Tải bản đầy đủ (.pdf) (60 trang)

Nghiên cứu chuyển gen chịu lạnh atcbf1 trên cây thuốc lá nicotiana tobacum l thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.12 MB, 60 trang )

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
---------------------

CHU THỊ NGỌC ÁNH
Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN CHỊU LẠNH AtCBF1 TRÊN CÂY THUỐC
LÁ (Nicotiana tobacum L) THƠNG QUA VI KHUẨN
Agrobacterium tumefacciens”

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chun ngành
Khoa
Khóa học

: Chính quy
: Công nghệ Sinh học
: CNSH - CNTP
: 2014 - 2018

Thái Nguyên - 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
-----------

-----------


CHU THỊ NGỌC ÁNH
Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN CHỊU LẠNH AtCBF1 TRÊN CÂY THUỐC
LÁ (Nicotiana tobacum L) THƠNG QUA VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens”

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Lớp
Khoa
Khóa học
Giảng viên hướng dẫn

: Chính quy
: Cơng nghệ Sinh học
: K46 - CNSH
: CNSH - CNTP
: 2014 - 2018
: 1. TS. Nguyễn Tiến Dũng
2. GS. TS. Ngơ Xn Bình

Thái Ngun - 2018


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài: “Nghiên cứu chuyển gen chịu lạnh AtCBF1 trên

cây thuốc lá (Nicotiana tobacum L) thơng qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens” là một cơng trình nghiên cứu độc lập khơng có sự sao chép của người
khác. Đề tài là một sản phẩm mà tôi đã nỗ lực nghiên cứu trong quá trình học tập tại
khoa CNSH-CNTP trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Trong quá trình viết
bài có sự tham khảo một số tài liệu có nguồn gốc rõ ràng, dưới sự hướng dẫn của
TS. Nguyễn Tiến Dũng và GS. TS. Ngơ Xn Bình. Tơi xin cam đoan nếu có vấn
đề gì tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Thái Nguyên, ngày tháng năm 2018
Sinh viên thực hiện

Chu Thị Ngọc Ánh


ii

LỜI CẢM ƠN
Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường Ban chủ nhiệm khoa Công
nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trong thời gian thực tập tốt nghiệp em đã
thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chuyển gen chịu lạnh AtCBF1 trên cây thuốc lá
(Nicotiana tobacum L) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”.
Trang đầu tiên của khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu
nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm
cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề
tài nghiên cứu này.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, gửi lời cảm ơn chân thành tới
thầy giáo TS. Nguyễn Tiến Dũng và thầy giáo GS. TS. Ngơ Xn Bình, giảng viên
khoa Cơng nghệ Sinh học và Cơng nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và
hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài.
Đồng thời, em xin cảm ơn ThS. Ma Thị Hoàn đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt
nhất cho em trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp.

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn là chỗ
dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lịng động
viên, giúp đỡ tơi trong suốt thời gian qua.
Trong quá trình thực tập, cũng như là q trình làm báo cáo thực tập thời
gian có hạn, trình độ và kỹ năng bản thân cịn nhiều hạn chế nên đề tài khơng thể
tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của thầy
cô và các bạn để đề tài của em được hồn thiện hơn.
Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo trong nhà trường, trong khoa
Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng các bạn đồng nghiệp sức khoẻ,
thành công trong cuộc sống.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày tháng năm 2018
Sinh viên thực hiện
Chu Thị Ngọc Ánh


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .....................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN .........................................................................................................ii
MỤC LỤC ............................................................................................................ iii
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ........................................................ v
DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................viii
Phần 1 MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài .................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................................... 2
1.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn........................................................................... 2

1.4.1. Ý nghĩa khoa học ........................................................................................... 2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................... 2
Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................. 3
2.1. Tổng quan về tính chống chịu (stress) của thực vật ........................................... 3
2.1.1. Khái niệm stress............................................................................................. 3
2.1.2. Tính chất của các tác nhân gây stress ............................................................. 3
2.1.3. Phản ứng của thực vật với stress .................................................................... 3
2.2. Ảnh hưởng của stress đến sinh trưởng và phát triển cây trồng........................... 5
2.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ thấp đến sinh trưởng và phát triển của cây trồng ...... 5
2.2.2. Ảnh hưởng của tính chịu hạn đến sinh trưởng và phát triển cây trồng ............ 6
2.3. Nghiên cứu nâng cao tính chống chịu nhiệt độ thấp ở thực vật.......................... 6
2.3.1. Trên thế giới .................................................................................................. 7
2.3.2. Ở Việt Nam ................................................................................................... 9
2.4. Đặc điểm của gen CBF1 ................................................................................... 9
2.5. Chuyển gen ở thực vật .................................................................................... 12
2.5.1. Khái niệm chuyển gen ở thực vật ................................................................. 12


iv

2.5.2. Các phương pháp chuyển gen cho cây trồng ................................................ 12
Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 21
3.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu ......................................................... 21
3.1.1. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 21
3.1.2. Hóa chất ...................................................................................................... 21
3.1.3. Thiết bị thí nghiệm....................................................................................... 22
3.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 22
3.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 23
3.3.1. Phương pháp thiết kế vector chuyển gen ...................................................... 23
3.3.2. Phương pháp chuyển gen ở thuốc lá............................................................. 26

3.3.4. Phân tích cây chuyển gen bằng phương pháp PCR....................................... 28
3.3.5. Các chỉ tiêu đánh giá.................................................................................... 29
Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................................... 30
4.1 Thiết kế vector chuyển gen .............................................................................. 30
4.3. Chọn lọc và phân tích hiệu quả chuyển gen .................................................... 34
4.4. Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển AtCBF1 trên cây thuốc lá.................... 36
Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 40
5.1. Kết luận .......................................................................................................... 40
5.2. Đề nghị ........................................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 41
PHỤ LỤC


v

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
ADP

Adenosine Diphotphat

As

Acetosyringone

ACS

Agrocinopine Synthase

ATP


Adenosin Triphosphat

BAP

Benzylaminopurine

Bp

Base pair

BSA

Bovine Serum Albumin

CBF

C-repeat Binding Factors

CNSH

Công Nghệ Sinh Học

cs

Cộng sự

CTAB

Cetyltrimethylammonium Bromide


DREB

Dehydration-Responsive Element-Binding

DNA

Deoxynucleic acid

dNTPs

Deoxy Nucleoside Triphosphate

EDTA

Ethylene Diamine Tetra Acetic acid

Kb

Kilo base

kDa

Kilo Dalton

LB

Luria và Bertani

LB


Left Border

MAS

Maker- Assisted Selection

MCS

Multi Cloning Site

MS

Murashige và Skoong (1962)

NAA

α- Naphthalenne Acetic Acid

NAD

Nicotinamide Adenine Dinucleotide

NIL

Nearly Isogenic Lines

NOS

Nopaline Synthase


OD

Optical Density


vi

PCR

Polymerase Chain Reaction

PMI

Phosphomanose Isomerase

QTL

Quantitative Trait Loci

RB

Right Boder

RMOP

Regeneration Medium for Organogenesis Plant

RNA

Ribonucleic Acid


ROS

Reactive Oxygen Species

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphismtg

SDS

Sodium Dodecyl Sufate

TAE

Tris bazơ - Axit acetic - EDTA

T-DNA

Tranfer - DNA

TE

Tris HCl - EDTA, pH = 8

Ti - plasmid

Tumor inducing plasmid

UV


Ultraviolet

v/p

Vòng/phút

Vir

Virulence


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu .................................................. 21
Bảng 3.2. Thành phần môi trường sử dụng trong chuyển gen ................................ 27
Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR .................................................................... 29
Bảng 3.4: Chương trình thực hiện phản ứng PCR .................................................. 29
Bảng 4.1. Kết quả chuyển gen CBF1 ở cây thuốc lá thông qua vi khuẩn
A.tumefaciens ........................................................................................................ 34
Bảng 4.3. Kết quả đánh giá hiệu quả chuyển gen CBF1 trên cây thuốc lá .............. 37


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopyne............................................... 15
Hình 2.2. Ti-plasmid của A.tumefaciens dạng nopalin ........................................... 16
Hình 2.3. Sự tương tác giữa Agrobacterium với tế bào thực vật ............................. 19

Hình 4.1. Hình vẽ cấu trúc vector nhân dịng và vector chuyển gen AtCBF1 ......... 30
Hình 4.2. Kết quả kiểm tra khuẩn lạc mang gen AtCBF1 bằng PCR và enzyme cắt
giới hạn ................................................................................................................. 31
Hình 4.3. Hình ảnh mơ tả q trình biến nạp và tái sinh tạo cây thuốc lá chuyển gen
.............................................................................................................................. 36
Hình 4.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi AtCBF1 .............................. 39


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Hàng trăm năm qua con người đã ln tìm kiếm các phương pháp để cải tiến
cây trồng với mục tiêu tăng năng suất cũng như chất lượng. Mặc dù các phương
pháp chọn, tạo giống truyền thống đã mang lại nhiều thành tựu trong công tác phát
triển giống cây trồng, nhưng dường như vẫn chưa thỏa mãn nhu cầu thực tế. Công
nghệ gen ra đời được ví như “chìa khóa đa năng” để mở nút thắt vốn gây rất nhiều
khó khăn cho các nhà chọn tạo giống truyền thống nhằm tạo ra một cây trồng hoàn
hảo hơn khi chúng được kết hợp với nhau. Tính trạng mong muốn sẽ được tạo ra
bằng cách đưa thêm một đoạn gen vào hệ gen của cây bằng con đường trực tiếp hay
gián tiếp thông qua kỹ thuật chuyển gen.
Đến nay, sau hơn 20 năm đưa vào canh tác, cây trồng biến đổi gen đang
mang lại những hiệu quả rõ rệt như tăng năng suất, cải thiện chất lượng, giảm ô
nhiễm môi trường, nâng cao thu nhập cho người dân,… Cây trồng biến đổi gen hiện
đang chiếm một diện tích đáng kể trên tồn cầu và hứa hẹn còn tiếp tục phát triển
trong những năm tới.
Dưới điều kiện bất lợi của môi trường như hạn, mặn, lạnh,… thực vật phải
thay đổi các quá trình sinh lý, sinh hóa để tồn tại và thích nghi. Ở mức độ phân tử
điều kiện bất lợi của môi trường sẽ làm cho thực vật gia tăng mức độ biểu hiện và

tích lũy hàng loạt các gen và protein đáp ứng lại điều kiện bất lợi của môi trường.
Các gen đáp ứng bất lợi của mơi trường được chia làm hai nhóm: nhóm gen trực
tiếp chống lại điều kiện mơi trường bất lợi và nhóm gen điều hịa biểu hiện của các
gen chức năng tham gia trực tiếp vào phản ứng chống chịu điều kiện bất lợi.
Gần đây, Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử, khoa Công nghệ Sinh học và
công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã phân lập được một
số gen có khả năng tăng cường tính chống chịu stress của cây trồng như hạn, lạnh,
nóng. Tuy nhiên các gen này cần thiết phải tiến hành đánh giá biểu hiện cũng như khả
năng ứng dụng trên cây trồng để làm cơ sở tiến hành các ứng dụng chuyển gen.


2

Xuất phát từ những lý do trên, tôi tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu chuyển gen
chịu lạnh AtCBF1 trên cây thuốc lá (Nicotiana tobacum L) thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens”.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Đánh giá khả năng chuyển gen chịu nhiệt AtCBF1 trên cây thuốc lá.
1.3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen AtCBF1
Nội dung 2: Nghiên cứu chuyển gen AtCBF1 trên cây thuốc lá.
Nội dung 3: Nghiên cứu phương pháp chọn lọc và đánh giá hiệu quả
chuyển gen AtCBF1.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Bổ sung vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn.
Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, thu nhận được nhiều kinh nghiệm
thực tế cũng như tác phong làm việc khoa học phục vụ cho công tác sau này.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu chuyển gen AtCBF1 trên cây thuốc lá làm cơ sở cho việc chuyển

gen này trên các cây trồng khác như lúa, ngô, cà chua…


3

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về tính chống chịu (stress) của thực vật
2.1.1. Khái niệm stress
Khái niệm stress được dùng để chỉ những yếu tố bên ngoài gây ảnh hưởng
bất lợi cho thực vật và phản ứng của cơ thể thực vật đối với các tác nhân gây stress
này. Đó là tính chống chịu của thực vật đối với điều kiện bất lợi của môi trường [3].
Dưới các điều kiện tự nhiên và nhân tạo thực vật không ngừng chịu các
stress. Các tác nhân gây nên stress cho thực vật là khơ, hạn, lạnh, nóng, mặn, sự ơ
nhiễm khơng khí... Các tác nhân gây stress sẽ tạo nên những khả năng thích ứng đặc
trưng của thực vật. Sinh lý stress nghiên cứu mối quan hệ khăng khít đó giữa cơ thể
với môi trường, đồng thời đưa ra những biện pháp nhằm giúp cho cây trồng nâng
cao khả năng chống các stress của mơi trường [3].
2.1.2. Tính chất của các tác nhân gây stress
Stress có thể làm giảm mạnh sự tăng trưởng và phát triển của cây trồng, qua
đó làm giảm năng suất cây trồng. Do đó tìm hiểu cơ chế gây hại của các tác nhân
gây stress cũng như những phản ứng thích nghi của cây trồng có vai trò quan trọng
trong trồng trọt.
Một số tác nhân gây stress có thể tác động riêng rẽ nhưng cũng có nhiều
stress có thể phối hợp với nhau tác động lên cơ thể thực vật. Ví dụ stress thiếu nước
thường liên kết với stress nhiễm mặn ở vùng rễ và stress nhiệt độ cao ở lá.
Một số yếu tố môi trường từ tác nhân bình thường chuyển sang tác nhân stress
chỉ trong vài phút (ví dụ nhiệt độ) có những yếu tố môi trường phải mất nhiều ngày
hay nhiều tháng mới trở nên tác nhân stress (nước trong đất, chất khoáng...) [3].
Tác nhân gây stress cho lồi thực vật này có thể khơng gây cho lồi thực vật khác.

2.1.3. Phản ứng của thực vật với stress
Phản ứng của cơ thể thực vật với các tác nhân gây stress có thể là phản ứng
đặc thù hay không đặc thù. Phản ứng đặc thù là những phản ứng ngược với những
biến đổi theo qui luật tự nhiên bình thường. Ví dụ khi nhiệt độ cao, qui luật tự nhiên


4

bình thường là độ nhớt của tế bào giảm nhưng ở đây cơ thể phản ứng đặc thù ngược
qui luật trên là độ nhớt không bị giảm dưới tác động của nhiệt độ cao - phản ứng
này dẫn đến thích nghi. Phản ứng không đặc thù là những phản ứng tuân theo qui
luật bình thường của tự nhiên như khi gặp nhiệt độ cao thì độ nhớt giảm [3].
Tính chống chịu stress của thực vật như là quá trình hình thành các đặc điểm
thích nghi đó là những phản ứng tự vệ mang tính đặc thù. Phản ứng đáp ứng của cây
với các điều kiện bất lợi có thể rất khác nhau tùy thuộc vào đặc tính và cường độ
của các nhân tố gây ra stress.
Đặc điểm của phản ứng trước hết phụ thuộc vào cường độ của tác nhân gây
phản ứng. Ở cường độ các nhân tố còn thấp chưa tới ngưỡng gây stress thì cây biểu
hiện bình thường. Khi tác nhân có cường độ mạnh đến ngừng gây stress cơ thể mới
xuất hiện phản ứng tự vệ, lúc đó cơ thể xuất hiện những đặc tính mới mà trước đó
chưa có, đó là những đặc điểm chống chịu stress [3].
Khả năng thích nghi với điều kiện bất lợi là tiềm năng của toàn bộ cơ thể
thực vật. Nhưng thường sự chống chịu chỉ xuất hiện từng lúc theo sự xuất hiện từng
yếu tố nhất định phát huy ưu thế của nó lên cơ thể, lúc đó cơ thể phát sinh ra khả
năng chống chịu yếu tố do tiềm năng chống chịu có sẵn trong cơ thể, khi gặp yếu tố
nào sẽ gây phản ứng tự vệ thích ứng của cơ thể với yếu tố đó.
Có hai hình thức chống chịu: chống chịu riêng biệt từng yếu tố gây stress và
chống chịu liên kết với nhiều yếu tố gây stress đồng thời.
Theo một số nhà khoa học. Phản ứng tự vệ của cây trước các stress của môi
trường thể hiện chung nhất là những biến đổi tính chất của nguyên sinh chất của tế bào.

- Giảm mức độ phân tán của nguyên sinh chất.
- Tăng tính thấm của nguyên sinh chất.
- Biến tính protein của ngun sinh chất.
- Hóa coaxecva nguyên sinh chất.
Khi gặp các stress của môi trường phản ứng đặc trưng để tự vệ của thực vật
là những phản ứng theo chiều hướng ngược lại những phản ứng bình thường khơng
đặc trưng. Ví dụ khi gặp nhiệt độ cao chiều hướng phản ứng bình thường của cây


5

khơng có khả năng chịu nóng là độ nhớt giảm. Nhưng với cây chịu nóng khi gặp
nhiệt độ cao độ nhớt lại tăng lên để chịu được nhiệt độ cao.
Trong quá trình phản ứng tự vệ với các stress của mơi trường nhiều khi cơ
thể tạo ra những đặc tính thích nghi của cây với yếu tố bất lợi và chuyển yếu tố bất
lợi thành điều kiện sống bình thường của cây, yếu tố cần thiết cho cây sinh trưởng
phát triển. Ví dụ một số cây do sống trong mơi trường mặn đã hình thành đặc tính
thích nghi với mơi trường mặn đó, dần dần đất mặn là điều kiện sống thích hợp cho
loại cây này, cây phát triển tốt trong mơi trường mặn so với mơi trường bình
thường. Như vậy từ khả năng chống chịu đã chuyển thành đặc tính thích nghi.
2.2. Ảnh hưởng của stress đến sinh trưởng và phát triển cây trồng
Thực vật có đặc điểm về trạng thái sống đặc thù, đó là bám trụ vào đất tại
một chỗ, không di chuyển từ nơi sống này đến nơi sống khác trong suốt quá trình
phát triển. Do đó, khác với động vật, thực vật thường xuyên đối mặt trực tiếp với
các điều kiện ngoại cảnh bất lợi, tác động lên quá trình sinh trưởng và phát triển.
Những tác động bất lợi từ mơi trường có thể gây ra những biến đổi sinh lý, hóa sinh
và hình thái; từ đó ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng cây trồng.
2.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ thấp đến sinh trưởng và phát triển của cây trồng
Nhiệt độ thấp làm cho lá cây bị héo mặc dù môi trường vẫn đủ nước do nhiệt
độ thấp ức chế sự hút nước của hệ rễ và sự vận chuyển nước của hệ mạch. Đồng

thời nhiệt độ thấp cũng gây ức chế quang hợp của lá, làm giảm hô hấp, ức chế các
quá trình tổng hợp nhất là tổng hợp protein do các enzym hoạt động yếu. Ở nhiệt
thấp màng nguyên sinh chất bị tổn hại làm tăng tính ngoại thấm nên thất thoát chất
dinh dưỡng của tế bào. Nhiệt độ thấp ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng bộ rễ.
Sự hút nước và chất khoáng bị giảm mạnh làm cho cây thiếu nước và chất dinh
dưỡng. Nhiệt độ thấp làm tổn hại đến màng tế bào, màng các bào quan như lục lạp,
ty thể từ đó ảnh hưởng sâu sắc đến các quá trình sinh lý của cây như quang hợp, hô
hấp. Ở các cây không chịu lạnh các lipid của màng có tỷ lệ chuỗi axit béo bão hồ
cao hơn cây chịu lạnh, do đó gặp lạnh màng có khuynh hướng đổi thành trạng thái
bán tinh thể. Khi tính lỏng của màng kém, các protein của màng không hoạt động


6

bình thường dẫn đến hậu quả xấu cho sự vận chuyển các chất, sự biến đổi năng
lượng và hoạt động enzym [18].
2.2.2. Ảnh hưởng của tính chịu hạn đến sinh trưởng và phát triển cây trồng
Hạn hán là một nguyên nhân quan trọng làm giảm năng suất và chất lượng
sản phẩm của cây trồng.
Khi hạn hán cây bị stress nước dẫn đến nhiều hậu quả nghiêm trọng:
- Gây nên hiện tượng co nguyên sinh và làm cho cây bị héo [8]. Sự co nguyên
sinh các tế bào diễn ra khi nồng độ nước trong môi trường quá cao hay do stress nước
làm cho nước trong tế bào thất thoát ra ngoài nên khối nguyên sinh chất của tế bào co
lại, thể tích khơng bào thu hẹp. Khi mơi trường thiếu nước kéo dài, tế bào mất nước
không bào co lại, mô trở nên mềm yếu và sự héo xảy ra. Sự héo tạm thời nhưng cũng
có thể vĩnh viễn nếu sự thiếu nước nghiêm trọng và kéo dài.
- Hạn hán cản trở sự vận chuyển nước trong mạch gỗ. Khi thiếu nước do hạn
hán sự cung cấp nước cho rễ khơng đủ trong đêm để thủy hố các mơ đã bị thiếu
nước ban ngày, các lông hút bị tổn thương lớp ngoài vùng vỏ bị phủ suberin... đã
làm giảm áp suất rễ để đẩy cột nước lên trong mạch gỗ. Đặc biệt khi thiếu nước sẽ

hình thành nhiều bọt khí trong mạch gỗ phá vỡ tính liên tục của cột nước nên cột
nước trong mạch gỗ không được đẩy lên liên tục.
- Hạn hán làm dày lớp cutin trên bề mặt lá làm giảm sự thốt hơi nước qua
biểu bì.
- Hạn hán làm giảm mạnh quang hợp. Sự thiếu nước làm giảm cường độ
quang hợp. Khi hàm lượng nước trong lá cịn khoảng 40-50% quang hợp của lá bị
đình trệ [3].
- Hạn hán cản trở sự sinh trưởng của cây. Do thiếu nước ảnh hưởng đến các
hoạt động sinh lý nhất là quang hợp, nên làm giảm sinh trưởng, cây chậm lớn, năng
suất giảm sút.
2.3. Nghiên cứu nâng cao tính chống chịu nhiệt độ thấp ở thực vật


7

2.3.1. Trên thế giới
Ở phía bắc nước Nhật, hiện tượng bất thụ do nhiệt độ lạnh được xem như
vấn đề nghiêm trọng nhất làm năng suất lúa giảm rất nhiều [43]. Đối với kiểu gen
cây lúa mẫn cảm với tính trạng bất thụ do nhiệt độ lạnh, giai đoạn tăng trưởng nhạy
cảm nhất là giai đoạn làm đòng, đặc biệt là giai đoạn vi bào tử chuyển từ pha
“tetrad” sang pha đầu tiên của nhiễm thể thu nhỏ lại, xét trên cơ sở gián phân nhiễm
thể trong di truyền tế bào [36]. Nhiệt độ thấp trong suốt qúa trình phát sinh vi bào tử
(microsporogenesis) sẽ làm cho thối hóa vi bào tử và tạo ra hiện tượng phình to tế
bào hạt phấn. Mặt khác, cơ quan của noãn vẫn duy trì được khả năng thụ tinh một
cách bình thường, nhưng tiến trình phát triển microspore hồn tồn bị ức chế [19].
Do đó, hiện tượng thối hóa microspore hoặc hiện tượng phình to tế bào hạt phấn
được xem như phản ứng của kiểu gen bất thụ đối với sự tổn thương do nhiệt độ lạnh
[33]. Cơ chế chống chịu lạnh hiện nay vẫn chưa được nghiên cứu một cách chi tiết,
còn nhiều câu hỏi chưa được giải đáp thỏa đáng. Muốn đạt được một kết qủa thành
công về thụ phấn, cây lúa cần có đủ số lượng hạt phấn cần thiết trong túi phấn. Số

lượng hạt phấn giảm theo nghiệm thức xử lý lạnh làm cho tỉ lệ bất thụ gia tăng rất
có ý nghĩa [39]. Những giống lúa chống chịu lạnh thường sản sinh ra số lượng hạt
phấn nhiều hơn giống nhiễm [41]. Như vậy, chúng ta có thể nói rằng số lượng hạt
phấn là một yếu tố quan trọng trong cơ chế chống chịu lạnh. Người ta còn ghi nhận
số lượng hạt phấn tương quan thuận với chiều dài túi phấn [34]; [44], và dường như
chiều dài túi phấn có tương quan với hiện tượng chống chịu lạnh [46]. Hiện tượng
chống chịu lạnh là tính trạng di truyền số lượng và chưa có một gen chủ lực nào
được xác định [43]. Futsuhara và Toriyama (1966) ước đoán rằng: số gen chống
chịu lạnh có thể là 4 gen hoặc nhiều hơn 4 gen. Chúng liên kết rất chặt với gen Pr
(tính trạng võ trấu màu tím), Rc (tính trạng võ lụa hạt gạo màu nâu), d2 (tính trạng
lùn), gh (tính trạng võ trấu màu vàng), nl (neck leaf), và bc (tính trạng thân rạ giịn,
dễ bẻ gãy = brittle) trên nhiễm sắc thể số 3, 4, 5 và 7 [14]; [37]; [45]
Giống lúa “Norin-PL8” có gen chống chịu lạnh kế thừa từ giống lúa Silewah
(japonica). Saito và ctv. (2001) đã quan sát trên hai đoạn nhiễm sắc thể được hội tụ


8

gen mục tiêu từ Silewah, định vị trên nhiễm thể số 3 - vai ngắn, và trên nhiễm thể số
4 - vai dài [42]. Các tác giả này đã tiến hành lập bản đồ QTL theo kiểu” fine
mapping”, tập trung trên nhiễm thể số 4, trên cơ sở quần thể hồi giao (BC) và NIL
(nearly isogenic lines). Norin-PL8 là giống lúa chống chịu lạnh được phát triển nhờ
lai hồi giao giữa giống japonica chống chịu lạnh Silewah với một dòng lúa Nhật
Hokkai 241, trong đó dịng Hokkai 241 được dùng làm dòng tái tục (recurrent
parent), và Silewah là giống cho gen mục tiêu (donor). Saito và ctv. (2001) đã chọn
được một dòng Syo6 từ tổ hợp lai Kirara 397 / Norin
PL8 // Kirara 397 (quần thể BC1F5). Dịng Syo6 có chứa đoạn nhiễm sắc thể
số 3 và 4 hội tụ gen mục tiêu từ Norin-PL8. Sau hai lần hồi giao, tác giả đã chọn
một cây dị hợp tử đối với hội tụ gen mục tiêu ở nhiễm thể số 4, nhưng khơng có gen
mục tiêu ở nhiễm thể số 3. Cho cây này tự thụ phấn, người ta phát triển quần thể

phân ly ký hiệu là BT4, và 114 cây BT4 này được chọn để sử dụng trong phân tích
bản đồ cách quãng. Mẫu DNA được ly trích từ lá lúa theo phương pháp CTAB [29].
RFLP marker được sử dụng có nguồn gốc từ chương trình genome cây lúa của Nhật
(RGP) ký hiệu là “R” và “C”, có nguồn gốc từ Saito và ctv. (1991) ký hiệu là
“XNpb”. Phương pháp đánh giá kiểu hình tính trạng chống chịu lạnh trong nước có
nhiệt độ lạnh [13], được xem như là phương pháp thống nhất trong thanh lọc giống
chống chịu lạnh quốc tế. cây lúa được xử lý ở nhiệt độ nước 19oC từ giai đoạn
tượng khối sơ khởi đến giai đoạn trỗ. Độ sâu mực nước 20 cm ở thí nghiệm ngoài
đồng và 24 cm ở trong nhà lưới. Đánh giá hạt hữu thụ để kết luận về thanh lọc
chống chịu lạnh. Saito và ctv. (2001) đã sử dụng phần mềm MAPL97 [20]; [53] để
phân tích QTL và bản đồ QTL. Muốn xác định chính xác vị trí QTL trên nhiễm sắc
thể số 4, người ta phát triển một quần thể hồi giao cải tiến, chọn Kirara 397 làm
giống tái tục. Bổ sung thêm 5 RFLP marker (R738, R740, R1427, R2737 và
C1016), 2SCAR marker (SCAB1 và SCAM20) để phân tích. Những marker được
thể hiện trên bản đồ (hình 8-1B). Saito và ctv. (2001) đã sử dụng 117 cá thể của
quần thể BT4 phân ly để phân tích theo phương pháp cách quãng đối với tính trạng
chống chịu lạnh.


9

Saito và ctv. (2001) còn phát triển quần thể NIL để thực hiện kỹ thuật “fine
mapping” QTL điều khiển tính trạng chống chịu lạnh. Người ta chọn lựa 12 dòng
tái tổ hợp (recombinants) giữa R738 và R1427 trong quần thể BT4. Con lai của mỗi
“recombinant” được phát triển thành những dịng ổn định (fixed) thơng qua phương
pháp MAS (markeraided selection). Kiểu hình chống chịu lạnh được đánh giá thơng
qua giá trị trung bình của hạt hữu thụ. Kiểu gen của BT4-9-7 là kiểu gen của NorinPL8 đối với marker R738. Tính trạng chống chịu lạnh của BT4-76-2 và BT4-76-7 là
kiểu gen của Norin-PL8 đối với marker R738 và R2737. Kết qủa như vậy cho thấy
rằng QTL điều khiển tính chống chịu lạnh định vị giữa marker R738 và XNpb102
2.3.2. Ở Việt Nam

Hiện nay có nhiều cơng trình đi sâu vào nghiên cứu cơ chế chịu lạnh ở mức
độ gen. Nhiệt độ thấp trước hết làm thay đổi hoạt động của một số gen, một số loại
protein nhanh chóng được sinh tổng hợp [18]; [19]. Lê Trần Bình và Cs (1989) đã
phân tích thành phần protein ở các giống lúa khi bị lạnh tác động và thấy rằng: ở
các giống lúa chịu lạnh có một số protein mới suất hiện, một số khác hàm lượng
giảm xuống, hiện tượng này không thấy ở các giống lúa nhạy cảm với lạnh. Ở mức
độ phân tử, khi gặp lạnh hoạt động của các enzyme cung cấp năng lượng như
ATPase của tonoplas tỏ ra bền vững ở những giống lúa chống chịu [34]. Tính chất
của hệ thống màng nguyên sinh nói chung bị biến đổi dưới tác động của lạnh,
những giống cây trồng chịu lạnh thì những biến động đó khơng làm cho các hoạt
động trao đổi chất ngừng trệ hoàn toàn.
2.4. Đặc điểm của gen CBF1
Đặc điểm gen CBF1: Hoạt chất phiên mã liên kết với yếu tố điều hòa DRE /
CRT và gây ra sự biểu hiện gen COR (lạnh được điều hòa) làm tăng khả năng chịu
lạnh của cây trồng. Nó mã hóa một thành viên của phân họ DREB A-1 của họ hệ số
phiên mã ERF / AP2 (CBF1). Protein chứa một tên miền AP2. Có bốn thành viên
của họ CBF, đáp ứng với stress phi sinh học của cây. Ba gen đầu tiên là CBF1
CBF2 và CBF3, rất cần thiết cho phản ứng với nhiệt độ lạnh, trong khi gen CBF4


10

rất cần thiết cho phản ứng khi có khơ hạn xảy ra. Gen CBF1 này liên quan đến phản
ứng với nhiệt độ thấp và axit abscisic [56].
Các nghiên cứu về gene CBF1
Để khai thác tốt chức năng khác nhau giữa CBF1 (StCBF1) của khoai tây
trồng và CBF1 (ScCBF1) của khoai tây hoang dại Commerson, nhóm nghiên cứu
của Jian Li thuộc Đại học Nông nghiệp Sơn Đông đã cho thể hiện thành cơng hai
gen này trong cây Arabidopsis với hai dịng khác nhau. Tất cả cây chuyển gen ấy
đều thể hiện kiểu hình lùn, trổ bơng muộn, lá dầy hơn và điểm những chấm hồng.

Tuy nhiên, dòng chuyển gen ScCBF1 thể hiện sự chống chịu đáng kể đối với lạnh
giá và khơ hạn hơn dịng chuyển gen StCBF1. Mức độ thể hiện của nhiều gen liên
quan đến chịu lạnh và phát triển, bao gồm các gen ức chế cây tăng trưởng và trổ
bông muộn, cũng cao hơn trong tất cả các cây chuyển gen.
Kết quả cho thấy hai gen CBF1 có vai trò quan trọng trong phản ứng của cây
đối với stress phi sinh học, tăng trưởng và phát triển. Tuy nhiên, ScCBF1 có chức
năng rõ hơn StCBF1 [57].
+ Nhóm tác giả: Li Y, Song Y, Xu B, Xie J, Zhang D, Cooke J thuộc trường
đại học khoa học và công nghệ sinh học, Đại học Lâm nghiệp Bắc Kinh, Bắc Kinh,
Trung Quốc đã tiến hành nghiên cứu:” Hoạt động đặc biệt của gen CBF1 cây dương
trong một mạng lưới điều hịa lạnh tích hợp”. Các yếu tố liên kết C-repeat (CBFs),
cũng được gọi là thành viên nhóm protein yếu tố phản ứng mất nước (DREB1),
đóng vai trị quan trọng trong việc thu nhận khả năng chịu stress, nhưng trong cây,
các cơ chế cơ bản của khả năng chịu stress vẫn cịn khó nắm bắt. Để hiểu rõ hơn về
các cơ chế này, nhóm nghiên cứu đã phân lập năm orthologs CBF1 từ bốn phần cây
dương (Populus spp). Và đánh giá biểu hiện của chúng trong điều kiện hạn hán,
lạnh, nhiệt và muối. Biểu hiện trên toàn phần gây ra trong phản ứng với lạnh gợi ý
một mối tương quan giữa biểu hiện CBF1 dương tính và việc thu nhận khả năng
chịu lạnh. Các phản hồi thay đổi giữa các phần có thể phản ánh các cơ chế chịu ứng
suất theo từng phần cụ thể, cho thấy ảnh hưởng của bối cảnh sinh thái đối với sự
phát triển khả năng chịu ứng suất trung gian CBF1 trong cây dương. Sau đó, nhóm


11

nghiên cứu đã sử dụng chiến lược tìm kiếm tồn bộ bộ gen trong Populus
trichocarpa để dự đoán 2263 gen mục tiêu CBF giả định; các gen được xác định
tham gia vào nhiều quá trình và con đường sinh học. Hầu như tất cả các gen mục
tiêu giả định có chứa nhiều yếu tố tác động cis mà trung gian phản ứng với các tín
hiệu mơi trường và nội sinh khác nhau, phù hợp với vai trò quan trọng của CBF1

trong một mạng lưới điều hịa lạnh tích hợp. Cuối cùng, phân tích 528 cá thể của
Populus simonii đã xác định sáu đa hình đơn nucleotide (tỷ lệ phát hiện sai Q
<0,10) đáng kể (P <0,005) kết hợp với sản xuất malondialdehyde và rò điện phân,
cho thấy tầm quan trọng tiềm năng của PsCBF1 trong quy định một số chức năng
liên quan đến màng tế bào. Phát hiện của nhóm nghiên cứu cung cấp những hiểu
biết mới về chức năng của PsCBF1 và làm sáng tỏ mạng lưới quy định trung gian
CBF trong cây dương [58].
+ Nghiên cứu: “Biểu hiện cảm ứng ectopic của At-CBF1 trong cà chua
chuyển gien không có marker làm tăng khả năng chịu lạnh “Trong một nỗ lực để cải
thiện khả năng chịu đựng lạnh của stress, một gen yếu tố liên kết C-lặp lại
Arabidopsis C (At-CBF1) được thúc đẩy bởi promoter cảm ứng RD29A được đồng
chuyển vào cà chua var. Shalimar. Marker (NPTII) - chuyển gen miễn phí thu được
trong thế hệ T (1) vì sự tích hợp khơng liên kết của các gen CBF1 và NPTII. Phản
ứng chuỗi sao chép ngược polymerase đã khẳng định sự biểu hiện của CBF1 trong
các dòng chuyển gen T (1). Nghiên cứu mơ hình biểu hiện trong T (1) dòng biến đổi
gen cho thấy sự gia tăng dần dần với thời gian làm lạnh kéo dài và cũng khẳng định
sự đảo ngược của biểu hiện về loại bỏ stress. Cây chuyển gen khơng có sự khác biệt
về hình thái và nông học so với cây không biến đổi. Khi cây chuyển gen non bị phơi
nhiễm với stress lạnh (4°C) trong 3 ngày, tăng tỷ lệ sống (50%) ở các dịng chuyển
gen so với cây khơng biến đổi (10%). Cây chuyển gen chịu áp lực làm lạnh cho thấy
sự giảm đáng kể chỉ số tổn thương màng và peroxid hóa lipid và cũng làm tăng hàm
lượng proline tự do đáng kể trong các mô lá so với cây không biến đổi. Vì vậy,
những phát hiện này chỉ ra rằng cây cà chua chuyển gen khơng có marker khơng


12

biểu hiện gen Arabidopsis CBF1 cung cấp khả năng bảo vệ và có khả năng chịu
lạnh đối với cà chua biến đổi gen mà khơng có bất kỳ biến đổi kiểu hình nào [59].
2.5. Chuyển gen ở thực vật

2.5.1. Khái niệm chuyển gen ở thực vật
Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở
dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói
chung (vi sinh vật, động vật, …) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ
hợp hoặc gắn và bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng
hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể
chuyển gen [2]; [4].
Chuyển gen ở thực vật có ý nghĩa lớn về mặt khoa học, nó khẳng định tính
khách quan tự nhiên của vật chất di truyền: khả năng mã hóa cho các tính trạng nhất
định, khả năng phiên mã, dịch mã và khả năng di truyền. Thông qua chuyển gen,
các nhà sinh lý, hóa sinh và di truyền có thể nghiên cứu các quá trình điều khiển,
thể hiện và ảnh hưởng của các yếu tố di truyền và ngoại cảnh lên hoạt động của gen.
2.5.2. Các phương pháp chuyển gen cho cây trồng
Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân loại
thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp và phương
pháp chuyển gen trực tiếp.
2.5.2.1. Phương pháp chuyển gen trực tiếp
- Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật xung điện
- Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm
- Phương pháp chuyển gen trực tiếp qua ống phấn
- Phương pháp chuyển gen nhờ sung bắn gen
- Chuyển gen nhờ silicon carbide
2.5.2.2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp
- Chuyển gen nhờ virus
- Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium


13

Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium được nghiên cứu từ những năm

1960-1970. Việc phát kiến ra Agrobacterium tumefaciens (A.tumefaciens) có khả
năng chuyển gen vào thực vật vào đầu những năm 1980 đã biến lồi này trở thành
một trong những cơng cụ quan trọng nhất của Công nghệ sinh học (CNSH) thực vật
với những ưu điểm nổi trội: số bản sao của gen biến nạp được chuyển vào tế bào
thực vật bậc thấp (khoảng 1 - 2 gen, trong khi sử dụng sung bắn gen là nhiều hơn).
Do vậy, giảm tối thiểu sự không biểu hiện của gen được chuyển, tăng khả năng
chuyển gen bền vững, hiệu quả chuyển gen cao tránh được sự hình thành của các
cây chuyển gen khảm; kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện; khơng địi hỏi thiết bị đắt
tiền [4].
Phương pháp này đã khắc phục được những hạn chế chủ yếu của các phương
pháp chuyển gen trực tiếp như: thường thu nhận được cây trồng có nhiều bản sao
của một gen dẫn tới sự “nhiễu gen” và không bền vững của gen trong thực vật, tần
số chuyển gen thấp, kết quả có thể thu được những cây mang thể khảm nghĩa là chỉ
mang gen ở một số vị trí.
Đặc biệt là khi nhược điểm của A.tumefaciens chỉ chuyển gen trên cây hai lá
mầm được khắc phục, việc chuyển gen vào cây một lá mầm trở thành hiện thực và
được ứng dụng thành cơng thì phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn
Agrobacterium ngày càng gây được sự quan tâm và dần trở thành một phương pháp
chuyển gen được ưu tiên lựa chọn của các nhà khoa học và các nhà chọn tạp giống
trên thế giới.
2.5.2.3. Đặc điểm và cơ chế chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Đặc điểm chung của vi khuẩn A.tumefaciens:
A.tumefaciens là loài vi khuẩn gram âm, có khả năng gây bệnh khối u cho 140
loài cây trồng [28]. A.tumefacien là một trong hai loài vi khuẩn sống trong đất gây ra
bệnh khối u hình chóp (crown gall) ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm.
Việc tạo thành khối u do quá trình tổng hợp amino acid mới và các dẫn xuất của đường
được biết chung là opine [27]; [49]. Loại opine tổng hợp trong khối u như nopaline,
octopine, agrocinopine, mannopine và agropine phụ thuộc vào dòng Agrobacterium



14

khởi đầu sự hình thành khối u. Octopine và nopaline là hai loại opine có nguồn gốc từ
arginine và dễ dàng phát hiện nhất trong mơ khối u. Do đó nhiều dòng A.tumefaciens
phổ biến được thiết kế theo kiểu octopine hoặc nopaline. Agrobacterium chịu trách
nhiệm đối với sự hình thành khối u dị hóa một cách có chọn lọc opine mà nó tổng hợp
được và sử dụng opine như là một nguồn cacbon và nitơ.
Cả việc gây ra khối u và tổng hợp opine liên quan với sự có mặt của một loại
plasmid có kích thước lớn là Ti-plasmid (Tumour inducing: Ti gây ra khối u) trong
tế bào vi khuẩn A.tumefaciens.

Cấu trúc và chức năng Ti-plasmid
Ti-plasmid được tìm thấy trong tất cả các dịng A.tumefaciens, có kích thước
khoảng 200-250 kb [48]. Chúng được duy trì ổn định trong Agrobacterium ở nhiệt
độ dưới 300C. Bằng phương pháp lai DNA-DNA và lập bản đồ chuỗi kép dị hợp,
người ta đã xác định được Ti-plasmid có 4 vùng tương đồng. Kết quả phân tích di
truyền cho thấy vùng T-DNA (transferred DNA) và vùng gây độc vir (virulence)
liên quan đến sự hình thành khối u trong khi hai vùng khác liên quan đến sự tiếp
hợp và sự tái bản của plasmid trong Agrobacterium. Có hai dịng Ti-plasmid là
nopaline và octopine, trong đó kiểu nopanie phổ biến trong các dịng A.tumefaciens.
Trong Ti-plasmid có hai vùng quan trọng cần thiết cho quá trình chuyển gen
ở thực vật. Thứ nhất, vùng T-DNA là vùng được chuyển vào thực vật nhờ quá trình
tiếp hợp giữa A.tumefaciens và thực vật ở những chỗ có vết thương. Hiện nay trong
kỹ thuật chuyển gen cây trồng, người ta lợi dụng vùng T-DNA đã mang đoạn gen
cần chuyển vào thực vật. Thứ hai, vùng vir là vùng gây độc cho thực vật nên không
được chuyển vào bộ gen của cây trồng, mà nó đóng vai trị hỗ trợ cho q trình
chuyển T-DNA vào trong tế bào thực vật [7].


15


Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopyne
Cấu trúc và chức năng T-DNA
T-DNA là nhân tố chính trong việc chuyển DNA ngoại lai vào tế bào thực
vật và hợp nhất với hệ gen nhân. Vị trí hợp nhất của T-DNA vào DNA thực vật là
hoàn toàn ngẫu nhiên [26]; [52]. Các vùng tương đồng với T-DNA đã được tìm thấy
ở các Ti-plasmid khác nhau. Trong các dòng A.tumefaciens kiểu nopaline được sử
dụng phổ biến. Vùng T-DNA có kích thước khoảng 24 kb. T-DNA được giới hạn
bởi đoạn trình tự lặp lại gần như hoàn toàn khoảng 25 bp gọi là đoạn biên [35]. Ở
đoạn biên bên phải (Right Boder - RB) có yếu tố điều khiển cis cần cho quá trình
chuyển T-DNA. Đoạn biên bên trái (Left Border - LB) gián tiếp tham gia vào quá
trình chuyển T-DNA [8]; [22]; [31].
Ở một số khối u kiểu octopine, có hai đoạn khơng kề nhau đã được tìm thấy
là TL và TR. TL kích thước 14 kb, có mặt trong tất cả các dịng tế bào đã biến nạp và
có chức năng tương đương với T-DNA ở các dòng tế bào nopaline. TR có kích
thước 7 kb, được hình thành từ phía bên phải của TL-DNA trong Ti-plasmid. TDNA được phiên mã trong các tế bào khối u, tạo ra nhiều mRNA polyadenyl. Các
loại sản phẩm phiên mã của T-DNA tích lũy lại là tương đối thấp so với các mRNA
của thực vật [30]. Giải trình tự T-DNA kiểu nopaline đã cho thấy có 13 khung đọc
mở lớn (open-reading frame) trong khi ở TL-DNA và TR-DNA kiểu octopine tương


×