Luận văn tốt nghiệp một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính pectin methylesterase từ aspergillus niger

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

VƯƠNG TỐ TRINH
MSSV 2060378

MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN
HOẠT TÍNH PECTIN METHYLESTERASE
TỪ ASPERGILLUS NIGER
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Mã ngành: 08

Người hướng dẫn
Ths. TRẦN THANH TRÚC

NĂM 2010


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

Trường Đại học Cần Thơ

LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan tồn bộ nội dung và số liệu được trình bày trong luận văn là cơng
trình nghiên cứu của tơi theo sự hướng dẫn của giáo viên.

Người viết

Vương Tố Trinh

Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHUD

Trang

i


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

Trường Đại học Cần Thơ

LỜI CẢM TẠ
Luận văn tốt nghiệp là kết quả sau hơn ba tháng nghiên cứu tại phịng thí nghiệm bộ
môn Công nghệ thực phẩm, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại
học Cần Thơ và đó cũng là sự đúc kết tất cả các kiến thức được học trong suốt 4 năm
qua. Tuy nhiên, để hoàn thành tốt luận văn khơng chỉ có sự nỗ lực của chính bản thân
mà cịn có sự giúp đỡ rất nhiều của thầy cô, người thân và bạn bè.
Con xin gửi đến ba mẹ là những người thân yêu nhất của con lịng biết ơn sâu sắc vì
tất cả những gì ba mẹ đã dành cho con.
Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Văn Mười và cơ Trần Thanh Trúc đã
tận tình hướng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện để tơi hồn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô của trường Đại học Cần Thơ đặc biệt là quý
thầy cô của bộ mơn Cơng nghệ thực phẩm đã tận tình truyền đạt kiến thức và rèn
luyện kỹ năng cho tôi trong suốt những năm qua.
Xin chân thành cảm ơn tất cả các bạn lớp Cơng nghệ thực phẩm khóa 32 và khóa 34
liên thơng trong thời gian qua đã ln quan tâm giúp đỡ, động viên, cổ vũ để tôi có thể
hồn thành khóa học cũng như hồn thành luận văn này.
Cuối cùng xin gởi đến q Thầy Cơ và tất cả các bạn lời chúc sức khỏe và thành công
trong cuộc sống.

Chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày 20 tháng 5 năm 2010
Sinh viên

Vương Tố Trinh

Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHUD

Trang

ii


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

Trường Đại học Cần Thơ

TÓM TẮT

Đề tài: “Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính pectinmethylesterase từ Aspergillus niger”,
được thực hiện nhằm khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến hoạt tính PME từ
nấm mốc Aspergillus niger. Các yếu tố mơi trường có ảnh hưởng đến hoạt tính PME như
nồng độ cơ chất, nhiệt độ tối thích, độ bền nhiệt, pH môi trường, cũng như nồng độ của NaCl
và CaCl2 đã được khảo sát.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, hằng số Michealis – Menten (Km) của PME là 1,092 g/L. PME
từ Aspergillus niger thể hiện hoạt tính cao nhất ở 400C, pH mơi trường 5,0 với sự có mặt của
NaCl

hay

CaCl2

làm

chất

hoạt

hóa.

Phương

trình

động

học

bậc

1:

ln(A/A0) = - 0,0082 t (với t: thời gian gia nhiệt, phút) có thể được ứng dụng để tốc độ vơ hoạt
enzyme PME ở nhiệt độ 600C.
Từ khóa: PME, NaCl, CaCl2, hằng số Michealis – Menten, phương trình động học bậc 1.

Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHUD

Trang

iii


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

Trường Đại học Cần Thơ

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN......................................................................................................................i
LỜI CẢM TẠ ...........................................................................................................................ii
TÓM TẮT ..............................................................................................................................iii
MỤC LỤC ..............................................................................................................................iv
DANH SÁCH HÌNH..............................................................................................................vii
DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................................viii
CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN...............................................................................................1

1.1

ĐẶT VẤN ĐỀ ...........................................................................................................1

1.2

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ......................................................................................1

CHƯƠNG 2
2.1

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ...........................................................................2

NẤM MỐC ASPERGILLUS ....................................................................................2

2.1.1

Giới thiệu chung về nấm mốc Aspergillus.........................................................2

2.1.2

Aspergillus niger................................................................................................3

2.2

PECTIN METHYLESTERASE ................................................................................3

2.2.1

Pectin methylesterase và hệ enzyme pectinase..................................................3

2.2.2

Cấu trúc của PME ..............................................................................................4

2.2.3

Đặc tính sinh lý, sinh hóa...................................................................................5

2.2.4

Kiểu phản ứng.................................................................................................... 6

2.2.5

Nguồn tổng hợp PME ........................................................................................7

2.2.6

Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme PME...................8

2.3

ĐỘNG HỌC ENZYME...........................................................................................11

2.3.1

Khái niệm enzyme và cấu tạo hóa học ............................................................11

2.3.2

Giới thiệu về phản ứng enzyme .......................................................................11

2.3.3

Động học phản ứng enzyme ............................................................................11

2.3.4

Động học sự vô hoạt enzyme...........................................................................13

2.4

MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA PME TRONG CHẾ BIẾN THỰC PHẨM...............14

2.4.1

Trích ly dịch quả ..............................................................................................15

2.4.2

Làm trong nước quả.........................................................................................15

2.4.3

Cải thiện cấu trúc .............................................................................................16

2.4.4

Một số ứng dụng khác .....................................................................................16

2.5

CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CĨ LIÊN QUAN................................................16

Ngành Cơng nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHUD

Trang

iv

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

CHƯƠNG 3
3.1

Trường Đại học Cần Thơ

PHƯƠNG TIỆN – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................18

PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ............................................................................18

3.1.1

Địa điểm, thời gian thí nghiệm ........................................................................18

3.1.2

Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................18

3.1.3

Dụng cụ, thiết bị...............................................................................................18

3.1.4

Hóa chất ...........................................................................................................18

3.2

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................................................................19

3.2.1

Phương pháp chuẩn bị mẫu..............................................................................19

3.2.2

Phương pháp thu thập và xử lý số liệu.............................................................19

3.3

PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM...............................................................19

3.3.1

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất pectin đến hoạt tính của

enzyme PME từ A.niger .................................................................................................. 19
3.3.2

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu sự biến đổi hoạt tính PME của nấm mốc

Aspergillus niger theo nhiệt độ .......................................................................................20
3.3.3

Thí nghiệm 3: Động học sự vơ hoạt của enzyme PME từ A.niger ..................22

3.3.4

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính PME của nấm

mốc Aspergillus niger. .................................................................................................... 23
3.3.5

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu sự thay đổi hoạt tính enzyme PME theo nồng độ

NaCl.

.........................................................................................................................25

3.3.6

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu sự biến đổi hoạt tính PME của nấm mốc A.niger

theo nồng độ CaCl2. ........................................................................................................26
CHƯƠNG 4
4.1

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 28

ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CƠ CHẤT (PECTIN) ĐẾN HOẠT TÍNH

ENZYME PME TỪ ASPERGILLUS NIGER......................................................................28
4.2

ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME PME .................29

4.3

XÁC ĐỊNH SỰ ỔN ĐỊNH NHIỆT CỦA ENZYME PME TỪ ASPERGILLUS

NIGER ................................................................................................................................. 30
4.4

ẢNH HƯỞNG CỦA pH ĐẾN SỰ ỔN ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME PME

TỪ ASPERGILLUS NIGER ................................................................................................33
4.5

ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ NaCl VÀ CaCl2 ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME

PME TỪ ASPERGILLUS NIGER .......................................................................................34
CHƯƠNG 5

KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ...........................................................................37

5.1

KẾT LUẬN..............................................................................................................37

5.2

ĐỀ NGHỊ .................................................................................................................37

Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHUD

Trang

v

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

Trường Đại học Cần Thơ

TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................... 38
PHỤ LỤC 1: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ......................................................................xi
PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ THỐNG KÊ ................................................................................xiv

Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHUD

Trang

vi


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1: Aspergillus niger..........................................................................................................2
Hình 2: Sự thủy phân liên kết methyl ester của pectin với xúc tác PME .................................. 4
Hình 3 : Cấu trúc của PME từ carrot .........................................................................................4
Hình 4: Cấu trúc bậc II của PME từ E. chrysanthemi (A), cà chua (B), và carrot (C) ..............5
Hình 5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 ............................................................................................20
Hình 6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 ............................................................................................21
Hình 7: Sơ đồ thí nghiệm 3......................................................................................................23
Hình 8: Sơ đồ thí nghiệm 4......................................................................................................24

Hình 9: Sơ đồ thí nghiệm 5......................................................................................................26
Hình 10: Ảnh hưởng của nồng độ pectin đến hoạt tính enzyme PME từ Aspergillus niger .. 29
Hình 11: Phương trình động học vơ hoạt enzyme PME từ Aspergillus niger ở pH 4,5, nhiệt
độ 60ºC..................................................................................................................................... 32

Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHUD

Trang vii


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Thông số động học Km của một số enzyme ..............................................................13
Bảng 2 : Hiệu quả xử lý nước táo và nước vải bằng chế phẩm enzyme pectinase..................15
Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ pectin (g/L) đến hoạt tính PME từ A.niger (U/mL)............28
Bảng 4: Sự thay đổi hoạt tính PME do ảnh hưởng của nhiệt độ..............................................30
Bảng 5: Kết quả đánh giá sự ổn định nhiệt của enzyme PME từ Aspergillus niger................31
Bảng 6: Ảnh hưởng của pH đến sự ổn định hoạt tính của enzyme PME từ A.niger ...............33
Bảng 7: Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính enzyme PME từ A.niger ......................34
Bảng 8: Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 đến hoạt tính enzyme PME từ A.niger .....................35

Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và SHUD

Trang viii


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

CHƯƠNG 1

Trường Đại học Cần Thơ

TỔNG QUAN

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, công nghệ sinh học ngày càng phát
triển mạnh mẽ. Với những thành tựu trong lĩnh vực khoa học ứng dụng, nghiên
cứu, phát minh cơng nghệ sinh học ngày càng khẳng định vai trị khoa học của
mình. Cơng nghệ enzyme cũng là một lĩnh vực không kém phần quan trọng trong
công nghệ sinh học.
Ngày nay, enzyme ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành cơng
nghiệp nói chung và cơng nghiệp thực phẩm nói riêng. Các chế phẩm enzyme phổ
biến như amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, glucoseoxydase… Trong
đó, pectin methylesterase là một enzyme quan trọng và được sử dụng phổ biến
trong công nghệ thực phẩm. Pectin methylesterase có thể được sản xuất từ thực vật
và vi sinh vật, Aspergillus là nguồn chủ yếu (Polizeli et al., 1991). Việc trích ly
enzyme pectin methylesterase (PME) từ Aspergillus niger (A.niger) cũng đã được
ưu tiên chọn lựa nhiều nhất do sản phẩm từ A.niger được Viện nghiên cứu thực
phẩm và thuốc của Mỹ (FDA) chứng nhận sản phẩm an tồn (GRAS) và chúng có
khả năng phát triển và sinh enzyme rất nhanh trên các cơ chất rẻ tiền.
PME có thể được tìm thấy ở rất nhiều thực vật, vi sinh vật. Tùy thuộc vào nguồn
gốc của PME, các thông số tối ưu cho hoạt động của enzyme này (pH, nhiệt độ tối
thích, các chất hoạt hóa của PME...) cũng thay đổi, đặc biệt là sự khác nhau về
phương thức hoạt động của PME. Do đó, để có thể ứng dụng enzyme PME từ
A.niger một cách hiệu quả nhất, bản chất cũng như điều kiện hoạt động tối thích
của enzyme cần phải được hiểu rõ.
Vì vậy, việc nghiên cứu để tìm hiểu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của

A.niger PME là rất cần thiết.
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, độ bền nhiệt, pH, nồng độ NaCl,
nồng độ CaCl2 đến hoạt tính của enzyme PME từ A.niger.

Ngành Cơng nghệ thực phẩm

Trang 1


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

CHƯƠNG 2

Trường Đại học Cần Thơ

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 NẤM MỐC ASPERGILLUS
2.1.1 Giới thiệu chung về nấm mốc Aspergillus
Nấm mốc Aspergillus đã được tìm ra vào năm 1729 bởi Micheli. Giống
Aspergillus đã được tìm ra trên 180 lồi và có vai trị quan trọng trong ngành nấm
sợi Ascomycetes. Mặc dù nó có nhiều loại gây bệnh cho con người như
Aspergillus fumigatus nhưng hầu hết đều có lợi và có vai trị quan trong trong công
nghiệp sản xuất enzyme đồng loại và khác loại. Một trong các loài được sử dụng
nhiều nhất là Aspergilllus niger, Aspergilllus oryzae chúng đã được FDA công
nhận là an tồn.
Aspergillus thuộc nhóm nấm bất tồn (Deuteromycetes hay Fungi Imperfecti),
cuống đính bào tử có đầu phình ra. Nhóm nấm bất tồn là những nấm sinh sản vơ
tính bằng bào tử bụi mang bởi những giá bào tử có hình dạng khác nhau xếp thành

chuổi (đính bào tử) ở đầu ngọn có cuống bào tử. Nấm Aspergillus cịn gọi là mốc
tương. Sợi nấm có vách ngăn, cuống mang bào tử bụi phồng lên ở ngọn. Các chuỗi
bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp mọi hướng. Bào tử bụi A.niger có màu đen
(Hình 1).

Hình 1: Aspergillus niger
Nguồn:

Ngành Cơng nghệ thực phẩm

Trang 2


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

Trường Đại học Cần Thơ

2.1.2 Aspergillus niger
Loại nấm mốc này thường thấy trong quá trình thu hoạch và bảo quản các loại thực
phẩm như đậu phộng, bắp, táo, cà chua, lê, và dưa (Pitt and Hocking, 1997).
A.niger sản xuất nhiều loại enzyme tác động trên phần homogalacturonan của phân
tử pectin. Chúng bao gồm pectin methylesterase và pectin acetylesterase
endopolygalacturonase, exopolygalacturonase…
A.niger thường được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp để sản xuất enzyme (như
a-galactosidases, lipases, protease, hemicellulase, cellulases và pectinases) và acid
hữu cơ. Ngay từ năm 1917, A.niger đã được sử dụng để sản xuất acid citric (Raper
and Fennel, 1965). Ngày nay, acid citric được sản xuất từ A.niger với sản lượng
khoảng 700.000 ÷ 1.000.000 tấn/năm. Khoảng 70% acid citric sản xuất được sử
dụng trong các loại thực phẩm và sản phẩm bia, phần còn lại thường được ứng
dụng trong ngành dược.

Pectinases từ nguồn nấm mốc, đặc biệt là A.niger, thường được sử dụng phổ biến
trong công nghệ chế biến nước quả, kế đến là cellulases và hemicellilases
(Kashyap et al., 2001). Các enzyme này thường được sử dụng trong sản xuất các
loại nước quả trong như nước táo, lê, nho,… và một lượng nhỏ sử dụng trong chế
biến các dạng nước quả có độ đục ổn định như nước chanh, nước mận.
Hệ enzyme pectinolytic từ A.niger có nhiều ứng dụng trong cơng nghiệp thực
phẩm. Tuy nhiên, các enzyme này thường ở dạng hỗn hợp, gây khó khăn cho việc
ứng dụng chúng để tác động các loại pectin công nghiệp, như trong các loại gel
thực phẩm. Do đó, ta phải nghiên cứu về hệ enzyme pectinase của A.niger.
2.2 PECTIN METHYLESTERASE
2.2.1 Pectin methylesterase và hệ enzyme pectinase
Pectinmethylesterase (PME) (pectin pectylhydrolase, EC 3.1.1.11) là enzyme
thuộc nhóm enzyme pectinase, xúc tác sự thủy phân các nhóm methyl ester.
Enzyme này cịn có tên khác là pectinesterase (PE). PME thường tấn cơng vào các
nhóm estermethyl của đơn vị galacturonate nằm kề đơn vị khơng bị ester hóa, phân
cắt các nhóm methoxyl (–OCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành
acid pectinic hoặc acid pectic và methanol (Hình 2). Hiệu suất thủy phân pectin
của enzyme này rất cao, có thể đạt 98%.
Những enzyme khác trong hệ pectinase là Polygalacturonase (PG) và Pectate lyase
(PL), chúng thủy phân các polymer pectin theo hình thức khác nhau. Hệ enzyme
pectinase được ứng dụng nhiều trong quá trình chế biến thực phẩm đặc biệt là khả

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 3


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

Trường Đại học Cần Thơ

năng làm trong nước quả. Việc kiểm soát hoạt động của enzyme này cũng có thể
điều chỉnh được độ nhớt của sản phẩm (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

Hình 2: Sự thủy phân liên kết methyl ester của pectin với xúc tác PME
Nguồn: Duvetter, 2007

2.2.2 Cấu trúc của PME
Cho đến hiện nay, các nghiên cứu bởi tia X đã làm sáng tỏ cấu trúc tinh thể của
PME vi khuẩn E. chrysanthemi (Jenkins et al., 2001) và PME carrot (Johansson et
al., 2002). Cấu trúc không gian 3 chiều cho PME cà chua cũng đã được xây dựng
(D'Avino et al., 2003). Tuy nhiên, cho đến hiện tại, chưa có cấu trúc tinh thể của
PME từ nấm mốc được xác định. Cả 3 loại PME từ vi khuẩn, carrot và khoai tây
đều được cho là có cấu trúc gấp nếp β- helix theo hướng phải, bao gồm 3 chuỗi βsheet song song, và có những đoạn dạng vịng được kéo ra từ lõi của vịng xoắn, nó
tạo ra một vùng giống như khe nứt (cấu trúc của PME carrot được chỉ ra trong hình
3a và 3b). Kiểu kiến trúc này gần giống như các enzyme pectinolytic khác. Nói
chung kiểu gấp lại của ba loại enzyme trên giống nhau, nhưng chúng khác nhau ở
chiều dài của đoạn vịng. Trong đó enzyme PME vi khuẩn có đoạn vịng dài hơn,
nói cách khác là nó tạo ra vết nứt sâu hơn.

Hình 3 : Cấu trúc của PME từ carrot
Nguồn: Johansson et al., 2002

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 4


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Sự sắp xếp các chuỗi của PME để lộ ra một số gốc amino acid. Khi enzyme tiếp
xúc với dung mơi thì các gốc này tập hợp lại thành bó và tạo nên vết nứt sâu ở bề
mặt (hình 3c).Vùng này tương ứng với trung tâm hoạt động của PME (Jenkins et
al., 2001; Johansson et al., 2002). Vết nứt này có thể được tạo nên bởi các gốc có
chứa vịng thơm, đặc trưng cho các liên kết của carbohydrate, cùng với 2 gốc
aspartate, đây là những gốc được cho là có hoạt tính xúc tác (Jenkins et al., 2001;
Johansson et al., 2002).
Carrot
Tomato

PME

PME

E. Chrysanthemi
PME

Hình 4: Cấu trúc bậc II của PME từ E. chrysanthemi (A), cà chua (B), và carrot (C)
Nguồn: D’Avino et al., 2003

2.2.3 Đặc tính sinh lý, sinh hóa
PME từ những nguồn khác nhau có những đặc trưng không giống nhau. Nhiều loại
PME khác nhau về phân tử khối, pI và hoạt tính sinh hóa được tìm thấy ở các thực
vật 2 lá mầm (Bordenave et al., 1996). PME là những enzyme có kích thước trung
bình và phân tử khối vào khoảng 25 ÷ 54 kDa (Benen et al., 2003). Điểm đẳng
điện của PME thay đổi từ 3,1 đối với enzyme từ nấm mốc đến 11 đối với PME cà
chua. Hầu hết PME chiết xuất từ thực vật có pI trung tính đến kiềm, chỉ một vài
trường hợp có PME có tính acid (Bordenave, 1996).

Ngành Cơng nghệ thực phẩm

Trang 5


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Việc đo lường hoạt tính đã chỉ ra có sự khác biệt giữa các loại PME lấy từ các bộ
phận khác nhau hoặc trong giai đoạn phát triển khác nhau (Bordenave và
Goldberg, 1993).
Nhìn chung, PME rất nhạy cảm đối với môi trường chứa ion và chịu tác động lớn
bởi pH. Hầu hết PME thực vật có pH tối ưu từ 6 ÷ 8, trong khi giá trị pH tối ưu của
PME vi sinh vật nằm trong khoảng từ 4 ÷ 9 (Bordenave, 1996). Giá trị pH tối thích
cho hoạt động của enzyme PME cà chua là 8,0 trong khi đó giá trị 4,5 là
phù hợp cho Aspergillus PME (Duvetter, 2006). PME thường được hoạt hóa bởi
các ion Ca2+ và Mg2+.
Hai nguồn được dùng sản xuất PME là từ thực vật (cà chua, cam, táo, cà rốt…) và
vi sinh vật (nấm mốc Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger…). Trong vi sinh
vật thì khơng có sự đa dạng lớn về PME ngoại trừ Erwinia chrysanthemi, một
PME duy nhất được tìm thấy trong tất cả các nghiên cứu (Benen et al., 2003).
2.2.4 Kiểu phản ứng
Phản ứng thủy phân pectin được thực hiện ở đơn vị galacturonic chứa ester bên
cạnh nhóm carboxyl tự do hoặc từ cuối chuỗi pectin (Rexova-Benkova et al.,
2004). Kết quả là hình thành methanol và chất pectin có độ methoxyl thấp hơn
(pectinic acid hoặc pectic acid). Điều này dẫn đến sự thay đổi thuộc tính tạo keo
của pectin nên làm tăng độ nhớt của rau quả và làm giảm pH.
Phối hợp với các enzyme pectinase khác, PME có trách nhiệm trong việc điều
khiển sự thối hóa của pectin và sự mềm đi của mơ thực vật trong q trình chín và

là enzyme đầu tiên tác dụng lên pectin trên vách tế bào.
Động học phản ứng của PME thường tuân theo định luật Michaelis-Menten, tuy
nhiên cũng có sự khác biệt về pH tối thích và đặc điểm động học ở các isozyme
khác nhau (Sajjaanantakul và Pitifer, 1991). Các PME acid và kiềm có thể khử gốc
methyl của cơ chất pectin theo cùng một kiểu. PME kiềm hình thành các pectin ít
được ester hóa và pectin này có thể tạo gel mạnh với ion Ca2+. PME acid tạo ra
pectin bị ester hóa có khả năng tạo gel yếu với ion Ca2+.
PME có tính đặc hiệu cao đối với nhóm methylester của acid polygalacturonic.
Tuy nhiên, PME khơng khử hồn tồn mạch ester hóa. Sự thủy phân dừng lại ở
một mức độ ester nhất định, có thể do giới hạn bởi các nhóm polymer thế có kích
thước nhỏ hiện diện trên mạch. Pectin ở độ methoxyl 65 ÷ 75% cho hoạt tính PME
mạnh nhất (Sajjaanantakul và Pitifer, 1991).
PME không hoạt động trên các cơ chất polyuronic như các chuỗi pectin được
methoxyl hoàn toàn hay methyl alginate. PME cũng không thủy phân ở các glycyl

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 6


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

Trường Đại học Cần Thơ

và glycerin ester, ethyl acetate. Các ester khác chỉ bị tấn cơng rất chậm như ethyl
polygalacturonase (1 ÷ 6% so với methyl galacturonase). Các nhóm allyl, propyl,
propargyl ester thủy phân ở mức độ rất ít (Sajjaanantakul và Pitifer, 1991). Các
nhóm methylester của acid polymanuronic thì khơng bị tấn cơng. Cho đến nay
chưa có enzyme methylesterase nào được tìm thấy là có tác động đến nhóm methyl
ester của RG (rhamnogalacturonan) (Benen et al., 2003).

Do sự khác biệt về cách sắp xếp thứ tự các acid amin của các loại PME thực vật,
nấm mốc và vi khuẩn mà cơ chế phản ứng của mỗi loại sẽ khác nhau. PME nguồn
gốc vi sinh vật thủy phân tại vị trí bất kì (các nhóm methoxyl bị lấy đi một cách
ngẫu nhiên), PME thực vật thủy phân tại những vị trí định trước (Markovic và
Janecek, 2004).
2.2.5 Nguồn tổng hợp PME
PME có thể tổng hợp từ nguồn thực vật và vi sinh vật.
(i)

Thực vật

PME có nhiều trong hầu hết các loại trái cây. Đặc biệt có nhiều trong cà chua,
chuối, cam, táo,… PME ở thực vật thường tồn tại dạng đồng phân. Thông thường,
các dạng đồng phân của chúng khác nhau ở điểm đẳng điện pI và (hoặc) khối
lượng phân tử (Bordenave, 1996). Mối quan hệ tỉ lệ của các dạng đồng phân này
có thể thay đổi tùy theo mức độ tăng trưởng của trái và các nguồn PME khác nhau
(Bordenave và Goldberg, 1993). Ví dụ như cà chua có hai loại đồng phân là PME1
và PME2. Trong giai đoạn trái bắt đầu chín, PME1 và PME2 đều tăng nhưng ở
giữa giai đoạn chín thì PME1 giảm xuống, PME2 tiếp tục tăng đến cuối q trình
chín (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Hoặc như hai dạng đồng phân của PME trong
cam, PME1 có pI là 10,05 và PME2 có pI > 11. Các đồng phân PME trong kiwi thì
có cùng khối lượng phân tử, cùng pI nhưng lại khác nhau về tính bền nhiệt
(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
PME thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi kiềm. Các cation
kim loại ở nồng độ thấp như Ca2+ có khuynh hướng làm tăng độ hoạt động của
enzyme. Các ion Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở các nồng
độ lần lượt là 0,005M và 0,05M (Bordenave, 1996).
Các PME ở thực vật tấn công vào hoặc đầu không khử hoặc gần với nhóm
carboxyl tự do và tiến dọc theo phân tử bằng cơ chế chuỗi đơn, tạo ra các khối
galacturonic acid khơng bị ester hóa rất mẫn cảm với calcium (Nguyễn Đức

Lượng, 2004).

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 7


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Hoạt tính của PME thực vật có thể được gia tăng bởi tác động của áp suất và đạt
được cường độ hoạt động tối ưu ở áp suất thay đổi trong khoảng 200 ÷ 500 MPa
và nhiệt độ từ 50 ÷ 57°C (Verlent et al., 2004).
(ii)

Vi sinh vật

Nguồn giàu enzyme pectinase là nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Các PME có
nguồn gốc từ nấm mốc chịu nhiệt kém hơn so với các PME có nguồn gốc từ thực
vật. Các PME của nấm mốc khác với PME của thực vật theo cơ cấu đa dạng, các
nhóm methoxyl bị lấy đi một cách ngẫu nhiên (Ly Nguyen, 2004).
Nấm mốc là nguồn cung cấp enzyme, đặc biệt là enzyme pectinase. PME từ nấm
mốc là các loại enzyme ngoại bào. Chúng hoạt động trong khoảng nhiệt độ tối ưu
30 ÷ 45oC và bị vô hoạt ở nhiệt độ lớn hơn 55oC. pH tối ưu của nấm mốc trong
khoảng 3 ÷ 5,5. PME từ các lồi Aspergillus là điển hình cho các PME có điểm
đẳng điện và pH tối ưu trong vùng acid. Hoạt động của PME từ A.niger đạt tối đa
ở pH 4,5 và nhiệt độ 400C. Trong khi pH tối ưu của PME từ A.species là 3,7 ¸ 4,2
và PME từ A.sojae là 5,5 (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.2.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme PME

(i)

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme. Cũng như các phản ứng hố
học thơng thường, vận tốc phản ứng enzyme tăng khi nhiệt độ tăng. Tuy nhiên, do
enzyme có bản chất là protein nên nó kém bền với nhiệt độ cho nên tốc độ phản
ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ
phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá nhiệt độ đó, tốc
độ phản ứng enzyme sẽ giảm dần và dẫn đến mức triệt tiêu. Đa số enzyme bị mất
hoạt tính ở nhiệt độ trên 70°C. Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme
cao nhất được gọi là nhiệt độ tối thích của enzyme. Phần lớn enzyme hoạt động
mạnh nhất ở nhiệt độ 40 ÷ 50°C. Nhiệt độ tối ưu của những enzyme khác nhau thì
hồn tồn khác nhau tuỳ thuộc vào nguồn gốc của chúng. Một số enzyme có nhiệt
độ tối ưu ở 60°C, một số khác lại có nhiệt độ tối ưu ở 70°C. Enzyme pectinesterase
từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu là 30 ÷ 45°C và bị vơ hoạt ở 55 ÷ 62°C (Nguyễn
Đức Lượng, 2004). Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính
enzyme sẽ bị giảm, khi đó enzyme khơng có khả năng phục hồi lại hoạt tính.
Ngược lại, ở nhiệt độ 0°C enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi đưa
nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu. Nhiệt độ tối ưu
của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH. Người ta
thường sử dụng yếu tố nhiệt độ để điều khiển hoạt động của enzyme và tốc độ
phản ứng trong chế biến và bảo quản thực phẩm.
Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 8


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Giống như các phản ứng của enzyme khác, tốc độ của phản ứng phân giải pectin
do PME sẽ gia tăng cùng với sự gia tăng nhiệt độ đến một mức tối thích, sau đó
hoạt tính của PME giảm. Nhiệt độ tối thích cho hoạt động của PME dao động
trong khoảng từ 45 ÷ 55oC, phụ thuộc vào nguồn enzyme. Sự thay đổi áp suất sẽ
kéo theo sự thay đổi nhiệt độ, do đó ở áp suất cao (chẳng hạn như 200 ÷ 500 MPa),
nhiệt độ tơi thích cho hoạt động của PME thực vật vào khoảng 50 ÷ 57oC (Verlent
et al., Castro et al., 2006; Sila et al., 2007)
(ii)

Ảnh hưởng của pH trên hoạt động của enzyme

Enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi pH của môi trường, mỗi enzyme chỉ hoạt
động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích. pH mơi trường
thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, đặc biệt là ảnh hưởng đến độ bền
của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzyme.
Các enzyme từ các nguồn gốc khác nhau thì có pH tối thích khác nhau. Nhiều
enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính. Tuy nhiên, cũng có nhiều enzyme
hoạt động ở pH acid yếu. Một số khác lại hoạt động mạnh ở pH kiềm và cả pH
acid. Enzyme pectinesterase của Aspergillus có điểm đẳng điện và pH tối ưu nằm
trong khoảng acid, hoạt động của PE đạt tối đa ở pH = 4,5 và nhiệt độ 40°C.
Khi pH > 7, pectin tự khử nhóm ester và tăng cường độ hoạt động của PME. Đối
với pectinase có nguồn gốc từ nấm mốc, pH hoạt động tối thích nằm trong khoảng
3 ÷ 5 (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004). Tại một giá trị pH, trên điểm pI, PME
thực vật khi ở trạng thái trung hịa hay mang điện tích âm, điều này được giải thích
do PME được thốt ra khỏi cơ chất bởi vì có sự đẩy tĩnh điện giữa nhóm carboxyl
tự do và enzyme mang điện tích âm (Nari et al., 1991). Ngược lại PME từ vi sinh
vật có pH tối thích từ 4,0 cho đến 9,0 (Bordanave, 1996). Đồng thời với độ pH trên
7,0, pectin tự khử nhóm ester và tăng cường độ hoạt động của PME, cần nhóm

carboxyl tự do để hoạt động.
(iii) Ảnh hưởng của cation lên hoạt động của enzyme PME
Những cation kim loại rất cần thiết đối với hoạt động của PME thực vật cả trong
việc mở rộng vách tế bào và trong chế biến thực phẩm trong khi chúng ít ảnh
hưởng trên hoạt động PME từ vi sinh vật. Moustacas và các cộng sự đề nghị một
bức tranh mô tả nhất quán vai trò của ion kim loại trên việc mở rộng vách tế bào.
Sự phát triển của vách tế bào mang lại sự giảm nồng độ proton hiện diện bởi vì sự
khác nhau điện tích của thành tế bào giảm. Quá trình này được thực hiện bởi sự tấn
cơng của ion kim loại trên vách tế bào polyanionic. Hơn nữa, còn có sự kiềm hãm
của PME bởi nồng độ muối cao, ngăn ngừa sự tích điện q cao (Ly Nguyen,
2004).

Ngành Cơng nghệ thực phẩm

Trang 9


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Theo Nari và các cộng sự (1991), hoạt động của PME tăng cùng với sự tăng nồng
độ ion kim loại và đạt đến tối thích, ở trên điểm này thường giảm. Trong phản ứng
khử ester hóa xúc tác bởi PME thực vật, ion kim loại cung cấp giúp cho phản ứng
thủy phân xảy ra. Ion kim loại phản ứng với nhóm mang điện tích âm (nhóm
carboxyl) cho phép enzyme phản ứng trên liên kết ester và giải phóng nó. Ở nồng
độ cao, ion kim loại ức chế hoạt động của enzyme. Điều này được hiểu dựa trên
nhóm carboxyl kế cận liên kết ester được giải phóng cho phép phản ứng tiếp diễn.
Nếu những nhóm này được khóa bởi ion kim loại, phản ứng enzyme không xảy ra
và đây là nguyên nhân ức chế khi có nồng độ ion kim loại cao (Nari et al., 1991).

Theo Leiting và Wicker (1997) ở cùng mức độ ion hóa và những ion hóa trị II kích
hoạt PME khác nhau. Với NaCl, nồng độ tối ưu cho hoạt động PME là 0,2M. Tính
chất của anion cũng có thể gây kích hoạt này. Muối thêm vào có tác dụng hạ pH
tối thích xuống giá trị acid (Lin et al., 1989; Moustacas et al., 1991). Hiệu ứng của
cation hóa trị II trên hoạt động của PME xuất hiện phức tạp hơn so với ion hóa trị
I. Trong số những ion hoá trị II, calcium là một trong những ion quan trọng nhất.
Tại nồng độ thấp (5 ¸ 25 nM), calcium tăng khả năng hoạt động của PME, trong
khi đó mà tại nồng độ cao, có lẽ vì sự hình thành gel pectate mà tốc độ phản ứng
của PME giảm (Leiting và Wicker, 1997). Trong nấm mốc Vigra radiata,
magnesium là một trong những chất hoạt hóa mạnh hơn calcium. Mangan có khả
năng cân bằng hoạt tính PME tự do và PME cố định, trong khi magnesium và
calcium chỉ kích hoạt enzyme cố định (Goldberg et al., 1992).
(iv)

Chất hoạt hố

Các chất có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme gọi là các chất hoạt hố enzyme.
Những chất hoạt hóa có tác dụng làm cho enzyme từ trạng thái không hoạt động
trở thành hoạt động, từ hoạt động yếu trở thành hoạt động mạnh hơn. Các chất hoạt
hóa thường có bản chất hóa học rất khác nhau, chúng có thể là:
- Các chất hữu cơ phức tạp làm nhiệm vụ chuyển nhóm, chuyển gốc hóa học
- Những chất có tác dụng phục hồi những nhóm hoạt động của trung tâm hoạt
động enzyme
- Những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử proenzyme
làm loại bỏ một vài đoạn peptid, tạo điều kiện cho các nhóm chức xích lại
gần nhau để hình thành trung tâm hoạt động.
(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Như vậy, tùy theo nguồn gốc của PME, tính ổn định cũng như hiệu quả hoạt động,
phương thức phản ứng của chúng cũng thay đổi.

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 10


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

Trường Đại học Cần Thơ

2.3 ĐỘNG HỌC ENZYME
2.3.1 Khái niệm enzyme và cấu tạo hóa học
Enzyme là những chất xúc tác sinh học có bản chất là protein – Mỗi phản ứng hóa
học xảy ra trong cơ thể sống có một enzyme xúc tác riêng biệt và đặc hiệu cho
từng loại phản ứng nhất định.
Chúng được sản xuất ra bởi các tế bào sống (động vật, thực vật, và vi sinh vật) và
có vai trị như là chất xúc tác bắt buộc cho các phản ứng sinh học (Nguyễn Đức
Lượng, 2004).
Dựa vào thành phần hóa học của enzyme thì chúng thuộc hai loại:
Enzyme đơn giản (enzyme một cấu tử): trong thành phần cấu tạo của nó chỉ gồm
các gốc acid amin.
Enzyme phức tạp (enzyme hai hoạc nhiều cấu tử): trong thành phần của nó ngồi
acid amin (protein) nó cịn có các nhóm phụ khác có phân tử lượng thấp gọi là
phần phi protein hoặc là những yếu tố kết hợp gọi tắt là cofactor gồm các ion kim
loại, vitamin, nucleotid, nhân pocfirin…
- Phần protein của enzyme 2 cấu tử gọi là apoenzyme.
- Phần phi protein (cofactor): quyết định kiểu phản ứng và tham gia trực tiếp
vào cơ thể xúc tác của enzyme. Thực hiện cầu nối của enzyme và cơ chất,
giúp ổn định bền vững cấu trúc của enzyme.
(Nguyễn Đức Lượng, 2004 ; Lê Ngọc Tú, 2002)
2.3.2 Giới thiệu về phản ứng enzyme

Enzyme là protein có khả năng xúc tác đặc biệt với tốc độ nhanh, các phản ứng
hóa học xảy ra dưới điều kiện tương đối thấp đã được tìm thấy trong cơ thể sống.
So với các phản ứng cần điệu kiện acid, nhiệt độ cao thì phản ứng enzyme khơng
chỉ xảy ra ở điều kiện thấp mà còn xảy ra với tốc độ rất nhanh (Nguyễn Đức
Lượng, 2004).
2.3.3 Động học phản ứng enzyme
Động học phản ứng enzyme thì tương tự như phản ứng khơng enzyme ngoại trừ
enzyme có tác dụng duy nhất là làm tăng nhanh tốc độ của phản ứng. Chúng hoạt
động như một chất xúc tác bởi việc mang cơ chất lại với nhau nên làm tăng phản
ứng hóa học.

Ngành Cơng nghệ thực phẩm

Trang 11


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Khi có sự tham gia của enzyme, năng lượng cản trở được hạ thấp, nhờ vậy sự tạo
thành phức hợp enzyme – cơ chất diễn ra dễ dàng hơn. Tức là đối với phản ứng có
enzyme, chỉ cần một mức năng lượng nhỏ cung cấp cho hệ thống thì phản ứng đã
xảy ra nhanh chóng.
Vai trị xúc tác của enzyme trong phản ứng hóa học là khi có sự tham gia của các
enzyme, cơ chất được hoạt hóa mạnh, làm thay đổi tính chất và cấu trúc của cơ
chất, từ đó sinh ra các sản phẩm mới của phản ứng (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Năm 1913, hai nhà khoa học Lenom Michealis và Maud Menten đã đưa ra mơ
hình động học để giải thích phản ứng được xúc tác bởi enzyme và lập phương trình
phản ánh mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất và enzyme. Theo

mơ hình này, enzyme (E) kết hợp với cơ chất (S) tạo thành phức hợp enzyme – cơ
chất (E – S). Phức hợp này sẽ được chuyển hóa tiếp tục để tạo thành sản phẩm (P)
và giải phóng enzyme. Enzyme được giải phóng sẽ thực hiện phản ứng mới.
Theo Michealis – Menten, cơ chế xúc tác tổng quát của phản ứng có enzyme được
trình bày theo sơ đồ:
K1
E+S

K2
ES

K-1

E+P
K-2

Trong đó: K1, K-1, K2, K-2 là những hằng số vận tốc của các phản ứng tương ứng.
Sự hình thành phức hợp ES thường xảy ra nhanh, nhưng ngược lại sự chuyển hóa
thành sản phẩm thì chậm hơn
Phản ứng chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm là quan trọng nhất
ES

K2

E+P

K2 tỉ lệ với nồng độ ES: v = K2.[ES] (v: vận tốc phản ứng)
Khi nồng độ ES càng lớn, vận tốc phản ứng càng lớn (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Theo thuyết Mischaelis và Menten, cơ chế phản ứng có xúc tác của enzyme xảy ra
qua ba giai đoạn:

- Giai đoạn một: enzyme (E) sẽ kết hợp với cơ chất (S) tại vị trí trung tâm
hoạt động của enzyme bằng các liên kết hóa học, tạo thành phức hệ enzyme
cơ chất (E-S). Ở giai đoạn này, các liên kết được hình thành thường là
những liên kết yếu nên phức hệ E – S thường không bền. Phản ứng tạo phức
hệ này thường xảy ra rất nhanh và cần có một ít năng lượng. Giữa E và S có

Ngành Cơng nghệ thực phẩm

Trang 12


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

Trường Đại học Cần Thơ

năm loại liên kết tham gia, mỗi loại có đặc tính riêng và năng lượng liên kết
khác nhau, gồm liên kết phối trí, liên kết hydro, liên kết ion, liên kết kỵ
nước lực Vander-Waals và liên kết do dịch chuyển điện tử.
- Giai đoạn hai: khi tạo thành phức hệ E – S, dưới tác dụng của enzyme, cơ
chất sẽ bị thay đổi về cấu trúc không gian và mức độ bền vững của các liên
kết bên trong phân tử, dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa
trị tham gia phản ứng. Sau đó xảy ra sự thay đổi mật độ điện tích của phức
hợp E – S làm biến dạng các liên kết giữa chúng, kết quả là cơ chất được
hoạt hóa, dễ dàng tham gia phản ứng.
- Giai đoạn ba: đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm của quá trình phản ứng
được tạo thành, enzyme tách ra và trở về trạng tháng ban đầu, chuẩn bị kết
hợp với phân tử cơ chất khác (Mathewson, 1998).
Tùy thuộc vào nguồn gốc enzyme sẽ có bản chất khác nhau, thơng số động học
Km đặc trưng cho mỗi enzyme (Bảng 1).
Bảng 1: Thông số động học Km của một số enzyme

Enzyme

Tên quốc tế

Nguồn gốc

Cơ chất

Km

a-Amylase

3.2.1.1

Dịch tụy heo

Tinh bột

1,0

b-Amylase

3.2.1.2

Khoai lang

Amylose

0,07

Bromelin

4.3.1.1

Trái khóm

Benzoyl-L-arginine ethyl ester 170

Glucose-isomerase

5.3.1.5

D-Glucose

920

Lipoxygennase

1.13.11.12

Lactobacillus
brevis
Đậu nành

Linoleate

1,0

Papain

3.4.22.2

Nước đu đủ

Benzoyl-L-arginine ethyl ester 1,89

Urease

3.5.1.5

Đậu

Urea

10,5

Nguồn Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2002

2.3.4 Động học sự vô hoạt enzyme
Sự vô hoạt enzyme ở một điều kiện nhiệt độ nhất định có thể được mơ tả bởi mơ
hình phương trình bậc một (Ludikhuyze et al., 2001; Eagerman và Rouse, 1976,
trích dẫn bởi Ly Nguyen et al., 2004):
A = A0 exp(-kt)
Với

(1)

A: Hoạt tính của enzyme ở thời điểm t
A0: hoạt tính ban đầu của enzyme
k: hằng số tốc độ vô hoạt

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 13


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

Trường Đại học Cần Thơ

t: thời gian xử lý nhiệt
Phương trình động học bậc 1 nêu trên (phương trình 1) có giá trị trong điều kiện
đẳng nhiệt và đẳng nhiệt – đẳng áp. Trong trường hợp này, hằng số tốc độ vô hoạt
k có thể xác định bằng phương trình hồi quy bậc 1 của ln(A/A0) theo thời gian t :
ln (A/A0) = - kt

(2)

Trong nhiều trường hợp, hoạt tính của enzyme vẫn duy trì khi thời gian gia nhiệt
kéo dài, khi đó phương trình bậc 1 biến đổi một phần có thể được áp dụng để xác
định động học sự vô hoạt của enzyme.
Khi đó, hoạt tính enzyme khơng đổi và được biểu diễn là A¥
f =

Với

f

A0 - A
A0 - A¥

(3)

: hệ số chuyển đổi một phần

A¥ : hoạt tính enzyme cịn lại sau q trình xử lý nhiệt kéo dài
A¥ gần như bằng 0 và phương trình (3) có thể viết thành
f =

A0 - A
A0

(4)

Đồ thị logarithm của (1-f) theo thời gian là một đường thẳng với hằng số tốc độ (k)
được biểu thị bằng giá trị âm của hệ số góc (Levenspiel, 1972; trích dẫn bởi
Ludikhuyze et al., 2001).
ln(1 - f ) = ln

A
= - kt
A0

(5)

Vậy phương trình (5) giống phương trình (2) khi A¥ gần bằng 0.
Để tính tốn hoạt tính enzyme cịn lại sau q trình xử lý nhiệt kéo dài, mơ hình
chuyển đổi một phần sau nên được sử dụng:
é A - A¥ ù
ln(1 - f ) = ln ê

ú = - kt
ë A0 - A¥ û

(5)

Sự sắp xếp lại phương trình (5) sẽ thành phương trình (6)
A = A¥ + ( A0 - A¥ )e - kt

(6)

2.4 MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA PME TRONG CHẾ BIẾN THỰC PHẨM
Pectinase đã được sử dụng trong lĩnh vực công nghiệp sản xuất rượu vang và nước
trái cây từ năm 1930. Tùy vào mục đích sản xuất mà enzyme PME có thể được sử

Ngành Cơng nghệ thực phẩm

Trang 14


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

Trường Đại học Cần Thơ

dụng riêng hoặc kết hợp với enzyme khác, hầu hết là kết hợp với pectinase. Sau
đây là một số ứng dụng của enzyme trong thực phẩm.
2.4.1 Trích ly dịch quả
Pectin là một thành phần quan trọng trong tế bào, cùng với cellulose tạo nên vách
tế bào. Chính vách tế bào là lớp bảo vệ các thành phần bên trong và tạo hình cho tế
bào. Khi vách tế bào còn cứng chắc sẽ ngăn cản, làm cho dịch bào khó thốt ra
ngồi. Vì vậy để thu được dịch bào nhiều nhất, ta sử dụng enzyme pectinase để

phân cắt thành tế bào, tạo điều kiện để thu được dịch bào nhiều nhất. Quá trình này
thường kết hợp với việc sử dụng enzyme cellulase để sự phân cắt được tốt hơn.
Kết quả là hiệu suất thu hồi dịch bào sẽ cao hơn (Bảng 2).
Bảng 2 : Hiệu quả xử lý nước táo và nước vải bằng chế phẩm enzyme pectinase
Loại nước quả

Độ
acid
chuẩn
(%)

Đường
(%)

Pectin
(%)

(%)

Hàm
lượng
chất
khơ
(%)

Điểm
đánh
giá
cảm
quan

a- Khơng có chế phẩm enzyme

71,2

10,2

0,53

6,7

0,33

4,5

b- Có chế phẩm enzyme

78,8

11,5

0,62

8,0

0,15

4,8

a- Khơng có chế phẩm enzyme

49,2

8,5

0,91

5,62

0,26

3,8

b- Có chế phẩm enzyme

72,4

10,2

1,16

7,4

0,12

4,3

Hiệu
suất
nước

quả

Nước quả từ táo

Nước quả vải

Nguồn Nguyễn Đức Lượng, 2004

2.4.2 Làm trong nước quả
Một trong những vấn đề quan trọng trong việc sản xuất nước quả là tránh được sự
vẩn đục của sản phẩm. Khi chiết tách dịch bào, một lượng lớn pectin sẽ đi theo.
Lượng pectin này nếu không được loại ra khỏi dịch quả sẽ gây đục nước quả và
tăng độ nhớt sản phẩm. Trong trường hợp này, pectinase được sử dụng để phân cắt
pectin thành những phần nhỏ, rời rạc dẫn đến lắng cặn và thu được dịch quả trong.
Ngoài ra, trong tế bào, phức hệ protein-pectin là một phức hệ gồm protein mang
điện dương và lớp vỏ pectin mang điện âm. Do lớp vỏ ngồi tích điện cùng dấu
nên chúng đẩy nhau và ở trạng thái lơ lửng, gây vẩn đục. Khi xử lý với enzyme

Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 15


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 2010

Trường Đại học Cần Thơ

pectinase, lớp vỏ pectin sẽ bị phân cắt làm các protein lộ ra. Khi đó, các hạt sẽ hút
nhau và lắng cặn, kết tủa.
2.4.3 Cải thiện cấu trúc

Trong các sản phẩm địi hỏi tính giịn, độ cứng chắc của sản phẩm (như trong sản
phẩm rau muối chua, táo cắt lát, rau quả đóng hộp…). Trong q trình làm trắng
nguyên liệu ở nhiệt độ thấp, thời gian dài sẽ làm kích hoạt PME phân cắt nhóm
ester của pectin, tạo điều kiện cho pectin liên kết với ion Ca2+ tạo cấu trúc theo
mong muốn (Van Puren, 1979).
2.4.4 Một số ứng dụng khác
Ngoài lĩnh vực chế biến nước quả, pectinase từ vi sinh vật cũng đang được ứng
dụng và có nhiều triển vọng trong công nghiệp chế biến ca cao và cà phê. Khi
được xử lý với pectinase, trong quá trình lên men, lớp chất nhầy xung quanh các
hạt này bị phân hủy nhanh hơn và bị rửa khỏi hạt trước khi hạt được sấy khơ.
Pectinase cịn được ứng dụng trong việc tạo hương vị đặc trưng cho sản phẩm rượu
do hình thành các sản phẩm trao đổi chất của nấm mốc trong nguyên liệu (Nguyễn
Đức Lượng, 2004).
Trong lĩnh vực chăn nuôi, người ta cho thêm chế phẩm pectinase vào thức ăn có
chứa nhiều cellulose để làm tăng q trình hấp thu thức ăn của gia súc, vì nó góp
phần vào việc thủy phân chất pectin, cellulose có trong thức ăn. Lượng chế phẩm
pectinase thường dùng là 0,03 ÷ 0,05% so với ngun liệu.
PME có tính đặc hiệu cao và chỉ tác dụng lên một cơ chất nhất định là pectin.
Chính vì thế, đặc điểm tính chất của pectin cũng cần được quan tâm.
2.5 CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN
Việc xác định đặc tính của enzyme PME từ thực vật và nấm mốc đã được thực
hiện và áp dụng vào thực tế ở nhiều nơi trên thế giới.
Arotupin et al., (2008) đã nghiên cứu về điều kiện thích hợp cho hoạt động của
pectin methylesterase từ Aspergillus repens. Nhiệt độ tối ưu cho PME hoạt động là
300C và hoạt động hầu hết ở pH 6,5. Hoạt động của enzyme tăng khi có sự hiện
diện của ion Na+, K+, Ca2+ trong khi đó EDTA, PbCl2, HgCl2 lại ức chế hoạt động
của enzyme.
Plaza et al., (2008) đã công bố ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến khả năng
hoạt động của PME từ Aspergillus aculeatus. Theo đó, ở pH 5,0 và nồng độ ion
cao (0,50 M), PME có khả năng ổn định nhiệt cao (vơ hoạt ở nhiệt độ ≥ 60ºC).

Ngồi ra, hoạt động của PME vẫn được duy trì ở pH 7,0 và nhiệt độ trên 55ºC, tuy
Ngành Công nghệ thực phẩm

Trang 16