Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa hình đột biến gen CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 và CYP2D6 Cytochrome P450 ở người Kinh Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Vũ Phương Nhung

NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH/ĐỘT BIẾN GEN CYP2C9, CYP2C19,
CYP3A5 VÀ CYP2D6 CYTOCHROME P450
Ở NGƯỜI KINH VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – Năm 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Vũ Phương Nhung

NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH/ĐỘT BIẾN GEN CYP2C9, CYP2C19,
CYP3A5 VÀ CYP2D6 CYTOCHROME P450

Ở NGƯỜI KINH Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. Nguyễn Hải Hà
2. GS. TS. Nông Văn Hải

Hà Nội – Năm 2020


i
LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi với sự hướng dẫn
khoa học của TS. Nguyễn Hải Hà và GS.TS. Nông Văn Hải. Những kết quả thu được
của luận án là mới, trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ cơng trình nào
khác. Các kết quả cơng bố chung đã được cán bộ hướng dẫn và các đồng tác giả cho
phép sử dụng trong Luận án.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2020

Tác giả luận án

Vũ Phương Nhung


ii
LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới GS.TS.
Nông Văn Hải-nguyên Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen, Chủ tịch hội đồng Khoa
học Viện Nghiên cứu hệ gen và TS. Nguyễn Hải Hà-Phó trưởng phịng Phân tích hệ
gen, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong
suốt quá trình học tập và nghiên cứu, tinh thần say mê và nghiêm khắc trong khoa
học cùng với sự hướng dẫn tận tình và khích lệ của các thầy là động lực lớn lao giúp
tôi không ngừng cố gắng và phấn đấu, vượt qua nhiều khó khăn để có thể hồn thành
Luận án.
Tơi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Đăng Tơn-Trưởng phịng Phân tích hệ
gen cùng các đồng nghiệp cơng tác tại phịng Phân tích hệ gen đã luôn tạo điều kiện
thuận lợi, đồng hành và giúp đỡ tơi trong suốt q trình học tập và làm việc chun
mơn tại Phịng. Bằng những tình cảm chân thành nhất, tôi xin trân trọng cảm ơn
những giúp đỡ q báu đó.
Trong q trình nghiên cứu và học tập, tơi đã nhận được những ý kiến đóng
góp q báu của các nhà khoa học, các cán bộ nghiên cứu tại Viện nghiên cứu hệ
gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Những nhận xét và góp ý
chun mơn sâu sắc trong các buổi báo cáo, hội thảo đã giúp tơi hồn thiện tốt nhất
Luận án của mình.
Nhân dịp này, tơi cũng xin chân thành cảm ơn ban Giám đốc, tập thể cán bộ
Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam
đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tơi trong q trình học tập và nghiên cứu tại đây.
Sau cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè
đã ln tin tưởng và là nguồn động viên tinh thần lớn lao đối với tơi trong suốt q
trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành Luận án.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2020

Tác giả luận án

Vũ Phương Nhung


iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN ........................ vii
DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. ix
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ x
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................... 4
1.1. CYP450 và chuyển hóa thuốc trong gan ........................................................... 4
1.2. Đa dạng di truyền các gen mã hóa cho enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa
thuốc. ...................................................................................................................... 6
1.2.1. Gen CYP2C9 ................................................................................................. 7
1.2.2. Gen CYP2C19 ............................................................................................. 11
1.2.3. Gen CYP2D6 ............................................................................................... 14
1.2.4. Gen CYP3A5................................................................................................ 17
1.3. Ảnh hưởng của đa dạng di truyền các gen dược học đối với các ADR và sự khác
biệt trong đáp ứng thuốc ........................................................................................ 20
1.3.1. Khái quát về các ADR ................................................................................. 20
1.3.2. Một số trường hợp đa dạng di truyền các gen dược học gây nên khác biệt trong

đáp ứng thuốc ........................................................................................................ 22
1.4. Ứng dụng và triển vọng của di truyền dược học trong lâm sàng ...................... 29
1.5. Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền của các gen CYP450 ........ 32
1.5.1. Các phương pháp nghiên cứu SNP và indel ................................................. 32
1.5.2. Các phương pháp nghiên cứu CNV .............................................................. 34
1.6. Tình hình nghiên cứu đa hình di truyền một số gen CYP450 trên người Việt Nam
và phạm vi nghiên cứu của luận án ........................................................................ 37
1.6.1. Tình hình nghiên cứu đa hình di truyền của các gen CYP450 tại Việt Nam và
trên thế giới ........................................................................................................... 37


iv
1.6.2. Phạm vi nghiên cứu của luận án ................................................................... 39
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 40
2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 40
2.2. Các thiết bị, dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu ...................................... 40
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 41
2.3.1 Tách chiết DNA tổng số ............................................................................... 41
2.3.2. Xác định nồng độ DNA tổng số ................................................................... 42
2.3.3. Phương pháp PCR Khuếch đại đặc hiệu các gen .......................................... 43
2.3.3.1. Thiết kế mồi .............................................................................................. 43
2.3.3.2. PCR đặc hiệu các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 ............. 45
2.3.4. Giải trình tự Sanger...................................................................................... 46
2.3.4.1. PCR giải trình tự ....................................................................................... 46
2.3.4.2. Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự ....................................................... 47
2.3.4.3. Biến tính sản phẩm PCR và điện di mao quản trên máy giải trình tự ......... 47
2.3.5. Phương pháp MLPA .................................................................................... 47
2.3.5.1. Thực hiện phản ứng MLPA....................................................................... 48
2.3.5.2. Điện di mao quản phân tách đoạn ............................................................. 49
2.3.5.3. Phân tích kết quả bằng phần mềm Coffalyzer ........................................... 49

2.3.6. Long range (LR) PCR .................................................................................. 50
2.3.7. Real-time PCR ............................................................................................. 51
2.3.8. Phân tích số liệu nghiên cứu ........................................................................ 52
2.3.8.1. Phân tích kết quả giải trình tự Sanger và đánh giá trạng thái cân bằng di truyền
Hardy-Weinberg của quần thể ............................................................................... 52
2.3.8.2. Phân tích thống kê .................................................................................... 52
2.3.9. Dự đoán chức năng in silico của các biến thể mới ........................................ 53
2.3.9.1. Dự đoán chức năng của các biến thể mới trong vùng mã hóa .................... 53


v
2.3.9.2. Dự đoán chức năng của các biến thể mới trong vùng khơng mã hóa ......... 53
2.3.9.3. Dự đốn chức năng của các biến thể mới trong vùng promoter ................. 54
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 55
3.1. Tách chiết DNA tổng số ................................................................................. 55
3.2. Khuếch đại đặc hiệu các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A5 và giải trình
tự ........................................................................................................................... 55
3.3. Phân tích đa hình/đột biến các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 ở
quần thể người Kinh Việt Nam .............................................................................. 59
3.3.1. Đa hình/đột biến của gen CYP2C9 ............................................................... 59
3.3.2. Đa hình/đột biến của gen CYP2C19 ............................................................. 65
3.3.3. Đa hình/đột biến của gen CYP2D6 ............................................................... 70
3.3.4. Đa hình/đột biến của gen CYP3A5 ............................................................... 83
3.4. Phân tích liên kết giữa các biến thể trên CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6 ....... 85
3.5. Dự đoán chức năng in silico của các biến thể mới tìm thấy trên CYP2C9,
CYP2C19 và CYP2D6 ........................................................................................... 87
3.6. So sánh tần số allele của các gen nghiên cứu giữa quần thể người Kinh Việt Nam
với các quần thể người khác trên thế giới............................................................... 90
3.6.1. So sánh tần số allele của gen CYP2C9 giữa quần thể người Kinh Việt Nam với
các quần thể người khác trên thế giới..................................................................... 90

3.6.2. So sánh tần số allele của gen CYP2C19 giữa quần thể người Kinh Việt Nam
với các quần thể người khác trên thế giới............................................................... 92
3.6.3. So sánh tần số allele của gen CYP2D6 giữa quần thể người Kinh Việt Nam với
các quần thể người khác trên thế giới..................................................................... 93
3.6.4. So sánh tần số allele của gen CYP3A5 giữa quần thể người Kinh Việt Nam với
các quần thể người khác trên thế giới..................................................................... 96
3.7. Thảo luận........................................................................................................ 98
3.7.1.

Sự phân bố của các SNP gây ảnh hưởng chức năng protein CYP2C9,

CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 ở các quần thể người trên thế giới ....................... 98


vi
3.7.2. Phân tích liên kế t giữa các biế n thể và ý nghiã trong nghiên cứu đa da ̣ng di
truyề n các gen CYP450........................................................................................ 102
3.7.3. Vai trò của các CNV và SV của các gen nghiên cứu trong đa dạng đáp ứng
thuốc cá nhân....................................................................................................... 103
3.7.4. Vai trò của các biến thể mới của CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6 đối với chức
năng của các protein tương ứng ........................................................................... 105
3.7.5. Ý nghĩa của việc sử dụng thông tin di truyền các gen CYP450 tham gia chuyển
hóa thuốc trong tối ưu hiệu quả dùng thuốc trên người Kinh Việt Nam ............... 107
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 112
DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ..................................................... 114
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 115
PHỤ LỤC................................................................................................................ 1


vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN

Tên viết tắt

Tên đầy đủ tiếng Anh

Nghĩa tiếng Việt dùng
trong luận án

ADR

Adverse drug reaction

Phản ứng có hại của thuốc

CNV

Copy number variant

Biến thể số bản sao

CPIC

Clinical Pharmacogenetics
Implementation Consortium

Hiệp hội ứng dụng Di
truyền dược học lâm sàng

CYP2C19

Cytochrome P450 2C19

CYP2C9

Cytochrome P450 2C9

CYP2D6

Cytochrome P450 2D6

CYP3A5

Cytochrome P450 3A5

CYP450

Cytochrome P450

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTPs

Deoxynucleotide triphosphates

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic Acid

EM

Extensive metabolizer

Chuyển hóa thuốc bình
thường

FDA

U.S. Food and Drug Administration

Cục quản lý Thực phẩm và
Dược phẩm Hoa Kỳ

FPR

False positive rate

Tỉ lệ dương tính giả

GWAS

Genome-wide association study

Nghiên cứu tương quan

toàn bộ hệ gen

HSF

Human Splicing Finder


viii
IM

Intermediate metabolizer

Chuyển hóa thuốc trung
bình

Indel

Insertion/deletion

Biến thể thêm/mất
nucleotide

INR

International normalized ratio

Chỉ số phản ánh thời gian
hình thành cục máu đơng

LD

Linkage disequilibrium

Độ liên kết giữa các biến
thể

LR-PCR

Long range PCR

MLPA

Multiplex ligation dependent probe
amplification

PCR

Polymerase chain reaction

PGRN

Pharmacogenomics Research
Netwwork

Mạng lưới nghiên cứu hệ
gen dược học

PharmVar

Pharmacogene Variation

Đa dạng di truyền các gen
dược học

PM

Poor metabolizer

Chuyển hóa thuốc yếu

SNP

Single nucleotide polymorphism

Đa hình đơn nucleotide

SRS

Substrate recognition site

Vị trí nhận biết cơ chất

SSRI

Selective serotonin reuptake
inhibitor

Ức chế tái hấp thu
serotonine

SV

Structural variant

Biến thể cấu trúc

TPMT

Thiopurine S-methyltransferase

enzyme chuyển hóa các
thuốc thiopurine

UM

Ultra rapid metabolizer

Chuyển hóa thuốc cực
nhanh

Khuếch đại đa đầu dò phụ
thuộc phản ứng ghép nối


ix
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi sử dụng cho khuếch đại gen CYP2C9 ................... 43
Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi sử dụng cho khuếch đại gen CYP2C19 ................. 44
Bảng 2.3. Trình tự các mồi sử dụng cho khuếch đại gen CYP2D6 ......................... 44
Bảng 2.4. Trình tự các cặp mồi sử dụng cho khuếch đại gen CYP3A5 ................... 45

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR giải trình tự ................................................. 46
Bảng 2.6. Thông số điện di mao quản trên máy 3500............................................. 49
Bảng 2.7. Mối liên hệ giữa giá trị DQ và số bản sao của mẫu nghiên cứu .............. 50
Bảng 2.8. Trình tự các cặp mồi sử dụng cho real-time PCR ................................... 52
Bảng 3.1. Các biến thể của CYP2C9 trong quần thể người Kinh Việt Nam ............ 60
Bảng 3.2. Dữ liệu MLPA về CNV gen CYP2C9 của một số mẫu nghiên cứu ........ 62
Bảng 3.3. Tần số kiểu gen CYP2C9 trong quần thể người Kinh Việt Nam ............. 65
Bảng 3.4. Tần số các allele CYP2C9 trong quần thể người Kinh Việt Nam ........... 65
Bảng 3.5. Các biến thể của CYP2C19 trong quần thể người Kinh Việt Nam .......... 66
Bảng 3.6. Dữ liệu MLPA về CNV gen CYP2C19 của một số mẫu nghiên cứu ...... 68
Bảng 3.7. Tần số kiểu gen của CYP2C19 trong quần thể người Kinh Việt Nam .... 69
Bảng 3.8. Tần số các allele CYP2C19 trong quần thể người Kinh Việt Nam.......... 69
Bảng 3.9. Biến thể của CYP2D6 trong quần thể người Kinh Việt Nam xác định bằng
phương pháp giải trình tự ...................................................................................... 70
Bảng 3.10. Xác định kiểu gen của CYP2D6 ở người Kinh Việt Nam thơng qua kết
hợp dữ liệu giải trình tự và MLPA ......................................................................... 78
Bảng 3.11. Tần số allele của CYP2D6 trong quần thể người Kinh Việt Nam ......... 80
Bảng 3.12. Tần số kiểu gen và tần số allele CYP3A5 trên người Kinh Việt Nam ... 84
Bảng 3.13. Dữ liệu MLPA về CNV gen CYP3A5 của một số mẫu nghiên cứu ....... 84
Bảng 3.14. So sánh tần số các biến thể CYP2C9 trong nghiên cứu này với các quần
thể khác trên thế giới ............................................................................................. 91
Bảng 3.15. So sánh tần số các biến thể CYP2C19 trong nghiên cứu này với các quần
thể khác trên thế giới ............................................................................................. 92
Bảng 3.16. So sánh tần số các allele của CYP2D6 có ảnh hưởng đến chức năng protein
ở quần thể người Kinh Việt Nam và các quần thể khác trên thế giới ...................... 94
Bảng 3.17. So sánh tần số allele CYP3A5*3 trong nghiên cứu này với các quần thể
khác trên thế giới ................................................................................................... 96


x

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc của CYP450 và các vị trí nhận biết cơ chất (SRS) . .................... 6
Hình 1.2. Đa dạng di truyền các gen CYP450 và vai trị trong chuyển hóa thuốc . ... 7
Hình 1.3. Các biến thể sai nghĩa và dịch khung của CYP2C9. ................................ 10
Hình 1.4. Phân bố một số biến thể trên gen CYP2C19 . ......................................... 12
Hình 1.5. Cấu trúc gen CYP2D6 và sự phân bố của một số biến thể . .................... 16
Hình 1.6. Phân bố của các biến thể trên gen CYP3A5. ........................................... 18
Hình 1.7. Ảnh hưởng của các ADR tới các cơ quan trong cơ thể. .......................... 21
Hình 1.8. Ứng dụng di truyền dược học trong xây dựng chiến lược sử dụng thuốc phù
hợp. ....................................................................................................................... 29
Hình 2.1. Sơ đồ chi tiết thực hiện nghiên cứu ........................................................ 41
Hình 3.1. Điện di đồ 9 mẫu DNA tổng số .............................................................. 55
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP2C9 của 8 mẫu nghiên cứu .... 56
Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP2C19 của 8 mẫu nghiên cứu... 57
Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP2D6 của 5 mẫu nghiên cứu .... 58
Hình 3.5. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP3A5 của 8 mẫu nghiên cứu ..... 58
Hình 3.6. Các biến thể mới trong vùng intron và exon của CYP2C9 ...................... 61
Hình 3.7. Kết quả MLPA xác định mất toàn bộ 01 bản sao của gen CYP2C9. ....... 63
Hình 3.8. Kết quả Real-time PCR kiểm tra mất số bản sao của CYP2C9 ............... 64
Hình 3.9. Các biến thể mới trong vùng intron của CYP2C19. ................................ 67
Hình 3.10. Các biến thể mới trong vùng promoter CYP2D6 .................................. 72
Hình 3.11. Các biến thể mới trong intron và exon của CYP2D6 ............................. 73
Hình 3.12. Kết quả MLPA xác định số bản sao bình thường của gen CYP2D6 ...... 74
Hình 3.13. Kết quả MLPA xác định bất thường số bản sao (các exon 1,5,6) gen
CYP2D6. ............................................................................................................... 75
Hình 3.14. Kết quả MLPA xác định mất toàn bộ 01 bản sao của gen CYP2D6. ..... 75
Hình 3.15. LR-PCR kiểm tra allele CYP2D6*5. .................................................... 76
Hình 3.16. Các SV của CYP2D6 được xác định trên các mẫu người Kinh ............. 82
Hình 3.17. Kết quả giải trình tự của CYP3A5*3. .................................................... 83
Hình 3.18. Phân tích liên kết giữa các biến thể gen CYP2C9 ................................ 86

Hình 3.19. Phân tích liên kết giữa các biến thể gen CYP2C19 .............................. 86
Hình 3.20. Phân tích liên kết giữa các biến thể gen CYP2D6 ................................. 87


xi
Hình 3.21. Dự đốn chức năng của biến thể CYP2C9 42627C>A bằng Polyphen 2 (a)
và PROVEAN (b) .................................................................................................. 88
Hình 3.22. Tính bảo thủ của vị trí amino acid Proline 363 trên protein CYP2C9 ... 88
Hình 3.23. Dự đốn chức năng của các biến thể 3157G>T và 2988G>A thuộc
CYP2D6 ................................................................................................................ 90
Hình 3.24. Tính bảo thủ của vị trí amino acid Argine 329 trên protein CYP2D6 ... 90


1

MỞ ĐẦU
Các enzyme cytochrome P450 (CYP450) thuộc một họ protein-heme lớn,
những enzyme này có vai trị thiết yếu đối với các q trình chuyển hóa hợp chất nội
sinh và ngoại sinh. Ở người, có 57 gen chức năng và 58 gen giả đã được báo cáo,
trong đó các CYP450 được phân loại thành 18 họ và 44 phân họ. Hầu hết các gen
trong nhóm này đều mang những chức năng sinh học trong chuyển hóa các chất nội
sinh như acid mật, eicosanoid và steroid. Tuy nhiên, khoảng 12 enzyme CYP450
thuộc các phân họ CYP1, CYP2 và CYP3 là tham gia chuyển hóa thuốc chính. Phần
lớn các loại thuốc được kê đơn trong lâm sàng được chuyển hóa bởi các enzyme
CYP450, ngồi ra cũng có rất nhiều loại thuốc chỉ được chuyển hóa bởi một CYP450
duy nhất. Có thể thấy, những yếu tố nội sinh và ngoại sinh gây ảnh hưởng đến hoạt
tính enzyme của CYP450 đóng vai trị rất quan trọng đến dược động học của các loại
thuốc được đưa vào cơ thể. Đối với một số các CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc
như CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6, các biến thể di truyền trong các gen mã hóa
cho protein có ảnh hưởng nhiều đến sự khác biệt trong hoạt tính của enzyme, trong

khi đó đối với những CYP450 khác (CYP1A2, CYP3A4) thì tỉ lệ này khơng đáng kể.
Các gen mã hóa cho các enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc có tính
đa hình rất cao. Sự đa dạng di truyền này được thể hiện ở những đa hình đơn
nucleotide (Single nucleotide polymorphism-SNP) xuất hiện với tần số hiếm (rare)
hoặc phổ biến (common), ngồi ra cịn có các biến thể số bản sao (Copy number
variant-CNV) bao gồm các mất/lặp đoạn. Chức năng của biến thể được phân loại từ
không chức năng đến tăng cường chức năng, từ đó mà kiểu hình chuyển hóa được
chia thành các cấp độ: chuyển hóa thuốc yếu (Poor Metabolizer-PM), chuyển hóa
thuốc trung bình (Intermediate Metabolizer-IM), chuyển hóa thuốc bình thường
(Extensive Metabolizer-EM) và chuyển hóa thuốc cực nhanh (Ultrarapid MetaolizerUM). Những CYP450 tham gia vào chuyển hóa nhiều loại thuốc trên thị trường nhất
hiện nay là CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A4/5. Năm gen CYP450 nói trên
mã hóa cho các enzyme tham gia vào chuyển hóa 60-80% các loại thuốc thường được
kê đơn.


2
Tính cấp thiết của vấn đề nghiên cứu:
Sự khác nhau trong đáp ứng thuốc giữa các cá nhân là điều khó tránh khỏi
trong điều trị, trong đó có các phản ứng có hại của thuốc (Adverse drugs
reaction/ADR). Các ADR là một trong những nguyên nhân chính của các trường hợp
bệnh nhân phải nhập viện, một số có thể dẫn tới tử vong. Ingelman-Sunberg và cộng
sự đã ước tính ADR làm tiêu tốn khoảng 100 tỉ đô la Mỹ, đây cũng là nguyên nhân
dẫn tới 100.000 ca tử vong mỗi năm tại Mỹ. Khoảng 7% các ca nhập viện tại Anh và
Thụy Điển cũng có nguyên nhân từ các ADR. Từ năm 2009, Hiệp hội ứng dụng Di
truyền dược học lâm sàng (Clinical Pharmacogenetics Implementation ConsortiumCPIC) đã cung cấp các thông tin về việc xét nghiệm di truyền có thể được sử dụng
trong tối ưu hóa phác đồ sử dụng thuốc. Đối với một vài loại cặp gen-thuốc, CPIC
cũng đã đưa ra những chỉ dẫn về liều dùng cụ thể. Như đã trình bày ở trên, các gen
CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 là 4 trong số các gen CYP450 có tính đa
hình cao mà các dạng đa hình của chúng khiến cho bệnh nhân có khả năng chuyển
hóa từng loại thuốc cụ thể rất khác nhau, từ mạnh tới yếu. Cho tới nay, các hiểu biết

về đa dạng di truyền của nhóm gen CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc ở người Việt
Nam còn rất hạn chế. Ngày nay, vai trò của dược lý học di truyền liên quan đến
chuyển hóa thuốc và tương tác thuốc trong lâm sàng mang tính cấp bách và rất cần
đầu tư nghiên cứu. Hiểu biết về tính đa dạng di truyền của các gen tham gia chuyển
hóa thuốc ở người Việt Nam được coi là tiền đề để phát triển lĩnh vực này. Nghiên
cứu này tập trung vào việc phát hiện các allele đã biết cũng như xác định cả những
allele mới ở người Việt Nam. Do vậy, số liệu thu được từ nghiên cứu sẽ cung cấp
những thông tin khoa học về đa dạng di truyền của các gen CYP2C9, CYP2C19,
CYP2D6 và CYP3A5 trên người Việt Nam. Đây cũng là những tiền đề có ý nghĩa và
đóng góp một phần cho sự phát triển của lĩnh vực di truyền dược học và y học cá thể.
Mục tiêu nghiên cứu:
-

Xây dựng cơ sở dữ liê ̣u về đa hình/đô ̣t biế n của 04 gen CYP2C9, CYP2C19,
CYP2D6 và CYP3A5 ở người Kinh Viê ̣t Nam.

-

Xác định kiểu gen và tần số các allele của 04 gen CYP2C9, CYP2C19,
CYP2D6 và CYP3A5 trên người Kinh ở Việt Nam đồ ng thời phân tích và dự
đoán chức năng của các biế n thể mới.


3
Cách tiếp cận nghiên cứu:
Đối tượng nghiên cứu là 136 người Kinh khỏe mạnh khơng có quan hệ huyết
thống. Nghiên cứu này sử dụng phương pháp giải trình tự Sanger nhằm xác định tất
cả các biến thể nằm trong vùng promoter cùng với tất cả 9 exon và vùng biên của 03
gen CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6. Đối với gen CYP3A5, phương pháp giải trình
tự Sanger cũng được áp dụng nhằm xác định các biến thể đã được công bố là có ảnh

hưởng đến hoạt tính của enzyme bao gồm: *3, *6, *8 và *9. Các CNV của các gen
nghiên cứu được xác định bằng phương pháp khuếch đại đa đầu dò phụ thuộc phản
ứng ghép nối (Multiplex ligation-dependent probe amplification-MLPA). Những
mẫu được xác định là có bất thường số bản sao được kiểm tra lại bằng phương pháp
Long range PCR hoặc real-time PCR. Các biến thể sau khi đã được xác định sẽ tiếp
tục được tổng hợp số liệu để tính tốn tần số allele cũng như tần số kiểu gen trên tổng
số mẫu nghiên cứu đối với mỗi gen. Tiến hành so sánh về tần số và phân bố của các
allele của mỗi gen ở quần thể người Kinh Việt Nam so với các quần thể người khác.
Bên cạnh đó, những biến thể mới được tiến hành phân tích in silico nhằm dự đoán
ảnh hưởng của các biến thể này đến chức năng của protein tương ứng.
Những đóng góp mới của luận án:
Xác định được một số biến thể mới trong promoter và intron của các gen
CYP450, cụ thể: 5 biến thể mới trong in tron của CYP2C9, 3 biến thể mới trong intron
của CYP2C19, 3 biến thể mới trong promoter và 2 biến thể mới trong intron của
CYP2D6 và 3 biến thể mới thuộc vùng mã hóa của 2 gen CYP2C9 và CYP2D6. Đã
phân tích in silico cho thấy những biến thể này gây ảnh hưởng có hại đến chức năng
của protein.
Các biến thể CYP2D6*5, CYP2D6*10, CYP2D6*13 và CYP2D6*36-*10 đã
được xác định trên người Kinh ở Việt Nam là những biến thể làm giảm hoặc mất hoạt
tính của enzyme đã được xác định với tỉ lệ lần lượt là: 8,09%, 43,75%, 1,547% và
12,13%.


4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. CYP450 và chuyển hóa thuốc trong gan
Thuốc là những chế phẩm có chứa dược chất dùng với mục đích phịng-chữa
bệnh hay điều trị giảm nhẹ. Enzyme chuyển hóa thuốc được biết đến nhiều nhất là
các enzyme CYP450, đây là những enzyme tham gia vào các quá trình oxi hóa khử
và thủy phân. Mục tiêu chính của q trình chuyển hóa thuốc đó là giúp đào thải

thuốc ra khỏi cơ thể. Ví dụ như các tiền chất (khơng có hoạt tính dược lý) sau khi
được hấp thụ vào cơ thể sẽ được chuyển đổi thành thuốc có hoạt tính. Mặt khác đa số
các loại thuốc sau khi chuyển hóa sẽ chuyển sang trạng thái kém hoạt động hơn. Q
trình chuyển hóa thuốc xảy ra ở nhiều cơ quan trong cơ thể như gan, thành ruột, phổi,
thận và huyết tương. Trong số đó, gan là cơ quan chuyển hóa thuốc đầu tiên, đóng
vai trị như vị trí thải độc và loại thải các chất ngoại lai bằng cách biến đổi các hợp
chất tan trong lipid trở nên ưa nước hơn, q trình này có sự tham gia của các enzyme.
Q trình chuyển hóa thuốc tại gan trải qua 3 giai đoạn: pha I, pha II và pha
III. Trong đó pha I có sự tham gia của các enzyme CYP450, pha II được thực hiện
bởi các enzyme vận chuyển acid glucuronic của UDP (UDP-glucuronosyltransferase)
(chuyển hóa 40-70% các loại thuốc) và trong pha III thì các enzyme vận chuyển thuốc
(drug transporter) sẽ giúp đưa sản phẩm chuyển hóa thuốc tới mật.
Klingenberg lần đầu tiên phát hiện ra CYP450 vào năm 1954 trong nghiên cứu
về chuyển hóa hoocmon steroid, khi ơng trích xuất một loại protein mới từ tế bào gan
[1]. Gần một thập kỷ sau, chức năng và tầm quan trọng của CYP450 đã được xác
định. Năm 1963, Estabrook và cộng sự đã mơ tả vai trị của CYP450 như một chất
xúc tác trong quá trình tổng hợp hormone steroid và chuyển hóa thuốc. Cooper và
các đồng nghiệp sau đó đã xác nhận CYP450 là một enzyme chủ chốt liên quan đến
phản ứng hydroxyl hóa thuốc và steroid [2]. Nhiều protein CYP450 đã được phát hiện
rộng khắp cơ thể, chứng tỏ sự tham gia đáng kể vào hoạt hóa hóa học, khử hoạt tính
và gây ung thư [3].
Các enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc pha I là các protein biểu hiện
chủ yếu trên mạng lưới nội chất trơn và ti thể của các tế bào gan và biểu mô ruột non
(ngồi ra cũng cịn ở một số cơ quan khác). Ở người, có 115 gen CYP450 bao gồm


5
cả các gen giả, được đặt tên bắt đầu từ CYP1A1 và kết thúc bởi CYP51P3. Các protein
được mã hóa bởi các CYP450 được phân loại dựa trên mức độ tương đồng về trình tự
của các amino acid thành các cấp độ từ họ (ví dụ: họ CYP1, CYP2…), phân họ (ví

dụ: phân họ CYP1A, CYP2B…) và từng enzyme riêng lẻ (ví dụ: enzyme CYP1A1,
CYP2D6…). Trong số các CYP450 biểu hiện trong gan thì CYP3A4 có mức độ biểu
hiện mạnh nhất (chiếm 22,1%), tiếp theo là 2 enzyme CYP2E1 (15,3%) và CYP2C9
(14,6%) tính trên tổng số protein trong gan. Các enzyme CYP450 tham gia xúc tác
cho nhiều loại phản ứng như: oxi hóa, oxi hóa sulpho (lưu huỳnh), hydroxyl hóa vịng
(nhân) thơm, hydroxy hóa hợp chất khơng vịng, khử (tách) nhóm N-alkyl, khử (tách)
nhóm O-alkyl (alkoxy).
Trong số các phản ứng này, phản ứng oxi hóa là phản ứng giúp thêm một
nguyên tử oxy vào phân tử thuốc, được biểu diễn bằng phương trình sau:
NADPH + H+ + O2 + RH →

NADP+ + H2O + ROH

Về mặt cấu trúc, CYP450 là những protein có khoảng 400-500 amino acid và
chứa một nhóm heme với nguyên tử Fe ở trung tâm. Tất cả các CYP450 đều có chung
cấu trúc bảo thủ được tạo nên bởi bốn vòng xoắn D, L, I và E. Trong đó nhóm heme
nằm giữa vịng xoắn I và L. Mặc dù cấu trúc dạng gấp cuộn của CYP450 có tính bảo
thủ cao, vẫn có sự đa dạng trong cấu trúc của các họ CYP450 khác nhau từ đó cho
phép protein này kết hợp với các cơ chất với kích thước khác nhau và mức độ đặc
hiệu khác nhau. Một số CYP450 có tính đặc hiệu cao trong q trình oxi hóa cơ chất,
trong khi đó CYP3A4 lại tham gia chuyển hóa hơn 50% các loại thuốc trên thị trường
hiện nay. Ở mức độ đơn giản nhất về mặt cấu hình nhận biết và kết hợp với cơ chất
thì có 6 vị trí nhận biết cơ chất (Substrate recognition site-SRS). Các vị trí này bao
gồm vùng xoắn B' (SRS1), một phần của các chuỗi xoắn F và G (SRS2 và SRS3),
một phần của chuỗi xoắn I (SRS4), vùng β2 của chuỗi xoắn K (SRS6) và cấu trúc
kẹp tóc β4 (SRS5) ở trung tâm hoạt động của CYP450 (Hình 1.1). Trên thực tế, các
SRS định trước tính đặc hiệu cơ chất của các CYP450 và những đột biến điểm xảy ra
tại các vị trí này do đó có thể ảnh hưởng đến độ đặc hiệu đối với cơ chất [4]. Các SRS
là những vùng cấu trúc linh hoạt, có thể di chuyển khi kết hợp với cơ chất và có khả
năng cảm ứng phù hợp với cơ chất, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho mối liên kết

enzyme-cơ chất và sau đó là phản ứng xúc tác [5].


6

Hình 1.1. Cấu trúc của CYP450 và các vị trí nhận biết cơ chất (SRS) [6].
CYP450 có cấu trúc gấp nếp bảo thủ và được thể hiện bởi các vòng xoắn (đánh dấu
bằng các chữ cái in hoa). Các SRS được tô đậm tối màu.

1.2. Đa dạng di truyền các gen mã hóa cho enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa
thuốc.
Các gen chuyển hóa là một phần của hệ các gen dược học. Đây là những gen
đóng vai trị quan trọng trong biến đổi sinh học của thuốc, những thay đổi trong di
truyền của các gen này góp phần tạo nên sự khác biệt giữa các cá thể trong đáp ứng
thuốc [7]. Các gen liên quan đến chuyển hóa thuốc bao gồm gen mã hóa cho các
enzyme tham gia chuyển hóa thuốc pha I và pha II. Các enzyme chuyển hóa thuốc có
mức độ đa hình rất cao trong biểu hiện và hoạt tính của chúng.
Các CYP450 chính là nguồn gốc chính gây ra sự đa dạng trong dược động học
và dược lý học của thuốc. Các protein CYP450 biểu hiện mạnh nhất trong gan bao
gồm CYP3A4, CYP2C9, CYP2C19, CYP2C8, CYP2E1 và CYP1A2. Trong khi đó
các protein CYP2A6, CYP2D6, CYP2B6 và CYP3A5 biểu hiện ít hơn. Các CYP450
khác như CYP2J2, CYP1A1 và CYP1B1 biểu hiện chủ yếu ở ngoài gan. Các kiểu đa


7
hình di truyền khác nhau của các gen CYP450 sẽ quyết định về mặt chức năng và
kiểu hình chuyển hóa thuốc (PM, IM, EM và UM). Những CYP450 tham gia vào
chuyển hóa nhiều loại thuốc trên thị trường nhất hiện nay là CYP2C9, CYP2C19,
CYP2D6 và CYP3A4/5. Năm gen CYP450 nói trên mã hóa cho các enzyme tham gia
vào chuyển hóa 60-80% các loại thuốc thường được kê đơn. Trong số các protein

thuộc 18 họ CYP450, các protein có tính đa hình cao nhất là CYP2A6, CYP2B6,
CYP2C9, CYP2D6 và CYP2C19. Bên cạnh đó có một số protein CYP450 thuộc các
phân họ khác có tính đa hình thấp hơn như CYP1A1, CYP1A2, CYP2E1. Về chức
năng chuyển hóa thuốc, CYP3A4/5 tham gia chuyển hóa nhiều loại thuốc trên thị
trường nhất, tiếp theo là các enzyme CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 và CYP2E (Hình
1.2).
Phần tổng quan này trình bày khái quát về đa hình 04 gen mã hóa cho các
enzyme CYP450 chính tham gia chuyển hóa thuốc pha I bao gồm: CYP2C9,
CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5.

Hình 1.2. Đa dạng di truyền các gen CYP450 và vai trò trong chuyển hóa thuốc [8].
(a)Số lượng SNP trong một số gen CYP450. (b) Số lượng thuốc được chuyển hóa bởi các
enzyme CYP450. Các số trong biểu đồ thể hiện số lượng SNP/thuốc được chuyển hóa.

1.2.1. Gen CYP2C9
Gen CYP2C9 nằm ở vai dài của nhiễm sắc thể số 10, mã hóa cho protein có
490 amino acid và có khối lượng phân tử là 55,6 kDa. Vùng gen chứa CYP2C9 cũng


8
bao gồm các gen mã hóa cho các enzyme CYP2C8, CYP2C18 và CYP2C19. Trong
số 4 gen này, CYP2C9 là gen biểu hiện mạnh nhất và tham gia nhiều nhất vào các
q trình chuyển hóa thuốc. Trên thực tế, dữ liệu khối phổ cho thấy CYP2C9 chiếm
20% tổng số protein CYP450 trong gan. Ngoài gan, CYP2C9 cũng biểu hiện trong
đường tiêu hóa. Sau CYP3A4 và CYP2D6, CYP2C9 là enzym quan trọng nhất thuộc
họ cytochrome 450 tham gia vào các phản ứng oxi hóa và chuyển hóa khoảng 15%
các loại thuốc lưu hành bao gồm cả một số thuốc có chỉ số trị liệu hẹp [9]. Sự khác
biệt giữa các cá thể trong biểu hiện và hoạt tính của enzyme CYP2C9 có thể ảnh
hưởng tới hiệu quả sử dụng và sự an toàn khi dùng thuốc. Các phản ứng tương tác
thuốc xảy ra do sự ức chế hay kích hoạt CYP2C9 và đa hình di truyền của gen này là

nguyên nhân gây nên sự đa dạng trong hoạt tính của enzyme ở cấp độ in vivo [10,
11].
*Cơ chất đặc hiệu của CYP2C9
CYP2C9 tham gia vào q trình oxi hóa của nhiều loại thuốc, đồng thời cũng
tham gia chuyển hóa nhiều hợp chất nội sinh trong cơ thể như acid linoleic, acid
arachidonic và các chất ngoại sinh không phải là thuốc khác (galangin, methiocarb,
pyrene, sulprofos). Phần lớn các cơ chất của CYP2C9 là các hợp chất ở dạng acid
yếu, tuy nhiên CYP2C9 cũng chuyển hóa dạng N-demethylation một số các loại thuốc
như amitriptyline, fluoxetins và zopiclone. S-flurbiprofen, S-wafarin, tolbutamide,
phenytoin, losartan và diclofenac đều là các cơ chất của CYP2C9. Trong đó,
Diclofenac và tolbutamide là các cơ chất thường xuyên được sử dụng trong các
nghiên cứu đánh giá kiểu hình hoạt tính của enzyme. Nói chung, các loại thuốc là cơ
chất chuyển hóa của CYP2C9 có thể phân làm các nhóm như thuốc chống đông máu,
thuốc hạ huyết áp, các thuốc kháng viêm không phải steroid và thuốc hạ đường huyết
dạng uống.
*Đa hình di truyền của CYP2C9 và sự phân bố giữa các quần thể trên thế giới
Allele CYP2C9*2 (3608C>T, p.Arg144Cys) và *3 (42614A>C, p.Ile359Leu)
là những allele được nghiên cứu nhiều nhất, đồng thời đây cũng là những allele được
nghiên cứu rộng rãi nhất tren nhiều quần thể người cho tới nay [12]. Đối với allele
CYP2C9*2 và *3, các kết quả nghiên cứu cho thấy những biến thể này làm giảm
chuyển hóa S-warfarin và tolbutamide in vitro. Đồng thời những bệnh nhân có mang


9
các biến thể này có liên quan chặt chẽ đến việc sử dụng warfarin với liều thấp hơn
liều thông thường và tăng nguy cơ chảy máu [13]. Một số allele khác ít phổ biến hơn
cũng đã được xác định, tuy nhiên ngày càng nhiều dữ liệu về các biến thể di truyền
của CYP2C9 trên thế giới nhờ các kĩ thuật hiện đang phát triển mạnh mẽ như giải
trình tự tồn bộ hệ gen và hệ gen biểu hiện. CYP2C9*3 là allele phổ biến của các
nước Nam Á và CYP2C9*2 rất hiếm khi xuất hiện ở các nước Đông Á. Trong khi các

biến thể gây sai nghĩa và dịch khung đọc mở có thiên hướng hiếm thì CYP2C9*9 là
allele phổ biến hơn so với *2 và *3 ở các quần thể châu Phi. Tương tự, CYP2C9*11
có tần số xuất hiện ở châu Phi cao gấp 10 lần so với châu Âu mặc dù *11 và *12 là
các allele phổ biến nhất ở châu Âu chỉ sau *2 và *3. Như đã nói, các nước khu vự
Đơng Á có *3 là allele phổ biến nhất và hiếm khi xuất hiện *2 ở khu vực này. Trên
thực tế, CYP2C9*52 (33498C>G, p.Thr299Arg)-một biến thể hiếm gây sai nghĩa
cũng là biến thể ở khu vực Đông Á chỉ sau *3 [14]. Khu vực nam Ấn Độ xuất hiện
các allele *2, *3 và cả *14 (2%)-đây là allele rất hiếm khi xuất hiện ở các quần thể
khác trên thế giới. Trong một nghiên cứu trên 8 quần thể người khác nhau tại Mexico,
allele CYP2C9*2 xuất hiện ở 2 quẩn thể với tần số cao hơn so với khu vực Đông Á
và CYP2C9*3 xuất hiện ở 6 quần thể với tần số từ 3.7%-10.4% [15]. Kết quả này phù
hợp với tình trạng dân tộc có nguồn gốc pha trộn giữa châu Á và châu Âu của những
quần thể khu vực này.
Các biến thể gây dịch khung rất hiếm, trong đó allele CYP2C9*6 bị xóa 1
nucleotide ở exon 5 đã được công bố [16]. Biến thể này gây nên protein được tổng
hợp khơng hồn chỉnh và khơng có hoạt tính, tần số xuất hiện của biến thể này tại
châu Phi là 1% và hiếm thấy hơn ở các quần thể người khác. Việc giải trình tự
CYP2C9 ở một số quần thể độc lập đã được tiến hành. Ví dụ, trong một nghiên cứu
ở những người Alaska bản địa và Ấn-Mỹ đã cho thấy CYP2C9*2 và *3 ở người Yupik
xuất hiện với tần số thấp hơp so với những chủng tộc người khác ở Alaska. Trong khi
đó ở khu vực Đông Á, CYP2C9*29 chiếm 2% ở tộc người Yupik, ngồi ra tộc người
này cịn xuất hiện 2 biến thể mới là p.Met1Leu (6%) và p.Asn218Ile (4%) [17]. Với
việc thực hiện các nghiên cứu giải trình tự trên các quần thể người, các nhà khoa học
sẽ phát hiện được thêm các biến thể mới của CYP2C9.
Sự phân bố của một số biến thể sai nghĩa và dịch khung của CYP2C9 được
thể hiện chi tiết ở Hình 1.3.


10

Hình 1.3. Các biến thể sai nghĩa và dịch khung của CYP2C9 [18].
Gen CYP2C9 mã hóa cho protein bao gồm 490 amino acid (khối lượng 55,6 kDa). Gen
CYP2C9 bao gồ m 9 exon, nằm trên cụm gen bao gồm một số gen CYP450 thuộc nhiễm sắc
thể số 10. Cơ sở dữ liệu về đa dạng di truyền các gen dược học (Pharmacogene variationPharmVar) đã công bố 62 biến thể của CYP2C9. Trong số đó có các biến thể gây giảm (*2,
*3), mất hồn tồn hoạt tính của enzyme (*6, *15, *25) cùng với một số biến thể khác chưa
rõ chức năng (như *13).

Có một số các nghiên cứu về đa hình CYP2C9 ở vùng trình tự điều khiển của
gen này (khoảng 10.000 base ngược chiều với trình tự khởi đầu dịch mã). Tổng quát
lại, các nghiên cứu đã cho thấy các đa hình ở vùng mã hóa góp phần quan trong hơn
trong sự khác biệt về hoạt tính của enzyme nhưng cũng đã có những phát hiện thú vị
về các biến thể trong vùng trình tự khơng mã hóa.
Các biến thể trong vùng khơng mã hóa và ảnh hưởng của chúng tới chức năng
của protein được quan tâm nhiều nhất ở những cá thể mà khơng có đa hình nào được
tìm thấy ở vùng mã hóa. Biến thể -1188C>T (rs4918758) đã được báo cáo ở một vài
nghiên cứu trên người châu Âu, Bắc Mỹ và Nhật Bản. Mặc dù vậy, chưa có bằng
chứng nào cho thấy -1188C>T làm thay đổi quá trình phiên mã cũng như ảnh hưởng
tới liều dùng của wafarin [19]. Biến thể -2663delTG (rs71486745) nằm trong vùng
trình tự kết hợp với yếu tố phiên mã Nrf2 xuất hiện khá phổ biến ở những cá thể
không mang đa hình nào của CYP2C9 trong vùng mã hóa. Xa hơn về phía vùng 5’
của CYP2C9, biến thể -4302C>T (rs12251841) đã được tìm thấy ở người Mexico
nhưng lại khơng xuất hiện ở người Mĩ trắng khơng có nguồn gốc Latin [19]. Biến thể


11
này có liên quan tới sự giảm mức độ biểu hiện của gen. Một nghiên cứu xa hơn trên
những mẫu gan của các bệnh nhân được điều trị với warfarin cho thấy có nhiều kiểu
sắp xếp trình tự lặp lại ở vị trí -3979. Có 3 kiểu lặp lại được gọi tên dưới dạng ngắn,
vừa và dài đã được phát hiện. Kiểu lặp lại vừa là dạng biến thể phổ biến nhất, trong
khi đó nghiên cứu về cân bằng allele và gen báo cáo cho thấy dạng lặp lại ngắn có

liên quan tới sự giảm mức độ phiên mã của CYP2C9 trong gan. Hơn nữa, kiểu gen
đồng hợp tử với dạng lặp lại ngắn có liên quan tới cần giảm liều lượng warfarin, tuy
nhiên mức độ ảnh hưởng tới liều warfarin của biến thể dạng này không nhiều như
ảnh hưởng gây nên bởi CYP2C9*2 và *3 [20]. Một nghiên cứu về mối liên quan giữa
biến thể của CYP2C9 và liều lượng warfarin ở người Mỹ-Phi cho thấy một biến thể
trong intron 3 (rs7089580) có liên quan tới tăng liều dùng của warfarin. Biến thể này
nằm trong mối liên kết với một số biến thể khác trong intron và một trong các biến
thể này được cho là nằm trong vùng kết hợp với yếu tố phiên mã [21]. Một nghiên
cứu tương quan toàn bộ hệ gen (Genome-wide association study-GWAS) về liều
dùng warfarin ở người Mĩ-Phi đã cho thấy biến thể rs12777823 thuộc vùng điều khiển
của CYP2C9 có liên quan chặt chẽ đến liều lượng của thuốc này [22].
1.2.2. Gen CYP2C19
Protein CYP2C19 có khối lượng 55,92 kDa với 490 amino acid, protein này
được mã hóa bởi gen CYP2C19 dài 90,21 kb. Gen này bao gồm 9 exon, thuộc nhiễm
sắc thể số 10 tại vị trí 10q24.1. CYP2C19 biểu hiện trong gan với các bản phiên mã
dài 1901 bp, 2395 bp và 1417 bp. Enzyme này tham gia chuyển hóa nhiều loại thuốc,
trong đó có clopidogrel là thuốc sử dụng trong chống kết tập tiểu cầu. Những biến
thể di truyền của CYP2C19 lần đầu tiên được chú ý cách đây 46 năm. Kể từ thời điểm
đó, hơn 50 SNP đã được xác định với allele CYP2C19 kiểu dại được quy ước là *1.
Sự phân bố của một số biến thể CYP2C19 được thể hiện ở Hình 1.4.


12

Hình 1.4. Phân bố một số biến thể trên gen CYP2C19 [18].
Gen CYP2C19 gồm có 9 exon, nằm trên cụm gen bao gồm một số gen CYP450 thuộc nhiễm
sắc thể số 10. Cơ sở dữ liệu PharmVar đến nay đã cơng bố 37 biến thể của CYP2C19, trong
số đó một số biến thể đã biết chức năng như làm tăng cường (*17), giảm (*16, *26) hoặc
mất hồn tồn hoạt tính của enzyme (*2, *3, *7).

*Các biến thể gây giảm/mất chức năng enzyme CYP2C19
Các biến thể được nghiên cứu nhiều nhất từ trước đến nay là CYP2C19*2
(rs4244285) và *3 (rs4986893), cả 2 biến thể này đều có sự thay thế G bằng A.
CYP2C19*2 là biến thể tại vị trí nucleotide 681 trên cDNA, thuộc exon 5 gây ra sự
thay thế proline tại vị trí amino acid 227. CYP2C19*3 là biến thể tại nucleotide 636
trên cDNA thuộc exon 3 và gây nên sự thay thế tryptohan. Cả 2 biến thể đều tạo nên
hậu quả là hình thành protein CYP2C19 ngắn hơn bình thường, khơng có chức năng
và khơng có hoạt tính enzyme. Cụ thể, ảnh hưởng của các biến thể như CYP2C19*2,
*3 đến protein chức năng đã được đánh giá thông qua các nghiên cứu in vitro và in
vivo. Trong đó, các allele *2 và *3 làm giảm tỉ lệ chuyển hóa tiền chất proguanil thành
cycloguanil [23]. Những cá thể mang kiểu gen đồng hợp tử CYP2C19*2/*2 hoặc
CYP2C19*3/*3 sẽ có kiểu hình chuyển hóa yếu các cơ chất của CYP2C19 (ví dụ như
clopidogrel), điều này góp phần vào sự khác biệt trong đáp ứng thuốc giữa các cá thể.
Các biến thể khác cũng có liên quan đến mất chức năng enzyme CYP2C19 đó là *4
(1A>G), *5 (90033C>T), *6 (12478G>A), *7 (19294T>A) và *8 (12711T>C) nhưng
đây là những biến thể rất hiếm với tần số xuất hiện dưới 1% và cũng chưa được nghiên
cứu rộng rãi. Hoạt tính làm mất chức năng enzyme của các biến thể *5, *6, *7 khi