAO) cho thấy hiện nay có 1.350 giống vật nuôi đang phải đối mặt với nguy cơ
biến mất hoàn toàn. Trong những năm qua, tổ chức FAO đã giúp 170 quốc gia
trên thế giới thu thập các số liệu về khoảng 6.500 giống vật nuôi bao gồm trâu,
bò, lợn, gà, dê, thỏ, cừu, đà điểu, vịt….Báo cáo cũng cho thấy thực trạng của các
giống vật nuôi đang bị đe dọa trên thế giới ngày một tăng. Từ năm 1995 số giống

vật ni có vú có nguy cơ bị tuyệt chủng đã tăng từ 23% lên 35%. Một dấu hiệu
đáng báo động là số lượng lớn 2.225 giống vật ni sẽ có nguy cơ tuyệt chủng
trong vịng 2 thập kỷ tới.
Tổ chức Quốc tế về Bảo tồn thiên nhiên và tài nguyên thiên nhiên IUCN
định nghĩa bảo tồn nguồn tài nguyên di truyền động vật là cách quản lý của con
7


người đối với tài nguyên di truyền động vật nhằm đạt được lợi ích bền vững lớn
nhất cho thế hệ hiện tại, đồng thời duy trì được tiềm năng của tài nguyên đó để
đáp ứng được nhu cầu và mong muốn của thế hệ tương lai.
Nguồn gen động vật đang biến mất nhanh chóng trên tồn thế giới, trong
vịng 15 năm qua 300 trong số 6.000 giống xác định (nguồn www.fao.org/DADIS) đã bị tuyệt chủng và trung bình khoảng 1-2 giống biến mất mỗi tuần. Các
nước đã, đang xây dựng và thực hiện một chiến lược toàn cầu cho việc quản lý
các nguồn tài nguyên di truyền động vật. Trong nỗ lực quốc tế bảo tồn và phát
triển nguồn gen động vật, nâng cao nhận thức về vai trò và giá trị của các nguồn
gen động vật, cung cấp cơ sở khoa học cho việc thiết lập các chính sách quốc gia,
khu vực và toàn cầu, chiến lược và hành động là rất quan trọng. Có hai phương
pháp bảo tồn nguồn gen gồm:Bảo tồn nguyên vị “in situ” và bảo tồn chuyển vị
“ex situ” chúng bổ trợ cho nhau, để bảo tồn một giống vật nuôi tốt nhất là đồng
thời cả hai phương pháp nêu trên.
Giống vật ni có vai trị rất quan trọng đối với lồi người trong việc cung
cấp thực phẩm (thịt, trứng, sữa, chất đốt, len, dạ, dược phẩm, sức kéo…) trong
canh tác cây trồng tạo việc làm cho hàng tỉ người trên thế giới. Trong khi đó nguy
cơ tuyệt chủng của các giống vật ni là khá cao. Sự đe dọa lớn nhất đối với tính
đa dạng của vật nuôi là việc xuất khẩu các giống gia súc, gia cầm từ các nước
phát triển sang các nước đang phát triển, điều này đẫn đến việc lai tạo hoặc thậm
chí thay thế các giống bản địa. Ở các nước đang phát triển nguồn giống nhập từ
các nước phát triển vẫn được xem là các giống có năng suất cao hơn và được ưu
tiên lựa chọn trong sản xuất vì hiệu quả kinh tế mà chúng mang lại. Tuy nhiên các

giống này chúng thích nghi tốt với điều kiện khí hậu của những nước xuất khẩu
chúng, nhưng sẽ gặp phải khó khăn khi đối mặt với điều khiện khí hậu khắc
nghiệt hơn ở các nước đang phát triển, từ đó sẽ làm giảm tính ổn định về di truyền
của giống. Ví dụ như các giống vật ni ở các nước thuộc vùng khí hậu ơn đới khi
được xuất khẩu sang các nước thuộc điều kiện khí hậu nhiệt thường khơng giữ
được tính năng sản xuất cả về số lượng cũng như chất lượng bằng khi chúng ở
8


nước xuất khẩu. Thông thường các giống vật nuôi được nhập khẩu về thường
đươc quan tâm, đầu tư nhiều hơn trong khi đó ít để ý các giống bản địa điều này
vơ tình làm biến mất các giống vật ni bản địa năng suất thấp. Trong khi đó sự
thích nghi của giống mới nhập về chưa ổn định, chưa phát huy được đăc tính di
truyền của giống, xu hướng này khơng chỉ dẫn tới sự thối hóa của giống nhập về
mà còn làm biến mất các giống bản địa đang có sẵn.
Ý thức được những tác động tiêu cực của con người lên tính đa dạng sinh
học, nhiều nhà khoa học, các tổ chức quốc tế đã thống nhất tìm những giải pháp
nhằm bảo vệ môi trường sống, cứu lấy trái đất. Sau Hội nghị thượng đỉnh đầu tiên
về môi trường do Liên Hợp Quốc tổ chức tại Thuỵ Điển, đến nay đã có nhiều hội
nghị thượng đỉnh họp bàn về tài nguyên, môi trường và đa dạng sinh học, như hội
nghị Kyoto tại Nhật Bản. Đặc biệt tại Rio De Janeiro (Barazil) vào tháng 6/1992
Liên hợp Quốc đã thông qua chương trình 21 - Chương trình hành động về bảo vệ
môi trường và đa dạng sinh học cho thế kỷ 21. Trong hội nghị này, tất cả các
nước tham dự đều ký vào công ước bảo tồn đa dạng sinh học trên tồn cầu.
Chương trình này là tạo hành lang pháp lý buộc tất cả các quốc gia trên thế giới
hợp tác với nhau để bảo vệ các loài, nơi cư trú và các nguồn gen, chuyển sang các
phương thức sử dụng tài nguyên thiên nhiên bền vững và tiến hành những đều
chỉnh cần thiết về chính sách kinh tế, quản lý của từng Quốc gia.
1.2.2.Nghiên cứu tại Việt Nam
Việt Nam là một quốc gia thuộc khu vực nhiệt đới, gió mùa có sự phong

phú đa dạng của nhiều loại động thực vật và các hệ sinh thái khác nhau. Việt Nam
được xếp hạng thứ 16 trên thế giới về sự đa dạng tài nguyên sinh vật và là một
trong 10 trung tâm đa dạng sinh học phong phú nhất thế giới, được Liên hợp quốc
đánh giá cao trong việc thực hiện mục tiêu thiên niên kỷ nhờ những thành công
trong lĩnh vực nông nghiệp, lương thực. Đến nay, khoảng 49.200 loài sinh vật đã
được xác định gồm 7.500 loài/chủng vi sinh vật; 20.000 loài thực vật trên cạn và
dưới nước; 10.500 loài động vật trên cạn; 2.000 loài động vật không xương sống
và cá nước ngọt; trên 11.000 loài sinh vật biển. Tuy nhiên, sự đa dạng tài nguyên
9


thiên nhiên nói trên đang bị đe dọa nghiêm trọng do việc khai thác bừa bãi và
thiếu ý thức. Thiên tai, thói quen canh tác lạc hậu, sự gia tăng dân số và đơ thị
hóa, sự phát triển của các ngành kinh tế đã và đang có những ảnh hưởng khơng
tích cực tới các hệ sinh thái. Nạn khai thác và chặt phá rừng bừa bãi, sự biến đổi
của khí hậu dưới tác động của xu hướng cơng nghiệp hóa làm mất sự cân bằng
của các hệ sinh thái, nguồn tài ngun bị xói mịn nghiêm trọng, nhiều lồi sinh
vật đã bị tiệt chủng, một số loài khác đang dần bị biến mất. Hơn thế, hiện nay
chúng ta chưa xác định được thứ tự ưu tiên đối tượng bảo tồn nguồn gen. Thậm
chí, trong một số đề án, nhiệm vụ đối tượng bảo tồn còn dàn trải và chưa xác định
được. Nhiều nguồn gen đang lưu giữ, bảo tồn không đủ căn cứ để được xếp ưu
tiên. Hiện cũng chưa có chương trình, dự án điều tra, kiểm tra chính xác tiềm
năng thực sự và thực tế xói mịn về nguồn gen sinh vật Việt Nam. Chúng ta cũng
thiếu các nghiên cứu cơ bản để cải tiến phương pháp lưu giữ, bảo tồn cũng như
việc sử dụng, khai thác và phát triển nguồn gen còn nhiều hạn chế (do dữ liệu
chưa đánh giá đầy đủ, thông tin giá trị nguồn gen chưa sẵn có để chia sẻ cho
người sử dụng).
Từ năm 1990 chúng ta đã khởi động chương trình bảo tồn nguồn gen vật
nuôi Việt Nam, các kết quả trước đó cho thấy chúng ta đã mất đi ít nhất 8 giống
vật nuôi khá nổi tiếng như: lợn Ỉ mỡ, lợn trắng Phú Khánh, lợn Thuộc Nhiêu, lợn

lang Sơn Vi, lợn lang hồng Hà Bắc, lợn cỏ NghệAn, gà Văn Phú… Cùng với sự
mở cửa với thế giới, các giống vật nuôi ngoại được nhập ồ ạt, phong trào đổi mới
giống vật nuôi được nhân rộng là những mối đe dọa đến nguồn gen vật ni bản
địa. Trong khi đó các địa phương lại không đủ sức để phát hiện, giữ lại các giống
vật nuôi quý và đặc hữu tại các địa phương. Hiện nay Việt Nam có khoảng 100
giống, dịng vật ni bản địa, một nửa trong số đó vẫn đóng vai trị quan trọng
trong cung cấp thực phẩm, sức kéo…Một số trong các giống, dịng vật ni đó có
số lượng ít được ni nằm rải rác ở vùng núi cao, vùng sâu vùng xa nơi mà các
cộng đồng dân tộc thiểu số đang sinh sống. Những năm gần đây việc khai thác
nguồn gen vật nuôi bản địa từng bước được thực hiện, các giống vật nuôi hiếm
hoi của cộng đồng người dân tộc thiểu số đã được chú ý đầu tư phát triển. Lý do

10


chính là thị hiếu của người tiêu dùng vì vậy các giống vật ni bản địa đã mang
lại lợi ích kinh tế cho người chăn nuôi cao hơn so với giống vật ni nhập khẩu.
Trước thực trạng đó, bảo vệ tài ngun thiên nhiên, đảm bảo duy trì được
tính đa dạng sinh học là những tiền đề cần thiết về tài nguyên sinh học phục vụ
cho công tác nghiên cứu khoa học, hướng tới sự phát triển bền vững nền nông
nghiệp hiện tại cũng như trong tương lai đang là nhiệm vụ được đưa lên hàng đầu.
Để ngăn ngừa sự suy thoái đa dạng sinh học, Việt Nam đã tiến hành công tác bảo
tồn đa dạng sinh học khá sớm. Hai hình thức bảo tồn da dạng sinh học phổ biến
được áp dụng ở Việt Nam là: bảo tồn nguyên vị (Insitu conservation) và bảo tồn
chuyển vị (Exsitu conservation).
Bảo tồn nguyên vị bao gồm các phương pháp và công cụ nhằm mục đích
bảo vệ các lồi, các chủng và các sinh cảnh, các hệ sinh thái trong điều kiện tự
nhiên. Tuỳ theo đối tượng bảo tồn để áp dụng các hình thức quản lý thích hợp.
Thơng thường bảo tồn ngun vị được thực hiện bằng cách thành lập các khu bảo
tồn và đề xuất các biện pháp quản lý phù hợp.

Bảo tồn chuyển vị là hình thức bảo tồn chủ yếu ở Việt Nam trong thời gian
vừa qua. Kết quả của phương pháp bảo tồn này thể hiện rõ nhất là xây dựng và
đưa vào hoạt động một hệ thống rừng đặc dụng. Bảo tồn chuyển vị bao gồm các
vườn thực vật, vườn động vật, các bể nuôi thuỷ hải sản, các bộ sưu tập vi sinh vật,
các bảo tàng, các ngân hàng hạt giống, bộ sưu tập các chất mầm, mơ cấy... Các
biện pháp gồm di dời các lồi cây, con và các vi sinh vật ra khỏi môi trường sống
tự nhiên của chúng. Mục đích của việc di dời này là để nhân giống, lưu giữ, nhân
nuôi vô tính hay cứu hộ trong trường hợp; (i) Nơi sinh sống bị suy thối hay huỷ
hoại khơng thể lưu giữ lâu dài các lồi nói trên; (ii) Dùng để làm vật liệu cho
nghiên cứu, thực nghiệm và phát triển sản phẩm mới, để nâng cao kiến thức cho
cộng đồng.
Việc UBND tỉnh Thái Nguyên ra Quyết định 2150/QĐ-UBND ngày
08/10/2013 là một chủ trương sáng suốt, kịp thời để bảo tồn nguồn gen cây, con
giống trên địa bàn tỉnh trong đó có nhiệm vụ bảo tồn nguồn gen lợn đen Định Hóa
mà trước hết tiến hành các nghiên cứu bảo tồn, xác minh nguồn gốc giống để
11


đăng ký nguồn gen, tạo điều kiện đăng ký thương hiệu lợn đen Định Hóa sau này.
Ngồi ra đây là cơ hội để lưu giữ nguồn nguyên liệu cho nhu cầu sản xuất và tiêu
dùng trong tương lai, là vật liệu quý cho công tác đào tạo và nghiên cứu khoa học
về lĩnh vực chọn giống, di truyền, miễn dich…
1.3. Giới thiệu về gen PIT1 và đa hình gen PIT1
1.3.1. Đặc điểm về gen PIT1
Gen là một đơn vị vật chất di truyền có chức năng nhỏ bé nhất. Gen chứa
đựng các thơng cần thiết cho việc hình thành, phát triển và hoạt động của một cá
thể. Gen được hiểu giống như một cơng thức nấu ăn trong đó có chứa tất cả các
thông tin cần thiết để tạo ra một món ăn nào đó. Mỗi gen sẽ có hai bản sao, một
đến từ bố và một đến từ mẹ. Trên nhiễm sắc thể, một gen thường có một vị trí xác
định và liên kết với các vùng điều hịa phiên mã và các vùng chức năng khác để

đảm bảo và điều khiển hoạt động của gen. Ở lợn, bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n =
38.
Gen PIT1 ở lợn nằm trên nhiễm sắc thể 13, tại vị trí QTLs có liên quan tới
tốc độ sinh trưởng và lượng mỡ thân thịt (carcass fatness). Gen PIT1 dài 19.723
bp ( kích thước phân tử mARN là
1518bp.
Gen PIT1 là gen mã hóa nhân tố phiên mã chuyên biệt tuyến
yên (pituitary-specific transcription factor), mã hóa cho các protein đóng vai trị
quan trọng trong q trình phát triển của cơ thể và điều hịa sự phiên mã các
hóoc mơn sinh trưởng như GH, prolactin, TSH-β và GHRH ở mức độ mRNA ở
một số động vật, và nồng độ GH trong huyết tương, giữa tính đa hình gen PIT1
và tỷ lệ mỡ trong thân thịt. Ở gà, gen PIT1 nằm trên nhiễm sắc thể số 1 (GGA1),
kích thước phân tử 14 kb gồm 7 exon và 6 intron. Ở bò, gen PIT1 nằm trên
nhiễm sắc thể số 1, giữa gen TGLA57 và gen RM95, trọng lượng phân tử
khoảng 33 kDa, bao gồm 6 exon, mã hóa cho chuỗi polypeptide gồm 291 axit
amin [39].
Yu và cs (1994) nghiên cứu nhân bản đoạn gen PIT1 ở lợn có kích thước
1745bp, đoạn ADN được nhân bản kéo dài từ vùng intron 4 đến vùng 3’UTR.

12


1.3.2. Đa hình gen PIT1
Đa hình là sự xảy ra hai hay nhiều dạng của cùng một tính trạng. Sự đa
hình ADN là những biến đổi trong trình tự ADN của một cá thể, sự biến đổi có
thể hay khơng thể ảnh hưởng lên kiểu hình thường được phát hiện qua nhiều
phương pháp sinh học phân tử khác nhau. Những biến đổi được phát hiện xem
như một marker đặc hiệu cho biến đổi đó, nghĩa là một cá thể có cùng sự đa hình
đó, sẽ có biểu hiện một vài đặc điểm tương tự. Các marker ADN được thiết lập
nhằm phát hiện sự đa hình ADN của từng cá thể. Sự đa hình này sẽ được chọn là

marker cho những biểu hiện tính trạng. Vì thế, trong nơng nghiệp người ta
thường sử dụng chúng trong công tác chọn tạo giống, chọn các đối tượng mang
tính trạng tốt. Có thể chia thành các nhóm chính sau: các marker cổ điển RFLP
và phân tích ADN ty thể, các ADN marker dựa vào PCR, các marker dựa vào
phương pháp lai, các marker dựa vào giải trình tự.
Đa hình gen PIT1 được nghiên cứu lần đầu tiên bởi Yu và cs (1994). Hiện
nay nhiều nghiên cứu đa hình di truyền gen PIT1 đã được nghiên cứu ở nhiều
đối tượng vật nuôi khác nhau như: lợn, gà, dê, khỉ, cừu, trâu, … gen quy định
tính trạng chất lượng thịt, tốc độ tăng trọng…
Yu và cs (1995)nhân đoạn ADN từ vùng cuối exon 3 – intron 3 – đầu
exon 4 của gen PIT1 ở lợn. Sử dụng enzym MspI phân tích đa hình gen của
lợnđược phân tích bằng phương pháp PCR – RFLP sử dụng enzyme MspI
vàTaqI để kiểm tra với 120 ADN từ mẫu máu lợn và 10 ADN từ mẫu lông cho
kết quả lợn mang gen DD có độ dày mỡ lưng cao nhất so với hai kiểu gen CC,
CD trong quần thể lợn phân tích. Sử dụng enzym RsaI đa hình khơng có sự khác
biệt đối với tỷ lệ mỡ, nạc. Sản phẩm PCR có kích thước 2100bp sau khi được cắt
bởi enzymm MspI có các kiểu gen CC 20%, kiểu gen DD 34.2%, kiểu gen CD
45.8%. Sản phầm PCR được cắt bởi enzym RsaI có các kiểu gen EE 39.2%, kiểu
gen EF 52.3%, kiểu gen FF 8.5% [35].
Maurico và cs (2004)sử dụng enzym giới hạn phân tích đa hình gen PIT1,
GH, GHRH của lợn Landrance cho thấy gen PIT1 liên quan với độ dày mỡ lưng,
trong khi đó đa hình gen GH liên quan đến độ dày mỡ lưng tăng trọng trung
bình hàng ngày, đa hình gen GHRH liên quan đến tăng trọng trung bình hàng
ngày [20].

13


Jiang và cs (2004)cho thấy đột biến không đồng nghĩa trên exon 6 của gen
PIT1 có liên quan đến trọng lượng cơ thể gà ở tuần tuổi thứ 8. Tần số alen có sự

khác nhau đáng kể giữa kiểu hình gà thịt và gà đẻ trứng [18].
Chengyi Song và cs (2005)sử dụng enzym MspI phân tích đa hình trong
intron 3 của gen POU1F1 (PIT1) của lợn cho thấy lợn mang kiểu gen DD có
khối lượng cơ thể ở 180 ngày và tốc độ tăng trọng trung bình hàng ngày cao
nhất [14].
Nei và cs (2008) tại Trung Quốc, kết quả nghiên cứu trên quần thể gà lai
thể hệ F2 cho tần số kiểu gen AA chiếm rất cao (74,28%), tần số kiểu gen dị hợp
tử AB chiếm (23,28%), tần số kiểu gen BB chiếm khá thấp (2,44%). Tần số alen
A (85,92%) cao gấp nhiều lần tần số alen B (14,08%) [24].
Zahra Rodbari và cs (2011) tại Iran cũng nghiên cứu đa hình PIT1 – TaqI
trên giống gà thịt thương phẩm có tỉ lệ kiểu gen AA chiếm 61%, kiểu gen BB và
AB có tỷ lệ lần lượt là 32% và 7%. Từ đó cho thấy, tần số alen A cao hơn alen
B, tần số alen A chiếm 77% còn alen B chiếm 23%. Đa hình gen PIT1 – TaqI có
liên kết cao với trọng lượng cơ thể ở tuần thứ 6, trọng lượng thịt xẻ, trọng lượng
cánh, đùi, cơ lưng ở gà thương phẩm [8].
Lê Thị Thu Hà và cs (2013) sử dụng enzym TaqI trên Gà tàu vàng cho tỉ
lệ kiểu gen dị hợp tử cao nhất AB (52%), kiểu gen AA BB có tỉ lệ tương ứng
33% và 15%. Kết quả cho thấy alen A chiếm tỉ lệ cao hơn alen B, tần số alen A
chiếm 59% cao hơn tần số alen B chỉ có 41%. Alen B có ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng của gà tàu vàng nhóm gà mang kiểu gen BB và AB có khuynh hướng
tăng trưởng cao hơn nhóm gà mang kiểu gen đồng hợp tử AA [8].
Chung Anh Dũng và cs (2014) nhân bản đoạn ADN từ vùng intron 4 đến
vùng 3’UTR có kích thước 1745bp sau đó được cắt bởi enzym RsaI cho kiểu
gen AA (1 vạch 710bp), kiểu gen AB (3 vạch 710bp, 388bp và 322bp), kiểu gen
BB (2 vạch 388bp và 322bp). Kiểu gen AB và alen A xuất hiện phổ biến hơn
với tần suất là 0,72 và 0,63. Nhóm lợn có kiểu gen AA có tăng trọng trung bình
hằng ngày, độ dày mỡ lớn hơn nhóm có kiểu gen AB [1].
Chung Anh Dũng và cs (2014) nhân bản đoạn ADN từ vùng cuối exon 3 –
intron 3 – đầu exon 4 của gen PIT1, sản phẩm PCR có kích thước 21000bp sau

14


đó được cắt bởi enzym MspI. Các kiểu gen PIT1 với MspI gồm: kiểu gen CC (2
vạch 420bp và 1680bp), kiểu gen DD (3 vạch 420bp, 830bp và 850bp) và kiểu
gen CD (4 vạch 420bp, 830bp, 850bp và 1680bp). Kiểu gen DD và alen D
chiếm đa số trong quần thể với tần số lần lượt là 0,76 và 0,86. Các alen C và D
của gen PIT1 có ảnh hưởng ý nghĩa đến mức sinh trưởng/ngày, trong đó alen C
tác động tích cực lên sinh trưởng [1].
Vì vậy, gen PIT1 có thể coi là marker chỉ thị xác định độ dày mỡ và tỷ lệ
nạc ở động vật.
1.4.

Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là phương pháp được sử dụng

rộng rãi trong xét nghiệm DNA và sinh học phân tử để tạo ra nhiều bản sao của
một trình tự DNA cụ thể.
PCR là một kỹ thuật được sử dụng để khuếch đại một đoạn DNA hoặc sản
xuất và nhân bản nhiều mẫu DNA giống nhau theo cấp lũy thừa, tạo ra hàng
ngàn đến hàng triệu bản sao của một trình tự DNA nào đó từ một mẫu nhỏ ban
đầu hoặc là một bản sao duy nhất.
Nguyên tắc hoạt động của PCR
Phương pháp PCR dựa trên chu kỳ nhiệt, nghĩa là các chu kỳ tăng giảm
nhiệt độ trong phản ứng biến tính DNA và tái bản DNA. Đoạn mồi (là đoạn
DNA ngắn) mang các trình tự bổ sung với trình tự DNA mẫu và DNA
polymerase là những thành phần quan trọng cho phép khuếch đại một cách chọn
lọc và lặp lại. Khi quá trình PCR diễn ra, DNA mới được tạo ra từ DNA khuôn
ban đầu sẽ tiếp tục được sử dụng làm khuôn để tổng hợp phân tử DNA tiếp theo,
tạo thành chuỗi phản ứng dây chuyền khuếch đại theo cấp số nhân. Phản ứng

PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ liên tiếp, gồm 3 giai
đoạn:
Giai đoạn biến tính:

15


Ở nhiệt độ cao (94 – 95oC) các liên kết hidro của phân tử ADN bị đứt gãy,
phân tử ADN sợi đôi bị tách thành 2 sợi đơn. Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây
đến 1 phút.
Giai đoạn gắn mồi:
Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi) cho phép các
mồi bắt cặp với khuôn. Nhiệt độ gắn mồi thường nằm trong khoảng 40 – 70o C
phụ thuộc vào độ dài và tỷ lệ G – C của mồi. Thời gian gắn mồi kéo dài từ 30
giây đến 1 phút.
Giai đoạn tổng hợp:
Ở giai đoạn này, enzym ADN polymerase bám vào đầu 3’OH của mồi xúc
tác kéo dài chuỗi để hình thành nên sợi ADN mới bổ sung với sợi khuôn. Thời
gian tổng hợp phụ thuộc vào độ dài của đoạn ADN cần tổng hợp, thông thường là
30 giây đếm 1 phút. Nhiệt độ tối thiểu cho enzym hoạt động là 72oC.
Giai đoạn bảo quản:
Giai đoạn này thực hiện ở nhiệt độ 4 - 15°C trong một thời gian để bảo quản
ngắn hạn sản phẩm của phản ứng.
Yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật PCR
ADN khuôn mẫu
Enzyme
Mồi và nhiệt độ lai
Ảnh hưởng của các nucleotid
Môi trường phản ứng
Thời gian và số lượng chu kỳ của phản ứng PCR

Thiết bị và dụng cụ
Ứng dụng của kỹ thuật PCR
Dùng PCR có thể phân tích một lượng ADN rất nhỏ
PCR trong chuẩn đoán lâm sang
Dùng PCR để nhân số lượng ARN
Sử dụng PCR để so sánh các hệ gen khác nhau
16


1.5.

Phương pháp PCR – RFLP (Restriction Fragments Length
Polymorphism)
Trong sinh học phân tử, đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn, hay là RFLP

(thường đọc là "rif-lip"), là kỹ thuật khai thác những khác biệt trong trình tự
ADN. Trong phân tích RFLP, ADN mẫu được cắt thành các đoạn nhỏ bằng
cách sử dụng các enzyme cắt giới hạn, và sau đó các đoạn ADN nhỏ tạo thành
được phân tách dựa theo kích thước bằng kỹ thuật điện di trên gel. Mặc dù ngày
nay kỹ thuật này đã trở nên lỗi thời do bị thay thế bởi cơng nghệ giải trình tự,
RFLP là cơng nghệ nghiên cứu đa hình DNA đầu tiên đủ rẻ để có thể được ứng
dụng một cách rộng rãi. RFLP là công cụ quan trọng trong lập hồ sơ di truyền,
lập bản đồ hệ gen, định vị gen chịu trách nhiệm cho các rối loạn di truyền, xác
định nguy cơ mang bệnh, và xét nghiệm phả hệ.
Sau khi PCR ra đời, có hàng nghìn cơng trình nghiên cứu liên quan đến
PCR. Các nhà khoa học đã xây dựng thành công nhiều phương pháp khác nhau
ứng dụng trong di truyền phân tử dựa trên nguyên tắc của PCR. Những phương
pháp di truyền dựa trên nguyên tắc PCR là con số chưa có giới hạn.
Phương pháp PCR – RFLP: là phương pháp nghiên cứu đa hình chiều dài
các đoạn ADN cắt bởi các enzym giới hạn. Kỹ thuật này dựa trên đặc điểm của

các loại enzym giới hạn khác nhau, tạo nên các đoạn cắt ADN khác nhau phân
biệt bằng điện di đồ. Các đoạn cắt còn được gọi là các “dấu vân tay
(Fingerprinting)” đặc trưng cho từng phân tử ADN. Phương pháp này được sử
dụng để xác định sự khác biệt về cấu trúc gen quan tâm giữa các mẫu nghiên cứu.
Nguyên lý
Các mẫu nghiên cứu được tách chiết, tinh sạch ADN, rồi xử lý bằng hai
enzym giới hạn khác nhau. Mỗi enzym giới hạn sẽ nhận biết và cắt đặc hiệu ADN
ở những vị trí xác định. Do đó, các bộ gen có cấu trúc khác nhau tạo nên số lượng
đoạn cắt ADN khác nhau, và có thể có kích thước khác nhau. Ngược lại, những
bộ gen hồn tồn giống nhau tạo nên số lượng và kích thước các đoạn cắt ADN
giống nhau, có thể phát hiện nhờ điện di đồ.
17


Sau khi nhân đoạn ADN nhờ một cặp mồi đặc hiệu, sản phẩm PCR được
cắt bằng một hoặc một số enzym giới hạn. Sau khi phân tích các sản phẩm cắt
bằng enzym giới hạn, điện di trên gel có thể thấy được sự thay thế các bazơ nitơ
tại vị trí cắt trên ADN được nhân lên.Phương pháp này được áp dụng khá phổ
biến trên nhiều phịng thí nghiệm trên thế giới do phát hiện đa hình tương đối cao,
dễ tiến hành, chi phí thấp.
Việc sử dụng các RE có ý nghĩa quyết định trong sự phát triển của sinh học
phân tử Eukaryota. Chúng cho phép cắt nhỏ bộ gen khổng lồ của các sinh vật
Eukaryota. Các RE chủ yếu được sử dụng trong các phương pháp tạo dịng với
mục đích thu nhận một trình tự xác định với số lượng lớn. Ngồi ra chúng cịn
được dùng vào việc lập bản đồ giới hạn (restriction map), vào việc phân tích so
sánh bộ gen của các lồi khác nhau thơng qua kỹ thuật RFLP (Restriction
Fragments Length Polymorphism – đa hình kích thước của các đoạn giới hạn).
Ưu điểm
Không tốn kém.
Dễ thiết kế.

Áp dụng cho phân tích các đa hình đơn nucleotide.
Khơng u cầu đối với các công cụ thiết bị đắt tiền.
Không yêu cầu đào tạo chuyên sâu cho nhân viên phòng thí nghiệm.
Nhược điểm
Yêu cầu sinh ra một biến thể hoặc một vị trí thay đổi được enzyme giới
hạn nhận biết.
Một số enzyme giới hạn đắt tiền.
Không thể đạt được kiểu gen chính xác trong trường hợp có nhiều hơn
một nucleotide bị thay đổi trong trình tự enzyme giới hạn có thể nhận biết.
Yêu cầu số lượng mẫu tương đối lớn.
Thời gian dài từ khi bắt đầu đến khi hoàn thành phân tích.
Khơng thích hợp cho các nghiên cứu có thơng lượng cao các mẫu cần
phân tích.
18


PCR-RFLP là kỹ thuật rất phổ biến để xác định loài và sự khác biệt. Cho
đến gần đây, kỹ thuật ưu tiên để nhận dạng và phân biệt các loài vi khuẩn, các
lồi chim và động vật có vú.
Ứng dụng của phương pháp PCR – RFLP
Xác định đột biến gen gây bệnh thối hóa cơ tủy.
Xác định kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo.
Xét nghiệm đột biến gen.
Xác định tính trạng sữa, chất lượng thịt, mỡ nạc của giống lợn, dê…
Xác định phương pháp lấy dấu vân tay.
Xác định các mẫu được lấy ra từ các hiện trường vụ án để bắt tội phạm.
Xác định phụ hệ, lập bản đồ gen và phân tích bệnh di truyền.

19