Nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn có khả năng sinh enzyme amylaza và cellulaza cao ứng dụng trong chế biến thức ăn cho gia súc nhai lại

ĐẠI HỌC THÁI NGUN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM
-----------------------------------

HỒNG TUẤN VŨ

Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN CÓ KHẢ
NĂNG SINH ENZYME AMYLAZA VÀ CELLULAZA CAO ỨNG
DỤNG TRONG CHẾ BIẾN THỨC ĂN CHO GIA SÚC NHAI LẠI”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chun ngành
Khoa
Khố học

:
:
:
:

Chính quy
Thú y
Chăn nuôi Thú y
2009 - 2014

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS. Trần Huê Viên
Khoa Chăn nuôi Thú y - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, 2013


ĐẠI HỌC THÁI NGUN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM
-----------------------------------

HỒNG TUẤN VŨ

Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN CÓ KHẢ
NĂNG SINH ENZYM EAMYLAZA VÀ CELLULAZA CAO ỨNG
DỤNG TRONG CHẾ BIẾN THỨC ĂN CHO GIA SÚC NHAI LẠI”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chun ngành
Khoa
Khố học

:
:
:
:

Chính quy
Thú y
Chăn nuôi Thú y
2009 - 2014

Thái Nguyên, 2013


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành được khóa luận tốt nghiệp này tôi đã nhận được sự
hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo và động viên của các thầy cô, bạn bè và gia đình.
Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Huê Viên
người đã hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành khóa
luận tốt nghiệp.
Tơi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, các anh chị làm việc tại Viện Vi
sinh vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp tơi trong
q trình hồn thành luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Chăn nuôi Thú y
đã dạy dỗ và giúp đỡ tơi trong suốt q trình vừa qua.
Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động
viên, giúp đỡ, hỗ trợ để tơi có thể hồn thành luận văn này.
Sinh viên

Hồng Tuấn Vũ


2
CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG KHOÁ LUẬN
ADN

: Axit deoxyribonucleic

ATVSTP

: An toàn vệ sinh thực phẩm

ARN

: Axit ribonucleic

ARNase

: Ribonuclease

ARNr

: Axit ribonucleic ribosome

CMC

: Cacboxyl metyl cellulose

DNS

: Axit Dinitrosalicylic

dNTP

: Deoxynucleoside triphosphate

EDTA

: Ethylene diamine tetra - acetic acid

kb

: Kilo base pair (base pair - Cặp bazơ của ADN kép)

NN-PTNT : Nông nghiệp phát triển nông thôn
OD

: Optical Density (Mật độ quang)

PCR

: Polymerase Chain Reaction

SDS

: Sodium Dodecyl Sulphate

TAE

: Tris - acetate - EDTA

SX

: Sản xuất

XK

: Xuất khẩu

3
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 4.1. Số lượng vi sinh vật phân lập được có khả năng phân giải
amylaza và cellulaza ..................................................................... 32
Bảng 4.2. Đặc điểm hình thái của 3 chủng vi khuẩn được lựa chọn .............. 33
Bảng 4.3. Lựa chọn môi trường ni cấy thích hợp cho khả năng sinh trưởng
và sinh tổng hợp enzyme của chủng 4.30.1 .................................. 34
Bảng 4.4. Lựa chọn mơi trường ni cấy thích hợp cho khả năng sinh trưởng
và sinh tổng hợp enzyme của chủng 4.30.9 .................................. 34
Bảng 4.5. Lựa chọn mơi trường ni cấy thích hợp cho khả năng sinh trưởng
và sinh tổng hợp enzyme của ba chủng 5.30.1 ............................. 34
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của pH môi trường tới khả năng sinh trưởng và sinh
tổng hợp enzyme của chủng 4.30.1 ............................................... 35
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của pH môi trường tới khả năng sinh trưởng và sinh
tổng hợp enzyme của chủng 4.30.9 ............................................... 36
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của pH môi trường tới khả năng sinh trưởng và sinh
tổng hợp enzyme của chủng 5.30.1 ............................................... 36
Bảng 4.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng sinh trưởng và sinh
tổng hợp enzyme của chủng 4.30.1 ............................................... 37
Bảng 4.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng sinh trưởng và sinh
tổng hợp enzyme của chủng 4.30.9 ............................................... 37
Bảng 4.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng sinh trưởng và sinh
tổng hợp enzyme của chủng 5.30.1 ............................................... 38
Bảng 4.12. pH thích hợp cho enzyme trong dịch nuôi cấy các
chủng vi khuẩn .............................................................................. 38
Bảng 4.13. Nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ enzyme của dịch nuôi của các
chủng vi khuẩn .............................................................................. 39

4
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Cấu trúc mạch amyloza (glucose-α-1,4-glucose) ............................. 9
Hình 2.2: Cấu trúc mạch amylopectin ............................................................ 10
Hình 2.3: Cấu trúc của α-amylaza................................................................... 11
Hình 2.4: Hợp chất cao phân tử Celluloza ...................................................... 14
Hình 2.5: Các mắt xích β-D-Glucose trong Celluloza .................................... 15
Hình 2.6: Cellulaza.......................................................................................... 16


5
MỤC LỤC
Trang
PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ ...........................................................................................1
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................4
2.1. ENZYME VI SINH VẬT....................................................................................4
2.1.1. Enzyme ...............................................................................................................4
2.1.2. Hệ thống enzyme vi sinh vật ............................................................................5
2.1.3. Yêu cầu giống VSV trong công nghiệp enzyme ............................................7
2.2. TINH BỘT, CELLULOZA VÀ CÁC ENZYME THUỶ PHÂN ..................8
2.2.1. Tinh bột và enzyme amylaza ............................................................................8
2.2.1.1. Tinh bột ................................................................................................ 8
2.2.1.2. Amylaza ............................................................................................. 10
2.2.1.3. Ứng dụng của Amylaza ...................................................................... 12
2.2.1.4. Các chế phẩm ứng dụng của enzyme amylaza .................................. 13
2.2.2. Celluloza và Cellulaza.......................................................................................14
2.2.2.1. Celluloza............................................................................................. 14
2.2.2.2. Cellulaza ............................................................................................. 16
2.2.2.3. Ứng dụng của enzyme Cellulaza........................................................ 17

2.2.2.4. Các chế phẩm ứng dụng của enzyme ................................................. 18
2.3. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LÊN KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP AMYLAZA VÀ CELLULAZA Ở VI KHUẨN....................18
2.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ ....................................................................................18
2.3.2. Ảnh hưởng của pH ............................................................................................19
2.3.3. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên khả năng tổng hợp enzyme của
vi khuẩn .........................................................................................................................19
2.4. TỔNG QUAN VỀ ĐỘNG VẬT NHAI LẠI ....................................................19
2.4.1. Giới thiệu về động vật nhai lại .........................................................................19
2.4.2. Vai trò và tác dụng của vi sinh vật trong hệ thống tiêu hóa của động vật
nhai lại ...........................................................................................................................20


6
2.4.3. Vai trò của Ngành thú y Việt Nam trong q trình kiểm sốt thức ăn chăn
ni giai đoạn hội nhập................................................................................................22
2.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU AMYLAZA VÀ CELLULAZA TRONG VÀ
NGỒI NƯỚC ............................................................................................................24
PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................25
3.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ..................................................25
3.2. NGUYÊN LIỆU ...................................................................................................25
3.2.1. Mẫu phân lập ......................................................................................................25
3.2.2. Hóa chất ..............................................................................................................25
3.2.3. Mơi trường..........................................................................................................25
3.2.4. Thiết bị ................................................................................................................27
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................28
3.3.1. Phương pháp phân lập và tuyển chọn ..............................................................28
3.3.2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme ........................................................28
3.3.3. Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn..................................................29
3.3.4. Quan sát hình thái ..............................................................................................29

3.3.5. Các điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh trưởng và sinh enzyme của các
chủng vi khuẩn .............................................................................................................30
3.3.5.1. Lựa chọn môi trường ni cấy thích hợp ........................................... 30
3.3.5.2. Lựa chọn pH thích hợp....................................................................... 30
3.3.5.3. Lựa chọn nhiệt độ thích hợp .............................................................. 30
3.3.5.4. Lựa chọn nguồn cacbon ..................................................................... 30
3.3.5.5. Lựa chọn nguồn nitơ .......................................................................... 30
3.3.6. Nghiên cứu đặc tính enzyme của các chủng vi khuẩn ...................................30
3.3.6.1. pH thích hợp của enzyme trong dịch ni vi khuẩn .......................... 31
3.3.6.2. Nhiệt độ thích hợp của enzyme trong dịch nuôi cấy vi khuẩn........... 31
3.3.7. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................31
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...............................................................32
4.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN.................................................32
4.1.1. Phân lập ..............................................................................................................32
4.1.2. Tuyển chọn .........................................................................................................32


7
4.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI ........................................................33
4.3. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NI CẤY THÍCH HỢP CHO SỰ SINH
TRƯỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ENZYME CỦA VI KHUẨN PHÂN GIẢI
AMYLAZA VÀ CELLULAZA ................................................................................33
4.3.1. Lựa chọn mơi trường ni cấy thích hợp ........................................................33
4.3.2. Lựa chọn pH thích hợp......................................................................................35
4.3.3. Lựa chọn nhiệt độ ni cấy thích hợp .............................................................36
4.4. NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH ENZYME.............................................................38
4.4.1. pH thích hợp cho enzyme hoạt động trong dịch ni cấy các
chủng vi khuẩn .............................................................................................................38
4.4.2. Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme trong dịch nuôi cấy các
chủng vi khuẩn .............................................................................................................39

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................40
5.1. Kết luận ..................................................................................................................40
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................40
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................41
I. TIẾNG VIỆT.............................................................................................................41
II. TIẾNG ANH............................................................................................................42
III. TRANG WEB ........................................................................................................44


1

PHẦN 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là một nước đang phát triển, phần lớn dân số hoạt động trong
lĩnh vực nông nghiệp. Trong nơng nghiệp,ngành Thú y chiếm một vị trí quan
trọng, Ngành Thú y được xem là ngành bảo vệ sức khỏe, khơng những cho
con vật mà cịn cho con người. Ngành Thú y giải quyết các vấn đề về thực
phẩm từ gốc.
Khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển cho nên các ngành khoa học
ứng dụng ngày càng được ứng dụng vào thực tế, từ đó giúp cho cuộc sống
ngày càng nâng cao và hồn thiện.
Trong đó, lĩnh vực sản xuất và nghiên cứu về enzyme đặc biệt phát triển, là
mục tiêu nghiên cứu của nhiều đề tài mang tính ứng dụng cao và khoa học.
Enzyme có bản chất là protein, nó có khả năng xúc tác sinh học khơng
những bên trong cơ thể mà cịn có thể thực hiện bên ngoài cơ thể khi tạo cho
chúng điều kiện thích hợp để hoạt động.
Nhân tố quan trọng để thúc đẩy ngành công nghiệp enzyme phát triển
là khả năng to lớn của vi sinh vật. Các vi sinh vật có tốc độ phát triển cực kỳ
nhanh đồng thời enzyme do chúng tạo ra có hoạt lực cao. Bên cạnh đó, mơi
trường ni cấy vi sinh vật chúng ta có thể tận dụng phế thải của ngành khác.

Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn đề được các nhà
khoa học và kỹ thuật chú ý từ lâu. Ngày nay, việc sử dụng này đã trở thành
phổ biến ở nhiều nước mang lại lợi ích kinh tế khá lớn.
Ngoài số enzyme đã được sử dụng rộng rãi và lâu đời (amylaza,
proteaza...), cịn có hàng chục loại enzyme khác đã được nghiên cứu và áp
dụng vào thực tế.
Trước đây, các enzyme dùng nghiên cứu hoặc áp dụng trong sản xuất,
thường thu nhận từ động vật, thực vật. Nhưng vài chục năm gần đây, người ta
đã chú ý đến một nguồn enzyme vơ cùng phong phú và rẻ tiền, đó là nguồn


2
enzyme từ vi sinh vật. Thực ra đây là một nguồn enzyme rất quen thuộc đối
với một số nước phương đông (Trung Quốc, Nhật Bản).
Để mở rộng việc sử dụng các enzyme vào thực tế cuộc tế ở nước ta và
đáp ứng yêu cầu của một số cơ sở sản xuất trong những năm qua, các nhà
khoa học đã tiến hành nghiên cứu tách và chọn chủng vi sinh vật có tính
enzyme cao, nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho việc tổng hợp mạnh mẽ
enzyme của chúng, thu nhận chế phẩm enzyme Amylaza và Cellulaza là
những enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng và phổ biến trong đời sống, Bên
cạnh đó, chúng cũng được ứng dụng rộng rãi trong các ngành và lĩnh vực
khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp…hoạt tính chung của enzyme nói
chung đều bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố. Do đó để thu nhận enzyme có hiệu
quả nhất cần khảo sát điều kiện tối ưu.
Để giúp động vật nhai lại nói riêng và động vật nói chung tận dụng triệt
để nguồn dinh dưỡng trong thức ăn, người ta thêm vào khẩu phần ăn của chúng
các chế phẩm enzyme chứapectinase, cellulase, xylanase, hemicellulase. Từ đó,
cung cấp đầy đủ hơn chất dinh dưỡng giúp cho gia súc nhai lại có thể tăng
trọng nhanh, đạt năng suất cao, phẩm chất tốt, tăng sức đề kháng.
Từ những mục đích trên tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm

sinh học của vi khuẩn có khả năng sinh enzyme amylaza và cellulaza cao
ứng dụng trong chế biến thức ăn cho gia súc nhai lại” nhằm tìm ra được
các chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme amylaza và cellulaza cao để
góp phần đưa vào quy trình sản xuất thức ăn chăn nuôi gia súc.
* Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:
- Phân lập và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn có khả năng sinh
enzyme amylaza và cellulase cao.
- Tuyển chọn được bộ giống vi sinh vật của vi khuẩn có khả năng sinh
các chất hoạt động sinh học mạnh(các enzyme ngoại bào) ứng dụng trong
việc chế biến thức ăn cho gia súc nhai lại.
- Nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh
tổng hợp amylaza và cellulase.


3
- Định loại các chủng vi khuẩn thu được
- Sơ bộ nghiên cứu đặc tính của enzyme amylaza và cellulase.
* Mục đích nghiên cứu:
- Phân lập và tuyển chọn được các chủng vi sinh vật có hoạt tính
enzyme cao.
- Nghiên cứu các đặc tính sinh học của các chủng trên
- Các chủng vi sinh vật phải an toàn với người, động vật và môi trường
- Dễ dàng nuôi cấy
* Ý nghĩa của đề tài:
- Ý nghĩa khoa học: Tìm ra các chủng vi sinh vật và khai thác nguồn
gen của các chủng bản địa.
- Ý nghĩa thực tiễn: Tìm ra các chủng vi sinh vật bản địa, không độc hại
với vật ni và mơi trường lại có khả năng tổng hợp các chất sinh học có hoạt
tính cao, đặc biệt là các enzyme ngoại bào để đưa vào sản xuất công nghiệp.

4

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. ENZYME VI SINH VẬT
2.1.1. Enzyme
Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất.
Sự trao đổi chất ngừng thì sự sống khơng cịn tồn tại. Q trình trao đổi của
một chất là tập hợp của rất nhiều các phản ứng hóa học phức tạp. Các phản
ứng này có liên quan chặt chẽ với nhau và điều chỉnh lẫn nhau. Enzyme là
hợp chất protein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó. Chúng có khả năng
xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho các phản
ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể
sống. Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống. Chính do
những tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên Enzyme còn được gọi là
các chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm để phân biệt với các chất xúc
tác hóa học. Chúng là chất xúc tác sinh học khơng chỉ có vai trị quan trọng
trong q trình sinh trưởng, phát triển của mọi sinh vật mà nó cịn giữ vai trị
rất quan trọng trong cơng nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ
thuật phân tích, trong cơng nghệ gen và bảo vệ mơi trường
Theo Apun K. và cs (2000)[15] thì Enzyme là những protein có chức
năng xúc tác, khơng thể thiếu trong hoạt động duy trì sự sống. Tất cả các phản
ứng hóa học diễn ra trong cơ thể sống đều cần có hoạt động xúc tác của
enzyme, vì thế enzyme được gọi là chất chuyển hóa sinh học.
Trong khoảng hai mươi năm trở lại đây, enzyme được sử dụng rất rộng rãi
trong nhiều ngành khác nhau của nền kinh tế quốc dân: hoá học, y học, trong
nhiều ngành công nghiệp nhẹ và đặc biệt là trong ngành công nghệ thực phẩm.
Sở dĩ enzyme được sử dụng phổ biến như vậy do chúng có các đặc điểm sau:
Theo Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi (2009)[11] thì Enzyme có

tính đặc hiệu cao, mỗi enzyme chỉ tác dụng lên một cơ chất nhất định. Tính
chất này rất quan trọng đặc biệt là khi chế biến các nguyên liệu có nguồn gốc
sinh vật, có thành phần hoá học phức tạp.


5
- Enzyme hoạt động trong những điều kiện tương đối bình thường và
phản ứng do enzyme xúc tác lại dễ dàng điều chỉnh.
- Enzyme có nguồn gốc tự nhiên, khơng độc. Đặc điểm này có ý nghĩa
quan trọng đối với các ngành thực phẩm và y học.
Dựa trên những đặc tính đó mà trong cơng nghiệp có thể sử dụng
enzyme nhằm hợp lý hố hoặc rút ngắn các q trình sản xuất, sử dụng quy
trình kỹ thuật mới, mở rộng phạm vi sử dụng nguyên liệu, giảm nhẹ điều kiện
lao động, tiết kiệm ngun vật liệu. Và cũng chính vì vậy mà việc tìm kiếm
các enzyme hiện nay cịn là cuộc chạy đua giữa các ngành công nghiệp trên
thế giới.
2.1.2. Hệ thống enzyme vi sinh vật
Tất cả các quá trình chuyển hóa hóa sinh trong cơ thể vi sinh vật đều có
sự tham gia của enzyme, dưới tác dụng của enzyme các phản ứng xảy ra
nhanh chóng mà khơng địi hỏi những điều kiện về nhiệt độ, áp suất cao, mơi
trường axít hay bazơ như những chất xúc tác khác. Enzyme vi sinh vật có khả
năng hoạt động cả trong và ngoài tế bào vi sinh vật.
Tế bào các sinh vật chứa nhiều loại enzyme khác nhau, enzyme có thể
được sản xuất từ động vật, thực vật như: amylaza từ hạt đại mạch nẩy mầm,
dứa hoặc từ dạ dày, tụy tạng… Nhưng q trình sản xuất này cịn gặp nhiều
khó khăn và giá thành rất đắt. Trong vòng 30 năm gần đây, người ta tìm thấy
được nguồn enzyme mới vơ cùng phong phú, đó là enzyme từ vi sinh vật.Có
khoảng hơn 1.000 loại enzyme khác nhau đã biết, nhưng chỉ những enzyme có
khả năng thủy phân mới được sử dụng rộng rãi trong các ngành kinh tế. Vi khuẩn
có khả năng tạo ra một lượng enzyme lớn với nhiều ứng dụng.

Tế bào vi sinh vật có khả năng tạo ra cho mình một tập hợp những
enzyme xúc tác các phản ứng sinh học xảy ra trong và ngoài tế bào nhằm thỏa
mãn các đặc điểm sinh hóa, nhu cầu sinh lý của tế bào. Đây chính là tính ưu
việt của vi sinh vật mà các cơ thể động vật hay thực vật khác khơng có được.
Chính vì vậy, enzyme từ vi sinh vật đang thu hút sự quan tâm, chú ý của các
nhà khoa học và các ngành kinh tế, nhằm nâng cao hiệu suất và chất lượng


6
sản phẩm đáp ứng nhu cầu ngày càng lớn của con người. Tế bào vi sinh vật
sản xuất ra hai loại enzyme: enzyme nội bào và enzyme ngoại bào.
Theo Lê Trần Bình và cs (2003)[2] thì Enzyme nội bào là những
enzyme hoà tan và khu trú trong tế bào chất, chúng tham gia vào quá trình
trao đổi chất trung gian của tế bào như -galactosidase, các enzyme của quá
trình đường phân, asparaginase, penicillinase.
Enzyme ngoại bào là những enzyme sau khi tổng hợp được tiết ra mơi
trường bên ngồi qua màng tế bào, chủ yếu là các hydrolase như: amylaza,
protease. Enzyme ngoại bào có tác dụng phân giải các hợp chất cao phân tử
thành các hợp chất có khối lượng nhỏ hơn phù hợp cho mục đích sử dụng của
tế bào, một số enzyme ngoại bào được sinh ra đóng vai trò là tác nhân gây
bệnh như: coagulase, exotocines… Hai enzyme được đề cập trong khoá luận
là hai enzyme ngoại bào.
Nhiều vi sinh vật rất giầu enzyme và có thể tạo nên những enzyme có
giá trị đối với đời sống con người, có ứng dụng rộng rãi trong sản xuất. Trên
thực tế, các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật đã dần thay thế các chế phẩm
enzyme từ động vật, thực vật là do những ưu điểm sau đây:
- Các enzyme vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh vượt xa các enzyme của
các sinh vật khác.
- Vi sinh vật rất nhạy cảm với tác động của môi trường nên khi thay đổi
điều kiện nuôi cấy hoặc các tác động khác bằng các yếu tố khác nhau có thể

làm thay đổi dễ dàng hệ enzyme và hoạt tính enzyme của chúng. Điều đó cho
phép thu được các enzyme theo ý muốn với hoạt tính cao.
- Vi sinh vật sinh sản cực kỳ nhanh chóng, có thể thu được một khối
lượng tế bào lớn trong khoảng thời gian rất ngắn, với một phạm vi nhỏ, ta có
thể sản xuất ra một lượng lớn các chế phẩm enzyme mong muốn.
- Phần lớn thức ăn để nuôi cấy vi sinh vật là dễ kiếm và rẻ tiền. Có thể
dùng các phế liệu, phế phẩm của các ngành sản xuất công nghiệp khác hoặc
nguyên liệu tự nhiên như dầu mỏ, khí đốt, và hầu như bất cứ chất nào trong


7
thiên nhiên, từ các chất vô cơ đơn giản đến các chất hữu cơ phức tạp đều
được vi sinh vật đồng hóa.
- Có thể dễ dàng điều khiển được các điều kiện tối ưu trong q trình
ni cấy để có thể thu được hiệu suất cao nhất trong sản xuất.
Tóm lại, vi sinh vật vô cùng nhỏ bé nhưng về phương diện khai thác nó
lại vượt xa các động vật, thực vật. Hiện nay người ta đã sản xuất được hàng
trăm loại enzyme khác nhau bằng phương pháp tổng hợp nhờ vi sinh vật.
2.1.3. Yêu cầu giống VSV trong công nghiệp enzyme
Cơng nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm cơng nghệ lên men hiện đại và
được sản xuất theo quy mô cơng nghiệp. Do đó, giống vi sinh vật ứng dụng
trong cơng nghệ enzyme cần phải có những u cầu và những chuẩn mực
nhất định. Đó là:
- Giống vi sinh vật phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm
này phải có số lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác. Vì trong
quá trình trao đổi chất, để chuyển hóa một khối lượng sinh chất khổng lồ lớn
gấp hàng nghìn lần cơ thể mình trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì
cơ thể vi sinh vật cần tổng hợp nhiều chất. Do đó, sản phẩm tạo ra sẽ tạo
nhiều loại khác. Chính vì thế, giống vi sinh vật dùng trong sản xuất một sản
phẩm nào đó, thì sản phẩm này phải trội hơn các sản phẩm khác cả về số

lượng và chất lượng.
- Giống phải cho năng suất sinh học cao.
- Giống vi sinh vật phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển
mạnh trong điều kiện sản xuất công nghiệp.
- Giống vi sinh vật phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền
và dễ kiếm tại địa phương nơi nhà máy đang hoạt động.
- Giống sử dụng trong quá trình sản xuất hiện đại phải là những vi sinh
vật thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh.
- Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo ra sản phẩm mong muốn; dễ dàng
tách sản phẩm ra khỏi các tạp chất môi trường sinh khối vi sinh vật giống.
- Giống phải ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo quản.


8
- Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống vi sinh vật cung cấp cho q trình
lên men cơng nghiệp, ta cần tiến hành phân lập giống vi sinh vật thuần khiết.
2.2. TINH BỘT, CELLULOZA VÀ CÁC ENZYME THUỶ PHÂN
2.2.1. Tinh bột và enzyme amylaza
2.2.1.1. Tinh bột
Tinh bột là nguồn dự trữ và cung cấp năng lượng rất quan trọng của
sinh vật.
Nó là hợp chất phổ biến trong tự nhiên. Tinh bột được thực vật tạo ra trong
tự nhiên trong các quả, củ như: ngũ cốc. Tinh bột, cùng với protein và chất béo là
một thành phần quan trọng bậc nhất trong chế độ dinh dưỡng của loài người cũng
như nhiều loài động vật khác. Ngoài sử dụng làm thực phẩm ra, tinh bột cịn được
dùng trong cơng nghiệp sản xuất giấy, rượu, băng bó xương. Tinh bột được tách ra
từ hạt như ngơ và lúa mì, từ rễ và củ như sắn, khoai tây, dong là những loại tinh
bột chính dùng trong cơng nghiệp.
Dù tinh bột có ở các nguồn khác nhau nhưng nó đều được cấu thành từ hai
cấu tử là amyloza và amylopectin đặc thù cho từng lồi vi sinh vật. Tinh bột

khơng hịa tan trong nước lạnh nhưng khi đun nóng đến 60-800C thì tinh bột sẽ bị
hồ hóa. Dưới tác dụng của enzyme hoặc axit mạnh các liên kết glycozit bị phá hủy
và như vậy tinh bột sẽ bị thủy phân. Sự thủy phân xảy ra ở 2 mức độ là dịch hóa
và đường hóa. Sản phẩm chủ yếu của dịch hóa tinh bột là các polyglucoza tương
ứng (dextrin), cịn sản phẩm của đường hóa là Glucoza hoặc Maltoza.
Tinh bột tồn tại dưới dạng các hạt có kích thước biến đổi từ 0,002-0,12mm.
Tinh bột là một polysacarit carbohydrates chứa hỗn hợp amyloza và
amylopectin, tỷ lệ phần trăm amyloza và amylopectin thay đổi tùy thuộc vào từng
loại tinh bột, tỷ lệ này thường từ 20:80 đến 30:70. Tinh bột có nguồn gốc từ các
loại cây khác nhau có tính chất vật lí và thành phần hóa học khác nhau. Chúng đều
là các polymer carbohydrat phức tạp của glucoza (cơng thức phân tử là C6H12O6).
Amyloza có cấu tạo dạng chuỗi không phân nhánh, các phân tử glucoza kết
hợp với nhau qua liên kết α-1,4 glycozit dài khoảng 300-1000 gốc glucoza theo
kiểu lò xo.


9

Hình 2.1: Cấu trúc mạch amyloza (glucose-α-1,4-glucose)
Mỗi xoắn có 6 gốc glucoza, trọng lượng phân tử là 100000-300000kDa.
Cấu trúc xoắn được giữ vững nhờ liên kết hidro giữa các nhóm OH tự do. Bên
trong xoắn có thể kết hợp các nguyên tử khác, ví dụ: amyloza tạo màu xanh
khi kết hợp với Iot.
Theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (2002)[3] Amyloza được kết tinh bằng alcol
butylic. Amyloza không tan trong nước lạnh mà dễ tan trong nước ấm tạo nên dung
dich có độ nhớt không cao và không bền khi nhiệt độ hạ thấp. Các dung dịch đậm
đặc của amyloza nhanh chóng tạo nên dạng gel vơ định hình cứng rắn hoặc co dãn,
sau đó tạo thành tinh thể và kết tủa khơng thuận nghich. Amyloza có xu hướng kết
tinh vì nó có cấu tạo đơn giản, khơng cồng kềnh về mặt tập thể. Tốc độ thối hóa
phụ thuộc vào pH, nồng độ, trọng lượng phân tử và sự có mặt của các ion.

Theo Kiều Hữu Ảnh (1999)[1] thì Amylopectin được cấu tạo bởi các
gốc glucoza liên kết với nhau bằng các liên kết α-1,4 glycozit và α-1,6 glycozit.
Một số nghiên cứu cho thấy trong phân tử cũng có cả liên kết α-,3 glycozit.
Cấu trúc phân tử của nó bao gồm một mạch nhánh trung tâm (chứa liên kết α1,4 glycozit) và từ đó phát ra các nhánh phụ có chiều dài vài chục gốc glucoza.
Điểm phân nhánh và liên kết α-1,6 glycozit. Trọng lượng phân tử 5000001000000 kDa, vì nó có cấu trúc mạch nhánh nên phân tử không tạo thành dạng
xoắn ốc như amyloza. Khi phản ứng với Iot cho màu đỏ nâu (Do kết quả của sự
hình thành nên các hợp chất hấp phụ). Dung dịch amylopectin khơng có xu


10

hướng kết tinh nên chúng khơng có khả năng giữ nước. Khác với dung dịch
amyloza, amylopectin có độ nhớt cao và bền hơn.

Hình 2.2: Cấu trúc mạch amylopectin
Theo Hồng Đình Hịa (2008)[7] thì trong tự nhiên, tinh bột tồn tại ở
dạng hạt gồm nhiều lớp đồng tâm: lớp ngoài là amylopectin, lớp trong là
amyloza. Ngoài cùng của hạt tinh bột là lớp vỏ xenluloza đặc hơn lớp tinh bột
bên trong chứa ít nước nên bền với tác động bên ngồi. Với cấu trúc này tinh
bột ít chịu ảnh hưởng của axit hoặc enzyme. Khi phá vỡ cấu trúc này bằng
nhiệt thì các hạt tinh bột hấp thụ nước, phồng lên, dính vào nhau làm độ nhớt
tăng và gây hiện tượng hồ hóa. Nếu xử lý nhiệt lâu hơn, hạt tinh bột sẽ bị
phân cắt do tác dụng thủy phân từng phần và hòa tan một phần các phần tử
cấu thành tinh bột, độ nhớt của dung dịch giảm xuống.
2.2.1.2. Amylaza
Enzyme amylaza hay còn được gọi với tên khác là Diatase là một
enzyme khơng những có ý nghĩa về mặt sinh lý , thương mại và cịn có ý
nghĩa khá quan trong trong cơng nghiệp nói chung và cơng nghiệp chế biến
thức ăn chăn ni nói riêng. Amylaza có thể được tìm thấy ở nhiều nguồn
khác nhau như động vật , thực vật và cả vi sinh vật . Amylaza được tinh sạch

từ malt vào năm 1835 bởi Anselme Payen và Jean Persoz . Amylaza thuộc
nhóm Enzyme thuỷ phân, xúc tác sự phân giải các liên kết glucoside nội phân
tử trong các polysaccharide với sự tham gia của nước. Amylaza thuỷ phân
tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose, và dextrin hạn chế.


11
Amylaza trong nước bọt còn được gọi là ptyalin, Enzyme này bắt đầu thuỷ
phân tinh bột từ miệng và quá trình này hồn tất ở ruột non nhờ amylaza của
tuyến tụy mà đơi khi cịn được gọi là amylopsin. Amylaza của malt thuỷ phân
tinh bột lúa mạch thành disaccharide làm cơ chất cho quá trình lên men bởi
nấm men, phân bố rộng rãi trong tự nhiên và là một trong những loại enzyme
được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, y tế và nhiều lĩnh vực kinh tế
khác, đặc biệt là trong các nghành công nghiệp thực phẩm để làm lỏng tinh
bột. Amylaza được thu nhận từ hạt nảy mầm, mầm mốc, nấm men, vi khuẩn,
trong đó amylaza được thu nhận từ malt với số lượng nhiều nhất, chủ yếu
dùng trong sản xuất bia. Amylaza được dùng rất phổ biến và đóng một vai trị
rất quan trọng trong cơng nghiệp thực phẩm như sản xuất bánh mì, glucose,
rượu , bia , …
Amylaza là hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới vi sinh vật, các
enzyme này thuộc nhóm enzyme xúc tác cho sự phân giải liên kết nội phân tử
trong polysaccarit với sự tham gia của nước.

Hình 2.3: Cấu trúc của α-amylaza


12

Cơ chất xúc tác của amylaza là tinh bột và glycogen, theo tính chất và
cách tác dụng lên tinh bột, ta phân biệt amylaza thành α-amylaza, β-amylaza,

glucoamylaza và oligo 1-6 glucozidaza.
Theo Apun K. và cs (2000)[15] sinh học phân tử và các kiến thức hóa
học đã mang lại những bước tiến quan trọng về tính chất hóa học, cơ chế phân
tử, cấu trúc phân tử… của amylaza và các enzyme liên quan.
Vi sinh vật là nguồn sinh amylaza rất lớn, α-amylaza đã được tìm thấy
ở hầu hết các loại vi sinh vật như nấm mốc, nấm men giả, vi khuẩn có bào tử
và xạ khuẩn. Chế phẩm α-amylaza từ vi sinh vật đã được sử dụng nhiều trong
công nghiệp và được sản xuất với số lượng lớn.
Theo Nguyễn Thị Thu Thủy và cs (2009)[12] ở vi khuẩn amylaza chủ yếu
được sinh ra từ các chủng Bacillus như B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B.
licheniformis… hoặc ở các chủng Clostridium [7.13]. Amylaza của vi khuẩn
khác nấm mốc ở chỗ nó ít có khả năng đường hóa nhưng lại dịch hóa hồ tinh bột
rất mạnh, tạo thành những α-dextrin phân tử cao bắt màu với Iot. α-amylaza của
vi khuẩn giống với nấm men ở chỗ là chúng được ổn định bằng ion Canxi.
α-amylaza của vi khuẩn có đặc điểm là có khả năng chịu nhiệt cao và
có phổ pH rất rộng từ loại chịu axit đến chịu kiềm. Vì vậy α-amylaza vi khuẩn
được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất trong những năm gần đây. Số lượng
gen α-amylaza của vi khuẩn đã được tách dòng cũng chiếm tỉ lệ cao trong
ngân hàng dữ liệu gen.
2.2.1.3. Ứng dụng của Amylaza
Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối
lượng rất lớn. Trong khối lượng này, thành phần tinh bột rất cao. Để tang hiệu
suất sử dụng năng lượng từ nguồn tinh bột, người ta thường cho them ezyme
amylaza vào. Enzyme amylaza sẽ tham gia phân giải tinh bột tạo thành
đường, giúp cho quá trình phân giải tinh bột tốt hơn.
Qua các khâu trong quy trình chế biến enzyme amylaza sẽ được tạo ra
trong quá trình lên men cuối cùng là tạo thành một chế phẩm giàu enzyme
(amylaza, proteaza, maltoza,…). Khi trộn chế phẩm này với thức ăn chính sẽ

13
làm cho thức ăn chuyển hóa tốt hơn, dễ tiêu, giảm tiêu tốn thức ăn, do vậy
làm vật nuôi tăng trọng nhanh, nhờ các tác dụng của enzyme amylaza và một
số enzyme khác.
2.2.1.4. Các chế phẩm ứng dụng của enzyme amylaza
- ProBio-S là chế phẩm dạng lỏng, được sản xuất bằng cách cho bã tươi
khoai mỳ vào những bao tải lớn rồi cấy chế phẩm EM-S chứa nhiều chủng vi
sinh vật hữu ích như Bacillus sp., Lactobacillus sp., Saccharomyces sp. Với tỉ
lệ 1 lít EM-S/25kg bã (1 ml chứa 1010 tế bào vi sinh vật hữu ích). Ba ngày ủ
làm cho lượng vi sinh vật tăng mạnh. Chế phẩm ProBio-S giúp cân bằng hệ
sinh thái vi sinh vật đường ruột của vật ni cũng như giảm lượng vi sinh vật
có hại. Nhờ thế mà vật ni tiêu hóa tốt hơn, giảm tỉ lệ bệnh đường ruột, tăng
trọng nhanh hơn.
- BiO-E là chế phẩm dạng bột khô, được tạo ra bằng cách cấy chủng
nấm mốc hữu ích A.Nigger lên bã khoai mỳ với tỉ lệ 2g mốc/1kg bã. Chủng
nấm mốc này do chính các chuyên gia thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới tạo ra
trước đó. Tiếp đến, bã được ủ trong khay nhơm 20 tiếng, sau đó được phơi
khơ, sấy và đóng bao.
- Hemicell® là sản phẩm lên men của vi khuẩn Bacillus lentus, hoạt
chất chính là beta-mananase, ngồi ra cịn có beta-glucanase, xylanase,
alpha-glucosidase, cellulase, amylase. Chế phẩm Hemicell® có hai dạng,
dạng bột và dạng hạt với hoạt tính enzyme tương ứng là 140 triệu đơn vị và
360 triệu đơn vị enzyme/kg. Beta-mananase là enzyme phân giải betamannan, một polysaccharide có đơn vị cấu tạo là đường D-mannose và Dgalactose gắn kết với nhau bằng dây nối beta 1,4 glucosid, tỷ lệ Dgalactose/D-mannose là 2/3 (Wikipedia.com). Beta-mannan có mặt trong
ngơ, mì, mạch, cám gạo, cám mì, đặc biệt có nhiều trong các loại khô dầu
như khô cọ (30-35%), khô dừa (25-30%), bột đậu guar (12-17%), khô dầu
vừng, vỏ đậu nành; trong khơ đỗ tương, khơ lạc, khơ hướng dương, khơ cải
có ít và chiếm tỷ lệ từ 1,6 đến 0,49%.


14

2.2.2. Celluloza và Cellulaza
2.2.2.1. Celluloza

Hình 2.4. Hợp chất cao phân tử Celluloza
Cellulozalà hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các liên kết các mắt xích
β-D-Glucose, có cơng thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong đó n
có thể nằm trong khoảng 5000-14000, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế
bào thực vật. Trong gỗ lá kim, Celluloza chiếm khoảng 41-49%, trong gỗ lá
rộng nó chiếm 43-52% thể tích.
Là chất màu trắng, khơng mùi, khơng vị. Celluloza khơng tan trong
nước ngay cả khi đun nóng và các dung môi hữu cơ thông thường. Tan trong
một số dung dịch acid vô cơ mạnh như: HCl, HNO3,... một số dung dịch
muối: ZnCl2, PbCl2,...
Là thành phần chính tạo nên lớp màng tế bào thực vật, giúp cho các mô
thực vật có độ bền cơ học và tính đàn hồi. Celluloza có nhiều trong bơng (9598%), đay, gai, tre, nứa, gỗ... (Celluloza chiếm khoảng 40-45% trong gỗ).


15

Hình 2.5. Các mắt xích β-D-Glucose trong Celluloza
Celluloza do các mắt xích β-D-Glucose liên kết với nhau bằng liên
kết 1.4 Glucocid do vậy liên kết này thường không bền trong các phản
ứng thủy phân.
Đun nóng lâu Celluloza với dung dịch axit sunfuric, các liên kết βglicozit bị đứt tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucozơ:
(C6H10O5)n+ nH2O → nC6H12O6(xúc tác H+, to)
Phản ứng này áp dụng trong sản xuất ancol etylic công nghiệp, xuất
phát từ nguyên liệu chứa Celluloza (vỏ bào, mùn cưa, tre, nứa, v.v...).
Phản ứng thủy phân xenlulozơ có thể xảy ra nhờ tác dụng xúc tác của
enzim Cellulaza có trong cơ thể động vật nhai lại (trâu, bị...). Cơ thể người

khơng có enzim này nên khơng thể tiêu hóa được Celluloza.
Khoảng một nửa hợp chất carbon trong sinh khối (biomass) trên mặt
đất là cellulose, chiếm tới 35 - 50% khối lượng khô sinh khối thực vật. Tất cả
sản phẩm sinh khối sẽ được khống hóa nhờ hệ thống enzyme được cung cấp
bởi vi sinh vật. Hệ thống enzyme phân giải cellulose thường chậm và khơng
hồn tồn. Tuy nhiên, trong khoảng thời gian ngắn (48 giờ) hệ vi sinh vật
trong dạ cỏ bị có thể phân giải 60 - 65% cellulose. Hơn thế nữa, nhờ hệ thống
vi sinh vật trong đường ruột mà lồi mối có thể tiêu hóa đến 90% cellulose


16

của gỗ. Còn trong hệ thống sinh học phức tạp như rễ cây hoặc những mảnh vỡ
thực vật trong đất, cellulose có thể được phân hủy trong khoảng thời gian lâu
hơn 1T(Schwarz, 2001)1T. Hệ vi sinh vật phân giải cellulose có thể lên men
hiếu khí hoặc kỵ khí, bình nhiệt hoặc ái nhiệt, bao gồm nấm, vi khuẩn và xạ
khuẩn được tìm thấy nhiều trong đất, nước, đường tiêu hóa một số động vật…
nơi cung cấp lượng cellulose dồi dào để vi sinh vật phân giải và phát triển.
2.2.2.2. Cellulaza
Cellulaza là một phức hệ enzyme xúc tác thủy phân Celluloza thành
cellobiose và cuối cùng là glucose.

Hình 2.6. Cellulaza
Cellulaza thủy phân các liên kết 1,4 β-glucosid trong celluloza và các
β-D-glucan của ngũ cốc.
Nguồn gốc được thu nhận từ các nguồn khác nhau:
- Động vật: dịch tiết dạ dày bị, các nhóm thân mềm…
- Thực vật: trong hạt ngũ cốc nảy mầm như đại mạch, yến mạch, lúa mì
mạch đen…
- Vi sinh vật: các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men…